CN111849785B - 一株细凹无梗囊霉gz-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物菌剂技术领域，具体公开了一株细凹无梗囊霉GZ‑1及其应用。本发明提供了一株保藏编号为CGMCC No.19905的细凹无梗囊霉(Acaulospora scrobiculata)GZ‑1，同时还提供了一种包括该细凹无梗囊霉(Acaulospora scrobiculata)GZ‑1的菌剂，该菌剂可以有效抑制柑橘黄龙病菌，显著增强宿主植物对柑橘黄龙病菌的抗病能力和耐病能力。

Description

一株细凹无梗囊霉GZ-1及其应用

【技术领域】

本发明涉及微生物菌剂技术领域，特别涉及一株细凹无梗囊霉GZ-1及其应用。

【背景技术】

丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhizal，AM)是由球囊霉(Glomeromycota)真菌与植物根系形成的互惠共生体，约90％以上的维管植物都能形成丛枝菌根，是自然界中最普遍的一种菌根类型。AM真菌与植物根系共生后，可以活化土壤中的无机营养元素，从而能够促进宿主植物对土壤矿质元素(如N、P、K、Zn等)，特别是磷的吸收和利用，改善宿主植物的营养状况，促进植物生长，提高作物产量和品质。

AM真菌在改善作物根际土壤环境中发挥重要作用。AM真菌在植物根际形成的庞大菌丝网络系统，能够增加宿主植物的根系表面积，提高根系的生长环境和吸收能力，提高作物的抗逆性。它能固定土壤中的营养物质及水分，稳定土壤的团粒结构，改善连作土壤的物化性状。AM真菌分泌土壤酶，如磷酸酶、脲酶等，并提高其活性，间接平衡连作土壤的营养元素、pH及菌群结构,促进因连作生产导致富集的土壤中有机污染物的降解和转化。AM真菌通过与植物根系形成的共生体能提高植株抗逆性，可显著抑制病原菌的繁殖和侵染，有效降低病虫害的危害。因此，AM菌剂在稳定土壤结构、控制水土流失、增强对病害的抑制、改善根际生态位的养分组成和微生物群落结构等方面发挥关键作用，在生态农业中发挥重要作用。

而目前，尚未见到利用单一AM真菌对柑橘黄龙病菌进行有效抑制的相关记载。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要提供一株细凹无梗囊霉(Acaulospora scrobiculata)GZ-1及其在抑制柑橘黄龙病菌中的应用，其能有效抑制柑橘黄龙病菌，提升长春花对柑橘黄龙病菌的抗病和耐病能力，从而为防治柑橘黄龙病提供理论依据，利于后续柑橘黄龙病防治新途径的探索。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一株细凹无梗囊霉(Acaulospora scrobiculata)GZ-1，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年5月25日，保藏编号为CGMCC No.19905。

一种如上所述细凹无梗囊霉GZ-1在防治柑橘黄龙病中的应用。

一种包括如上所述细凹无梗囊霉GZ-1的菌剂。

进一步的，所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将细凹无梗囊霉GZ-1的孢子接种于玉米幼苗根系，然后种植于河沙沸石培养基质中，光照培养12-16周，得细凹无梗囊霉菌丝及孢子；

(2)将上述培养所得玉米植株除去茎秆，保留根系，培养基质中所得菌丝、孢子、培养基质和保留的玉米根系即为所述菌剂。

更进一步的，步骤(1)中，所述河沙沸石培养基质中河沙和沸石的体积比为3:1，且所述河沙沸石培养基质在使用前经过灭菌处理，所述灭菌处理为在121℃高压蒸汽下灭菌1h。

更进一步的，步骤(1)中，所述细凹无梗囊霉GZ-1孢子的接种量为10-30个孢子/每株玉米幼苗，且每盆河沙沸石培养基质中种植2-3株玉米幼苗；在光照培养期间，每2周浇注质量浓度为50％的Hoagland营养液。

更进一步的，步骤(2)中，所述菌剂中孢子量为60-100个孢子/g。

本发明还提供一种如上所述菌剂在抑制柑橘黄龙病菌中的应用。

本发明还提供一种如上所述菌剂在防治植物柑橘黄龙病中的应用方法，该应用方法为：在植物根部周围接种所述菌剂。

本发明还提供一种如上所述菌剂在促进植物生长中的应用方法，该应用方法为：在植物根部周围接种所述菌剂。

本发明具有以下有益效果：

本发明从柑橘根际土壤中分离出的细凹无梗囊霉GZ-1，所得菌剂能有效抑制柑橘黄龙病菌并促进植物的生长，以长春花作为研究柑橘黄龙病的实验对象发现，所得菌剂能有效促进长春花植株的生长，并提高长春花对柑橘黄龙病菌的抗病和耐病能力，接种该菌剂的长春花对柑橘黄龙病的相对防效为78.39％，因此，该菌株以及包括该菌株的菌剂可有效抑制柑橘黄龙病菌，从而为防治柑橘黄龙病提供理论依据，利于柑橘黄龙病防治新途径的探索。

【附图说明】

图1是本发明细凹无梗囊霉GZ-1的菌株形态特征图，其中，a为在浮载剂无菌水中孢子及产孢子囊形态图(暗视野)；b为浮载剂PVLG中孢子及脱落痕形态结构图；c为浮载剂Melzer's试剂中孢壁结构及染色反应图；d为浮载剂PVLG中孢壁结构图。

图2是本发明细凹无梗囊霉GZ-1促进长春花植株的促生作用数据，其中，AM为接种细凹无梗囊霉GZ-1菌剂种植的长春花，CK为空白对照种植的长春花。

图3是本发明细凹无梗囊霉GZ-1对长春花植株的促生作用图，其中，a为接种细凹无梗囊霉GZ-1菌剂种植的长春花植株长势图，b为空白对照的长春花植株长势图。

图4是本发明细凹无梗囊霉GZ-1对长春花根系侵染作用的数据和图片，其中，a图为根系浸染率数据图，b、c、d和e图均为接种细凹无梗囊霉GZ-1菌剂的长春花植株根系浸染图，f图为空白对照的长春花植株根浸染图。

图5是本发明细凹无梗囊霉GZ-1对长春花的抗病作用，其中，AM为接种细凹无梗囊霉GZ-1菌剂种植的长春花植株嫁接感病叶片后20-70d的长春花植株长势图，CK为空白对照的长春花植株嫁接感病叶片后20-70d的长春花植株长势图。

图6是本发明细凹无梗囊霉GZ-1提高长春花植株对柑橘黄龙病抵抗作用的各具体数据，其中，AM是接种细凹无梗囊霉GZ-1菌剂且嫁接感病叶片后的的长春花植株防病作用数据，CK空白对照嫁接感病叶片后的长春花植株防病作用数据。

图7是本发明细凹无梗囊霉GZ-1缓解柑橘黄龙病对长春花植株生长影响的实验数据，其中，AM是接种细凹无梗囊霉GZ-1菌剂的长春花植株生长作用数据，CK空白对照的长春花植株生长作用数据。

如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。

【具体实施方式】

实施例1

菌株的筛选、鉴定和保藏

本发明提供一株细凹无梗囊霉GZ-1，所述细凹无梗囊霉GZ-1的筛选过程如下：

(1)从广西南宁武鸣县采集柑橘根际土壤10-20g作为培养物放入食品搅拌机杯中，加入600ml去离子水高速离心3-5s，得离心物；

(2)将上述离心物倒出，依次通过3层土壤标准筛(标准筛的孔径为上层0.8mm、中间层0.25mm、下层0.0385mm)，大部分砂砾余留在食品搅拌机杯中，用流水冲洗每层筛子，直至流出的水是清水；

(3)将下层筛子里的残余物转至装有浓度为60％的蔗糖的离心管中，于1500转/min的转速下离心3min，然后将离心管中的上清液迅速倒至孔径为0.0385mm的筛子中；

(4)用水冲洗筛子中的上清液遗留物1-2min后转移至玻璃培养皿，体视显微镜观察孢子；

(5)在体视显微镜下先观察记录孢子的颜色、大小、连孢菌丝的特征、孢子果形态等。在此基础上，用毛细吸管挑取新鲜的AM真菌孢子置于载玻片上，加浮载剂(如水、乳酸、乳酸甘油、PVLG)后，在Nikon E-600显微镜下观察，记录孢子的形状、大小、颜色、表面纹饰，孢子内含物、连孢菌丝的数目、宽度及形状、孢壁结构，辅助细胞(土生泡囊)，外生菌丝及附属结构产孢子囊等特征；同时辅助使用Melzer's试剂、乳酸酚棉蓝试剂，观察孢子的特异反应，对有代表性或特异性的特征进行拍照。根据孢子的形态特征，采用Schüβler&Walker(2010)的分类系统，并参阅Schenck&Perez(1988)的“VA菌根真菌鉴定手册和相关网站：http://invam.caf.wvu.edu(INVAM，West Virginia University，USA)；http://www.zor.zut.edu.pl/Glomeromycota/Taxonomy.html(Department of Plant Pathology,University of Agriculture in Szczecin,Poland)及http://www.lrz.de/～schuessler/amphylo/amphylogeny.html的鉴定资料以及近几年发表新种的原始描述，进行种属的检索、鉴定。对于难确定的种或可能的新种、新记录种进一步进行单孢培养，获得大量的同源孢子，再确定种类，部分种类采用分子生物学方法辅助鉴定。AM真菌孢子以Melzer's:PVLG＝1:1或PVLG为浮载剂制成玻片标本，密封、编号、并进行贮藏。

结果

(一)菌株形态特征

孢子：单生于土壤，侧生在产孢子囊梗近端，柔嫩时孢子呈无色透明或乳白色，成熟后呈土黄色至黄褐色，球形至近球形，偶有不规则形状(如附图1-a所示)；

大小：117.1-164.4(143.7)μm；

孢子壁：孢子壁三层；L1无色透明，厚约1.0μm，乳酸酚棉蓝中染成浅蓝色，Melzer’s试剂中染成浅黄色；L2层状壁，淡黄至淡黄褐色，厚5-7μm，表面有凹坑纹饰，凹坑为圆形、长形、多角形或几个相连成不规则的弯曲形，长x宽为1-5x1-3μm，深1-2μm，有时密集有时稀疏，大部分情况下布满孢子表面，乳酸酚棉蓝中染成蓝色；L3层状，透明，厚度小于1μm，紧贴L2，乳酸酚棉蓝中染成蓝色。

发芽壁：GW1两层，均为无色透明，紧密地贴在一起，外层厚1.0μm，外层表面附有珠状颗粒；内层厚1.5μm，易分开，在Melzer’s试剂中呈深红色，在乳酸酚棉蓝中染成深湖蓝色；内含物为油滴状，无色透明，在乳酸酚棉蓝和Melzer’s试剂中不变色。

产孢子囊：大小与孢子相仿，无色透明，孢子完全成熟后产孢子囊即萎缩变空。

脱落痕：光滑，由脊环绕。

(二)鉴定结果

综合形态学和分子生物学特征，将菌株初步鉴定为细凹无梗囊霉(Acaulosporascrobiculata)。

(三)菌株保藏

该菌株细凹无梗囊霉GZ-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年5月25日，保藏编号为CGMCC No.19905。

实施例2

菌株菌剂对盆栽长春花种植的促进作用

一.河沙沸石培养基质的制备

将河沙和沸石按体积比为3:1混合均匀后，在121℃高压蒸汽下灭菌1h，得所述河沙沸石培养基质。

二.菌剂制备

(1)将细凹无梗囊霉GZ-1的孢子按10-30个孢子/每株玉米幼苗的接种量接种于玉米幼苗根系，然后按每盆河沙沸石培养基质中种植2-3株玉米幼苗的比例种植于所述河沙沸石培养基质中，光照培养12-16周，且在在光照培养期间，每2周浇注质量浓度为50％的Hoagland营养液100-300ml/盆；

(2)将上述培养所得玉米植株除去茎秆，保留根系，培养基质中所得菌丝、孢子、培养基质和保留的玉米根系即为所述菌剂，所述菌剂中孢子量为60-100个孢子/g，所述孢子(即细凹无梗囊霉GZ-1的孢子)的形态如图1所示。

三.菌株菌剂对盆栽长春花的促生作用

细凹无梗囊霉GZ-1菌剂对长春花促生的盆栽试验

长春花(Catharanthus roseus)是夹竹桃科长春花属的喜光性植物，柑橘黄龙病菌可以感染长春花并使其呈现黄化症状。因为长春花具有生长周期短、易栽培、感染黄龙病菌后发病快、症状明显等特点，因此，将长春花作为研究柑橘黄龙病的模式植物和实验材料。

选择饱满的长春花种子，先经由1‰高锰酸钾灭菌2min后，采用纯净水浸泡2小时，然后穴盘播种，发芽后选取40株5-7cm高、生长一致的植株，分别移栽于经121℃高压蒸汽灭菌1h且河沙和沸石的体积比为3:1的河沙沸石培养基质中进行盆栽，每个盆栽中栽种一株长春花植株，其中10盆为A组，另外10盆为B组。

其中，A组盆栽在长春花植株根部接种上述细凹无梗囊霉GZ-1菌剂，并在盆栽上标注为AM。具体接种方法为：在前述处理盆栽中，在每株长春花植株根部加入孢子总含量为300个的细凹无梗囊霉GZ-1菌剂。

B组盆栽作为空白对照组，不接种细凹无梗囊霉GZ-1菌剂，而是采用等量的细沙沸石培养基质替代，其它操作与A组盆栽相同，并在盆栽上标注为CK。

上述两组盆栽中每14d浇注质量浓度为50％Hoagland营养液100-300mL/盆。移栽40d后统计每个处理的茎粗、株高、叶片数和叶绿素含量，其中，叶绿素含量用叶绿素SPAD值表示，利用叶绿素仪SPAD-502Plus进行测量；同时检测各组处理的根系侵染情况(测量结果如图2、3和4所示)。

结果如下：

(1)如图2和图3(20-40d)所示，试验结果表明，接种细凹无梗囊霉GZ-1菌剂的长春花植株长势好，植株高度比对照组高，且茎粗、叶片数、叶绿素SPAD值都显著高于对照组。

(2)如图4所示，接种细凹无梗囊霉GZ-1菌剂的实验组植株的根系有明显的菌根侵染，且结构丰富，而没有接种细凹无梗囊霉GZ-1菌剂的对照组植株处理未检测到菌根侵染。

由此可说明，接种细凹无梗囊霉GZ-1菌剂可有效促进长春花植株的生长。

四.菌株菌剂对盆栽长春花的防病作用

细凹无梗囊霉GZ-1菌剂对长春花防病的盆栽试验

在上述移栽40d后的20个A组盆栽中，选择15个盆栽为A1组，另外5个盆栽为A2组。其中，A1组盆栽嫁接感病叶片(即感染柑橘黄龙病的叶片)；A2组盆栽嫁接健康叶片。

同时，在上述移栽40d后的20个B组盆栽中，选择15个盆栽在为B1组，另外5个盆栽为B2组。其中，B1组盆栽嫁接感病叶片(即感染柑橘黄龙病的叶片)；B2组盆栽嫁接健康叶片。

上述四组盆栽中继续每14d浇注质量浓度为50％Hoagland营养液100-300mL/盆。嫁接第60d时，测量已感染柑橘黄龙病长春花和健康长春花的茎粗、茎长、叶片数和落叶率(落叶数/叶片数)；嫁接第120d时，测量所有植株的鲜重和干重(测量结果如图4、5和6所示)。

结果如下：

如图5、图6和图7所示：在柑橘黄龙病的危害下，接种细凹无梗囊霉GZ-1菌剂的长春花植株AM长势仍然相对较好，且其茎粗、茎长、叶片数都显著高于空白对照组CK，落叶率则显著低于空白对照组CK，同时，其感病率和病情指数均明显低于空白对照组CK，相对防效高达78.39％；此外，接种细凹无梗囊霉GZ-1菌剂的长春花植株的地上鲜重、地上干重、地下干重和根长都显著高于空白对照组CK，说明接种细凹无梗囊霉GZ-1菌剂的长春花植株受柑橘黄龙病的影响程度明显较低，长春花根系接种细凹无梗囊霉GZ-1菌剂有效提高了长春花对柑橘黄龙病菌的抗病和耐病能力。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (10)

1.一株细凹无梗囊霉（Acaulospora scrobiculata）GZ-1，其保藏编号为CGMCCNo.19905。

2.一种如权利要求1所述细凹无梗囊霉GZ-1在抑制柑橘黄龙病菌中的应用。

3.一种包括如权利要求1所述细凹无梗囊霉GZ-1的菌剂。

4.根据权利要求3所述菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将细凹无梗囊霉GZ-1的孢子接种于玉米幼苗根系，然后种植于河沙沸石培养基质中，光照培养12-16周，得细凹无梗囊霉菌丝及孢子；

（2）将上述培养所得玉米植株除去茎秆，保留根系，培养基质中所得的菌丝、孢子、培养基质和保留的玉米根系即为所述菌剂。

5.根据权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述河沙沸石培养基质中河沙和沸石的体积比为3:1，且所述河沙沸石培养基质在使用前经过灭菌处理，所述灭菌处理为在121℃高压蒸汽下灭菌1h。

6.根据权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述细凹无梗囊霉GZ-1孢子的接种量为10-30个孢子/每株玉米幼苗，且每盆河沙沸石培养基质中种植2-3株玉米幼苗；在光照培养期间，每2周浇注质量浓度为50%的Hoagland营养液。

7.根据权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述菌剂中孢子量为60-100个孢子/g。

8.一种如权利要求3-7任意一项所述菌剂在抑制柑橘黄龙病菌中的应用。

9.根据权利要求3-8任意一项所述菌剂在防治植物柑橘黄龙病中的应用方法，其特征在于：在植物根部周围接种所述菌剂。

10.根据权利要求3-8任意一项所述菌剂在促进植物生长中的应用方法，其特征在于，在植物根部周围接种所述菌剂。

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