CN112779168B - 无梗囊霉菌株jx2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及无梗囊霉菌株JX2及其应用。本发明公开了保藏编号为CGMCC NO.21464的菌株Acaulospora sattaca JX2，该菌株能有效促进柑橘砧木的生长，柑橘植株在接种了该菌株后，茎粗比对照组提高了18.28％；株高比对照组提高了53.76％；叶片数增加了15.23％；根系活力增加了1081.67％；可见该菌株对柑橘根系有良好的侵染作用；是一株对柑橘具有良好促生效果的AM真菌菌株；该菌株的发现和筛选能有效丰富AM真菌的种质资源，同时该菌株的应用还能有效促进植株对土壤养分的吸收，减少化肥用量，可用于加工生物肥。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别涉及无梗囊霉菌株JX2及其应用。
【背景技术】
丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhizal，AM)是由球囊菌门(Glomeromycota)真菌与植物根系形成的互惠共生体，约80％以上的维管植物都能形成丛枝菌根，是自然界中最普遍的一种菌根类型。AM真菌与植物根系共生后，可以活化土壤中的无机营养元素，从而能够促进宿主植物对土壤矿质元素(如N、P、K、Zn等)，特别是磷的吸收和利用，改善宿主植物的营养状况；促进水分代谢，增强植物抗旱性，从而促进植物生长，提高作物产量和品质。研究发现，AM真菌与植物根系形成的共生体能促进植株对营养和水分的吸收，进而促进植物的生长，提高植物的抗逆性。AM真菌可调节次生代谢物的合成，改善植物根际微环境，对土传病害有一定的抑制效应。但是在申请人的研究中发现，并非所有的AM真菌都能实现对植物的促生长，同样的也不一定具有抑制病虫害的功效，这与菌株对不同植物根部的不同侵染作用和菌株本身的特性有关，虽然同是对植物具有侵染效果的AM真菌，由于菌株不同，有的菌株能促进植物生长，而有的菌株却抑制植物生长，且同一菌株对不同植物的生长促进或抑制作用是不一样的，但是，自然界中存在的AM真菌仍然有部分菌株能起到良好的促生效果，为此，有必要加强对此类微生物的利用，坚持不懈的在此领域不断开展菌株鉴定和筛选工作，筛选出更多具有促生效果的菌株，也有助于提高植物抗逆性，改善土壤生态，提高土壤肥料的利用率。
申请人团队一直致力于AM菌株的筛选和研发，例如申请号为202010719127.4发明名称为《一株黄雷德克囊霉FS-1-106及其应用》的丛枝菌根真菌，该真菌由申请人从广西崇左市扶绥县的柑橘根际土壤分离而得，属于Redeckera属fulvum种，具有促进柑橘砧木生长的作用；但是该菌株与本申请不同种属，是两株完全不同的菌株；因此为了对AM真菌进行研究有必要不断开展菌株鉴定和筛选，丰富种质资源，鉴定出更多的具有良好农艺效益的菌株，使更多的菌株能应用到生物肥料领域。
【发明内容】
鉴于上述内容，筛选出更多对植物具有良好促生作用的AM真菌是目前能使用生物菌肥来减少化学肥料用量的最佳手段，本发明目的在于提供一种AM菌株，该菌株为Acaulospora sattaca JX2其具有促进柑橘砧木生长的作用。
为达到上述目的，本发明筛选出一株丛枝菌根真菌菌株Acaulospora sattacaJX2，其保藏编号为CGMCC NO.21464。属于真菌界，Acaulospora属，sattaca种。所述丛枝菌根真菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年1月27日。
本申请的菌株从江西赣州市安远县柑橘根际土壤中获得。
本发明还包括所述无梗囊霉菌株Acaulospora sattaca JX2在促进柑橘砧木生长上的应用。
进一步的，所述柑橘砧木为资阳香橙。
包含所述无梗囊霉菌株Acaulospora sattaca JX2的菌剂。
进一步的，所述菌剂制备时采用玉米或三叶草为宿主
本发明还包括一种应用所述无梗囊霉菌株Acaulospora sattaca JX2促进柑橘生长的方法，所述方法为：将菌株JX2接种到玉米或三叶草宿主中制备得到JX2菌剂，然后将JX2菌剂直接接种到播种柑橘砧木种子的种苗繁育基质中。
本发明的另一应用所述无梗囊霉菌株Acaulospora sattaca JX2促进柑橘生长的方法为：将柑橘种苗直接移栽至带有JX2菌剂的栽培基质中。
本发明具有以下有益效果：
本申请的新菌株Acaulospora sattaca JX2能够有效促进柑橘砧木的生长，柑橘植株在接种了该菌株后，茎粗比对照组提高了18.28％；株高比对照组提高了53.76％；叶片数增加了15.23％；根系活力增加了1081.67％；可见该菌株对柑橘根系有良好的侵染作用；是一株对柑橘具有良好促生效果的AM真菌菌株；该菌株的发现和筛选能有效丰富AM真菌的种质资源，同时该菌株的应用还能有效促进植株对土壤养分的吸收，减少化肥用量，可用于加工生物肥。
【附图说明】
图1为本发明JX2菌株的形态特征显微镜拍摄图；图中，a为暗视野拍摄，b为明场拍摄；
图2为本发明JX2菌株的系统发育树图；
图3为本发明JX2菌株对柑橘砧木根系侵染检测图片；其中a、b、c图为接种JX2菌株的柑橘砧木资阳香橙根系，d图为空白对照(CK)种植的柑橘砧木资阳香橙根系；
图4为本发明JX2菌株侵染柑橘砧木资阳香橙根系的侵染率结果图；
图5为本发明JX2菌株对柑橘砧木的促生作用的情况图，其中，AM为接种JX2菌株的柑橘砧木资阳香橙，CK为空白对照种植的柑橘砧木资阳香橙；
图6为本发明JX2菌株对柑橘砧木的砧木株高作用效果图；
图7为本发明JX2菌株对柑橘砧木的砧木茎粗作用效果图；
图8为本发明JX2菌株对柑橘砧木的砧木叶片数作用效果图；
图9为本发明JX2菌株对柑橘砧木的砧木根系活力作用效果图；
图10为本发明JX2菌株对柑橘砧木的砧木生物量作用效果图；
图11为本发明JX2菌株对柑橘砧木的砧木地上鲜重、干重作用效果图；
图12为本发明JX2菌株对柑橘砧木的砧木地下鲜重、干重作用效果图。
【具体实施方式】
下面结合附图和实施例和试验对本发明作进一步说明。
实施例1：
本发明筛选出一株无梗囊霉菌株Acaulospora sattaca JX2。属于真菌界，Acaulospora属，sattaca种。所述菌株JX2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.21464，保藏日期为2021年1月27日。
对菌株JX2采用Schüβler&Walker(2010)的分类系统，并参阅Schenck&Perez(1988)的“VA菌根真菌鉴定手册和相关网站：http://invam.caf.wvu.edu(INVAM,WestVirginia University,USA)；http://www.zor.zut.edu.pl/Glomeromycota/Taxonomy.html(Department of Plant Pathology,University of Agriculture inSzczecin,Poland)及http://www.lrz.de/～schuessler/amphylo/amphylogeny.html的鉴定资料以及近几年发表新种的原始描述，进行种属的检索、鉴定。对于难确定的种或可能的新种、新记录种进一步进行单孢培养，获得大量的同源孢子，再确定种类，部分种类采用分子生物学方法辅助鉴定。
1、菌株的形态学分类
如图1所示，该图为该菌形态特征显微镜拍摄图；其中，a为暗视野拍摄图，b为明场拍摄图，从该图可见，JX2的孢子：柔嫩孢子透明无色，逐渐成熟后至浅黄色，侧生于菌丝上，玉米和三叶草纯培养中未观察到产孢子囊，孢子壁2层，L1透明，幼嫩孢子表面有碎屑，随着孢子成熟该层脱落；L2浅黄色，层状壁，厚3.2-4.0μm,发芽壁两层(GW1,GW2),GW1透明，韧性壁，厚约0.8-1.3μm；GW2韧性壁，两层，L1表面有颗粒状物，厚约1.0μm，L2膜状壁，PVLG中膨胀厚约1.5-3.0μm，在Melzer’试剂中染成深紫红色。脱落痕：8-15μm，乳酸酚棉蓝中染成湖蓝色。内含物：油滴状，无色透明。
2、分子生物学鉴定
该菌株的序列如序列表SEQ ID NO:1所示，通过基因库比对构建JX2的分子系统发育树，该发育树如图2所示，可见其与Acaulospora属具有高度相似性，与Acaulospora属sattaca种的亲缘关系最近。
实施例2：
对柑橘砧木的促生长作用：
一、制备JX2菌剂：
具体操作步骤如下：
(1)以玉米或三叶草为宿主，将经过分离、纯化和繁殖获得的JX2孢子接种于玉米或三叶草幼苗根系，种植于经121℃高压蒸汽下灭菌2h的培养基质中，培养基质为河沙：沸石＝3:1体积比混合所得培养基质，按照1株玉米或20株三叶草根系接种50～100个JX2孢子的量接种，每盆(206mm×175mm×150mm)种植3～5株玉米或20-30株三叶草；光照培养12～16周，所得玉米或三叶草根系以及培养基质中含有无梗囊霉的菌丝、孢子，培养期间每2周浇注浓度为50％的Hoagland营养液100～300mL。
(2)将步骤(1)中培养12～16周所得玉米或三叶草幼苗除去茎秆，保留玉米或三叶草根系以及培养基质中含有的无梗囊霉的菌丝、孢子，培养基质和保留的玉米或三叶草根系即为JX2菌剂。
二、种植柑橘砧木：
盆栽试验：分别在播种资阳香橙的种子时，在培养基质中加入步骤一制备得到的JX2菌剂，按照10粒资阳香橙种子接种300～500个孢子的用量分别添加JX2菌剂，然后进行常规管理，即得。
设置A、B两组：
A组为接种JX2菌剂的柑橘砧木资阳香橙的菌根幼苗24株，每盆(147mm×125mm×105mm)种植1株，各盆栽分别编号为AM1-AM24号并按编号挂上标签。
B组为对照组，用灭菌基质代替JX2菌剂，其他操作一样，并在盆栽上标注为CK1-1至CK1-24号。
上述A、B两组盆栽中每2周浇注浓度为50％Hoagland营养液100mL，移栽120d生长后统计每个处理的茎粗、株高、叶片数、根系活力、干鲜重和生物量；同时检测根系侵染(数据结果如图3-12所示)。
如图3所示，图3为本发明JX2菌株对柑橘砧木根系侵染检测图片；其中a、b、c、图为接种JX2菌株的柑橘砧木资阳香橙根系，d图为空白对照(CK)种植的柑橘砧木资阳香橙根系；可见a-c图中JX2菌株侵染资阳香橙根系的根内菌丝、泡囊、丛枝结构，而d图并未发现JX2菌株侵染；
图4为本发明JX2菌株侵染柑橘砧木资阳香橙根系的侵染率结果图，从图中可见，JX2对资阳香橙砧木根系有很高的侵染率，其中侵染率达到100％，侵染强度为95％,相对侵染强度为：95％；丛枝丰度为：44％；丛枝相对丰度为：41.8％。
从图3-图4可见，菌株JX2对资阳香橙砧木根系的侵染率很高，能很好的和资阳香橙砧木共生。
图5为本发明JX2菌株对柑橘砧木的促生作用的情况图，其中，AM为接种JX2菌株的柑橘砧木资阳香橙，CK为空白对照种植的柑橘砧木资阳香橙，图中明显可见，AM组的柑橘砧木资阳香橙长势明显优于CK对照组，由此说明菌株JX2对柑橘砧木资阳香橙具有良好的促生作用。
图6为本发明JX2菌株对柑橘砧木的砧木株高作用效果图，可见AM组的平均株高达到了70.42cm，CK组的平均株高为45.80cm；AM组较CK组株高提高了53.76％。
图7为本发明JX2菌株对柑橘砧木的砧木茎粗作用效果图，可见AM组的平均茎粗达到了5.76mm，CK组的平均茎粗为4.87mm；AM组较CK组茎粗提高了18.28％。
图8为本发明JX2菌株对柑橘砧木的砧木叶片数作用效果图，可见AM组的平均叶片数达到了39.04张，CK组的平均叶片数达到了33.88张；AM组较CK组叶片数提高了15.23％。
图9为本发明JX2菌株对柑橘砧木的砧木根系活力作用效果图，可见AM组的平均还原强度为7.09，CK组的平均还原强度为0.60；AM组较CK组根系活力提高了1081.67％，是CK组根系活力的10倍。
图10为本发明JX2菌株对柑橘砧木的砧木生物量作用效果图，可见AM组的平均生物量达到了13.85g，CK组的平均生物量达到了6.08g；AM组较CK组生物量提高了89.80％。
图11为本发明JX2菌株对柑橘砧木的砧木地上鲜重、干重作用效果图，可见AM组的地上平均鲜重达到了17.74g、地上平均干重达到了8.44g；CK组的平均地上鲜重达到了9.47g、平均地上干重达到了3.85g；AM组较CK组的地上鲜重提高了87.33％、地上干重提高了119.22％。
图12为本发明JX2菌株对柑橘砧木的砧木地下鲜重、干重作用效果图，可见AM组的地下平均鲜重达到了14.58g、地下平均干重达到了5.41g；CK组的平均地下鲜重达到了8.51g、平均地下干重达到了2.23g；AM组较CK组的地上鲜重提高了71.33％、地下干重提高了142.60％。综上所述，本申请的菌株JX2属于Acaulospora属sattaca种，其对植物有良好的促生效果，特别是对柑橘砧木资阳香橙具有良好的促生作用，是一株具有良好促生功能的丛枝菌根真菌。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院
厦门大学
浙江养生堂天然药物研究所有限公司
<120> 无梗囊霉菌株JX2及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 444
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggtttatt ttacctaggc taatatgtgc aagagaccga tagcgaacaa gtaccgtgag 60
ggaaagatga aaagaacttt gaaaagagag ttaaatagta cgtgaaattg ttgaaaggga 120
aacgattaaa gtcagtcatg ttggtaggga atcaacttga tagtatgcgg gtttactcgt 180
gtcctttctg gtgcacttcc ttacttgcag gttagcatca atttcggtta tcatataaaa 240
attgagggaa ggtgactttt cttcggaaaa gtgttataga cctcgataaa tgtggtgact 300
gggattgagg attgcagcgg ataccctttg ggctagtcac ctggcttctg atggttgccc 360
cgtcttcgat agcttgctaa cgttggtggg actcgattat ctagatgttg gattgatcat 420
aaattcgtta aggatgttga cgta 444
Claims (6)
1.无梗囊霉（Acaulospora sattaca）菌株JX2，其保藏编号为CGMCC NO.21464。
2.如权利要求1所述无梗囊霉（Acaulospora sattaca）菌株JX2在促进柑橘砧木生长上的应用；所述柑橘砧木为资阳香橙。
3.包含如权利要求1所述无梗囊霉（Acaulospora sattaca）菌株JX2的菌剂。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂制备时采用玉米或三叶草为宿主。
5.一种应用如权利要求1所述无梗囊霉（Acaulospora sattaca）菌株JX2促进柑橘生长的方法，其特征在于，所述方法为：将菌株JX2接种到玉米或三叶草宿主中制备得到JX2菌剂，然后将JX2菌剂直接接种到播种了柑橘砧木种子的种苗繁育基质中，用于繁育柑橘菌根种苗；所述柑橘为资阳香橙。
6.一种应用如权利要求1所述无梗囊霉（Acaulospora sattaca）菌株JX2促进柑橘生长的方法，其特征在于，所述方法为：将柑橘种苗直接移栽至带有JX2菌剂的栽培基质中；所述柑橘为资阳香橙。
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-
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