CN113388530B - 一株明根孢囊霉jx11-14及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株明根孢囊霉JX11‑14，其分类命名为明根孢囊霉(Rhizophgus clarus)JX11‑14，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2020年04月13日，保藏号：CGMCC No.19623。本发明从江西省赣州市安远县柑橘根际土壤中分离的明根孢囊霉JX11‑14，制成菌剂后对柑橘砧木资阳香橙和枳壳的生长有很好的促进作用，提高了柑橘砧木的适应力、增强了定殖力，能促进柑橘砧木资阳香橙和枳壳对土壤中养分特别是磷的吸收，减少化肥的施用量，改善土壤生态环境。

Description

一株明根孢囊霉JX11-14及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株明根孢囊霉JX11-14及其应用。

背景技术

丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhizal，AM)是由球囊霉菌门(Glomeromycota)真菌与植物根系形成的互惠共生体，约90％以上的维管植物都能形成丛枝菌根，是自然界中最普遍的一种菌根类型。AM真菌与植物根系共生后，能够促进宿主植物对土壤矿质元素(如N、P、K、Zn等)，特别是磷的吸收和利用，改善宿主植物的营养状况；促进水分代谢，增强植物抗旱性，从而促进植物生长，提高作物产量和品质。

AM真菌在改善作物根际土壤环境中发挥重要作用，AM真菌在植物根际形成的庞大菌丝网络系统，能够增加宿主植物的根系表面积，提高根系的生长环境和吸收能力，提高作物的抗逆性。它能固定土壤中的营养物质及水分，稳定土壤的团粒结构，改善连作土壤的物化性状。AM真菌分泌土壤酶，如磷酸酶、脲酶等，并提高其活性，间接平衡连作土壤的营养元素、pH及菌群结构，促进因连作生产导致富集的土壤中有机污染物的降解和转化。AM真菌对大多数连作常见的土传病虫害均有抑制作用，可显著抑制病原菌的繁殖和侵染，有效降低连作病虫害的危害。

因此，AM菌剂在稳定土壤结构、控制水土流失、增强对土传病害的抑制、改善根际生态位的养分组成和微生物群落结构等方面发挥关键作用，能达到使作物增产，提高其经济效益的目的。尤其AM真菌的土壤修复功能，在生态农业中发挥重要作用。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一株明根孢囊霉JX11-14及其在柑橘砧木-资阳香橙和枳壳的菌根种苗生产中的应用，能有效的促进柑橘砧木资阳香橙和枳壳对土壤中养分的吸收，促进柑橘砧木资阳香橙和枳壳的生长。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一株明根孢囊霉JX11-14，从江西省赣州市安远县柑橘根际土壤中分离所得，明根孢囊霉JX11-14是丛枝菌根真菌球囊霉属中的一个类型；明根孢囊霉JX11-14命名为明根孢囊霉(Rhizophgus clarus)JX11-14，核苷酸序列表如SEQ ID NO:1所示，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2020年04月13日，保藏号：CGMCC No.19623。

一种如上所述明根孢囊霉JX11-14在柑橘砧木的菌根种苗生产中的应用，所述明根孢囊霉JX11-14对柑橘砧木生长有明显促进作用。

优选的是，所述的明根孢囊霉JX11-14制成菌剂后在柑橘砧木菌根种苗生产中应用。

优选的是，所述明根孢囊霉JX11-14菌剂在柑橘砧木菌根种苗生产中应用为：在柑橘砧木种子播种时，加入明根孢囊霉JX11-14菌剂，按照10粒柑橘砧木的种子接种100～300个孢子的用量添加明根孢囊霉JX11-14菌剂，即得。

优选的是，所述的柑橘砧木为资阳香橙或枳壳。

优选的是，所述明根孢囊霉JX11-14菌剂的制备方法，包含以下操作步骤：

(1)将明根孢囊霉JX11-14的孢子接种于玉米幼苗根系，种植于河沙沸石培养基质中，光照培养12～16周，所得玉米根系以及培养基质中就含有明根孢囊霉的菌丝、孢子，即得明根孢囊霉菌丝及孢子；

(2)将步骤(1)中培养12～16周所得玉米植株除去茎秆，保留玉米根系以及培养基质中含有的明根孢囊霉的菌丝、孢子，培养基质和保留的玉米根系即为明根孢囊霉JX11-14菌剂。

优选的是，步骤(1)每株玉米根系接种10～30个明根孢囊霉JX11-14的孢子，每盆(盆的规格206mm×175mm×150mm)种植3～5株玉米，培养期间每2周浇注浓度为100％的Hoagland营养液100～300mL。

优选的是，步骤(1)中所述的培养基质为河沙和沸石成3:1体积比混合所得，所述的培养基质预先在121℃高压蒸汽下灭菌2h。

优选的是，步骤(2)中所得明根孢囊霉JX11-14菌剂中孢子量为60～100个孢子/g。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明从江西省赣州安远县柑橘根际土壤中分离出明根孢囊霉JX11-14，制成菌剂后，所得菌剂对柑橘砧木资阳香橙和枳壳的生长有很好的促进作用，提高了柑橘砧木的适应力、增强了定殖力，能促进柑橘砧木资阳香橙和枳壳对土壤中养分特别是磷的吸收，减少化肥的施用量，改善土壤生态环境，适合用于柑橘砧木资阳香橙和枳壳菌根种苗生产的理想微生物菌剂。

保藏信息说明

明根孢囊霉(Rhizophgus clarus)JX11-14于2020年04月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19623。

附图说明

图1是本发明明根孢囊霉JX11-14的菌株形态特征显微镜拍摄图；其中，a为暗视野拍摄，b为明场拍摄。

图2是本发明明根孢囊霉JX11-14对柑橘砧木的促生作用，其中，AM1为接种明根孢囊霉JX11-14种植的柑橘砧木资阳香橙，AM2为接种明根孢囊霉JX11-14种植的柑橘砧木枳壳，CK1和CK2为空白对照种植的柑橘砧木资阳香橙和枳壳。

图3是明根孢囊霉JX11-14对柑橘砧木根系侵染检测图片，其中a、b、c、d图为接种明根孢囊霉JX11-14种植的柑橘砧木枳壳根系，e图为空白对照种植的柑橘砧木枳壳根系，f、g图为接种明根孢囊霉JX11-14种植的柑橘砧木资阳香橙根系，h为空白对照种植的柑橘砧木资阳香橙根系。

图4是本发明明根孢囊霉JX11-14侵染柑橘砧木的侵染率。

图5是本发明明根孢囊霉JX11-14对柑橘砧木的促生作用各具体数据，其中，a、b、c、d图为资阳香橙促生数据，e、f、g、h图为枳壳促生数据。

图6为明根孢囊霉JX11-14分子系统发育树图。

具体实施方式

下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、实际若无特殊说明，皆为市售所得。实施例中柑橘砧木菌根种苗生产采用盆栽实验，但是实际生产柑橘砧木中，并不仅限于本发明实施例采用的方式。

实施例1

一株明根孢囊霉JX11-14的筛选过程如下：

(1)取原始土样10～20g作为培养物放入食品搅拌机杯中，加入600ml去离子水高速离心3～5s(原始土样中菌株含量不多时，为了避免提取不到菌株，先富集：从江西省赣州市安远县采集柑橘根际土壤500克(原始土样)，与灭菌河沙(直径：0.5mm～2mm)1：1混合后播种玉米3～5粒/盆，温室光照培养4个月，所得玉米根系以及培养基质即为富集土样，将富集土样替代原始土样放入食品搅拌机杯中提取)；

(2)将步骤(1)中高速离心所得物质倒出，依次通过3个土壤标准筛叠起来的筛子(孔径为上层为0.8mm的土壤标准筛，中间为0.25mm的土壤标准筛，下层为0.0385mm的土壤标准筛)，大部分砂砾余留在食品搅拌机杯中，用流水冲洗每层筛子，直至流出的水是清水；

(3)下层的筛子里的残余物用流水清洗直至流出的为清水，将残余物用水冲洗聚集到一处，用净化水冲洗残余物悬浮孢子，静止1～3s，倒上清液到玻璃培养皿上，重复3～5次；

(4)将盛有孢子的玻璃培养皿在体视显微镜下观察，用移液枪挑取孢子至盛有水的表面皿上，从表面皿挑取孢子至另一个表面皿，重复2～4次，直到挑取到纯净的孢子；

(5)在体视显微镜下先观察记录孢子的颜色、大小、连孢菌丝的特征、孢子果形态等，在此基础上，用毛细吸管挑取新鲜的AM真菌孢子置于载玻片上，加浮载剂(如水、乳酸、乳酸甘油、PVLG)后，在Nikon Eclipse Ci-L显微镜下观察，记录孢子的形状、大小、颜色、表面纹饰，孢子内含物、连孢菌丝的数目、宽度及形状、孢壁结构，辅助细胞(土生泡囊)，外生菌丝及附属结构产孢子囊等特征；同时辅助使用Melzer's试剂、乳酸酚棉蓝试剂，观察孢子的特异反应，对有代表性或特异性的特征进行拍照。根据孢子的形态特征，如图1所示，采用Schüβler&Walker(2010)的分类系统，并参阅Schenck&Perez(1988)的“VA菌根真菌鉴定手册和相关网站：http://invam.caf.wvu.edu(INVAM,West Virginia University,USA)；http://www.zor.zut.edu.pl/Glomeromycota/Taxonomy.html(Department of PlantPathology,University of Agriculture in Szczecin,Poland)及http://www.lrz.de/～schuessler/amphylo/amphylogeny.html的鉴定资料以及近几年发表新种的原始描述，进行种属的检索、鉴定。对于难确定的种或可能的新种、新记录种进一步进行单孢培养，获得大量的同源孢子，再确定种类，部分种类采用分子生物学方法辅助鉴定。AM真菌孢子以Melzer's:PVLG＝1:1或PVLG为浮载剂制成玻片标本，密封、编号为JX11-14、并进行贮藏。

结果

(一)菌株形态特征

孢子：土壤中单生，球形至近球形，孢子大小(101.54)～163.41～(282.11)×(99.25)～149.41～(216.19)μm，亮黄色至红褐色；孢子壁：三层；

L1膜状壁，浅黄色有颗粒状花纹，在成熟孢子易脱落，(2.29)～8.08～(15.96)μm，棉兰试剂染成深蓝色，Melzer′s试剂染成亮黄色或是粉红色。

L2、L3都是层状壁，两层紧密相连不易分层，两层壁厚(4.40)～5.39～(7.70)μm，黄色至黄褐色，棉兰试剂不染色，Melzer′s试剂染成深黄色或黄褐色；L2厚(2.11)～3.11～(4.38)μm；L3厚(1.75)～2.94～(4.41)μm。

连孢菌丝：单根，稍成漏斗状，连点孔宽3.88～9.37μm，靠近孢子基部厚，离孢子而去逐渐减薄。

内含物无色透明，油滴状，棉兰试剂、Melzer′s试剂均不反应。

系统发育树如图6所示。

(二)鉴定结果

综合形态学和分子生物学特征将菌株鉴定为明根孢囊霉(Rhizophgus clarus)，核苷酸序列表如SEQ ID NO:1所示，命名为明根孢囊霉(Rhizophgus clarus)JX11-14。

实施例2

菌株菌剂对盆栽柑橘砧木植株生长的促进作用

一、菌株菌剂的制备

一株明根孢囊霉JX11-14菌剂的制备方法，具体操作步骤如下：

(1)以玉米为宿主，将经过分离、纯化和培养繁殖获得的单一明根孢囊霉JX11-14的孢子接种于玉米幼苗根系，种植于121℃高压蒸汽下灭菌2h的培养基质中，培养基质为河沙：沸石＝3:1体积比混合所得培养基质，按照每株玉米根系接种10～30个明根孢囊霉JX11-14的孢子的量接种，每盆(206mm×175mm×150mm)种植3～5株玉米；光照培养12～16周，所得玉米根系以及培养基质中就含有明根孢囊霉的菌丝、孢子，培养基质中出现明根孢囊霉菌丝，培养期间每2周浇注浓度为100％的Hoagland营养液100～300mL；

(2)将步骤(1)中培养12～16周所得玉米幼苗除去茎秆，保留玉米根系以及培养基质中含有的明根孢囊霉的菌丝、孢子，培养基质和保留的玉米根系即为明根孢囊霉JX11-14菌剂(菌株形态如图1所示)。

二、菌株菌剂对盆栽柑橘砧木植株生长的促进作用

明根孢囊霉JX11-14菌剂对柑橘砧木促生的应用：

盆栽试验：分别在播种资阳香橙和枳壳的种子时，在培养基质中加入明根孢囊霉JX11-14菌剂，按照10粒资阳香橙种子或10粒枳壳的种子接种100～300个孢子的用量分别添加明根孢囊霉JX11-14菌剂，常规管理，即得。

设置A、B两组：

A组为接种明根孢囊霉JX11-14菌剂的柑橘砧木资阳香橙、枳壳的菌根幼苗各15株，每盆(147mm×125mm×105mm)种植1株，各盆栽分别编号为AM1-1至AM1-15号和AM2-1至AM2-15号并按编号挂上标签。

B组为对照组，用灭菌基质代替明根孢囊霉JX11-14菌剂，其他操作一样，并在盆栽上标注为CK1-1至CK1-15号和CK2-1至CK2-15号。上述A、B两组盆栽中每2周浇注浓度为100％Hoagland营养液100mL，移栽120d生长后统计每个处理的茎粗、株高、叶片数和叶绿素含量；叶绿素含量用叶绿素SPAD值表示，利用叶绿素仪SPAD-502Plus测量所得；同时检测根系侵染(数据结果如图2、3、4、5所示)。

结果：

试验结果表明，接种明根孢囊霉JX11-14菌剂的柑橘砧木资阳香橙和枳壳的植株生长势好，植株高度比对照高，茎粗、叶片数、叶绿素SPAD值都显著高于对照。根系侵染检测表明，接种明根孢囊霉JX11-14的处理，资阳香橙和枳壳的根系有明显的菌根侵染，且结构丰富，没有接种明根孢囊霉JX11-14的对照组处理未检测到菌根侵染，见图3-4所示。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西壮族自治区农业科学院；厦门大学；浙江养生堂天然药物研究所有限公司

<120> 一株明根孢囊霉JX11-14及其应用

<130> JC

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 542

<212> DNA

<213> Rhizophgus clarus

<400> 1

aactaacggg attcagctca tagcgtatat taaagttgtt gcagttaaaa agctcgtagt 60

tgaatttcgg ggtcagtagg ttggtcgtgc caccggtacg tactggtctc actgattcct 120

ccttcctgaa gaaccgtaat gccattaatt tggtgttgcg gggaaacagg actgttactt 180

tgaaaaaatt agagtgttta aagcaagcta acgcttgaat acattagcat ggaataatga 240

aataggacga tcgatcctat tttgttggtt tctaggattg acgtaatgat taatagggat 300

agttgggggc attagtattc aattgtcaga ggtgaaattc ttggatttat tgaagactaa 360

ctactgcgaa agcatttgcc aaggatgttt tcattaatca agaacgaaag ttaggggatc 420

gaagacgatc agataccgtc gtagtcttaa ccataaacta tgccgactag ggatcggatg 480

atgttaattt tataatgact cattcggcgc cttacgggaa accaaagtgt ttgggttcaa 540

ca 542

Claims (9)

1.一株明根孢囊霉（Rhizophagus clarus）JX11-14，其特征在于，所述明根孢囊霉JX11-14命名为明根孢囊霉（Rhizophagus clarus）JX11-14，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2020年04月13日，保藏号：CGMCC No.19623。

2.一种如权利要求1所述明根孢囊霉JX11-14在柑橘砧木的菌根种苗生产中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述明根孢囊霉JX11-14制成菌剂后在柑橘砧木菌根种苗生产中应用。

4.根据权利要3所述的应用，其特征在于，所述明根孢囊霉JX11-14制成的菌剂在柑橘砧木菌根种苗生产中应用为：在柑橘砧木种子播种时，加入所述明根孢囊霉JX11-14制成的菌剂，按照10粒柑橘砧木的种子接种100~300个孢子的用量添加明根孢囊霉JX11-14制成的菌剂，即得。

5.根据权利要2-4任一所述的应用，其特征在于：所述的柑橘砧木为资阳香橙或枳壳。

6.根据权利要3或4所述的应用，其特征在于，所述菌剂的制备方法，包含以下操作步骤：

（1）将所述明根孢囊霉JX11-14的孢子接种于玉米幼苗根系，种植于培养基质中，光照培养12~16周，即得明根孢囊霉丝及孢子；

（2）将步骤（1）中培养12~16周所得玉米植株除去茎秆，保留玉米根系以及培养基质中含有的明根孢囊霉的菌丝、孢子，培养基质和保留的玉米根系即为明根孢囊霉JX11-14菌剂。

7.根据权利要6所述的应用，其特征在于：步骤（1）每株玉米根系接种10~30个明根孢囊霉JX11-14的孢子，每盆种植3~5株玉米，培养期间每2周浇注浓度为100%的Hoagland营养液100~300 mL。

8.根据权利要6所述的应用，其特征在于：步骤（1）中所述的培养基质为河沙和沸石成3:1体积比混合所得，所述的培养基质预先在121℃高压蒸汽下灭菌2h。

9.根据权利要6所述的应用，其特征在于：步骤（2）中所得明根孢囊霉JX11-14菌剂中孢子量为60~100个孢子/g。

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