CN106801014A - 一种提高丹参产量及其有效成分含量的内生真菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体是一种丹参内生真菌，是从唇形科鼠尾草属植物丹参植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，分类命名为球毛壳菌D68(Chaetomium globosum)，保藏编号为CGMCC No.12622。本发明还进一步公开了丹参内生真菌在提高宿主丹参生物量及丹参酮类和酚酸类成分含量的用途。本发明所述的丹参内生真菌，通过和丹参植株共培养能够有效地提高丹参根生物量，且对植株的冠幅、株高以及单个叶面积均有显著提高，还可有效促进丹参中丹参酮类和酚酸类有效成分的生物合成，具有较大的应用价值。

Description

一种提高丹参产量及其有效成分含量的内生真菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体地说，是一种提高丹参产量及其有效成分含量的内生真菌及其应用。
背景技术
丹参Salvia miltiorrhiza Bge.是唇形科鼠尾草属植物，其干燥根及根茎同名入药。始载于《神农本草经》，列为上品，是我国常用传统中药，味苦，性微寒，归心、肝经，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦等功效。丹参是我国临床应用最广泛、最重要的中药品种之一。丹参的活性成分主要分为两大类：水溶性成分——酚酸类化合物，包括原儿茶醛、丹参素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸等；脂溶性成分——丹参酮类化合物，包括丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、ⅡB、隐丹参酮Ⅰ、羟基丹参酮、丹参羟基酯、二氢丹参酮Ⅰ等。上述两类成分是丹参发挥药理如扩血管、活血化瘀、改善微循环、抗肿瘤的主要药效物质基础。
虽然丹参资源区域广阔，且已进行大量的人工栽培；但是其分布不集中，资源更新周期长，且人工栽培技术要求高，药材质量参差各异。随着丹参酮类和丹酚酸类化学成分众多药理活性的发现，其市场需求增大，通过直接采收丹参天然和人工资源将不能满足市场需求。另一方面，丹参酮类和丹酚酸类成分的化学合成困难，难以实现产业化。研究者们试图通过生物技术方法获得丹参酮类和丹酚酸类有效成分，因此，近年来这已成为人们关注的课题。
中国专利文献CN102676392A公开了一种丹参内生真菌及其应用，是从丹参植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为木霉Trichodermaatroviride，保藏号为CGMCC No.4712，通过其液体发酵，产生了丹参酮化合物丹参酮I和丹参酮II A。中国专利文献CN104830717A公开了具有诱导丹酚酸B积累作用的丹参内生真菌，为Pseudomonas psychrotolerans LG4，其保藏号为：CCTCC NO:M2015085，可促进丹参毛状根中酚酸类物质(丹酚酸B)含量的积累。中国专利文献CN103992961A公开了一株提高丹参产量及酚酸类成分含量的真菌，它是保藏编号为CGMCC No.6627的拟青霉(Paecilomycessp.)，栽培丹参时在每株丹参幼苗根部分别施予固体培养的菌材0.5-1.5g，经与丹参幼苗共生栽培4-6月，能提高收获期时丹参的产量和丹参总酚酸及丹酚酸B的含量。
可见，从丹参中寻找到新的内生真菌，特别是能够提高宿主丹参生物量和有效成分含量的内生真菌，一直是本领域技术人员不懈的追求。目前尚未见文献报道从丹参中分离到可以同时提高丹参酮类和丹酚酸类成分的内生真菌，也未见报道可以提高丹参植株生物量和有效成分含量的球毛壳菌。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的丹参内生真菌，并且提供其用途，即能够提高丹参植株生物量及丹参酮类与酚酸类有效成分的含量。
本发明的第一方面，提供一种丹参内生真菌，命名为球毛壳D68(Chaetomiumglobosum)。
所述的丹参内生真菌是从唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为球毛壳D68(Chaetomium globosum)。该菌株已保藏，保藏号为CGMCC No.12622，保藏日期为2016年6月16日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
本发明所述的丹参内生真菌显微特征为：
菌落直径55mm，质地絮状，浅灰色，铺展，后期形成大量橄榄褐色子囊壳；菌落背面褐色，无水溶性色素。子囊壳浅到深褐色，球形或椭球形，可达200～550μm；附属丝具分隔，不分枝，顶端弯曲或稍弯曲，壁粗糙，基部浅到深褐色，顶端橄榄褐色，宽2.3～4.0μm；子囊早期消解；子囊孢子宽柠檬形、近球形，褐色，壁略粗糙，6.5～11.4×6.1～8.0μm。未见无性态产孢结构。
本发明所述的丹参内生真菌的rRNA基因序列测定结果，包括18S rRNA片段，ITS1、5.8S rRNA、ITS2的全序列及28S区序列片断如SEQ ID NO.1所示。将测序结果(SEQ IDNO.1)于NCBI网站进行序列比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，同球毛壳菌(Chaetomium globosum)的相似性为100％。
本发明的第二方面，提供上述的丹参内生真菌在提高丹参植株生物量中的应用。
本发明的第三方面，提供了一种提高丹参植株生物量的方法，是将本发明所述的丹参内生真菌与丹参植株的共培养。
本发明的第四方面，提供上述的丹参内生真菌在提高丹参中丹参酮类和丹酚酸类含量中的应用。
本发明的第五方面，提供一种提高丹参中丹参酮类和丹酚酸类含量的方法，所述的方法是将上述的丹参内生真菌与丹参植株共培养。
所述的共培养，是在丹参培苗根部接触基质的地方均匀撒20g固体菌种，用灭菌的盆栽土基质将丹参组培苗根部埋好，用无菌水将植株浇透。将花盆移入温室，前1周用保鲜膜拱膜保湿，7天后移去。
所用的培养基包括：
A)内生真菌活化培养基：PDA土豆固体培养基(土豆200g，葡萄糖20g，每1L去离子水)；
B)丹参培苗培养基：MS培养基，pH 5.8；
C)内生真菌固体菌种培养基：麦麸250g，棉籽壳250g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4.7H2O 1.5g，每1L去离子水；
D)内生真菌与丹参共培养盆栽土基质为珍珠棉：腐殖土：蛭石＝1：3：l的混合栽培基质。
栽培器具：塑料花盆(盆口直径10cm，盆底直径7cm，盆高9cm)。
温室培养温度：25℃±1℃；
每日光照：16h；
光照度：2000Ix。
所述的共培养具体包括以下步骤：
(A)取本发明的丹参内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基试管，于28℃活化培养72小时；
(B)在丹参培苗根部接触基质的地方均匀撒20g固体菌种，用灭菌的盆栽土基质将丹参组培苗根部埋好，用无菌水将植株浇透；将花盆移入温室，前1周用保鲜膜拱膜保湿，7天后移去；所述的丹参内生真菌与丹参共培养盆栽土基质为珍珠棉：腐殖土：蛭石＝1：3：l的混合栽培基质。
所述的共培养后，可采用回流提取及固液分离等方法从丹参植株根中分离提纯得到丹参酮类和酚酸类有效成分。
所述的丹参酮类和酚酸类有效成分包括：丹参酮I，隐丹参酮，二氢丹参酮I，丹参酮IIA，迷迭香酸，丹酚酸B。
其中，丹参酮I，英文名：Tanshinone I，分子式：C18H12O3，CAS：568-73-0，化学结构式如下：
隐丹参酮，别称：隐丹参醌，英文名：Cryptotanshinone，分子式：C19H20O3，CAS：35825-57-1，化学结构式如下：
二氢丹参酮I，英文名：Dihydrotanshinone I，分子式：C18H14O3，CAS：87205-99-0，化学结构式如下：
丹参酮IIA，英文名：Tanshinone IIA，分子式：C19H18O3，CAS：568-72-9，化学结构式如下：
迷迭香酸，英文名：Rosmarinic acid，分子式：C18H16O8，CAS：20283-92-5，化学结构式如下：
丹酚酸B，英文名：Salvianolic acid B，分子式：C36H30O16，CAS：115939-25-8，化学结构式如下：
本发明优点在于：
本发明所述的丹参内生真菌，通过和丹参植株共培养能够有效地提高丹参根生物量，且对植株的冠幅、株高以及单个叶面积均有显著提高，还可有效促进丹参中丹参酮类和酚酸类有效成分的生物合成，具有较大的应用价值。
生物材料样品的保藏信息：
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2016年6月16日
保藏编号：CGMCC NO.12622
分类命名：球毛壳D68(Chaetomium globosum)
附图说明
图1.本发明所述丹参内生真菌在PDA平板培养基上的形态图。
图2.本发明所述丹参内生真菌子囊壳(A)和子囊孢子(B)在PDA平板培养基中的显微图。
图3.本发明所述丹参内生真菌菌丝作用于丹参植株60天后丹参植株生物量(A)、叶子数、冠幅、株高以及单个叶面积(B)、丹参酮类的含量(C)、丹酚酸类的含量(D)以及丹参酮类成分总量(E)和丹酚酸类成分总量(F)(Control为对照组，其余为处理组，D68为本发明所述内生真菌)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：丹参内生真菌的分离纯化
本发明的丹参内生真菌为从山西芮城丹参叶中得到的菌株。
本发明的丹参内生真菌按以下步骤分离获得：自来水冲洗30min去净泥沙后，用去离子水洗3次。将叶片按以下程序进行表面消毒：75％乙醇，30s→1.3M次氯酸钠(3-5％有效氯)，1min→75％乙醇，30s→无菌去离子水洗3次。滤纸吸干残留水份后，用灭过菌的手术刀将叶片剪成1cm×1cm大小的组织块，置于含有100mg/L青霉素的PDA(土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂，15g/L)培养基上28℃培养。每天观察样品真菌生长的情况。5-7天后有菌丝长出，挑取菌丝尖端转移到新的PDA培养基上纯化培养，并按形态合并，最终得到本发明的丹参内生真菌菌株。其分类命名为球毛壳D68(Chaetomium globosum)，保藏编号为CGMCCNo.12622。
如图1所示，本发明所述的丹参内生真菌在PDA培养基上菌落生长快，25℃黑暗条件下7天菌落直径55mm，质地絮状，浅灰色，铺展，后期形成大量橄榄褐色子囊壳；菌落背面褐色，无水溶性色素。
如图2A，2B所示，本发明所述的丹参内生真菌显微特征为：子囊壳浅到深褐色，球形或椭球形，可达200～550μm；附属丝具分隔，不分枝，顶端弯曲或稍弯曲，壁粗糙，基部浅到深褐色，顶端橄榄褐色，宽2.3～4.0μm；子囊早期消解；子囊孢子宽柠檬形、近球形，褐色，壁略粗糙，6.5～11.4×6.1～8.0μm。未见无性态产孢结构。
实施例2：丹参无菌苗的培养
本发明的丹参种子购于陕西商洛天士力丹参种植基地。
本发明的丹参无菌苗按以下步骤培养：将丹参种子用40-50℃热水浸泡2h 后，用无菌纱布抹掉种子表面的黏粘物；然后采用常规消毒法进行消毒处理：75％乙醇30s，2％NaClO3min，75％乙醇30s，无菌水冲洗10次，最后接种至MS培养基上25℃、16h光照/8h黑暗培养，待种子萌发转移至新的MS培养基上培养获得无菌苗。
实施例3：丹参植株根中丹参酮类和丹酚酸类有效成分含量的测定
制备丹参植株实生根收获时，洗掉丹参根上的土，蒸馏水洗3次后滤纸吸干残留水分。50℃烘干至恒重后，按以下方法测定成分的丹参酮类和丹酚酸类有效成分含量。
采用高效液相色谱法(HPLC)分析丹参酮类和丹酚酸类有效成分的含量，主要定量检测迷迭香酸、丹酚酸B、丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮I的含量。具体步骤如下：
丹参根HPLC进样样品的制备：精密称量烘干至恒重的丹参根，记录干重后研成粉末。精密称取毛状根粉末0.5g，加入250ml乙醇超声提取60分钟，旋转蒸发浓缩至10ml。所得提取溶液过0.45um微孔滤膜即得HPLC进样样品溶液。HPLC色谱分析条件：色谱柱：AgilentZORBAX SB-C18柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.05％甲酸水(B)，梯度洗脱(0～20min，A相由20％增加至40％；20～21min，A相由40％增加至80％；21～40min，A相由80％增加至90％；40～45min，A相由90％降至20％)；流速：0.8ml/min；检测波长：280nm；柱温：30℃；进样量：10μl。
标准曲线的确定：
(1)迷迭香酸：精密称取标准品迷迭香酸8mg于2ml容量瓶中，加甲醇定容刻度线，摇匀得浓度为4mg/ml的母液，以母液为基础，配制l mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml和0.125mg/ml浓度梯度的标准品溶液，进行HPLC分析，绘制标准曲线。
(2)丹酚酸B：精密称取标准品丹酚酸B 8mg于5ml容量瓶中，加甲醇定容刻度线，摇匀得浓度为1.6mg/ml的母液，以母液为基础，配制0.4mg/ml，0.2mg/ml，0.1mg/ml和0.05mg/ml浓度梯度的标准品溶液，进行HPLC分析，绘制标准曲线。
(3)隐丹参酮：精密称取标准品隐丹参酮5mg于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀得浓度为0.5mg/ml的母液，以母液为基础，配制0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.025mg/ml，0.005mg/ml和0.001mg/ml浓度梯度的标准品溶液，进行HPLC分析，绘制标准曲线。
(4)二氢丹参酮I：精密称取标准品二氢丹参酮I 5mg于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀得浓度为0.5mg/ml的母液，以母液为基础，配制0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.025mg/ml，0.005mg/ml，0.001mg/ml和0.0002mg/ml浓度梯度的标准品溶液，进行HPLC分析，绘制标准曲线。
(5)丹参酮I：精密称取标准品丹参酮I 1.5mg于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀得浓度为0.15mg/ml的母液，以母液为基础，配制0.0375mg/ml，0.015mg/ml，0.0075mg/ml，0.00375mg/ml和0.0015mg/ml浓度梯度的标准品溶液，进行HPLC分析，绘制标准曲线。
(6)丹参酮IIA：精密称取标准品丹参酮IIA 4mg于100ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀得浓度为0.04mg/ml的母液，以母液为基础，配制0.016mg/ml，0.008mg/ml，0.004mg/ml，0.002mg/ml和0.001mg/ml浓度梯度的标准品溶液，进行HPLC分析，绘制标准曲线。
丹参根样品中丹参酮类和丹酚酸类的有效成分含量测定：取上述制备的样品溶液10ul进样，按上述HPLC色谱条件进行丹参有效成分的分析，根据回归方程进行定量计算。
表1.六种丹参有效成分的线性回归方程
化合物 标准曲线 相关系数r2 n
迷迭香酸 Y＝7101.7X–87.58 1 15.625～4000.00 7
丹酚酸B Y＝4583.1X+16.597 0.9999 5.00～1600.00 7
二氢丹参酮Ⅰ Y＝25322X–37.858 0.9993 0.20～500.00 7
丹参酮Ⅰ Y＝34512X+23.085 0.9994 1.50～150.00 6
隐丹参酮 Y＝22632X–53.429 0.9962 1.00～500.00 6
丹参酮ⅡA Y＝33493X–13.901 0.9994 1.00～40.00 6
本发明所述的六种丹参有效成分含量测定的线性回归方程及线性范围如表1所示。测量结果显示(图3C和D)，与本发明所述的丹参内生真菌共培养的丹参植株中丹参酮类和丹酚酸类有效成分含量与对照组相比有显著提高。其中，二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹酚酸B分别为对照组的3.30倍，1.66倍，1.82倍和2.33倍。
实施例4：丹参内生真菌对丹参植株根生物量及有效成分生物合成的影响
将本发明所述的丹参植株和球毛壳D68进行共培养，包括以下步骤：
(A)取本发明的丹参内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基试管，于28℃活化培养72小时；
(B)丹参内生真菌与丹参植株培养方法为共培养，在丹参组培苗根部接触基质的地方均匀撒20g固体菌种，对照组撒20g不加菌的固体菌种培养基。用灭菌的盆栽土基质将丹参组培苗根部埋好，用无菌水将植株浇透。将花盆移入温室，前1周用保鲜膜拱膜保湿，7天后移去。内生真菌与丹参共培养盆栽土基质为珍珠棉：腐殖土：蛭石＝1：3：l的混合栽培基质。
栽培器具：塑料花盆(盆口直径10cm，盆底直径7cm，盆高9cm)。
培养室温度：25℃±1℃
每日光照：16h
光照度：2000Ix。
(C)将丹参内生真菌与丹参植株共培养60天的丹参植株收获，测量叶子数目、冠幅、株高以及单个叶面积。取丹参根称量鲜重，干燥至恒重后称量干重；
最后用回流提取及固液分离等方法从丹参植株根中分离提纯得到丹参酮类和酚酸类有效成分，测量干燥根样品中的迷迭香酸、丹酚酸B、丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮I的含量。
从图3A和B中数据可以看出，丹参内生真菌D68能够有效地提高丹参根生物量，植株湿重和干重分别是对照组的3.74倍和5.20倍。且对植株的冠幅、株高以及单个叶面积均有显著提高。结合实施例3中所述结果，丹参内生真菌D68(图3E和F)对丹参植株中两类有效成分的总量(含量乘以干重)影响更为显著，二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮ⅡA、迷迭香酸、丹酚酸B分别为对照组的14.78倍，8.32倍，9.04倍，6.36倍，6.82倍和11.89倍，提示D68可有效促进丹参中有效成分的生物合成。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军第二军医大学
<120> 一种提高丹参产量及其有效成分含量的内生真菌及其应用
<130> /
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 518
<212> DNA
<213> 球毛壳菌Chaetomium globosum
<400> 1
aaaggtggtt taacggccgg aacccgcggc gcgaccagag cgagatgtat gctactacgc 60
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Claims (10)

1.一种丹参内生真菌，其特征在于，所述的丹参内生真菌的分类命名为球毛壳菌D68(Chaetomium globosum)，保藏编号为CGMCC No.12622。
2.一种如权利要求1所述的丹参内生真菌在提高丹参植株生物量中的应用。
3.一种提高丹参植株生物量的方法，其特征在于，所述的提高丹参植株生物量的方法是将权利要求1所述的丹参内生真菌与丹参植株共培养。
4.一种如权利要求1所述的丹参内生真菌在提高丹参中丹参酮类和丹酚酸类含量中的应用。
5.一种提高丹参中丹参酮类和丹酚酸类含量的方法，其特征在于，所述的提高丹参中丹参酮类和丹酚酸类含量的方法是将权利要求1所述的丹参内生真菌与丹参植株共培养。
6.根据权利要求5所述的提高丹参中丹参酮类和丹酚酸类含量的方法，其特征在于，所述的丹参酮类和酚酸类有效成分包括：丹参酮I，隐丹参酮，二氢丹参酮I，丹参酮IIA，迷迭香酸，丹酚酸B。
7.根据权利要求5所述的提高丹参中丹参酮类和丹酚酸类含量的方法，其特征在于，所述的共培养是在丹参培苗根部接触基质的地方均匀撒20g所述的丹参内生真菌固体菌种，用灭菌的盆栽土基质将丹参组培苗根部埋好，用无菌水将植株浇透；将花盆移入温室，前1周用保鲜膜拱膜保湿，7天后移去。
8.根据权利要求7所述的提高丹参中丹参酮类和丹酚酸类含量的方法，其特征在于，所述的丹参内生真菌的固体菌种培养基：麦麸250g，棉籽壳250g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4.7H2O 1.5g，每1L去离子水。
9.根据权利要求7所述的提高丹参中丹参酮类和丹酚酸类含量的方法，其特征在于，所述的内生真菌与丹参共培养盆栽土基质为珍珠棉：腐殖土：蛭石为1：3：l的混合栽培基质。
10.根据权利要求7所述的提高丹参中丹参酮类和丹酚酸类含量的方法，其特征在于，所述的温室培养温度：25℃±1℃，每日光照：16h，光照度：2000Ix。
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