JPH08140672A - トチバニンジン毛状根の培養方法およびチクセツサポニンの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 トチバニンジンの無菌再生幼植物体の茎切片
にアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を接種し、効率良
く毛状根を誘導する。そして、多数の毛状根クローンよ
り増殖能およびチクセツサポニン生産能の優れたクロー
ンを選抜し、この毛状根クローンの培養に適した培地で
培養して、チクセツサポニンを生産させる。 【効果】 チクセツサポニンを安定して大量に供給する
ことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、トチバニンジンの無
菌再生幼植物体から効率良く毛状根組織を誘導する、ト
チバニンジン毛状根の培養方法、およびこれを人工培地
を用い、しかも環境（培養条件）を制御して培養し、チ
クセツサポニンを大量に生産する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】トチバニンジン（パナックス・ジャポニ
カス・シー・エイ・メイヤー：Ｐａｎａｘ ｊａｐｏｎ
ｉｃｕｓ Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）は、ウコギ科パナック
ス（Ｐａｎａｘ）属に属し、日本特産で、日本各地の山
林の樹間の陰地に自生している多年生の薬用植物であ
る。トチバニンジンの根茎を、通例、湯通ししたものを
生薬ではチクセツ人参と称し、健胃薬、去痰薬として用
いられている。

【０００３】チクセツ人参には薬用成分の１つとしてサ
ポニンが約７重量％含まれている。チクセツ人参のサポ
ニン成分は他のウコギ科パナックス（Ｐａｎａｘ）属植
物の根あるいは根茎に含まれるサポニン成分とは著しく
異なる。

【０００４】チクセツ人参に含まれるサポニンの主成分
はオレアノール酸サポニン類（チクセツサポニンＶ、Ｉ
Ｖ、Ｉｂなど）である。一方、他のウコギ科パナックス
属の根あるいは根茎に含まれるサポニンの主成分はダマ
ラン系サポニン類である。他のウコギ科パナックス属植
物とはオタネニンジン（根を生薬では薬用人参と称す
る）、三七ニンジン、アメリカニンジンなどである。

【０００５】チクセツ人参にもダマラン系サポニン類
（チクセツサポニンＩＩＩ、Ｉａなど）が含まれるが、
このうちチクセツサポニンＩＩＩは他のパナックス属植
物から得られておらず、チクセツ人参に特徴的なサポニ
ンである。このサポニンは血液賦活作用、抗ストレス性
潰瘍作用があると報告されており、これを主成分とする
補気薬が知られている（特公平０４−７３２５号）。

【０００６】チクセツ人参の主たるサポニン成分である
オレアノール酸サポニンは薬用人参にも含まれるがごく
微量である。薬用人参（オタネニンジンの根）に含まれ
ているサポニン成分をジンセノサイドと称しているが、
このジンセノサイドのうち、ジンセノサイドＲｏのみ
が、チクセツ人参に含まれるチクセツサポニンＶと同じ
ものである。

【０００７】チクセツサポニンＶは抗肝炎活性（特開平
４−５２３５号）、抗トロンビン作用を有し、これを有
効成分とする血栓症予防並びに治療薬が知られている
（特公６２−１３９２７号）。

【０００８】従来、チクセツサポニンの製法としては、
天然のトチバニンジンの根茎から抽出する方法が行われ
ていた。トチバニンジンは自然増殖能力が低いため、そ
の資源の枯渇が危惧されており、また、天然植物のチク
セツサポニン含量は採取時期、天候、自生地などの諸条
件によって左右され、チクセツサポニンの供給が必ずし
も安定しているわけではない。

【０００９】そこで、近年、植物組織を人工培地を用
い、しかも培養環境を人工的に制御して、培養し、植物
が生産する有用物質を工業的に生産（産生とも言う。）
する試みが盛んに行われている。

【００１０】チクセツサポニンを工業的に生産するた
め、トチバニンジンの組織（根茎、茎、葉、花芽）を植
物ホルモンを含む人工培地で培養してカルスを誘導し、
このカルスを増殖用培地で数回継代培養して増殖させた
後、特定の培地を用いて増殖したカルスを培養してチク
セツサポニンを生産する方法（特開平２−２１５３９７
号）、カルスからプロトプラストを調製し、このプロト
プラストに物理的あるいは化学的処理を加えて変異を誘
導した後、カルスを再生し、チクセツサポニンを高生産
するカルスを選抜して培養する方法（特開平２−２３４
６９６号）とか、或いはトチバニンジンの細胞を特定の
条件下で培養してチクセツサポニンを生産する方法が知
られている（特開平５−１９２１３７号）。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、カルス
や植物細胞を培養する場合、植物ホルモン添加培地で培
養するのが一般的であるが、カルスや植物細胞をこの植
物ホルモン添加培地でくり返し継代培養すると変異が生
じてしまい、このため、原植物（親植物とも言う。）に
含まれるサポニンと同一のサポニンが生産されなくなっ
たりして、安定した生産が望めない。

【００１２】ところで、現在、植物の根あるいは根茎に
有効成分を含む場合、有効成分を工業的に生産する別の
方法として、毛状根病を誘発する土壌細菌の１種である
アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を植物に感染させて
得られる毛状根を培養し、原植物に含まれる有効成分を
生産することが可能であり、多くの試みがなされてい
る。

【００１３】また、トチバニンジンと同じパナックス属
に属するオタネニンジンでは、無菌の植物体の根や茎に
アグロバクテリウム・リゾゲネスの付着した針を刺すこ
とにより、あるいは、カルスと菌懸濁液とを共存培養し
て、菌を感染させて毛状根を誘導している。そして、誘
導された毛状根を人工培地を用いて培養すると原植物オ
タネニンジンに含まれるサポニン成分であるジンセノサ
イドを生産することが知られている（特開平４−３４１
１９４号、特開昭６２−１１１６９６号、文献：プラン
ト・セル・リポート（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏ
ｒｔｓ）、Ｖｏｌ．６、ｐｐ４４９−４５３、１９８７
年）。

【００１４】また、植物体あるいは植物組織片にアグロ
バクテリウム・リゾゲネスを接種し、毛状根を誘導する
方法については多くの報告がある。植物体の茎や葉に傷
をつけながら、アグロバクテリウム・リゾゲネスを直接
接種する方法、無菌葉切片、培養細胞（カルス）などと
アグロバクテリウム・リゾゲネスを共存培養する方法で
ある。

【００１５】そこで、この出願に係る発明者等は、トチ
バニンジンの根茎に含まれるチクセツサポニンを効率良
く、大量に生産するために、オタネニンジンで行われた
手法と同じ手法あるいは一般的に行われている手法で毛
状根の誘導を試みた。トチバニンジンカルス（１２０
個）あるいは無菌葉切片（９２０個）とアグロバクテリ
ウム・リゾゲネス菌液を共存培養したり、また、トチバ
ニンジンの無菌植物体の根（１６０個）、茎部（１００
個）にアグロバクテリウム・リゾゲネスを直接接種し、
毛状根の誘導を試みたが、毛状根の誘導はならなかっ
た。このことは、同じ属に属する植物でも種が異なれ
ば、かならずしも同一の手法をとることができず、植物
種に応じて感染方法を改良する必要があることを示唆し
ている。

【００１６】この発明の目的は、トチバニンジンに毛状
根を誘導する土壌細菌の１種であるアグロバクテリウム
・リゾゲネスを感染させる方法を工夫し、効率良く多数
の毛状根を誘導する、トチバニンジン毛状根の培養方法
を提供することにある。

【００１７】さらに、この発明の他の目的は、多数の毛
状根クローンの中から増殖能力およびチクセツサポニン
の生産能に優れたクローンを選抜し、チクセツサポニン
を効率良く、大量に生産する方法を提供することにあ
る。

【００１８】

【課題を解決するための手段】そこで、発明者等は感染
方法等の改良を種々検討した結果、以下に述べる方法に
よって上述の目的を達成することができるこの発明を完
成するに至った。

【００１９】この発明の毛状根の培養方法によれば、先
ず、トチバニンジンの無菌再生幼植物体の茎切片にアグ
ロバクテリウム・リゾゲネスを接種してトチバニンジン
毛状根を誘導することを特徴とする。

【００２０】この発明の実施に当たり、好ましくは、無
菌再生幼植物体を、トチバニンジン根茎よりカルスを誘
導し（または形成し）、このカルスから不定胚を誘導し
（または形成し）、次に、不定胚を無菌的に発芽・発根
させることにより、形成するのが良い。

【００２１】この発明の好適実施例によれば、無菌再生
幼植物体の茎切片の根側の切断面にアグロバクテリウム
・リゾゲネスを接種するのが良い。

【００２２】さらに、この発明によれば、この茎切片を
ショ糖のみを含む寒天培地に差し込み、暗所で培養する
ことにより、多数の毛状根を誘導するのが好適である。
この場合、ショ糖の含有量を１〜３重量％とするのが好
適である。この場合、ショ糖の含有量が３重量％を越え
ると、毛状根の誘導が困難となってしまい、また、ショ
糖の含有量が１重量％より少ないと茎切片が枯死し易く
なってしまう。

【００２３】この発明の実施に当たり、好ましくは、不
定胚を無菌的に発芽・発根させるために用いる培地を、
ジベレリン酸を１ｐｐｍ添加しおよび１−ナフタレン酢
酸を０．１〜１ｐｐｍ添加した、無機塩濃度が２分の１
のムラシゲ−スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏ
ｇ）培地（以下、単に１／２ＭＳ培地とも言う。）とす
るのが良い。

【００２４】さらに、この発明の好適実施例によれば、
ＭＳ培地に用いる支持体をセラミックファイバーマット
とするのが良い。

【００２５】さらに、この発明のチクセツサポニンの生
産方法によれば、好ましくは、誘導されたチクセツニン
ジンの多数の毛状根クローンから増殖速度およびチクセ
ツサポニン生産能に優れたクローンを選抜し、この毛状
根クローンをくり返し継代培養し、継代培養されたチク
セツニンジンの毛状根からチクセツサポニンを抽出す
る。

【００２６】以下、この発明について具体的に説明す
る。この発明に用いられるトチバニンジンの再生幼植物
体は、公知の方法で原植物の組織から誘導される（生薬
学雑誌、４０、１５２−１５８、１９８６年）ものであ
っても良い。尚、再生幼植物体とは、種子が発芽して生
じた実生ではなく、不定胚（人工種子）が発芽・発根し
て生じた植物体のことを言い、原植物とは、ここでは野
生のトチバニンジンのことを言う。

【００２７】先ず、採取したトチバニンジンの根茎を水
洗後、７０体積％エタノールで６０秒、ついで０．１重
量％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含む１０重量％サ
ラシ粉溶液で１０〜２０分間殺菌する。次に、殺菌済根
茎を滅菌水で３〜５回洗浄する。この洗浄済のトチバニ
ンジンの根茎を、滅菌したコルクボーラー（外径２〜３
ｍｍ）で打ち抜き、ついで滅菌したメスで２〜３ｍｍの
厚さに切断して、組織片とする。

【００２８】トチバニンジン根茎の殺菌した組織片を組
織培養で一般的に用いられるムラシゲ−スクーグ（Ｍｕ
ｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ）基本培地（単にＭＳ培地
ともいう。）に２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（単
に、２，４−Ｄとも言う。）を０．２〜１．０ｐｐｍ、
カイネチンを０〜２ｐｐｍ、ショ糖を２〜３重量％およ
びゲランガムを０．２〜０．３重量％添加し、これらが
添加されたＭＳ培地に、上述した殺菌済の組織片を置床
した後、室温例えば２５℃の温度で、暗所で４〜６週間
培養してカルスを誘導する。ゲランガムを用いる代わり
に、支持体としてセラミックファイバーマットを用いて
もゲランガムの場合と同様な良好な結果が得られる。

【００２９】誘導されたカルスをカルス誘導と同じ組成
の培地で４週間毎に室温例えば２５℃の温度で、暗所で
継代培養をくり返すと不定胚が誘導される。４〜５回の
継代培養で不定胚が誘導される。

【００３０】誘導された不定胚を、１−ナフタレン酢酸
（単に、ＮＡＡとも言う。）を２ｐｐｍ、ベンジルアデ
ニン（単に、ＢＡとも言う。）を５ｐｐｍ、ショ糖を２
重量％含むＭＳ培地で、室温例えば２５℃の温度で、１
６時間にわたる２，０００〜３，０００ルックスの明所
およびこれに続く８時間にわたる暗所で、交互に、４〜
６週間培養して、成熟不定胚を得た。このときの支持体
としてセラミックファイバーマットを用いた。

【００３１】得られた成熟不定胚を無菌的に発芽・発根
させて、無菌再生幼植物体を得るには、公知の方法に従
って行うことができる。しかし、公知の方法によれば、
成熟不定胚をジベレリン酸を１ｐｐｍおよびベンジルア
デニンを０〜１ｐｐｍ添加した、無機塩濃度が２分の１
のＭＳ培地（１／２ＭＳ培地とも言う。）で、室温例え
ば２５℃の温度で、連続照明下において６週間にわたり
培養してシュートを形成させた後、発根培地で１５週間
にわたり培養して再生幼植物体を得ている。従って、従
来は成熟不定胚から再生幼植物体を得るまでに２１週を
も要していることになる。

【００３２】そこで、この発明の実施例では、成熟不定
胚から無菌再生幼植物体を得るための期間を短縮するた
めに、添加する植物ホルモンの種類と濃度について改良
を加えた結果、ベンジルアデニンの代わりにオーキシン
の１種である１−ナフタレン酢酸を０．１〜１ｐｐｍ培
地に加えることにより、シュートと根が同時に生じ、２
５℃、１６時間２，０００ルックスの照明、８時間暗
所、６週間の培養で、再生幼植物体を得ることができ、
従来の方法より成熟不定胚から再生幼植物体を得るまで
に１５週間期間が短縮された。なお、１−ナフタレン酢
酸の添加量を０．１ｐｐｍより少なくすると実質的に１
−ナフタレン酢酸を添加した効果が現れず再生幼植物体
を得ることができず、また１−ナフタレン酢酸の添加量
を１ｐｐｍより多くすると発根率が低下する。この場
合、ジベレリン酸の添加量は１ｐｐｍとしているが、こ
の量は、従来より好ましい量として知られているので、
この量をそのまま用いた。

【００３３】この場合、培地の支持体として寒天或いは
ゲランガムの代わりにセラミックファイバーマットを用
いると良好な結果が得られる。例えば、支持体をセラミ
ックファイバーマットとすると、発芽・発根率は５０〜
６０％となったが、寒天を固形化剤として用いると発芽
・発根率は３６％程度であり、また、ゲルライトを固形
化剤とすると、ゲルライトがトチバニンジンの不定胚の
分泌する物質により分解されるため、固形化剤として用
いることができなかった。

【００３４】上記条件で培養することにより、不定胚の
５０〜６０％がシュートと根を同時に生じ、再生幼植物
体を得ることができる。

【００３５】比較のため、ジベレリン酸を１ｐｐｍおよ
び１−ナフタレン酢酸を１ｐｐｍ含む１／２ＭＳ培地に
さらにベンジルアデニンを０．０２ｐｐｍ〜０．２ｐｐ
ｍ添加して無菌再生幼植物体を得る実験を行なったとこ
ろ、この場合には発根が抑制され、ベンジルアデニンの
濃度が高くなるにしたがって発根率は低下することがわ
かり、実用に供さないことがわかった。

【００３６】次に、トチバニンジンの不定胚由来の無菌
再生幼植物体に毛状根病を誘発するアグロバクテリウム
・リゾゲネスを接種し、毛状根を誘導する操作を具体的
に説明する。

【００３７】この発明では、トチバニンジン不定胚由来
の無菌再生幼植物体の茎切片（約２ｃｍ）の根側を上向
きにして２重量％ショ糖のみを含む寒天培地に立てて、
根側の切断面にアグロバクテリウム・リゾゲネスを直接
接種し、２５℃、暗所で３０日間培養すると効率良く多
数の毛状根を誘導することができる。茎切片６００個よ
り３３０本の毛状根が得られた。

【００３８】ちなみに、比較のため、植物組織培養で常
用されるＭＳ培地等（例えばＭＳ培地、ＭＳ培地を１／
２，１／３，１／４，１／５および１／１０に希釈した
１／２ＭＳ，１／３ＭＳ，１／４ＭＳ，１／５ＭＳおよ
び１／１０ＭＳ培地等）栄養を十分に含んだ培地でアグ
ロバクテリウム・リゾゲネスを接種した茎切片を培養し
たが、毛状根の誘導に至らなかった。

【００３９】ショ糖２重量％のみを含む寒天培地でアグ
ロバクテリウム・リゾゲネスを接種した茎切片を培養す
ることにより毛状根の誘導が最も効率良く行え、さら
に、ショ糖が１〜３重量％の範囲内であると毛状根の誘
導が効率よく行なえて実用的であることがわかった。

【００４０】比較のため、例えばショ糖を添加しない素
寒天培地（水と寒天のみからなる）でアグロバクテリウ
ム・リゾゲネスを接種した茎切片を培養する試験をした
が、毛状根の誘導には至らなかった。

【００４１】次に、誘導された毛状根を１本ずつ切り出
し、公知の方法によって除菌後、毛状根を１本ずつ植物
ホルモンを含まない培地、例えばショ糖５重量％を含む
ガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ） Ｂ５液体培地の入った
試験管に移植し、６０日間培養する。旺盛に増殖を示す
毛状根クローンを選抜し、同じ培地で３０日おきに継代
培養する。

【００４２】培地はＢ５培地以外でも良く、植物組織培
養で常用されるＭＳ培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培
地、シェンク−ヒルデブラント（Ｓｃｈｅｎｋ−Ｈｉｌ
ｄｅｂｒａｎｔ（ＳＨ））培地、ニッチ−ニッチ（Ｎｉ
ｔｓｃｈ−Ｎｉｔｓｃｈ（ＮＮ））培地、グレショフ−
デイ（Ｇｒｅｓｈｏｆｆ−Ｄａｙ（ＧＤ））培地、カオ
−ミカイルク（Ｋａｏ−Ｍｉｃｈａｙｌｕｋ（ＫＭ））
培地等があげられる。

【００４３】次に、トチバニンジン毛状根の増殖に適し
た培地組成を決定するため、９種類の基本培地、ＭＳ培
地、２０分の１のＮＨ₄ ＮＯ₃ を含むＭＳ培地、ホワイ
ト培地、ＳＨ培地、ガンボーグＢ５培地、ウッディ−プ
ラント（Ｗｏｏｄｙ ｐｌａｎｔ）培地（本木植物用培
地とも言う。）、ＧＤ培地、ＮＮ培地、、ＫＭ培地に３
重量％のショ糖を加えた液体培地４０ｍｌに毛状根０．
０５ｇを移植し、２５℃、９５ｒｐｍで６０日間往復振
盪培養する。そして、６０日間培養後、毛状根の重さを
測定し、トチバニンジン毛状根の培養に適した培地組成
を決定する。尚、培地は液状でも固形状でも良い。

【００４４】毛状根クローンはそれぞれ増殖速度および
物質の生産能等の性質を異にするので、増殖能およびチ
クセツサポニン生産能に優れた毛状根クローンを選抜す
るため以下の操作を行う。トチバニンジン毛状根の増殖
に適した液体培地に得られた毛状根クローンを移植し、
２５℃、暗所、９５ｒｐｍで３０日間往復振盪培養し、
増殖能力にすぐれた毛状根を決定する。さらに、増殖し
た毛状根から公知の方法によりチクセツサポニンを抽出
し、チクセツサポニンの生産能に最も優れた毛状根を決
定する。

【００４５】この場合、抽出は従来と同様に、次のよう
にして行なうのが良い。増殖した毛状根を水洗し、濾紙
で水分を除いた後、細かく切断した毛状根に７０体積％
メタノールを加えて加熱抽出した。抽出した液を濾過し
た後、濾液を濃縮乾固する。濃縮乾固したものに蒸留水
を加え、溶解する。これにエーテルを加え、振盪後、エ
ーテル層を除く。次に、水層にｎ−ブタノールを加え、
振盪後、水層を除き、ｎ−ブタノール層を濃縮乾固す
る。濃縮乾固したものにメタノールを加え、溶解する
と、チクセツサポニンが得られる。

【００４６】毛状根から抽出したチクセツサポニンが原
植物に含まれるチクセツサポニンと同一のものであるか
否かの証明は薄層クロマトグフィーにより、次のように
して行った。毛状根および原植物の根茎より、抽出した
抽出液をキーゼルゲル６０Ｆ₂₅₄ 薄層プレート（メルク
社製）に添加し、展開液クロロホルム：メタノール：蒸
留水の体積比を６０：４０：１０として行った。サポニ
ンの検出は１０重量％硫酸を噴霧し、１０５℃で１０分
間加熱することにより行った。

【００４７】チクセツサポニンの定量は、チクセツサポ
ニンのなかで比較的多量に含まれるチクセツサポニンＶ
を高速液体クロマトグラフィーによって、次のようにし
て定量することによった。ポンプは日立社製日立Ｌ−６
２００、カラムはＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＡＭ−３０４−７
Ｓ−７ １２０Ａ ＯＤＳ（４．６×３００mm）、溶
出液はアセトニトリル：蒸留水の体積比を３０：７０と
して行った。検出はＵＶ２０５nm、流速１．５ml／min
の条件で分析し、定量した。

【００４８】チクセツサポニンＶの構造決定は、原植物
のトチバニンジン根茎および毛状根から常法によりチク
セツサポニンを抽出し、単離したものを¹³Ｃ−ＮＭＲ
（ブレッカー社製）によって行った。

【００４９】尚、上述した培養で、培養条件として暗所
を用いているが、明所で培養を行なうと茎切片が褐変枯
死するのが早くなるので、この褐変枯死を遅らせるため
に暗所で培養する。また、培養条件として最適温度を２
５℃またはその付近の温度としているが、この温度に限
定されるものではなく、２０℃〜３０℃の温度範囲であ
るならば、２５℃の場合よりも毛状根の成育が劣り、そ
の収量は減るかもしれないが実用上何ら差し支えないと
予想される。また、２０℃より低かったり或いは３０℃
より高くなると、毛状根の成育が劣り実用性に欠けてく
る。

【００５０】

【実施例】以下に実施例を示し、この発明を詳細に説明
する。

【００５１】実施例１ （カルスの誘導および増殖） トチバニンジンは、北海
道江別市の野幌原始林に自生しているものを採取した。
流水で良く洗った根茎を７０体積％エタノールに６０秒
間浸漬し、滅菌水で１度洗った後、０．１重量％トウィ
ーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含む１０重量％サラシ粉溶液
に２０分間浸漬して滅菌し、滅菌水で３度洗浄した。

【００５２】次に、滅菌したコルクボーラー（外径３ｍ
ｍ）で滅菌したトチバニンジン根茎を打ち抜き、ついで
滅菌したメスで２〜３ｍｍの厚さに切断し、組織片とし
た。この組織片を２，４−Ｄを１ｐｐｍ、ショ糖を２重
量％、ゲランガムを０．３重量％を含むＭＳ培地に置床
し、２５℃、暗所で６週間培養するとカルスが誘導され
た。生じたカルスを同じ条件で４週毎に継代培養し、カ
ルスを増殖させた。

【００５３】（不定胚の誘導および不定胚の成熟） カ
ルスを２，４−Ｄ ０．１ｐｐｍ、ショ糖２重量％、ゲ
ランガム０．３重量％を含むＭＳ培地で２５℃、暗所で
４週毎に４回培養を繰返すと、不定胚が生じた。

【００５４】この不定胚を１−ナフタリン酢酸２ｐｐ
ｍ、ベンジルアデニン５ｐｐｍ、ショ糖２重量％を含む
ＭＳ培地で２５℃、１６時間２，０００ルックスの照明
で、４〜６週間培養して成熟させた。培地は寒天を含ま
ず、支持体としてセラミックファイバーマットを使用し
た。

【００５５】（無菌再生幼植物体の形成） 成熟した不
定胚を１−ナフタリン酢酸１ｐｐｍ、ジベレリン酸１ｐ
ｐｍ、ショ糖２重量％を含む無機塩濃度が２分の１のＭ
Ｓ培地で、２５℃、１６時間２，０００ルックスの照明
下で６週間培養するとシュートと根が形成され、トチバ
ニンジンの無菌再生幼植物体を得ることができた。培地
は寒天を含まず、支持体としてセラミックファイバーマ
ットを用いた。

【００５６】（毛状根の誘導） アグロバクテリウム・
リゾゲネス（ＡＴＣＣ １５８３４）をＹＥＢ培地（肉
エキス５ｇ／ｌ、バクト酵母エキス１ｇ／ｌ、バクトペ
プトン１ｇ／ｌ、ショ糖５ｇ／ｌ、１Ｍ硫酸マグネシウ
ム２ｍｌ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ，但し、ｇ／ｌはグラム
／リットルを表わし、また、ｍｌ／ｌはミリリットル／
リットル表わしている。）で、２５℃、２４時間斜面培
養後、寒天を含まない上記ＹＥＢ培地で、２５℃、２４
時間往復振盪培養した。増殖した菌をトチバニンジンの
無菌再生幼植物体の茎切片（長さ約２ｃｍ）の根側に接
種した。

【００５７】そして、接種面を上方にして茎切片をショ
糖２重量％のみを含む寒天培地に立てて、２５℃、暗所
で３０日間培養すると菌の接種部位に毛状根が誘導され
た。６００個の茎切片の菌接種側から３３０本の毛状根
が得られた。

【００５８】誘導された毛状根を１本ずつ約１ｃｍの長
さに切り出し、７０体積％エタノールと２重量％サラシ
粉溶液で殺菌した。

【００５９】殺菌した毛状根クローンをショ糖５重量％
を含むガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５液体培地２ｍ
ｌの入った試験管に移植し、２５℃で６０日間往復振盪
培養した。そして、旺盛な増殖が認められたクローンを
選抜した。１１クローンが得られた。

【００６０】選抜した毛状根クローンをショ糖５重量％
を含むガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５液体培地２０
０ｍｌの入った５００ｍｌの三角フラスコに０．２ｇ移
植し、２５℃、暗所、９５ｒｐｍ往復振盪培養を行い、
３０日毎に継代培養した。

【００６１】（毛状根の増殖とチクセツサポニンの生
産） 毛状根クローンの増殖条件を検討した結果を表１
に示す。表１は、毛状根クローン試料番号 NO.８の増殖
に対する培地の影響を示し、各培地で６０日間培養して
増殖させた場合の毛状根クローンの収量（重さ：ｇ）と
増殖率とを示す。

【００６２】ここで使用した培地は植物ホルモンを含ま
ない９種類の培地である。そして、毛状根クローン試料
番号 NO.８を０．０５ｇだけ、培地が４０ｍｌ入った１
００ｍｌの三角フラスコに移植し、２５℃、暗所、９５
ｒｐｍで６０日間往復振盪培養した。

【００６３】９種類の基本培地のうちＢ５培地およびＮ
Ｈ₄ ＮＯ₃ を２０分の１にしたＭＳ培地が良好で、６０
日間の培養で、それぞれ６５．２倍、６０．８倍となっ
た。ＷＰ、ＧＤおよびＮＮ培地では生育が劣り、それぞ
れ３．４、６．０、６．４倍の増殖しか示さなかった。

【００６４】次に、各毛状根クローン（ NO.８， NO.４
２， NO.４５， NO.５１， NO.７２， NO.１０１， NO.
１０７， NO.１２１， NO.３０１， NO.３１０および原
植物）の増殖（収量（重さ：ｇ）と増殖率）とチクセツ
サポニン生産能（含量（ｍｇ／ｇ）と生産量（ｍｇ））
を培養３０日後について比較した。その結果を表２に示
す。

【００６５】この場合、各毛状根クローン０．０５ｇを
ショ糖５重量％を含むＢ５培地が４０ｍｌ入った１００
ｍｌの三角フラスコに移植し、２５℃、暗所、９５ｒｐ
ｍで往復振盪培養した。増殖した毛状根を水洗し、濾紙
で水分を除いた後、細かく切断した毛状根０．２ｇに７
０体積％メタノールを２０ｍｌ加え、７０℃で３０分間
加熱抽出した。濾過後、濾液を濃縮乾固した。これに蒸
留水１０ｍｌとエチルエーテル１８ｍｌを加えて溶解
し、エーテル層を除き、水層にｎ−ブタノールを１８ｍ
ｌ加えた。

【００６６】次に、水層を除き、ｎ−ブタノール層を濃
縮乾固した。これにメタノール０．２ｍｌを加えて溶解
し、チクセツサポニンの定性および定量に供した。

【００６７】毛状根が生産するサポニンと原植物の根茎
に含まれるサポニン成分とが同一であるか否かの検討を
薄層クロマトグラフィーにより行った。キーゼルゲル６
０Ｆ₂₅₄ 薄層クロマトプレート（メルク社製）に抽出液
１０μｌを添加し、展開液クロロホルム：メタノール：
蒸留水の体積比を６０：４０：１０として行った。サポ
ニンの検出は、１０重量％硫酸を噴霧し、１０５℃で１
０分間加熱した。その結果、すべての毛状根クローンが
原植物トチバニンジンの根茎に含まれるサポニン、すな
わちチクセツサポニンＩＩＩ、ＩＶ、Ｖなどを生産する
ことが判明した。

【００６８】チクセツサポニンの定量は、トチバニンジ
ン根茎に含まれるチクセツサポニンのうち比較的大量に
含まれるチクセツサポニンＶを指標として、高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行った。

【００６９】ＨＰＬＣは、ポンプ：日立Ｌ−６２００、
カラム：ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＡＭ−３０４−７ Ｓ−７
１２０Ａ ＯＤＳ（４．６×３００mm）、溶出液：ア
セトニトリル／蒸留水（３０／７０）、検出：ＵＶ２０
５nm、流速：１．５ml／minの条件で分析した。表２に
示すように毛状根クローンによって増殖能およびチクセ
ツサポニンＶの生産能に相違が認められた。増殖速度が
最大のクローン（ NO.４２）では、３０日間の培養で７
６．６倍に増殖した。これ以外に２０倍以上の増殖を示
したものは４クローンあった（ NO.８、 NO.５１、 NO.
７８、 NO.１０１）。

【００７０】毛状根クローンによってチクセツサポニン
の含量に相違が認められた。多いものでは毛状根１ｇ
（湿重量）当り１．８８ｍｇであった（ NO.１０７）。
毛状根クローンの増殖能とチクセツサポニンの生産能に
は相関関係が認められなかった。

【００７１】毛状根クローンを３０日毎に同じ条件で継
代培養し、増殖能およびチクセツサポニンの生産能を検
討したが、今回、選抜した毛状根クローンは継代培養に
よってその性質が変化せず、各毛状根クローンは固有の
性質を保持していた。

【００７２】

【発明の効果】この発明によれば、トチバニンジンの無
菌再生幼植物体の茎切片にアグロバクテリウム・リゾゲ
ネスを接種することにより、効率良く毛状根を誘導する
ことができる。

【００７３】また、この発明によれば、この発明の方法
で培養された毛状根の中から増殖能およびチクセツサポ
ニン生産能に優れた毛状根クローンを選抜することがで
き、血栓症予防、抗ストレス性潰瘍作用を有する医薬品
の原料として重要なチクセツサポニンを季節、天候など
の自然条件に左右されずに安定して大量に供給すること
ができる。

【００７４】また、毛状根はカルスなどと異なり継代培
養によって変異が起きにくく、増殖能およびチクセツサ
ポニン生産能に優れた毛状根を１度選抜すると長期間繰
返し同一の毛状根クローンを利用できる利点がある。

【００７５】

【表１】

【００７６】但し、ＭＳ：ムラシゲ−スクーグ培地、１
／２０ＭＳ：ＮＨ₄ ＮＯ₃ を２０分の１量としたムラシ
ゲ−スクーグ培地、Ｗ：ホワイト培地、ＳＨ：シェンク
−ヒルデブラント培地、Ｂ５：ガンボーグＢ５培地、Ｗ
Ｐ：本木植物用培地、ＧＤ：グレショフ−デイ培地、Ｎ
Ｎ：ニッチ−ニッチ培地、ＫＭ：カオ−ミカイルク培
地。

【００７７】

【表２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 本郷 裕明 北海道恵庭市恵み野北３丁目１番１ 恵庭 リサーチ・ビジネスパーク株式会社内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 トチバニンジン毛状根を培養するに当
   り、トチバニンジンの無菌再生幼植物体の茎切片にアグ
   ロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
   ｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を接種してトチバニンジ
   ン毛状根を誘導することを特徴とするトチバニンジン毛
   状根の培養方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のトチバニンジン毛状根
   の培養方法において、前記無菌再生幼植物体の形成は、 トチバニンジン根茎よりカルスを誘導し、該カルスから
   不定胚を誘導し、該不定胚を無菌的に発芽・発根させる
   ことにより行なうことを特徴とするトチバニンジン毛状
   根の培養方法。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のトチバニンジン毛状根
   の培養方法において、前記接種は、前記茎切片の根側の
   切断面に対して行なうことを特徴とするトチバニンジン
   毛状根の培養方法。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のトチバニンジン毛状根
   の培養方法において、前記茎切片を根側を上向きにして
   ショ糖のみを含む寒天培地に立て、前記茎切片の根側の
   切断面にアグロバクテリウム・リゾゲネスを接種し、そ
   の後２５℃の温度でかつ暗所で培養することを特徴とす
   るトチバニンジン毛状根の培養方法。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のトチバニンジン毛状根
   の培養方法において、前記寒天培地は、１〜３重量％の
   ショ糖を含むことを特徴とするトチバニンジン毛状根の
   培養方法。
6. 【請求項６】 請求項２に記載のトチバニンジン毛状根
   の培養方法において、前記不定胚を無菌的に発芽・発根
   させるために用いる培地を、ジベレリン酸を１ｐｐｍ添
   加しおよび１−ナフタレン酢酸を０．１〜１ｐｐｍ添加
   した、無機塩濃度が２分の１のムラシゲ−スクーグ（Ｍ
   ｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ）培地（単に１／２ＭＳ
   培地とも言う。）としたことを特徴とするトチバニンジ
   ン毛状根の培養方法。
7. 【請求項７】 請求項６に記載のトチバニンジン毛状根
   の培養方法において、前記ＭＳ培地に用いる支持体をセ
   ラミックファイバーマットとしたことを特徴とするトチ
   バニンジン毛状根の培養方法。
8. 【請求項８】 請求項１に記載のトチバニンジン毛状根
   の培養方法により誘導されたチクセツニンジンの毛状根
   クローンを選抜して継代培養し、継代培養されたチクセ
   ツニンジンの毛状根からチクセツサポニンを抽出するこ
   とを特徴とするチクセツサポニンの生産方法。