CN113475395B - 一种祁术下胚轴直接再生与体外生根的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种祁术下胚轴直接再生与体外生根的方法，涉及植物生物技术领域，本发明包括以下步骤：(1)外植体的预处理；(2)不定芽的诱导与继代增殖培养；(3)不定芽的伸长培养；(4)伸长芽的体外生根处理；(5)伸长芽的定植与成苗培养。本发明的有益效果在于：本发明所涉及的繁育过程具有再生效率高，操作简单，成苗时间短，成苗率高等优势，为后期祁术种苗的规模化繁育和品种改良奠定了基础。

Description

一种祁术下胚轴直接再生与体外生根的方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种祁术下胚轴直接再生与体外生根的方法。

背景技术

祁术即祁门白术，为菊科苍术属多年生草本植物，是徽州名优特产“三祁”(祁术、祁红茶、祁蛇)之一，是安徽道地名贵药材，具有重要的药用价值，是多种中成药的原料药。具有益胃、利湿、止泻、养神、安胎、消除疲劳和虚脱等多种功能，对黄胆病、心脏病、胃溃疡及腹水病人的康复十分有效，俗有“北参南术”、“十方九术”之说。作为道地药材的祁术，其品质及疗效均优于其他地域的同种药材，这与其独特的品种以及得天独厚的生长环境有着密切的联系。现代药理学研究表明，祁术主要含有苍术酮、术内酯、倍半萜类化合物、杜松酯和棕榈酸等成分，具有较强的生物活性，在利尿、抗肿瘤、抗菌消炎、抗糖尿病、抗衰老等方面具有重要的作用，此外，祁术还具有调节人体免疫功能。近年来，随着人们生活素养的提高及对养生的重视，对道地祁术的需求日益增加。然而，由于野生祁术的采挖过度及生境的人为破坏，野生祁术已处于濒危灭绝境地。

目前，在生产上，祁术主要采用播种繁殖，但由于祁术种子产量低，萌发率低，苗期抵抗力弱等问题，致使祁术成苗率非常低。为了保证祁术产业的健康可持续发展，亟需研发一种高效的祁术育苗技术，在提高祁术繁育系数的同时提高祁术田间成苗率，以满足市场对祁术种苗的需求。

植物组织培养技术作为一种新的高效育苗技术，因其具有繁育周期短，繁殖系数高，所需要的外植体材料少等优势，在濒危植物的繁育中起着重要作用。目前，有关利用组织培养技术对祁术进行繁殖的相关研究已有零星报道，如论文(胡长玉,叶玉娟,郝祥霞,等.祁术的组织培养及快速繁殖技术研究[J].黄山学院学报,2006(05):57-60.)中公开选用祁术的叶片和下胚轴接种于附加植物生长调节剂NAA、6-BA及其组合的MS固体培养基上，进行诱导分化。该技术与传统祁术育苗技术相比，虽能加快祁术的人工繁殖速度，但从现有的研究结果来看，其增殖系数较低且炼苗过程中同样存在成苗率较低问题。为了满足规模化种植和品种改良对祁术种苗的需求，急需开发一种祁术下胚轴直接高效再生与体外生根的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于一种祁术下胚轴直接再生与体外生根的方法。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：

一种祁术下胚轴直接再生与体外生根的方法，包括以下步骤：

(1)外植体的预处理：以祁术萌发种子实生苗的下胚轴为外植体，于超声仪中进行预处理后，切成适宜大小的切段，吸干表面水分，备用；

(2)不定芽的诱导与继代增殖培养：将步骤(1)中预处理的下胚轴切段接种于不定芽诱导培养基中，于温室中进行不定芽的诱导光照培养；光照培养后转接于继代增殖培养基中进行继代增殖培养；

(3)不定芽的伸长培养：继代培养后，将步骤(2)中的不定芽从不定芽丛上分离后直接转接于伸长培养基中于温室中进行芽的光照伸长培养；

(4)伸长芽的体外生根处理：将步骤(3)中伸长的组培芽取出，然后将伸长芽基部置于含有500-2000mg/L 3-吲哚丁酸钾和500-1000μM褪黑素的生根促进液中进行不定根的诱导处理；

(5)伸长芽的定植与成苗培养：将步骤(4)中处理后的伸长芽基部定植于装有营养基质的塑料育苗盘中，盖上育苗盖，于温室中进行不定根的诱导与成苗培养。

有益效果：本发明以祁术下胚轴为外植体，通过直接诱导不定芽再生，结合伸长芽的体外生根与驯化同步化来实现对祁术种苗的快速繁殖。

繁育过程采用下胚轴直接诱导不定芽，再生效率高，不定芽诱导率最高达98.3％，平均每个外植体最高可产生5.7个不定芽，经继代增殖后每个外植体可产生9.6个不定芽。

不定芽伸长后直接进行体外生根，同步实现了不定根的诱导和驯化移栽培养，简化了繁殖步骤，缩短了育苗时间，14周即可成苗，大大提高了不定根诱导率和移栽成活率，不定根诱导率高达96.7％，后期移栽成活率高达99.2％。

本发明繁育过程具有再生效率高，操作简单，成苗时间短，成苗率高等优势，为后期祁术种苗的规模化繁育和品种改良奠定了基础。

优选地，所述步骤(1)中将下胚轴置于装有无菌水的离心管中于超声仪中于600W超声处理30-120s，然后于无菌操作台中切成0.3cm的切段，备用。

有益效果：超声处理能够提高祁术下胚轴不定芽的诱导率及平均每个外植体产生的不定芽个数。

优选地，所述超声处理时间为60s。

有益效果：超声处理60s的下胚轴不定芽诱导率最高，达到98.3％。

优选地，所述步骤(2)中不定芽诱导和继代增殖培养基为：DKW+5.0mg/L KT+0.1mg/L IAA+5mg/L VC+3.0％(w/v)蔗糖+0.7％(w/v)琼脂，pH＝5.8。

优选地，所述步骤(3)中不定芽的伸长培养基为：1/2DKW+0.5mg/LZT+2.5mg/L VC+3.0％(w/v)蔗糖+0.7％(w/v)琼脂，pH＝5.8。

优选地，所述步骤(4)中诱导处理时间为10s。

优选地，所述步骤(4)中切除基部0.2cm左右茎段后将伸长芽置于自来水中清洗3遍，然后将伸长芽基部置于含有2000mg/L 3-吲哚丁酸钾和1000μM褪黑素的生根促进液中进行不定根的诱导处理。

有益效果：3-吲哚丁酸钾和褪黑素具有协同作用，当促进液中褪黑素浓度为1000μM，3-吲哚丁酸钾浓度为2000mg/L时不定根的诱导效果最佳，不定根诱导率高达96.7％。

优选地，所述步骤(5)中的营养基质为品氏泥炭土：园土：蛭石：珍珠岩＝3:2:1:1；所述营养基质经过营养补液喷施处理，所述的营养补液为添加有100μM褪黑素的不含有机元素的1/8DKW基本培养液。

优选地，所述上述步骤(2)和(5)中所述的温室条件为温度为23±2℃，光源为LED白光，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，光照时间为16h，相对湿度为50-60％。

优选地，所述步骤(3)中所述的伸长培养的温室条件为温度为23±2℃，LED光质及配比为红蓝复合光(3：1)，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，光照时间为16h，相对湿度为50-60％。

有益效果：本发明在祁术组培快繁中引入高寿命、低能耗的LED光质配比，在降低能耗成本的同时，缩短不定芽伸长时间，且使得祁术组培苗生长较快，为祁术的规模化繁育和品种改良提供了技术支撑。

当LED红:LED蓝＝3：1时，祁术不定芽的生长速度最快，伸长效果最佳，平均高度达4.4cm。

优选地，成苗培养期间每隔2周，叶片喷施一次营养补液。

本发明的优点在于：本发明以祁术下胚轴为外植体，通过直接诱导不定芽再生，结合伸长芽的体外生根与驯化同步化来实现对祁术种苗的快速繁殖。

繁育过程采用下胚轴直接诱导不定芽，再生效率高，不定芽诱导率最高达98.3％，平均每个外植体最高可产生5.7个不定芽，经继代增殖后每个外植体可产生9.6个不定芽。

不定芽伸长后直接进行体外生根，同步实现了不定根的诱导和驯化移栽培养，简化了繁殖步骤，缩短了育苗时间，14周即可成苗，大大提高了不定根诱导率和移栽成活率，不定根诱导率高达96.7％，后期移栽成活率高达99.2％。

本发明繁育过程具有再生效率高，操作简单，成苗时间短，成苗率高等优势，为后期祁术种苗的规模化繁育和品种改良奠定了基础。

超声处理能够提高祁术下胚轴不定芽的诱导率及平均每个外植体产生的不定芽个数。超声处理60s的下胚轴不定芽诱导率最高，达到98.3％。

3-吲哚丁酸钾和褪黑素具有协同作用，当促进液中褪黑素浓度为1000μM，3-吲哚丁酸钾浓度为2000mg/L时不定根的诱导效果最佳，不定根诱导率高达96.7％。

本发明在祁术组培快繁中引入高寿命、低能耗的LED光质配比，在降低能耗成本的同时，缩短不定芽伸长时间，且使得祁术组培苗生长较快，为祁术的规模化繁育和品种改良提供了技术支撑。

当LED红:LED蓝＝3：1时，祁术不定芽的生长速度最快，伸长效果最佳，平均高度达4.4cm。

附图说明

图1为本发明实施例1中接种于不定芽诱导培养基上的祁术下胚轴切段图；

图2为本发明实施例1中于不定芽诱导培养基中培养2周的祁术下胚轴图；

图3为本发明实施例1中于不定芽诱导培养基中培养3周的祁术下胚轴图；

图4为本发明实施例1中于不定芽诱导培养基上继代培养3周的祁术下胚轴丛生芽图；

图5为本发明实施例1中祁术组培芽的伸长培养图；

图6为本发明实施例1中祁术组培苗的体外生根图；

图7为本发明实施例1中祁术再生植株的成苗图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

实施例1

一种祁术下胚轴直接再生与体外生根的方法，具体包括以下步骤：

(1)将取材于萌发3周的祁术无菌种苗的下胚轴置于装有无菌水的离心管中于超声仪(600W)中进行60s的超声处理，然后于无菌操作台中切成0.3cm的切段，备用；

(2)将步骤(1)中的下胚轴切段水平接种于不定芽诱导培养基中(图1)，于温度为22±2℃，光源为LED白光，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，光照时间为16h，相对湿度为50-60％的恒温培养室中进行不定芽的诱导和继代增殖培养。经过2周的光照培养，下胚轴切口处诱导出不定芽丛(图2)；继续培养1周后，下胚轴周边形成大量的不定芽，不定芽的诱导率为98.3％，且平均每个外植体产生5.7个不定芽(图3)。然后，将诱导出不定芽的下胚轴转接于新鲜诱导培养基中进行继代增殖培养；继代培养3周后，平均每个外植体产生9.6个不定芽(图4)。其中不定芽的诱导和继代增殖培养基为DKW+5.0mg/L KT+0.1mg/L IAA+5mg/L VC+3.0％(w/v)蔗糖+0.7％(w/v)琼脂，pH＝5.8。

(3)将步骤(2)中的不定芽从不定芽丛上分离后直接转接于伸长培养基中于温度为23±2℃，LED光质及配比为红蓝复合光(3：1)，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，光照时间为16h，相对湿度为50-60％的恒温培养室中进行芽的伸长培养。光照培养3周后获得带有5～8片完整叶片、平均长度为4.4cm的伸长芽(图5)。其中不定芽伸长培养基为：1/2DKW+0.5mg/L玉米素(ZT)+2.5mg/L VC+3.0％(w/v)蔗糖+0.7％(w/v)琼脂，pH＝5.8。

(4)将步骤(3)中伸长的组培芽从培养瓶中取出，切除基部0.2cm左右茎段后将伸长芽置于自来水中清洗3遍，然后将伸长芽基部置于含有2000mg/L 3-吲哚丁酸钾(KIBA)和1000μM褪黑素的生根促进液中处理10s进行不定根的诱导处理；

(5)将步骤(4)中处理后的伸长芽基部定植于装有经过0.5‰(w/v)高锰酸钾溶液浇灌和不含有机元素的1/8DKW基本培养液喷施处理的营养基质(品氏泥炭土：园土：蛭石：珍珠岩＝3:2:1:1，以上为质量比)的塑料育苗盘中，盖上育苗盖，于温度为23±2℃，光源为LED白光，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，光照时间为16h，相对湿度为50-60％的温室中进行不定根的诱导与成苗培养。成苗培养期间每隔2周，叶片喷施一次营养补液，营养补液为添加有100μM褪黑素的不含有机元素的1/8DKW基本培养液。光照培养4周后，不定根的诱导率为96.7％，平均每个外植体产生12.2个不定根，平均不定根长3.4cm(图6)；继续培养4周后，获得根系、叶片健壮的可直接进行田间移栽的祁术再生植株(图7)，后期再生植株的移栽成活率高达99.2％。

实施例2

本实施例测试了超声处理时间对祁术下胚轴不定芽诱导的影响。

将取材于萌发3周的祁术无菌种苗的下胚轴置于装有无菌水的离心管中于超声仪(600W)中进行不同时间(0，30，60,120和180s)的超声处理，然后于无菌操作台中切成0.3cm的切段，水平接种于不定芽诱导培养基中，于温度为22±2℃，光源为LED白光，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，光照时间为16h，相对湿度为50-60％的恒温培养室中进行不定芽的诱导培养。光照培养3周后统计不定芽的诱导率及平均每个外植体产生的不定芽个数。研究结果(表1)表明适宜时间的超声处理能够提高祁术下胚轴不定芽的诱导率及平均每个外植体产生的不定芽个数，在所测试的超声处理时间中，超声处理60s的下胚轴不定芽诱导率最高(98.3％)，平均每个外植体产生个5.7不定芽。随着超声处理时间的延长，对不定芽诱导的促进效果逐渐减弱，甚至出现抑制作用。推测原因在于适宜时间的超声促使下胚轴产生适宜的机械损伤，利于不定芽的诱导；而长时间的超声处理，促进了下胚轴中次级代谢物的大量分泌，从而抑制不定芽的形成。

表1超声处理对祁术下胚轴再生的影响

超声处理时间(s)	不定芽诱导率(％)	不定芽个数/外植体
			0	75.8	4.1
30	82.5	4.4
			60	98.3	5.7
120	81.7	4.8
			240	64.2	3.5

注：数据为平均值，每个处理包含120个外植体，每个处理重复三次

实施例3

本实施例测试了不同光源及光之配比对祁术下胚轴不定芽伸长的影响。

将实施例1中伸长的祁术组培芽分离后接种于伸长培养基中于不同光质条件下进行不定芽的伸长培养。光质分别为白光、红光、蓝光、红蓝复合光(1：1)和红蓝复合光(3：1)培养。光照培养3周后，统计不定芽的伸长情况。

研究结果表明(表2)光质及配比在祁术不定芽伸长过程中起着重要作用，在所测试的不同光质种，LED红:LED蓝＝3：1时，祁术不定芽的生长速度最快，伸长效果最佳，平均高度达4.4cm。

表2 LED光质对祁术不定芽伸长的影响

LED光质	不定芽高度(cm)
		白光	2.8
蓝色	2.4
		红色	3.5
红蓝比＝3：1	4.4
		红蓝比＝1：1	3.2

注：数据为平均值，每个处理包含120个外植体，每个处理重复三次

实施列4

本实施例测试了KIBA和褪黑素混合液对祁术伸长芽瓶外生根的影响。

以实施例1中获得的长势均一的祁术伸长芽为外植体材料，将其形态学下端置于含有不同浓度褪黑素和KIBA的混合溶液中处理10s进行体外生根培养。温室中培养4周后，统计祁术伸长芽的体外生根情况。

研究结果如表3所示。研究结果表明KIBA和褪黑素对祁术伸长芽瓶外生根具有重要的影响。在一定范围内，随着处理液浓度的增加，不定根的诱导率和不定根的个数及不定根平均长度逐渐增加，当促进液中褪黑素浓度为1000μM，KIBA浓度为2000mg/L时不定根的诱导效果最佳。

表3褪黑素和KIBA浓度对祁术伸长芽瓶外生根的影响

注：数据为平均值，每个处理包含120个外植体，每个处理重复三次

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.一种祁术下胚轴直接再生与体外生根的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)外植体的预处理：以祁术萌发种子实生苗的下胚轴为外植体，于超声仪中进行预处理后，切成适宜大小的切段，吸干表面水分，备用；预处理步骤为将下胚轴置于装有无菌水的离心管中于超声仪中于600W超声处理30-120s，然后于无菌操作台中切成0.3cm的切段，备用；

(2)不定芽的诱导与继代增殖培养：将步骤(1)中预处理的下胚轴切段接种于不定芽诱导培养基中，于温室中进行不定芽的诱导光照培养；光照培养后转接于继代增殖培养基中进行继代增殖培养；所述不定芽诱导培养基和继代增殖培养基均为：DKW+5.0mg/L KT+0.1mg/L IAA+5mg/L VC+3.0％w/v蔗糖+0.7％w/v琼脂，pH＝5.8；

(3)不定芽的伸长培养：继代培养后，将步骤(2)中的不定芽从不定芽丛上分离后直接转接于伸长培养基中于温室中进行芽的光照伸长培养；所述不定芽的伸长培养基为：1/2DKW+0.5mg/L ZT+2.5mg/L VC+3.0％w/v蔗糖+0.7％w/v琼脂，pH＝5.8；

(4)伸长芽的体外生根处理：将步骤(3)中伸长的组培芽取出，然后将伸长芽基部置于含有500-2000mg/L 3-吲哚丁酸钾和500-1000μM褪黑素的生根促进液中进行不定根的诱导处理10s；

(5)伸长芽的定植与成苗管理：将步骤(4)中处理后的伸长芽基部定植于装有营养基质的塑料育苗盘中，盖上育苗盖，于温室中进行不定根的诱导与成苗培养；成苗培养期间每隔2周，叶片喷施一次营养补液；

所述步骤(3)中所述的伸长培养的温室条件为温度为23±2℃，LED光质及配比为红蓝复合光3：1，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，光照时间为16h，相对湿度为50-60％。

2.根据权利要求1所述的祁术下胚轴直接再生与体外生根的方法，其特征在于：所述步骤(4)中切除基部0.2cm左右茎段后将伸长芽置于自来水中清洗3遍，然后将伸长芽基部置于含有2000mg/L 3-吲哚丁酸钾和1000μM褪黑素的生根促进液中进行不定根的诱导处理。

3.根据权利要求1所述的祁术下胚轴直接再生与体外生根的方法，其特征在于：所述步骤(5)中的营养基质为品氏泥炭土：园土：蛭石：珍珠岩＝3:2:1:1；所述营养基质经过营养补液喷施处理，所述的营养补液为添加有100μM褪黑素的不含有机元素的1/8DKW基本培养液。

4.根据权利要求1所述的祁术下胚轴直接再生与体外生根的方法，其特征在于：所述上述步骤(2)和(5)中所述的温室条件为温度为23±2℃，光源为LED白光，光照强度为50μmol·m^-2·s^-1，光照时间为16h，相对湿度为50-60％。

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