CN114507626B - 一株对根结线虫有毒杀活性的枯草芽孢杆菌2jq3及其应用 - Google Patents

一株对根结线虫有毒杀活性的枯草芽孢杆菌2jq3及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株对根结线虫有毒杀活性的枯草芽孢杆菌2JQ3及其应用，属于生物农药领域。该菌株已于2021年10月12号送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.23580，分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)2JQ3。其应用是：包括利用该菌株制备成根结线虫病的生防菌剂，或制备成防治根结线虫病的可湿性粉剂、悬浮剂、水分散粒剂、颗粒剂，或是制备成具有防治根结线虫病功效的复合生物炭基功能肥料。本发明提供了一种对根结线虫幼虫具有特异性毒杀效果的枯草芽孢杆菌2JQ3；对烟草根结线虫病也具有较好的防治效果；③所分离的菌株源于自然，对环境安全友好，符合绿色农业生产技术的基本要求。

Description

一株对根结线虫有毒杀活性的枯草芽孢杆菌2JQ3及其应用
技术领域
本发明属于生物农药领域，具体涉及一株对根结线虫有毒杀活性的枯草芽孢杆菌2JQ3及其应用。
背景技术
枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，广泛分布于土壤及腐败的有机物中。枯草芽孢杆菌无荚膜，有鞭毛，能活动，芽孢位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不再膨大，为需氧型细菌。枯草芽孢杆菌在生物防治上具有很大潜力，在温度和通气等条件适宜下，幼龄细胞中大量形成芽孢。另外，枯草芽孢杆菌生长速度快，对营养要求比较低，能高效分泌许多蛋白及代谢产物，且其不会产生毒素，是一种无致病性的安全微生物，在医药卫生及食品等方面用途广泛。枯草芽孢杆菌在生长环境恶劣、营养物质缺乏等不适宜的环境下进入孢子休眠期，形成极具抗逆性、在高温、酸碱等极性环境下亦可生存的芽孢。
枯草芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，与病原菌竞争植物周围的营养，或分泌枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质抑制病原菌生长，同时也可诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防的目的。目前报道的枯草芽孢杆菌菌株对众多真菌和细菌病害具有拮抗作用，如水稻纹枯病、稻瘟病，番茄枯萎病，黄瓜枯萎病、霜霉病，茄子灰霉病和白粉病，辣椒疫病，烟草炭疽病、黑胫病、赤星病、根腐病等。
根结线虫病是制约农业可持续生产的重要瓶颈之一，防治不当极易造成严重的经济损失。根结线虫病属于典型的土传病害，病原习性隐蔽，抗逆性强，生产中极易与缺肥症状混淆而引起误判，与空气、水及种苗等传播途径的病害相比更难防治。根结线虫不仅直接危害植株，造成植株萎蔫黄化，发育迟缓甚至整株死亡，还可诱发青枯病、黑胫病、根黑腐病等其他土传病害。为有效控制根结线虫病危害，国内外在化学防治、物理防治和生物防治等方面已开展了相关研究。随着高污染、高残留、高毒性的化学杀线剂(例如涕灭威、呋喃丹等)逐渐被淘汰或限制使用，研制绿色高效的杀线剂品种则尤为重要，其中微生物农药则为根结线虫绿色防控的一个重要研究方向。
目前，利用淡紫紫孢霉菌、木霉菌、厚孢轮枝菌、解淀粉芽孢杆菌等生防菌防治根结线虫国内已有报道，但在田间具有较好防治效果的菌株资源仍相对匮乏，有关枯草芽孢杆菌在防治根结线虫方面的应用更鲜有报道。自然界中枯草芽孢杆菌菌株资源非常丰富，而且不同的菌株产生的抑菌活性物质的种类亦有差异，抑菌谱也不尽相同。对个体而言，单个菌株的抑菌特异性比较高，一般情况下某一个菌株只对某一类病原菌具有抑菌活性，因此针对特定的靶标生物筛选更多新型的、特异的高效生防菌株是生防微生物产品开发的重要工作。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的问题和不足，提供一株对根结线虫有毒杀活性的枯草芽孢杆菌2JQ3及其应用。
本发明的目的具体是：
一是针对上述根结线虫病生防菌株相对短缺的现状，以国内根结线虫优势种类南方根结线虫为防治靶标，筛选到了一株具有高效杀线虫活性的枯草芽孢杆菌2JQ3的菌株，其保藏编号为：CGMCC No.23580。
二是提供枯草芽孢杆菌2JQ3在制备成微生物生防菌剂和复合生物炭基功能肥料中的应用。
本发明的目的是这样实现的：
一、枯草芽孢杆菌2JQ3的获得
申请人从贵州省毕节地区烟草根结线虫重病田块中大量采集健康烟株的根际土壤样品，集中对杀线虫生防菌株进行筛选，对筛选出的生防菌株进行编号命名和菌种保存。以南方根结线虫为防治靶标，最终筛选到一株具有高效杀线虫活性的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株已于 2021年10月12号送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为： CGMCC No.23580，分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)2JQ3。
所述菌株2JQ3的生理生化特性和培养特性与普通的枯草芽孢杆菌相同。
二、枯草芽孢杆菌2JQ3在制备成微生物生防菌剂中的应用，包括利用该菌株制备成根结线虫病的生防菌剂，或制备成防治根结线虫病的可湿性粉剂、悬浮剂、水分散粒剂、颗粒剂，或是制备成具有防治根结线虫病功效的复合生物炭基功能肥料。
以上所述的菌株中，优选的，所述的微生物生防菌剂的有效成分为枯草芽孢杆菌2JQ3的菌悬液。
本发明具有下列优点和积极效果：
①本发明提供了一种对根结线虫幼虫具有特异性毒杀效果的枯草芽孢杆菌2JQ3，该菌株的菌悬液对根结线虫J2幼虫具有较强的毒杀活性，对盆栽番茄根结线虫病具有较好的防治效果；
②利用该菌株的固体培养基加工成的复合生物炭基功能肥料在烟田使用对烟草根结线虫病也具有较好的防治效果。
③本发明所分离的菌株源于自然，对环境安全友好。本防治技术不会使病原菌产生抗药性，也不存在药剂残留问题，符合绿色农业生产技术的基本要求。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌2JQ3菌落形态图；
图2为枯草芽孢杆菌2JQ3菌株16S rRNA序列系统发育树；
图3为不同生物炭基功能肥料对烟草根结线虫病情指数的影响；
图4为不同生物炭基功能肥料对烟草根结线虫病的防治效果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明详细说明。
一、实施例1：枯草芽孢杆菌2JQ3的分离、筛选、鉴定和保藏
1、杀线虫生防细菌的分离
申请人从贵州省毕节地区烟草根结线虫重病田块中大量采集健康烟株的根际土壤样品，采用平板划线法对根际土壤细菌菌株进行分离。细菌菌株用NA固体培养基进行分离培养。将所分离出的细菌菌株进行编号命名和菌种保存。不纯的菌株再用平板划线法分离纯化，然后保存。保存方法为：长期保存用甘油管在-80℃保存，临时保存用菌体水悬液在4℃保存。
所述NA固体培养基，其配方为：牛肉膏(Beef Extract)3g，蛋白胨(Tryptone)10g，氯化钠(NaCl)5g，琼脂粉(Agar Powder)15-20g，蒸馏水定容至1L，pH＝7.2± 0.2。
2、杀线虫生防细菌的筛选
2.1、根结线虫悬浮液的制备
供试病原线虫从毕节烟区根结线虫重病区病株根部采集获得，经过鉴定为南方根结线虫，室内采用活体黄瓜植株根系进行人工接种繁殖饲养。试验选用活力旺盛的J2龄幼虫进行活性测试。
线虫悬浮液的制备步骤为：①挖取感病黄瓜的根结，用清水或凉开水轻轻漂洗净根上的泥沙，在显微镜下用挑针或镊子挑取未孵化的卵囊；②将卵囊放入玻璃培养皿(直径约5.5cm)上，加入5mL清水，在22-24℃避光条件下放置孵化2-3天后，用巴氏管吸取线虫悬浮液；③镜检线虫液，如线虫死虫率高于5％，则将线虫液用贝曼漏斗法分离12h，去除死亡线虫。如线虫浓度低于100头/mL，则用4000转离心5min，弃去适量上清液。如线虫浓度大于200头/mL，则补填适量清水，使供试线虫浓度在100-200头/mL。
2.2、生测细菌菌悬液的制备
将在培养基上活化的各菌株接入盛有NB培养基的试管中，置于28℃-30℃下180r/min 振荡培养24h后，取菌液离心后去上清，用无菌水重悬，用分光光度计调节OD值为1.0，菌悬液浓度为1×108cfu/mL。
所述NB培养基，其配方为牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH＝7.2±0.2。
2.3、杀线虫活性筛选方法
将上述各细菌菌株用NB培养基培养后，用无菌水稀释定容，使菌悬液浓度分别为1× 108cfu/mL和1×107cfu/mL，然后分别取3mL稀释液与3mL上述线虫液充分混匀(即细菌测试浓度为0.5×108cfu/mL、0.5×107cfu/mL)，加入到48孔细胞培养皿内，每孔1.5mL，共加 4孔(即4次重复)，以无菌水为对照。加盖后，置于24℃避光条件下静置处理，24h后调查线虫死亡数。调查方法：每孔(重复)调查0.6mL，分6次计数，每次吸取0.1mL/次，置于载玻片上计数，调查死亡和活线虫数。每处理调查总虫数120-240头。
校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(100-对照死亡率)×100
线虫的死亡判定标准：在显微镜下进行线虫观察时，线虫活动或呈“S”形，卷曲形可判断为活虫，线虫僵直不动或呈“J”型判断为失活死亡，难以判断时用挑针轻轻触碰虫体，如虫体无任何反应则判定为死亡。
表1菌株2JQ3对南方根结线虫的毒杀活性(24h)
测试结果表明，菌株2JQ3的杀线活性优异(表1)，用0.5×108cfu/mL和0.5×107cfu/mL处理24h后，线虫的校正死亡率分别达95.74％和87.69％。
通过初步筛选，获得了杀线虫活性较高的菌株2JQ3，并将菌株2JQ3进行保存，保存方法为：长期保存用甘油管在-80℃保存，临时保存用菌体水悬液在4℃保存。
3、菌株2JQ3的鉴定和保藏
将2JQ3菌株在NA固体培养基上划线培养后，对2JQ3菌株菌落进行外部形态鉴定，观察表明，单菌落为圆形，暗白色，不透明，边缘不整齐，表面粗糙有褶皱(图1)。在NA培养基上，35-37℃培养18-24h后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动；经革兰氏染色呈紫色，为阳性。为了进一步对菌株进行鉴定，本发明对菌株2JQ3的16S rRNA的基因序列进行测序，通过在NCBI进行BLAST分析，结果显示菌株2JQ3属于枯草芽孢杆菌(图2)，该菌株已于 2021年10月12号送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为： CGMCCNo.23580，分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)2JQ3。
所述NA固体培养基，其配方为：牛肉膏(Beef Extract)3g，蛋白胨(Tryptone)10g，氯化钠(NaCl)5g，琼脂粉(Agar Powder)15-20g，蒸馏水定容至1L，pH＝7.2±0.2。
二、实施例2：枯草芽孢杆菌2JQ3对南方根结线虫J2的毒杀活性测定
1、根结线虫悬浮液的制备
按实施例1中的方法，制备南方根结线虫悬浮液。
2、枯草芽孢杆菌2JQ3菌悬液的制备
按实施例1中的方法，将枯草芽孢杆菌2JQ3菌悬液用无菌水进一步稀释成4×106cfu/mL、2×106cfu/mL、1×106cfu/mL三种浓度。
3、枯草芽孢杆菌2JQ3对南方根结线虫的毒杀活性
按实施例1中的方法，测试枯草芽孢杆菌2JQ3菌悬液不同浓度对南方根结线虫J2幼虫的毒杀效果。
表2不同处理浓度枯草芽孢杆菌2JQ3对南方根结线虫的毒杀活性
将枯草芽孢杆菌2JQ3悬浮液配制成4×106cfu/mL、2×106cfu/mL、1×106cfu/mL三种浓度梯度，分别处理南方根结线虫J2幼虫24h、48h、72h后，调查幼虫的死亡率，计算校正死亡率。当以4×106cfu/mL较高浓度处理24h后，南方根结线虫的校正死亡率为83.67％，随着处理时间的延长死亡率逐渐增加，当处理72h后南方根结线虫的校正死亡率高于90％。当以1 ×106cfu/mL较低浓度处理24h后，南方根结线虫的校正死亡率仅为33.92％，随着处理时间的延长死亡率逐渐增加，处理72h后南方根结线虫的校正死亡率高于70％。
三、实施例3：枯草芽孢杆菌2JQ3菌悬液对番茄根结线虫病的盆栽防治效果
1、枯草芽孢杆菌2JQ3菌悬液的制备
将实施例1中的枯草芽孢杆菌2JQ3菌悬液用无菌水配制成0.5×108cfu/mL和0.5× 107cfu/mL两种浓度，用于番茄移栽时灌根处理。
2、盆栽防治试验方法
番茄移栽时灌根处理：施药前将洁净的营养土与根结线虫染病土以2:1(w/w)充分混合均匀，装入直径为15cm，高为20cm的塑料花盆中，每盆装入病土混样2Kg。待健康的番茄幼苗长出第三片真叶后移栽到上述预先处理好的花盆中。移栽覆土前每盆灌入上述稀释液40毫升，设3个重复，每重复20盆。对照灌入40毫升洁净清水。放于塑料大棚内，统一水肥管理。
60d后轻轻拔出番茄根部，根据根部根结情况定级发病轻重，统计对根结线虫病的盆栽防治效果。按照Barker(1985)的方法对根结进行分级，分级标准如下：
0级：根系健康完整，未出现根结；1级：略微出现少量根结，且根结较小；2级：在侧根出现清晰可见的小根结，主根正常；3级：在侧根出现较大根结，主根正常；4级：侧根根结较多，主根正常；5级：主根开始出现零星根结；6级：部分主根出现明显根结；7级：绝大多数主根均出现根结；8级：所有的主根均出现根结；9级：所有根系均出现根结；10 级：所有根系均出现严重根结，受侵染严重。
根据以上的分级标准计算病情指数和防治效果，计算公式分别为：
病情指数＝∑(各病级植株数×该级数值)/(调查总株数×最重病级数值)×100
防治效果(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100
3、枯草芽孢杆菌2JQ3菌悬液对番茄根结线虫病的盆栽防治效果
表3枯草芽孢杆菌2JQ3菌悬液对番茄根结线虫病的盆栽防治效果
从表3可知，番茄定植60d后，经过枯草芽孢杆菌2JQ3菌悬液处理的番茄根系根结数量均比对照减轻，枯草芽孢杆菌2JQ3以0.5×108cfu/mL和0.5×107cfu/mL处理后根结线虫病情指数分别为8.50和14.00，防治效果分别为65.77％和43.62％，其中枯草芽孢杆菌2JQ3以 0.5×108cfu/mL处理后的盆栽防效明显高于0.5×107cfu/mL处理。
四、实施例4：复合生物炭基功能肥料对烟草根结线虫病的田间防治效果
1、枯草芽孢杆菌2JQ3的固体发酵培养
将实施例1中的枯草芽孢杆菌2JQ3用固体发酵培养基进行繁殖，使培养基中菌株2JQ3 的浓度为100×108cfu/g。
枯草芽孢杆菌2JQ3固体培养基配方为：麸皮50％，玉米淀粉20％，黄豆粉29.87％，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.03％，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1％，料水比为1:0.7(w/w)，功能菌的种子液添加量为3.0％(v/w)。
2、复合生物炭基功能肥料的制备
称取上述发酵后的固体培养基108g，与1Kg腐熟后的有机肥充分混匀。然后将混有枯草芽孢杆菌2JQ3的有机肥与26.43Kg有机肥混匀，再加入4.86Kg生物炭混合均匀。最后配制成总重为32.4kg的复合生物炭基功能肥料。
此外，以含氟吡菌酰胺的生物炭基肥为化学农药对照，以不含任何杀线成分的纯生物炭基肥为空白对照。化学农药对照配方为：41.7％氟吡菌酰胺悬浮剂259g，生物炭4.60Kg，有机肥27.54Kg，其他为水，混合后总重为32.4Kg。空白对照配方为：生物炭4.86Kg，有机肥 27.54Kg，混合后总重为32.4Kg。
上述有机肥含水量为28％，发酵原料主要为菌渣。生物炭含水量为25％，pH为8.0-8.5，生产原料为烟杆及烟梗废弃物。
3、田间试验设计
在贵州省黔西县仁和乡进行烟草根结线虫病田间防治应用试验。采用随机区组设计，根据局部控制的原则，将试验地按肥力、光照及地形坡度程度先划分为等于重复次数的区组，同一区组内各重复小区之间完全随机排列。试验设3次重复，每重复60株。株距0.55m×行距1.1m。肥料在移栽前穴施，每穴施60g,并与土壤充分拌匀。采用当地推广品种云烟87，各处理组除施肥外，其它田间管理措施按当地优质烟常规栽培技术进行。试验区严禁使用任何其他防治根结线虫病的农药。
4、调查方法
在烟草成熟期调查根结线虫病的防治效果。参考GB/T 23222-2008标准进行为害分级调查。成熟期拨根调查分级标准：0级，根部正常，无可见根结；1级，1/4以下根有少量根结；3级，1/4～1/3根有根结；5级，1/3～1/2根有根结；7级，1/2以上根有根结，少量次生根上产生根结；9级，所有根上(包括次生根)长满根结。
根据以上的分级标准计算病情指数和防治效果，计算公式分别为：
病情指数＝∑(各病级植株数×该级数值)/(调查总株数×最重病级数值)×100
防治效果(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100
5、试验效果
如图3-4，试验情况：三种类型的生物炭基肥按60g/株施用量处理后，在烟草采烤期调查，分析对烟草根结线虫病的防治效果。结果表明，用枯草芽孢杆菌2JQ3和氟吡菌酰胺两种生物炭基功能肥料处理的烟株根结线虫病情指数均明显低于空白对照处理。含有枯草芽孢杆菌2JQ3的生物炭基功能肥料处理烟株后，地下部根系根结数量明显少于对照，其防治效果为 51.2％。含有氟吡菌酰胺的生物炭基功能肥料烟株处理后，地下部根系根结数量也明显少于对照，其防治效果为55.2％。枯草芽孢杆菌2JQ3和氟吡菌酰胺两种处理的生物炭基功能肥料在烟草根结线虫病防效方面没有显著差异。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (2)

1.一株对根结线虫有毒杀活性的枯草芽孢杆菌2JQ3，其特征在于：
于2021年10月12号送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.23580，分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)2JQ3。
2.按权利要求1所述的一株对根结线虫有毒杀活性的枯草芽孢杆菌2JQ3的应用，其特征在于：
包括利用该菌株制备成根结线虫病的生防菌剂，或制备成防治根结线虫病的可湿性粉剂、悬浮剂、颗粒剂，或是制备成具有防治根结线虫病功效的复合生物炭基功能肥料。
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