WO2010084230A1 - Hongo formador de micorrizas arbusculares y su uso para estimular el crecimiento de plantas - Google Patents

Hongo formador de micorrizas arbusculares y su uso para estimular el crecimiento de plantas Download PDF

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WO2010084230A1
WO2010084230A1 PCT/ES2010/070033 ES2010070033W WO2010084230A1 WO 2010084230 A1 WO2010084230 A1 WO 2010084230A1 ES 2010070033 W ES2010070033 W ES 2010070033W WO 2010084230 A1 WO2010084230 A1 WO 2010084230A1
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plants
plant
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spores
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PCT/ES2010/070033
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Custodia Purificación CANO ROMERO
Alberto Bago Pastor
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H17/00—Symbiotic or parasitic combinations including one or more new plants, e.g. mycorrhiza
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G18/00—Cultivation of mushrooms
    • A01G18/10—Mycorrhiza; Mycorrhizal associations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture

Definitions

  • the present invention is within the field of the recovery of degraded areas, revegetation, production of mycorrhizal and biofertilizer inoculants, organic farming and nursery production. It refers to a new arbuscular mycorrhizal fungus (AMF) that establishes mycorrhizal symbiosis with the majority of plants of economic and ecological interest (horticultural, ornamental, used for revegetation, etc.) and that increases its survival, vitality and production, especially in conditions of high concentrations of heavy metals and other xenobiotics, and reduces the need for chemical fertilizers, pesticides and phytosanitary applications.
  • AMF arbuscular mycorrhizal fungus
  • Arbuscular mycorrhizae one of the most widely spread symbiosis in the world, appear in a wide range of habitats, from temperate ecosystems to those that withstand the most extreme conditions, such as rainforests or antartic soils.
  • the fungi involved in this mycorrhizal interaction belong to the recently described Glomeromycota taxon (Schussler et al., 2001. Mycol. Res. 105: 1413-1421), which includes less than 200 described species, distributed throughout the world.
  • arbuscular mycorrhizal fungi AMF report to the soil-plant system have been well proven and described, so that their potential use as ecological biofertilizers and useful tools in bioremediation and recovery programs of contaminated areas and / or degraded is widely accepted. They increase the absorbent surface of the root system and improve the physical properties of the soil through the formation of stable aggregates. In turn, the glomalina, a specific glycoprotein of these fungi, accelerates the processes of formation of stable micro aggregates in the soil, thus improving their physical structure, increasing oxygen levels, and facilitating a better colonization of the organism.
  • AMF arbuscular mycorrhizal fungi
  • the authors of the present invention have isolated and placed in culture in Vitro continuous a new fungus forming arbuscular mycorrhizae (HMA) of the terraces of the Rio Tinto (Huelva, Spain).
  • HMA arbuscular mycorrhizae
  • the authors have carried out tests that demonstrate that the establishment of mycorrhizal symbiosis between this new fungus and various plants confers special protection to them when they grow in adverse conditions, such as soils irrigated by waters heavily contaminated by heavy metals, soils with a high carbonate content. , or in conditions of nursery production. This protection is especially shown in a significant increase in the survival of these plants in these conditions, in addition to notable positive effects on their growth and development.
  • the present invention describes a new species of HMA (arbuscular mycorrhizal fungi) to which the code MUCL 51732 has been assigned, in the Belgian Co-ordinated Collection of Microorganims (BCCMTM). This new species has been taxonomically characterized by a combination of morphological and molecular techniques.
  • HMA arbuscular mycorrhizal fungi
  • mycorrhizae to increase the absorption of water and mineral salts from the soil.
  • the mycorrhizae are the association between roots of a plant and the mycelium of a fungus, so that the entire extent of the mycelium participates in the absorption of nutrients for the plant. In Nature this symbiosis occurs spontaneously. It is estimated that between 90 and 95% of the upper plants present mycorrhizae regularly.
  • the fungus of the present invention is of the genus Glomus that belongs to Superuk Eukaryota, (Metazoa / Fungi group), Kingdom Fungi, Phylum Glomeromycota, Class Glomeromycetes, Order Glomerales, Family Glomeraceae.
  • a first aspect of the invention refers to a fungus of the genus Glomus, deposited under the Budapest Treaty in the Belgian Co-ordinated Collection of Microorganims (BCCMTM), with the code MUCL 51732. From now on, object fungus of the invention.
  • Another aspect of the invention relates to a spore or hyphae of the fungus of the invention from which said fungus would be generated. From now on, spores or hyphae of the invention.
  • a typical mycorrhizal hypha consists of a cylindrical filament, either intra-radical or extra-radical, consisting of a cenocytic plasmalema (typically ascribed in most of its life cycle) multinucleated wrapped in a chitin cell wall that can give rise to various intra-radical structures ( arbuscles, arbusculated clews, tangles, vesicles) or extra-radicals (branched absorption structures linked or not to spores, etc.).
  • the fungus object of the invention produces a strong arbuscular colonization that begins with the entry of a guide hyphae at the root, forming a thick appressorium.
  • the appressorium corresponds to a flat structure, such as a bulb, which is formed when the hypha establishes contact with the surface and increases its diameter, increasing the area of union between the two organisms, which allows the pathogen to bind more firmly to the plant.
  • Another aspect of the invention relates to a cell of the root of a plant comprising the fungus of the invention, as well as or mycorrhized root of said plant.
  • compositions comprising the fungus, the spore or the hyphae of the invention.
  • Said composition optionally comprises at least one other microorganism, preferably another arbuscular mycorrhizal fungus (AMF) and more preferably of the Glomus genus.
  • this composition may include additives or nutrients as well as other compounds selected from organic or inorganic fertilizers, insecticides, nematicides or bactericides or agents promoting growth, nutrition or plant protection, whatever their origin.
  • composition would serve as an inoculant, or mycorrhization medium.
  • the composition could be a liquid, gel or solid mycorrhizal inoculant that, in addition to the fungus of the invention, as well as resistance spores, such as arbuscular extraradical mycelium, mycorrhized roots or like all of them, comprising other substances commonly used in the cultivation of HMA fungi.
  • compositions, the fungus, spores, hyphae or mycorrhized roots of the invention can be useful for the formation of a substrate, or any material used as support to grow plants or germinate seeds. Therefore, another aspect of the present invention refers to a substrate comprising the composition, the fungus, spores, hyphae or mycorrhized roots of the invention as well as any support useful in the cultivation or germination, which can be selected from the list that It includes, but is not limited to, peat, sand, perlite, vermiculite, sepiolite, clay minerals, coconut fiber, pine bark or any combination thereof.
  • the object of the present invention is also the use of this new species of AMF both only, and in combination with any other microorganisms, in formulations based on mycorrhizae for later application as biofertilizers, inoculants, amendments, soil recuperators, phyto-fortifiers, etc.
  • the object of the present invention is the use alone or in any combination with another chemical or biological material of the new species of AMF for use as a mycorrhizal biofertilizer, bio-amending, recovery of degraded areas, soil or water remediation, agricultural production, nursery, adjuvant for the survival of plants under conditions of oxidative stress and especially in the presence of heavy metals, chemical pollution, oil, etc.
  • Another object of the present invention is the cultivation, propagation and production of AMF, in any type of culture medium or biofilm, whether it is aseptic or not, chemical or physical, or its use in any type of support for biological, physiological purposes , chemical, physical or ecological.
  • the HMA object of the invention can be used for inclusion in seedbeds, alveoli, pots, containers, or any other similar system known to a person skilled in the art, in which any type of plant will be cultivated, preferably in its stages more youthful It can also be used extensively for the recovery of soils or areas degraded by anthropopogenic activity, especially as a consequence of mining, industrial, oil activity, but also as a result of land esplanades (civil works, road slopes and railway tracks, stations skiing, theme parks, etc.) and public or private gardening works.
  • Its application can be carried out by means of the application of individual aliquots of inoculant to the substrate where the seed or nursery plant is placed, said substrate being any of those commonly used in nurseries, for example peat, sand, soil, vermiculite, perlite, sepiolite, terragreen, clay minerals and their derivatives, and mixtures of said substrates in varying proportions; or by means of the brief immersion of the roots and / or of the seeds of the plants in him before his transplantation to the seedbed.
  • the HMA object of the invention can also be applied on a large scale through its distribution by irrigation water or by tank trucks, hydroseeding or any other similar implementation.
  • one aspect of the present invention refers to the use of the composition of the invention for its application to a culture substrate, irrigation water, roots and / or seeds as well as to stimulate the growth of a plant or part of a plant, to protect said plant from attack by pathogens and / or for the recovery of degraded soils or areas.
  • soils with high concentrations of heavy metals Preferably soils with high concentrations of heavy metals.
  • plants susceptible to being mycorrhized by the HMA object of the invention are (but not limited to): woody, shrubby, fruit and vegetable interest, ornamental, flowers, vines, aromatic plants, medicinal plants, tropical crops and subtropical, cereals, legumes, fodder or wild plants.
  • the fungus object of the invention stimulates growth, nutrition, survival, resistance to different abiotic stresses and eco-physiological development in the vast majority of members of all families of terrestrial plants.
  • the plants in which the growth is stimulated from the use of the fungus of the invention belong to the Leguminoseae, Compositeae, Boraginaceae, Cistaceae, Alliaceae, Apiaceae or Graminaceae families. If the plant belongs to the Leguminoseae Family, it is selected, but not limited to, from the genera Cicer, Vicia, Pisum, Lens, Phaseolus, Glycine, Trifolium, Medicago, Lotus or Sophora. If the plant belongs to the Compositeae Family, it is selected, but not limited, from the genera Chamaemelum, Carduus or Chrisanthemum.
  • the plant is preferably of the genus Echium, Cistus, Allium, Daucus and Avena, respectively.
  • HMA object of the invention in the aforementioned forms promotes the early establishment of arbuscular mycorrhizal symbiosis, with the consequent benefit in terms of viability, survival, resistance to biotic and abiotic stresses, nutritional improvement, adaptability, productivity, etc. presented by mycorrhized plants with respect to those that are not. It also favors the recovery of the soil balance, its physical-chemical characteristics, its biodiversity and the bio-geodynamic cycles. All of the above entails the faster and better reimplantation of the vegetation cover in the areas treated with the HMA object of the invention, favoring its recovery. HMA also collaborates in the sequestration or retention of chemical elements potentially harmful to the health of plants, animals, beneficial microorganisms and the environment.
  • the HMA object of the invention can also be applied as an enhancer of the reestablishment (recovery and restoration) of the vegetation cover of degraded soils, and for the revegetation of altered areas subjected to biotic and abiotic stresses.
  • the revegetar soils can be, among others, roadsides, mining areas, burned areas, desertified areas, contaminated soils, infested soils, soils degraded by excess salts, calcareous soils, extreme pH soils, etc.
  • Another aspect of the present invention is the mycorrhization procedures, in vitro (micropropagated plants during or immediately after their rooting phase, and before the acclimatization phase) and ex vitro (micropropagated plants during the acclimatization phase, and seedlings, alveoli, seedlings, nursery plants or any other plant obtainable from conventional techniques), which use the fungus object of the present invention. That is, to develop a plant (or cells of a plant) in a culture solution that contains the fungus of the invention, or to which the fungus object of the invention is applied in any of its stages of development
  • FIG. 1 Optical and electronic microscopy of juvenile spores of the fungus object of the invention grown in in vitro conditions.
  • 1.1. Group of two spores with support hyphae.
  • Scale bar 20 ⁇ m; 1.2., Separation of the cell wall from the spore in layers sw1, sw2 and sw3.
  • Scale bar 20 ⁇ m; 1.3. View of the three layers sw by electron microscope.
  • Scale bar 0.5 ⁇ m; 1.4., Deformed but perfectly viable spores formed by the fungus object of the invention in Melzer reagent.
  • Scale bar 50 ⁇ m; 1.5, detail of deformed spore.
  • Scale bar 20 ⁇ m; 1.6., Deformed spore detail in which its sw layers are perfectly distinguished.
  • Scale bar 20 ⁇ m.
  • FIG. 3 Photomicrographs of the intraradical colonization of carrot roots (Daucus carota L., clone DC2) growing in in vitro culture (monoxenic) with the fungus object of the invention (a-d) and the extraradical growth of the latter (e-h).
  • a points of entry and vesicles
  • b massive arbuscular colonization
  • c detail of hypha with intra-radical vesicles.
  • d detail of arbusculated clews.
  • FIG. 4 and 5 Phylogenetic trees in which the result of the SSU analysis of the fungus object of the invention is compared with the published sequences of other members of the Glomeraceae family.
  • FIG. 6. Genetic footprints of the fungus object of the invention and other reference members of the Glomeraceae family obtained by rep-PCR and its electrophoretic comparison.
  • FIG. 7. Different comparative images of the growth of plants in different soils in which the properties of the fungus object of the invention (H) with respect to the fungus G. intraradices are shown.
  • FIG. 8 Comparative graph of the survival and growth results obtained in Experiment 2.
  • the Y axis represents the average dry weight of the plants in grams (g) H represents the fungus of the invention
  • TEM transmission electron microscopy
  • the spores were treated with a 0.2M phosphate buffer with 2.8% glutaraldehyde, and 1.5% p-formaldehyde at 4 0 C for 18 hours, washed and centrifuged in double distilled water , post-fixed in 2% aqueous osmic acid, dehydrated, stained with uranyl acetate, and embedded in LRWhite (London Resin Company Ltd.). Ultrafine sections were mounted on grills and observed in a Zeiss EM902 electron microscope at 80 kv.
  • FIG. 1 and 2 Results (morphological description) FIG. 1 and 2:
  • the fungi of the present invention have an unknown sporocarp, isolated spores or in labile aggregates of 2 to 5 spores, produced distally or intercalarly along the ramifications of the hyphae, the rapidly buried and collapsed distal hypha, differentiated in their intra or extraradical Juvenile spores (4-month in vitro cultures, FIG. 1) are hyaline to pale yellow, globose, 42-90 ⁇ m in diameter, ovoid to pyriform, 62-67-72-77 ⁇ m in diameter, smooth surface.
  • the wall of the young spores constitutes a single wall with three detectable layers with a total thickness of 2.0-4.8 ⁇ m.
  • the outer wall (sw1) is hyaline, 0.5-1.0 ⁇ m thick, mucilaginous, evanescent, weakly reactive to Melzer reagent;
  • the intermediate layer (sw2) is hyaline, 1.0-1.5 ⁇ m thick, rigid, sometimes double, distinguishable but not easily distinguishable from layer 1, and does not react to Melzer reagent;
  • the inner wall (sw3) is hyaline to pale yellow, 1.6-2.8 ⁇ m thick, laminated with a weak arrangement of the sheets, not reactive against Melzer.
  • the support spore of the young spores persists in the spore, and is straight to slightly flared, 6.4- (9.6-14.4) ⁇ m in diameter at the base of the spore.
  • the pore is open, from 6.4 to 7.2 ⁇ m.
  • the walls of the bearing hyphae are continuous with the wall of the spore, and 3.6 - 4.8 ⁇ m thick at the junction point with the spore, decreasing to 1.5 - 2.0 ⁇ m thick at 30-35 ⁇ m from the spore .
  • the external wall (sw1) thins in rapidly, between 5-10 ⁇ m from the support hyphae, while the middle and internal walls (sw 2-3) are detected up to 30 ⁇ m from the spore.
  • the mature extra-radical spores (12-month in vitro and ex vitro cultures) are pale yellow (0/0/60/0), yellow-brown (0/30/100/0), globose to subglobose, 110- 172 ⁇ m in diameter (average size 125-140 ⁇ m), ovoids to ellipsoids, sometimes tonsils to tuberculates, 72-91 x 104-124 ⁇ m in size.
  • the walls of the mature spores are made of 5 layers in three groups: group 1 constitutes the layers 1-2, with the outer layer (sw1) hyaline, mucilaginous, evanescent, irregular thickness ( 0.8-2.5 ⁇ m thick), reddish to Melzer reagent, always present in spores obtained in vitro, generally absent or much thinner in spores obtained ex vitro.
  • the sw2 layer is hyaline to yellow (0/0/60/0), rigid, 1.6 - 2.9 ⁇ m thick, with the smooth outer surface and the occasionally granular inner surface as observed in spores cultured ex vitro, none of them reactive to the Melzer reagent, and easily separable from the sw1.
  • Group 2 constitutes the layer sw3, which is hyaline, rigid, smooth surface, 1.5-2.8 ⁇ m thick, which breaks into polygonal pieces when pressure is applied and not reactive to the Melzer.
  • Group 3 is constituted by layers sw 4-5, the sw 4 being yellow (0/10/80/0) to yellow-brown (0/30/100/0), laminated, smooth surface and 2.6-4.8 ⁇ m thick, very reactive to Melzer; and the sw 5 hyaline, semi-rigid to flexible, smooth surface, and 0.8 - 1.0 ⁇ m thick, not easily separable from layer 4 and not reactive to the Melzer.
  • the layers of the spore wall with irregular shapes are made of 3 detectable layers similar to those of the juvenile spores.
  • the support hyphae of mature spores is cylindrical, 9.6-12.8 ⁇ m in diameter in the spore, or slightly flared 12.8-14.4 ⁇ m in diameter, of the same color as the spore.
  • the wall of the bearing hyphae has a thickness of 3.2-4.8 ⁇ m at the pore level and is made of the layers of the spore wall with the exception of the layer sw5 that remained undetectable and sw1 that decreased in thickness between the first 5- 10 ⁇ m from the spore.
  • the juvenile spores are pale yellow to golden yellow of 68-74 ⁇ m in diameter; mature spores are yellow to brown yellow, globose to subglobose, 100-156 ⁇ m in diameter, never ovoid, tonsil or tuberculated. Juvenile or mature spores can occur in the same root segment and be found in the same spore groups.
  • the spore wall, support hyphae and hyphae network of juvenile or mature intraradical spores are similar to those described for extra-radical spores.
  • Mycorrhizal state The fungus object of the invention produces a strong arbuscular colonization that begins with the entry of a guide hyphae into the root, forming a thick appressorium.
  • the intraradical colonization reminds of the mycorrhiza of the Paris type.
  • Arbuscles are often formed from cell to cell, and intercellular hyphae are not frequent or absent (Fig. 3a and c).
  • the arbuscles are quite special, remembering more arbuscular clews ("arbusculate cois) (Fig. 3b and d), and remembering those formed by G. mosseae more than those formed by G. intraradices.
  • Vesicles are not frequent, although they are sometimes found in low numbers. They are pear-shaped and are formed intercellularly, staining more weakly than spores when stained with trypan blue.
  • Mycorrhizal association in the field, the fungus object of the invention has been isolated from the rhizosphere of a consortium of plants mainly belonging to the Compositae families (Chamaemelum sp., Carduus sp., Chrisanthemum sp.), But also included plants of the Boraginaceae (Echium sp.), Cistaceae ⁇ Cistus sp.) and Graminaceae (Avena sp.) families. After six weeks in monoxenic culture using the minimum medium "M" (Chabot et al., 1992.
  • PCR analysis of the 18S region of the DNA Approximately 1000 spores were sampled from monoxenic culture, dissolving the culture medium according to the method of Doner and Bécard (1991) (Doner and Bécard (1991). Biotechnology Techniques 5: 25-28). DNA extraction was carried out following a protocol using the CTAB extraction buffer, protein extraction with phenol-chloroform and precipitation with isopropanol. The DNA was resuspended in 50 ⁇ L of TE buffer (1OmM Tris-HCI, 1mM EDTA, pH 7.5).
  • PCR reactions were carried out with 1/10 of the DNA extract.
  • the following reagents were added: 1x PCR buffer (20 mM Tris-HCI (pH 8.4), 50 mM KCI, Invitrogen, USA), 1.5 mM MgCl2, 0.2 ⁇ M of each rDNA first, 200 ⁇ M of each dNTP (Finnzymes Oy, Finland), 2.5 units of Taq DNA polymerase (Invitrogen, USA).
  • the two primers used were VANsI (Simón et al., 1993. Appl. Environ. Microbiol. 59, 4211-4215) and NS8 (White et al., 1990.
  • VANsI Simón et al., 1993. Appl. Environ. Microbiol. 59, 4211-421
  • NS8 White et al., 1990.
  • VANsI VANsI
  • NS8 White et al., 1990.
  • PCR protocols a
  • the amplification was carried out in a PTC200 DNA machine (MJ Research, USA) under the following protocol: a first stage of denaturation at 94 0 C for 5 min., followeded by 40 cycles at 94 0 C for 30 s., 55 0 C for 1 min. And 72 0 C for 2 min. Amplification finished with a final elongation step at 72 0 C for 10 min.
  • PCR product was cloned into Escherichia coli using the Gateway cloning system (Invitrogen, USA) and sequenced using the sequencing kit "DYEnamic ET cycling terminator" (cat No. US 810 50, Amersham Pharmacia Biotech, GB).
  • the clones were sequenced using the following primers: NS1, NS2, NS3, NS4, NS5, NS6, NS7, NS8 (White et al., 1990. In: PCR protocols: a guide to methods and applications. Part 3. Academic Press, Inc. 315-322).
  • sequences were analyzed with an automatic sequencer ⁇ CEQ TM 2000 XL DNA analysis system, Beckam Coulter Inc., USA), edited with Sequencher v.4.1.4 (Gene Code Corporation, Ann Arbor, Ml), aligned with Clustal X 1.5 ( Thompson et al., 1997. Nucleic Acids Research, 25: 4876-4882) and manually corrected.
  • the amplification was carried out in a DNA thermocycler (Mastercycler ep Gradient S) using the following protocol: denaturation at 95 ° C for 7min, 35 cycles at 94 0 C for 3s, 92 0 C for 3Os, 5O 0 C for 1 min, 65 0 C for 1 min 3Os, and an elongation stage at 65 0 C for 8min.
  • the genetic traces obtained from the comparison by rep-PCR between the fungus object of the invention and reference strains of G. intraradices Schenck & Smith, G. clarum Nicolson & Schenk and G. claroideum Schenck & Smith allowed segregating the object fungus of the invention of the other Glomus species tested (FIG. 6a).
  • Clover seeds (Trifolium pretense L., var. Violet) were surface sterilized (bleach diluted 5% with water) and pre-germinated in autoclaved vermiculite (121 0 C, 20 min.). After one week the seedlings were transferred to 300-ml pots containing either natural soil from the banks of the Rio Tinto (passing through Nerva, Huelva, Spain) (Table 2) (Experiment 1), or agricultural soil mixed with quartz sand (1 part of soil for 9 of sand v: v) tindalized for three consecutive days (Experiment 2). In both cases a third of the pots were inoculated with the fungus object of the invention, another third with the reference mycorrhizal fungus G.
  • Table 2 Composition of the soil on the banks of the Rio Tinto and comparison with a soil in the uncontaminated area of Huelva.

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Abstract

La presente invención se encuentra dentro del campo de la recuperación de áreas degradadas, revegetación, producción de inoculantes micorrícicos y biofertilizantes, agricultura ecológica y producción viverística. Se refiere a un nuevo hongo micorrícico arbuscular (HMA) que establece simbiosis micorrícica con la mayoría de plantas de interés económico y ecológico (horto-frutícolas, ornamentales, utilizadas para revegetación, etc.) y que aumenta su supervivencia, vitalidad y producción, especialmente en condiciones de altas concentraciones de metales pesados y otros xenobióticos, y reduce la necesidad de aplicación de fertilizantes químicos, pesticidas y fitosanitarios.

Description

HONGO FORMADOR DE MICORRIZAS ARBUSCULARES Y SU USO PARA ESTIMULAR EL CRECIMIENTO DE PLANTAS
La presente invención se encuentra dentro del campo de Ia recuperación de áreas degradadas, revegetación, producción de inoculantes micorrícicos y biofertilizantes, agricultura ecológica y producción viverística. Se refiere a un nuevo hongo micorrícico arbuscular (HMA) que establece simbiosis micorrícica con Ia mayoría de plantas de interés económico y ecológico (horto-frutícolas, ornamentales, utilizadas para revegetación, etc.) y que aumenta su supervivencia, vitalidad y producción, especialmente en condiciones de altas concentraciones de metales pesados y otros xenobióticos, y reduce Ia necesidad de aplicación de fertilizantes químicos, pesticidas y fitosanitarios.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Las micorrizas arbusculares, una de las simbiosis mas ampliamente extendidas en el mundo, aparecen en un amplio rango de hábitats, desde ecosistemas templados hasta los que soportan las condiciones mas extremas, como las selvas tropicales o suelos antarticos. Los hongos implicados en esta interacción micorrícica pertenecen al recientemente descrito taxon Glomeromycota (Schussler et al., 2001. Mycol. Res. 105:1413-1421 ), que incluye menos de 200 especies descritas, distribuidas por todo el mundo. Los beneficios que los hongos formadores de micorrizas arbusculares (HMA) reportan al sistema suelo-planta han sido de sobra contrastados y descritos, de manera que su uso potencial como biofertilizantes ecológicos y herramientas útiles en programas de biorremediación y recuperación de áreas contaminadas y/o degradadas está ampliamente aceptado. Aumentan Ia superficie absorbente del sistema radicular y mejoran las propiedades físicas de los suelos mediante Ia formación de agregados estables. A su vez, Ia glomalina, una glicoproteína específica de estos hongos, acelera los procesos de formación de micro agregados estables en el suelo, mejorando así su estructura física, incrementando los niveles de oxígeno, y facilitando una mejor colonización del organismo. De hecho se han obtenido buenos resultados utilizando los HMA para recuperar suelos desertificados, áreas naturales afectadas por estreses hídricos o salinos y, en particular, áreas contaminadas naturalmente o bien por Ia mano del hombre con metales pesados (Vivas et al., 2003. Env. Pollution 126:179-189).
Es conocido que, de forma general, Ia presión evolutiva que se produce sobre los organismos que habitan en condiciones extremas origina Ia adquisición de caracteres particulares por parte de estos, muchos de ellos adecuados para Ia supervivencia en dichos medios. Un área natural que puede ser considerada como paradigmática como ecosistema degradado por efecto natural y antropogénico es Ia cuenca minera del Rio Tinto (Huelva, España). Este río discurre por mas de 90 km a través de un cinturón pirítico que confiere a sus aguas un pH de 2, elevadísimas concentraciones de Fe (2g/l), Mg (1.3g/l), Cu (390 mg/l), Zn (280 mg/l) and Mn (100 mg/l) entre otros metales pesados, de los que proviene su color rojo. A pesar de estas condiciones extremas, las aguas del Rio Tinto contienen una sorprendentemente elevada diversidad microbiana que consisten no sólo en bacterias, sino también organismos eucarióticos como algas, amebas y hongos (entre otros).
Son muy pocas las plantas capaces de crecer en determinadas condiciones adversas, como suelos degradados, contaminados por el hombre o regados/afectados por aguas altamente contaminadas por metales pesados, suelos con elevado contenido en carbonatos, etc., dificultando Ia implantación de sistemas de biorremediación en estos suelos. La adición de hongos formadores de micorrizas arbusculares capaces de establecer simbiosis con plantas en suelos con estas características, como se ha dicho, aumentaría Ia superficie absorbente del sistema radicular de las plantas y mejoraría las propiedades físicas de los suelos mediante Ia formación de agregados estables, facilitando su biorremediación así como Ia presencia de una cubierta vegetal estable y autóctona que mejorase globalmente estos ecosistemas dañados. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los autores de Ia presente invención han aislado y puesto en cultivo in Vitro continuo un nuevo hongo formador de micorrizas arbusculares (HMA) de los bancales del Río Tinto (Huelva, España). Los autores han realizado ensayos que demuestran que el establecimiento de Ia simbiosis micorrícica entre este nuevo hongo y diversas plantas confiere protección especial a éstas cuando crecen en condiciones adversas, tales como suelos regados por aguas altamente contaminadas por metales pesados, suelos con elevado contenido en carbonatos, o en condiciones de producción viverística. Esta protección se muestra especialmente en un incremento importante de Ia supervivencia de estas plantas en esas condiciones, además de notables efectos positivos sobre su crecimiento y desarrollo.
La presente invención describe una nueva especie de HMA (hongos micorrízicos arbusculares) al que Ie ha sido asignado el código MUCL 51732, en el Belgian Co-ordinated Collection of Microorganims (BCCMTM). Esta nueva especie ha sido caracterizada taxonómicamente por una combinación de técnicas morfológicas y moleculares.
Muchas plantas presentan micorrizas para aumentar Ia absorción de agua y sales minerales del suelo. Las micorrizas son Ia asociación entre raíces de una planta y el micelio de un hongo, de forma que toda Ia extensión del micelio participa en Ia absorción de nutrientes para Ia planta. En Ia Naturaleza esta simbiosis se produce espontáneamente. Se estima que entre el 90 y el 95% de las plantas superiores presentan micorrizas de forma habitual.
Es posible que un mismo hongo forme Ia micorriza con más de una planta a Ia vez, estableciéndose de este modo una conexión entre plantas distintas; esto facilita Ia existencia de plantas parásitas, que extraen todo Io que necesitan del hongo micobionte y las otras plantas con las que éste también establece simbiosis. Así mismo, varios hongos (en ocasiones de especies diferentes) pueden micorrizar una misma planta al mismo tiempo. El hongo de Ia presente invención es del género Glomus que pertenece al Superreino Eukaryota, (grupo Metazoa/Fungi), Reino Fungi, Phylum Glomeromycota, Clase Glomeromycetes, Orden Glomerales, Familia Glomeraceae.
Por tanto, un primer aspecto de Ia invención se refiere a un hongo del género Glomus, depositado bajo el Tratado de Budapest en el Belgian Co-ordinated Collection of Microorganims (BCCMTM), con el código MUCL 51732. A partir de ahora, hongo objeto de Ia invención.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a una espora o una hifa del hongo de Ia invención a partir de las cuales se generaría dicho hongo. A partir de ahora, esporas o hifas de Ia invención.
Entendiéndose por espora una célula reproductiva del hongo que emitir un tubo germinativo y micorrizar plantas hasta reproducirse y las hifas, los filamentos que, reunidos, forman el micelio del hongo. Una hifa típica micorrícica consiste en un filamento cilindrico, ya sea intrarradical o extrarradical, constituido por un plasmalema cenocítico (típicamente aseptado en Ia mayor parte de su ciclo vital) multinucleado envuelto en una pared celular de quitina que puede dar origen a diversas estructuras intrarradicales (arbúsculos, ovillos arbusculados, ovillos, vesículas) o extrarradicales (estructuras ramificadas de absorción ligadas o no a esporas, etc.).
El hongo objeto de Ia invención produce una fuerte colonización arbuscular que comienza con Ia entrada de una hifa guía en Ia raíz, formando un grueso apresorio.
El apresorio corresponde a una estructura plana, como un bulbo, que se forma cuando Ia hifa establece el contacto con Ia superficie e incrementa su diámetro, aumentando Ia zona de unión entre los dos organismos, Io cual permite que el patógeno se una con mayor firmeza a Ia planta. Otro aspecto de Ia invención se refiere a una célula de Ia raíz de una planta que comprende el hongo de Ia invención, así como o raíz micorrizada de dicha planta.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a una composición que comprende el hongo, Ia espora o Ia hifa de Ia invención. Dicha composición opcionalmente comprende, al menos, otro microorganismo, preferiblemente otro hongo micorrícico arbuscular (HMA) y más preferiblemente del género Glomus. Además, esta composición puede incluir aditivos o nutrientes así como otros compuestos seleccionados de entre fertilizantes orgánicos o inorgánicos, insecticidas, nematicidas o bactericidas o agentes de promoción del crecimiento, Ia nutrición o Ia protección de las plantas, cualquiera que sea su origen.
Esta composición, serviría como inoculante, o medio de micorrización. Por ejemplo, Ia composición podría ser un inoculante micorrícico líquido, tipo gel o sólido que, además del hongo de Ia invención, bien como esporas de resistencia, como micelio extraradical arbuscular, raíces micorrizadas o como todos ellos, comprendiera otras sustancias utilizadas de forma común en el cultivo de hongos HMA.
Por otro lado, bien Ia composición, bien el hongo, esporas, hifas o raíces micorrizadas de Ia invención pueden ser útiles para Ia formación de un sustrato, o cualquier material usado como soporte para cultivar plantas o germinar semillas. Por tanto, otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un sustrato que comprende Ia composición, el hongo, esporas, hifas o raíces micorrizadas de Ia invención así como cualquier soporte útil en el cultivo o germinación, que se puede seleccionar de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, turba, arena, perlita, vermiculita, sepiolita, minerales de arcilla, fibra de coco, corteza de pino o cualquiera de sus combinaciones. El objeto de Ia presente invención es asimismo Ia utilización de esta nueva especie de HMA tanto sólo, como en combinación con otros microorganismos cualesquiera, en formulados a base de micorrizas para su posterior aplicación como biofertilizantes, inoculantes, enmendantes, recuperadores de suelos, fitofortificantes, etc.
Es objeto de Ia presente invención el uso en solitario o en combinaciones cualesquiera con otro material químico o biológico de Ia nueva especie de HMA para su uso como biofertilizante micorrícico, bioenmendante, recuperación de áreas degradadas, remediación de suelo o de aguas, producción agrícola, viverística, adyuvante para Ia supervivencia de plantas en condiciones de estrés oxidativo y especialmente en presencia de metales pesados, contaminación química, petrolífera, etc.
Constituye otro objeto de Ia presente invención el cultivo, propagación y producción del HMA, en cualquier tipo de medio de cultivo o biofilm, ya sean éste aséptico o no, químico o físico, o su utilización en cualquier tipo de soporte con fines biológicos, fisiológicos, químicos, físicos o ecológicos.
El HMA objeto de Ia invención se puede utilizar para su inclusión en semilleros, alvéolos, macetas, contenedores, o cualquier otro sistema similar conocido por un experto en Ia materia, en los que se vayan a cultivar cualquier tipo de planta, preferentemente en sus estadios más juveniles. También puede utilizarse de manera extensiva para Ia recuperación de suelos o áreas degradadas por actividad antropopogénica, especialmente como consecuencia de actividad minera, industrial, petrolífera, pero también como consecuencia de explanaciones de terrenos (obras civiles, taludes de carreteras y vías ferroviarias, estaciones de esquí, parques temáticos, etc.) y obras de jardinería pública o privada. Su aplicación se puede llevar a cabo mediante Ia aplicación de alícuotas individualizadas de inoculante al sustrato donde se coloca Ia semilla o el plantón de vivero, siendo dicho sustrato cualquiera de los utilizados habitualmente en los viveros, por ejemplo turba, arena, suelo, vermiculita, perlita, sepiolita, terragreen, minerales de Ia arcilla y sus derivados, y las mezclas de dichos sustratos en proporciones variables; o bien mediante Ia breve inmersión de las raíces y/o de las semillas de las plantas en él antes de su transplante al semillero. El HMA objeto de Ia invención también se puede aplicar a gran escala mediante su distribución por agua de riego o mediante camiones cuba, hidrosiembra o cualquier forma de implantación similar.
Por todo Io anterior, un aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de Ia composición de Ia invención para su aplicación a un sustrato de cultivo, al agua de riego, a raíces y/o a semillas así como para estimular el crecimiento de una planta o parte de una planta, para proteger dicha planta del ataque de patógenos y/o para Ia recuperación de suelos o áreas degradadas. Preferiblemente suelos con altas concentraciones de metales pesados.
Es de reseñar que como plantas susceptibles de ser micorrizadas por el HMA objeto de Ia invención se encuentran (pero no se limitan a): plantas leñosas, arbustivas, de interés hortofrutícola, ornamentales, flores, vid, plantas aromáticas, plantas medicinales, cultivos tropicales y subtropicales, cereales, leguminosas, forrajeras o plantas silvestres.
Preferiblemente el hongo objeto de Ia invención estimula el crecimiento, Ia nutrición, Ia supervivencia, Ia resistencia a diferentes estreses abióticos y el desarrollo eco-fisiológico en Ia inmensa mayoría de los miembros de todas las familias de plantas terrestres.
Preferiblemente las plantas en las que se estimula el crecimiento a partir del uso del hongo de Ia invención, pertenecen a Ia Familia Leguminoseae, Compositeae, Boraginaceae, Cistaceae, Alliaceae, Apiaceae o Graminaceae. Si Ia planta pertenece a Ia Familia Leguminoseae, esta se selecciona, pero sin limitarse, de entre los géneros Cicer, Vicia, Pisum, Lens, Phaseolus, Glycine, Trifolium, Medicago, Lotus o Sophora. Si Ia planta pertenece a Ia Familia Compositeae, esta se selecciona, pero sin limitarse, de entre los géneros Chamaemelum, Carduus o Chrisanthemum. Y por último, si pertenece a Ia Familia Boraginaceae, Cistaceae, Alliaceae, Apiaceae o Graminaceae, Ia planta es preferiblemente del género Echium, Cistus, Allium, Daucus y Avena, respectivamente.
La utilización del HMA objeto de Ia invención en las formas arriba indicadas promueve el establecimiento temprano de Ia simbiosis micorrícica arbuscular, con el consiguiente beneficio en términos de viabilidad, supervivencia, resistencia a estreses bióticos y abióticos, mejora nutricional, adaptabilidad, productividad, etc. que presentan las plantas micorrizadas con respecto a las que no Io están. Además favorece Ia recuperación del equilibrio del suelo, de sus características físico-químicas, de su biodiversidad y de los ciclos bio- geodinámicos. Todo Io anterior conlleva Ia más rápida y mejor reimplantación de Ia cubierta vegetal en las zonas tratadas con el HMA objeto de Ia invención, favoreciendo su recuperación. Asimismo el HMA colabora en el secuestro o retención de elementos químicos potencialmente nocivos para Ia salud de las plantas, animales, microorganismos beneficiosos y medio ambiente.
El HMA objeto de Ia invención se puede aplicar así mismo como potenciador del reestablecimiento (recuperación y restauración) de Ia cubierta vegetal de suelos degradados, y para Ia revegetación de zonas alteradas sometidas a estreses bióticos y abióticos. En este sentido los suelos a revegetar pueden ser, entre otros, taludes de carreteras, zonas mineras, zonas quemadas, zonas desertificadas, suelos contaminados, suelos infestados, suelos degradados por exceso de sales, suelos calcáreos, suelos de pH extremos, etc. La inoculación de plantas con aislados HMA originarios de los suelos a recuperar, y su reintroducción en esos mismos suelos, asegura el mantenimiento de Ia biodiversidad de los mismos, así como de sus condiciones fisico-químicas, favoreciendo Ia reinstauración de Ia cubierta vegetal propia del área en cuestión. Asimismo, constituye otro aspecto de Ia presente invención los procedimientos de micorrización, in vitro (plantas micropropagadas durante o inmediatamente después de su fase de enraizamiento, y antes de Ia fase de aclimatación) y ex vitro (plantas micropropagadas durante Ia fase de aclimatación, y semilleros, alvéolos, plantones, plantas de vivero o cualquier otra planta obtenible a partir de técnicas convencionales), que utilicen el hongo objeto de Ia presente invención. Es decir, desarrollar una planta (o células de una planta) en una solución de cultivo que contiene el hongo de Ia invención, o a Ia que se aplique el hongo objeto de Ia invención en cualquiera de sus estadios de desarrollo
Aunque Ia adición de hongos formadores de micorrizas arbusculares capaces de establecer simbiosis con plantas se haya utilizado con anterioridad con los mismos propósitos, Io que se demuestra en los ejemplos y figuras que se adjuntan a continuación es que el hongo objeto de Ia invención presenta resultados claramente sorprendentes al compararlo con otros hongos del mismo género y de gran similitud (ver tabla 1 ). Por ejemplo, al comparar los resultados obtenidos tras Ia inoculación de plantas con el hongo objeto de Ia invención así como con G. intraradices MUCL43194, una cepa cuya secuencia SSU presenta un 99.8 % de similitud con Ia secuencia SSU (SEQ ID NO:1 ) del hongo de Ia invención, se demuestra que el hongo objeto de Ia invención en condiciones adversas (e.g. riego con agua conteniendo elevadas concentraciones de metales pesados y otros xenobióticos) incrementa significativamente Ia supervivencia de las plantas con respecto a los otros HMA que no están adaptados a dichas condiciones extremas.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención. EXPLICACIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1 : Microscopía óptica y electrónica de esporas juveniles del hongo objeto de Ia invención cultivado en condiciones in vitro. 1.1., grupo de dos esporas con hifas de sustentación. Barra de escala=20 μm; 1.2., separación de Ia pared celular de Ia espora en las capas sw1 , sw2 y sw3. Barra de escala=20 μm; 1.3. vista de las tres capas sw a microscopio electrónico. Barra de escala=0.5 μm; 1.4., esporas deformes pero perfectamente viables formadas por el hongo objeto de Ia invención en reactivo de Melzer. Barra de escala=50 μm; 1.5, detalle de espora deforme. Barra de escala=20 μm; 1.6., detalle de espora deforme en que se distinguen perfectamente sus capas sw. Barra de escala=20 μm.
FIG. 2: Microscopía óptica y electrónica de esporas maduras del hongo objeto de Ia invención cultivado en condiciones in vitro. 2.7., espora con hifa de sustentación. Barra de escala=20 μm; 2.8. a 2.10., arquitectura de Ia pared esporal. Barra de escala=20 μm; 2.11., ultraestructura de Ia pared esporal a microscopía electrónica de transmisión. Barra de escala=1
FIG. 3. Fotomicrografías de Ia colonización intrarradical de raíces de zanahoria (Daucus carota L., clon DC2) creciendo en cultivo in Vitro (monoxénico) con el hongo objeto de Ia invención (a-d) y del crecimiento extrarradical de éste (e-h). a, puntos de entrada y vesículas, b, colonización arbuscular masiva, c, detalle de hifa con vesículas intrarradicales. d, detalle de ovillos arbusculados.
FIG. 4 y 5. Árboles filogenéticos en los que se comparan el resultado del análisis SSU del hongo objeto de Ia invención con las secuencias publicadas de otros miembros de Ia familia Glomeraceae.
FIG. 6. Huellas genéticas del hongo objeto de Ia invención y de otros miembros de referencia de Ia familia Glomeraceae obtenidas por rep-PCR y su comparación electroforética. FIG. 7. Diferentes imágenes comparativas del crecimiento de plantas en distintos suelos en el que se muestran las propiedades del hongo objeto de Ia invención (H) con respecto el hongo G. intraradices.
(a) suelos naturales contaminados (ver tabla 2)
(b) control, plantas no inoculadas.
(c) Plantas inoculadas con el hongo de Ia invención (H)
(d) Plantas inoculadas con el hongo G. intraradices.
FIG. 8. Gráfica comparativa de los resultados de supervivencia y crecimiento obtenidos en el Experimento 2.
El eje de las Y representa el peso medio seco de las plantas en gramos (g) H representa el hongo de Ia invención
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Con el fin de comprobar los efectos del objeto de Ia invención descrito anteriormente, se realizaron diversas pruebas aplicando el inoculante sobre semillas y plantas micropropagadas en condiciones in vitro y ex vitro. Los resultados se muestran en los siguientes ejemplos.
EJEMPLO 1. Análisis morfológico
Materiales y Métodos:
Se aislaron esporas (de una muestra de suelo) y micelio extrarradical (ERM) de todos los estadios de desarrollo del hongo propagado in vitro, y esporas maduras fueron recuperadas de cultivo de macetas (cultivo ex vitro). El material fúngico fue montado en portas con alcohol polivinílico/ ácido láctico/ glicerol (PVLG) y también con una mezcla de PVLG y reactivo de Melzer (1 :1 , v/v). Las esporas (tanto intactas como aplastadas) fueron observadas con un microscopio Nikon Eclipse 800 equipado con óptica de contraste de fases Normarski. Se tomaron microfotografías con una cámara Nikon Coolpix 4500. Se siguió Ia terminología de las esporas de Walker (1983) (Walker, 1983. Mvcotaxon 18: 443-455) y Stürmer & Morton (1997) (Stürmer y Morton, 1997. Mvcoloqia 89, 72-81 ). Las observaciones de color se hicieron en base al código de cuadro de colores del International Culture Collection of Arbuscular and vesicular-arbuscular mycorrhizal Fungi (INVAM).
Para Ia microscopía electrónica de transmisión (TEM) las esporas se trataron con un buffer fosfato al 0.2M con 2,8% de glutaraldehido, y 1.5% de p- formaldehido a 40C durante 18 horas, lavadas y centrifugadas en agua doblemente destilada, post-fijadas en un 2% de ácido ósmico acuoso, deshidratadas, teñidas con acetato de uranilo, y embebidas en LRWhite (London Resin Company Ltd.). Se montaron secciones ultrafinas en parrillas y se observaron en un microscopio electrónico Zeiss EM902 a 80 kv.
Resultados (Descripción morfológica) FIG.1 y 2:
Los hongos de Ia presente invención tienen esporocarpo ignoto, esporas aisladas o en agregados lábiles de 2 a 5 esporas, producidas distal o intercalarmente a Io largo de las ramificaciones de las hifas, Ia hifa distal rápidamente septada y colapsada, diferenciadas en su producción intra o extraradical. Las esporas juveniles (cultivos in vitro de 4 meses, FIG. 1 ) son hialinas a amarillo pálido, globosas, de 42-90 μm de diámetro, ovoides a piriformes, 62-67 - 72-77 μm de diámetro, de superficie lisa. La pared de las esporas jóvenes constituye una única pared con tres capas detectables con un grosor total de 2.0-4.8 μm. La pared externa (sw1 ) es hialina, de 0.5-1.0 μm de grosor, mucilaginosa, evanescente, débilmente reactiva al reactivo de Melzer; Ia capa intermedia (sw2) es hialina, de 1.0-1.5 μm de grosor, rígida, a veces doble, distinguible pero no fácilmente diferenciable de Ia capa 1 , y no reacciona frente al reactivo de Melzer; Ia pared interna (sw3) es hialina a amarillo pálido, 1.6-2.8 μm de grosor, laminada con una débil ordenación de las láminas, no reactiva frente a Melzer.
La hifa de sustentación de las esporas jóvenes persiste en Ia espora, y es recta a ligeramente acampanada, de 6.4-(9.6-14.4) μm de diámetro en Ia base de Ia espora. El poro está abierto, de 6.4 a 7.2 μm. Las paredes de Ia hifa de sustentación son continuas con Ia pared de Ia espora, y de 3.6 - 4.8 μm de grosor en el punto de unión con Ia espora, decreciendo a 1.5 - 2.0 μm de grosor a las 30-35 μm desde Ia espora. La pared externa (sw1 ) adelgaza en rápidamente, entre 5-10 μm desde Ia hifa de sustentación, mientras que las paredes media e interna (sw 2-3) se detectan hasta 30 μm desde Ia espora. Las esporas maduras extrarradicales (cultivos in vitro y ex vitro de 12 meses) son de amarillas pálidas (0/0/60/0), a amarillas-pardas (0/30/100/0), globosas a subglobosas, de 110-172 μm de diámetro (tamaño medio 125-140 μm), ovoides a elipsoides, a veces amigdalazas a tuberculadas, de 72-91 x 104-124 μm de tamaño.
Las paredes de las esporas maduras (FIG. 2) están hechas de 5 capas en tres grupos: el grupo 1 Io constituyen las capas sw 1-2, con Ia capa externa (sw 1 ) hialina, mucilaginosa, evanescente, de grosor irregular (0.8-2.5 μm de grosor), rojiza al reactivo de Melzer, siempre presente en esporas obtenidas in vitro, generalmente ausente o mucho mas delgada en esporas obtenidas ex vitro. La capa sw2 es hialina a amarilla (0/0/60/0), rígida, de 1.6 - 2.9 μm de grosor, con Ia superficie externa lisa y Ia superficie interna ocasionalmente granular según se observa en esporas cultivadas ex vitro, ninguna de ellas reactiva al reactivo de Melzer, y fácilmente separables de Ia sw1. El grupo 2 Io constituyen Ia capa sw3, que es hialina, rígida, de superficie lisa, 1.5-2.8 μm de grosor, que se rompe en piezas poligonales cuando se Ie aplica presión y no reactiva al Melzer. El grupo 3 está constituido por las capas sw 4-5, siendo Ia sw 4 amarilla (0/10/80/0) a amarilla-parda (0/30/100/0), laminada, de superficie lisa y 2.6-4.8 μm de grosor, muy reactiva al Melzer; y Ia sw 5 hialina, semi-rígida a flexible, de superficie lisa, y de 0.8 - 1.0 μm de grosor, no fácilmente separable de Ia capa 4 y no reactiva al Melzer.
Las capas de Ia pared de las esporas con formas irregulares están hechas de 3 capas detectables similares a las de las esporas juveniles. La hifa de sustentación de las esporas maduras es cilindrica, de 9.6-12.8 μm de diámetro en Ia espora, o ligeramente acampanada de 12.8-14.4 μm de diámetro, de igual color que Ia espora. La pared de las hifas de sustentación tiene un grosor de 3.2-4.8 μm al nivel del poro y está hecha de las capas de Ia pared esporal con Ia excepción de Ia capa sw5 que permaneció indetectable y sw1 que decrecía en grosor entre los primeros 5-10 μm desde Ia espora. Poro abierto de 1.5-2.6 μm de diámetro, ocasionalmente cerrado por el engrosamiento de las paredes de Ia hifa de sustentación, raramente cerrado por un septo curvo al nivel del poro provocado por Ia capa sw5. Esporóforo único, de 35 a 300 μm de longitud, 6.5-12.0 μm de anchura con Ia pared en continuidad directa con Ia de las hifas exploradoras. Las esporas intrarradicales se diferencian en grupos laxos que deforman los tejidos de Ia raíz y modifican las capas epidérmicas hasta su liberación desde Ia raíz. Las esporas juveniles son amarillas pálidas a amarillas doradas de 68-74 μm de diámetro; las esporas maduras son amarillas a amarillas pardas, globosas a subglobosas, de 100-156 μm de diámetro, nunca ovoides, amigdaloides o tuberculadas. Esporas juveniles o maduras pueden producirse en el mismo segmento de raíz y ser encontradas en los mismos grupos de esporas. La pared esporal, hifa de sustentación y red de hifas de las esporas intrarradicales juveniles o maduras son similares a las descritas para las esporas extrarradicales.
Estado micorrícico: El hongo objeto de Ia invención produce una fuerte colonización arbuscular que comienza con Ia entrada de una hifa guía en Ia raíz, formando un grueso apresorio. La colonización intraradical recuerda a Ia micorriza de tipo Paris. Los arbúsculos se forman a menudo de célula a célula, y no son frecuentes las hifas intercelulares o están ausentes (Fig. 3a y c). Los arbúsculos son bastante especiales, recordando más a ovillos arbusculares ("arbusculate cois) (Fig. 3b y d), y recordando a los formados por G. mosseae más que a los formados por G. intrarradices. Las vesículas no son frecuentes, aunque se encuentran a veces en bajo número. Tienen forma de pera y se forman intercelularmente, tiñéndose más débilmente que las esporas cuando se tiñe con azul de tripán.
Asociación micorícica: en el campo, el hongo objeto de Ia invención ha sido aislado de Ia rizosfera de un consorcio de plantas pertenecientes principalmente a las familias Compositae (Chamaemelum sp., Carduus sp., Chrisanthemum sp.), pero que también incluía plantas de las familias Boraginaceae (Echium sp.), Cistaceae {Cistus sp.) y Graminaceae (Avena sp.). Tras seis semanas en cultivo monoxénico utilizando el medio mínimo "M" (Chabot et al., 1992. Mvcologia 84(3):315-321 ) con raiz de zanahoria transformada (Daucus carota L., clon DC-2) Ia colonización media de las raíces fue del 42.0% (21.8 s.d.) (FIG. 3). En cultivo de macetas (cultivo ex vitro) en invernadero junto con diferentes hospedadores como Allium porrum L., y Trífolium sp. Ia colonización micorrícica media de las raíces fue de un 50-80%.
EJEMPLO 2. Análisis molecular del hongo objeto de Ia invención.
Material y métodos:
Análisis por PCR de Ia región 18S del ADN: Se muestrearon aproximadamente 1000 esporas a partir de cultivo monoxénico, disolviendo el medio de cultivo de acuerdo con el método de Doner y Bécard (1991 ) (Doner y Bécard (1991 ). Biotechnology Techniques 5: 25-28). La extracción de ADN se llevó a cabo siguiendo un protocolo que utiliza el buffer de extracción CTAB, extracción de proteínas con fenol-cloroformo y precipitación con isopropanol. El ADN fue resuspendido en 50 μL de buffer TE (1OmM Tris-HCI, 1mM EDTA, pH 7.5).
Las reacciones PCR se llevaron a cabo con 1/10 del extracto de ADN. Los siguientes reactivos fueron adicionados: 1x PCR buffer (20 mM Tris-HCI (pH 8.4), 50 mM KCI, Invitrogen, USA), 1.5 mM MgCl2, 0.2 μM de cada rADN primer, 200 μM de cada dNTP (Finnzymes Oy, Finland), 2.5 unidades de Taq ADN polymerase (Invitrogen, USA). Los dos primers usados fueron VANsI (Simón et al., 1993. Appl. Environ. Microbiol. 59, 4211-4215) y NS8 (White et al., 1990. In: PCR protocols: a guide to methods and applications. Part 3. Academic Press, Inc. 315-322). La amplificación fue llevada a cabo en una máquina PTC200 DNA (MJ Research, USA) bajo el siguiente protocolo: una primera etapa de desnaturalización a 940C durante 5 min., seguido de 40 ciclos a 940C durante 30 s., 550C durante 1 min. Y 720C durante 2 min. La amplificación terminaba con un paso final de elongación a 720C durante 10 min.
El producto PCR fue clonado en Escherichia coli utilizando el sistema de clonado Gateway (Invitrogen, USA) y secuenciado usando el kit de secuenciación "DYEnamic ET terminador cycling" (cat n° US 810 50, Amersham Pharmacia Biotech, GB). Los clones fueron secuenciados utilizando los siguientes primers: NS1 , NS2, NS3, NS4, NS5, NS6, NS7, NS8 (White et al., 1990. In: PCR protocols: a guide to methods and applications. Part 3. Academic Press, Inc. 315-322). Las secuencias fueron analizadas con un secuenciador automático {CEQ™ 2000 XL DNA analysis system, Beckam Coulter Inc., USA), editadas con Sequencher v.4.1.4 (Gene Code Corporation, Ann Arbor, Ml), alineadas con Clustal X 1.5 (Thompson et al., 1997. Nucleic Acids Research, 25:4876-4882) y corregidas manualmente.
Para completar el análisis las secuencias SSU obtenidas fueron comparadas con el alineamiento (ALIGN_000124) utilizado por Schwarzott et al. (2001 ) (Schwarzott et al., 2001. Mol. Phyloqen. Evol. 21 :190-197). Los árboles filogenéticos fueron obtenidos mediante análisis "neighbor joining" bajo Ia biparamétrica de Kimura en PAUP v.4.0b10 (Swofford, 2003. PAUP. Phylogenetic analysis using parsimony. Versión 10. Sinauer, Sunderland, MA). Los árboles fueron evaluados por análisis "bootstrap" (1000 repeticiones para "neighbor joining". Análisis por rep-PCR: El ADN total fue extraído a partir de esporas obtenidas de cultivo monoxénico utilizando el kit FastDNA (Carlsbad, CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante para material fúngico. La amplificación PCR fue ajustada para obtener un volumen final de 20 μl_. Se empleó con aproximadamente 1-10 ng del ADN de base utilizando los siguientes reactivos: tampón 1X Titanium Taq (BD Biosciences); 0.5μM del primer ERIC IR :1 R (SEQ ID NO: 1 ); 21 (SEQ ID NO: 2) (Invitrogen); 2mM de cada dNTPs (Invitrogen); 1X Titanium Taq mix (Ultratherm Taq DNA polymerase 250 μ; BD Titanium Taq DNA polymerase 1 :9). La amplificación se llevó a cabo en un termociclador de ADN (Mastercycler ep Gradient S) utilizando el siguiente protocolo: desnaturalización a 95°C durante 7min, 35 ciclos a 940C durante 3s, 920C durante 3Os, 5O0C durante 1 min, 650C durante 1 min 3Os, y una etapa de elongación a 650C durante 8min.
Resultados:
Análisis por PCR de Ia región 18S del ADN: La secuencia obtenida para el hongo objeto de Ia invención por análisis PCR de Ia subunidad ribosomal 18S SEQ ID NO: 3. Las secuencias SSU de los clones seleccionados fueron insertadas en los alineamientos de genes SSU de hongos micorrícicos arbusculares publicados por Schwarzott et al. (2001 ) (Schwarzott et al., 2001. Mol. Phylogen. Evol. 21 :190-197). El árbol filogenético obtenido (FIG. 4 y 5) usando el análisis "neighbour joining" mostró que las secuencias del hongo objeto de Ia invención se agrupaba en el Grupo 1 de Ia familia Glomeraceae descrita por Schussler et al. (2001 ) (Schussler et al., 2001. Mvc. Res. 105, 1413-1421 ), y está próximamente relacionado con las secuencias de G. intraradices (Tabla 1 ): 99,6% de similitud con Ia secuencia de G. intraradices DAOM 197198 (que es un consenso de las secuencias con n° de acceso GeneBank AJ301859 y X58725) proveniente de esporas obtenidas ex Vitro; y 99,8 de similitud con G. intraradices MUCL 43194 AFTOL proveniente de esporas en cultivo in Vitro (Lutzoni et al., 2004. American Journal of Botany 91 (10): 1446-1480). Tabla 1 : Porcentaje de similitud con Ia secuencia SSU del hongo de Ia invención (H) con respecto a las secuencias SSU de diferentes especies de hongos pertenecientes a Ia familia Glomeraceae.
Figure imgf000019_0001
Análisis por rep-PCR:
Las huellas genéticas obtenidas a partir de Ia comparación mediante rep-PCR entre el hongo objeto de Ia invención y cepas de referencia de G. intraradices Schenck & Smith, G. clarum Nicolson & Schenk y G. claroideum Schenck & Smith permitieron segregar el hongo objeto de Ia invención de las otras especies de Glomus ensayadas (FIG. 6a). Las huellas genéticas obtenidas revelaron que el perfil genético del hongo objeto de Ia invención difería considerablemente de las otras especies de Glomus, que compartían entre ellas Ia totalidad de las bandas expresadas (FIG. 6b).
EJEMPLO 3. Ensayos de supervivencia de plantas en diversas condiciones de estrés. Material y métodos:
Semillas de trébol (Trifolium pretense L., var. Violeta) fueron esterilizadas en superficie (lejía diluida al 5% con agua) y pregerminadas en vermiculita autoclavada (1210C, 20 min.). Tras una semana las pántulas fueron transferidas a macetas de 300 mi de volumen conteniendo bien suelo natural de las orillas del Río Tinto (a su paso por Nerva, Huelva, España) (Tabla 2) (Experimento 1 ), o bien suelo agrícola mezclado con arena de cuarzo (1 parte de suelo por 9 de arena v:v) tindalizado durante tres días consecutivos (Experimento 2). En ambos casos una tercera parte de las macetas fueron inoculadas con el hongo objeto de Ia invención, otra tercera parte con el hongo micorrícico de referencia G. intraradices DAOM197198, y Ia otra tercera parte fueron dejadas sin inocular (controles). Se prepararon ocho repeticiones por tratamiento. Las macetas del Experimento 1 se regaron tres veces en semana con agua corriente, mientras que las del Experimento 2 se regaron tres veces en semana con 0, 25, 50 y 100% de agua del Río Tinto diluida en su caso con agua corriente. En el Experimento 2 los riegos comenzaron una semana después del transplante de las plántulas. Tres semanas tras el inicio del experimento se redujo el número de plantas por maceta para que quedasen 3 plántulas en cada una de ellas. Los dos experimentos (1 y 2) se mantuvieron en cámara de cultivo (24°/18° C día/noche, 12 horas de fotoperiodo) durante cuatro meses.
Pasado este tiempo Ia parte aérea de las plantas de cada tratamiento fue recolectada y su peso fresco anotado. Muestras de las raíces de cada tratamiento fueron evaluadas para constatar su colonización micorrícica de acuerdo con el método de tinción y recuento de Philips y Hayman.
Tabla 2: Composición del suelo de las orillas del Rio Tinto y comparación con un suelo de Ia zona de Huelva no contaminado.
Figure imgf000021_0001
Resultados:
Las plantas de trébol se desarrollaron inicialmente bien en ambos Experimentos. Sin embargo, seis semanas tras el inicio del ensayo ya se observaban diferencias claras entre los tratamientos. En el experimento 1 (suelo natural del Rio Tinto) todas las plantas parecían saludables, pero las inoculadas con el objeto de Ia invención eran las mayores, mientras que las plantas control (no inoculadas) eran las mas pequeñas (FIG. 7a). En el experimento 2 (agua del Rio Tinto) las plantas no inoculadas (control) eran mas pequeñas que las inoculadas, y dos meses después del inicio del experimento las que estaban siendo regadas con el 100% de agua del Rio Tinto empezaron a morir (FIG. 7b, columna derecha de macetas). Para este tiempo las plantas inoculadas tanto con el objeto de Ia invención como por G. intraradices se desarrollaban aún correctamente (FIG. 7c, 7d) con las tratadas con el objeto de Ia invención y regadas con el 25% de agua del Rio Tinto siendo las mayores; y las inoculadas con G. intraradices y regadas con el 100% del agua del Rio Tinto siendo las menores y comenzando a mostrar algunos síntomas de toxicidad (FIG. 7d, inserto). Transcurridos cuatro meses tras el inicio del ensayo no se observaban diferencias entre las plantas inoculadas o no en el experimento 1 (datos no mostrados), y sus pesos secos oscilaban entre 0,40 y 0,65 g. En este tiempo todas las plantas regadas con el 100% de agua del Río Tinto (Experimento 2) habían muerto (ya hubiesen sido inoculadas o no, FIG. 8, porcentajes en Ia parte superior de las columnas). Las plantas no inoculadas y aquellas inoculadas con el aislado no autóctono (G. intrarradices) que habían sido regadas con agua de Rio Tinto al 50% habían muerto también; mientras que el 12,5% de las plantas inoculadas con el hongo autóctono (objeto de Ia invención) sobrevivieron (Fig. 8). Las tasas de supervivencia fueron 62,5% tanto para las plantas no inoculadas (control) y las inoculadas con G. intraradices que habían sido regadas con agua del Río Tinto al 50%, mientras que para las inoculadas con el objeto de Ia invención alcanzaron un 87,5% (Fig. 8). En el caso de las plantas regadas con el 0% de agua del Río Tinto (es decir, plantas regadas con agua corriente) todas las plantas inoculadas sobrevivieron, mientras que sólo el 87,5% de las plantas no inoculadas Io hicieron (Fig. 8).
Tras cosechar las plantas Ia colonización micorrícica de las raíces fue analizada (Tabla 3). Todas las plantas del experimento 1 , ya fueran inoculadas o no, presentaban colonización por micorrizas arbusculares, sin que existiesen diferencias estadísticas en términos de colonización entre ellas. En el caso del experimento 2, las plantas control no presentaron colonización micorrícica. Las plantas inoculadas con G. intraradices o con el hongo objeto de Ia invención presentaron diferencias estadísticas en Ia colonización, con G. intraradices se mostró una mayor tasa de colonización que el hongo objeto de Ia invención en todos los casos. Es importante remarcar que el incremento en Ia concentración de agua del Río Tinto afectó muy negativamente Ia colonización del hongo no autóctono G. intrarradices. Por el contrario, Ia colonización micorrícica por el hongo autóctono objeto de Ia invención se mantuvo en todos los tratamientos. Las raíces de las plantas tratadas con el 100% del agua del Río Tinto en todos los tratamientos, así como aquellas tratadas con el 50% de agua del Río Tinto en los tratamientos control y G. intraradices fueron imposibles de analizar en cuanto a su colonización micorrícica debido a su importante estado de degradación.
No se encontraron diferencias estadísticas entre plantas inoculadas o no en el experimento 1 en Io que se refiere a peso seco al final del ensayo. Los resultados de los análisis de peso seco en el experimento 2 se muestran en Ia Fig. 8. Se obtuvieron diferencias significativas entre las plantas control y las inoculadas con ambos hongos micorrícicos en los tratamientos 0% y 25% del agua del Río Tinto. No hubo diferencias significativas entre las plantas inoculadas con G. intraradices o el hongo objeto de Ia invención, aunque estas últimas fueron ligeramente mas grandes. Las únicas plantas regadas con el 50% de agua del Río Tinto que fueron capaces de sobrevivir fueron las inoculadas con el hongo objeto de Ia invención; aún así permanecieron pequeñas y mostraron ciertos síntomas de toxicidad.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un hongo perteneciente a Ia cepa con número de depósito MUCL 51732.
2. Célula de raíz que comprende el hongo según Ia reivindicación 1.
3. Raíz micorrizada que comprende Ia célula según Ia reivindicación 2.
4. Una espora o una hifa del hongo según Ia reivindicación 1.
5. Composición que comprende el hongo según Ia reivindicación 1.
6. Composición según Ia reivindicación 5 que además comprende otro hongo micorriza arbuscular (HMA).
7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6 que además comprende otro microorganismo.
8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 que además comprende un aditivo seleccionado de entre fertilizantes orgánicos o inorgánicos, agentes químicos o biológicos promotores del crecimiento de las plantas, agentes químicos o biológicos protectores de las plantas, insecticidas, nematocidas o bactericidas.
9. Sustrato que comprende Ia composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8.
10. Uso de Ia a composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 para su aplicación a un sustrato de cultivo, al agua de riego, a raíces y/o a semillas.
11. Uso del hongo según reivindicación 1 , de Ia composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 o del sustrato según Ia reivindicación 9 para estimular el crecimiento de una planta o parte de una planta.
12. Uso del hongo según reivindicación 1 , de Ia composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 o del sustrato según Ia reivindicación 9 para proteger una planta del ataque de patógenos.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12 donde Ia planta se selecciona de entre Ia familia Leguminoseae, Compositeae, Boraginaceae, Cistaceae o Graminaceae.
14. Uso según reivindicación 12 donde Ia planta se selecciona de entre los géneros Trífolium, Chamaemelum, Carduus, Chrísanthemum, Echium, Cistus, Allium o Avena.
15. Uso del hongo según reivindicación 1 , de Ia composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 o del sustrato según Ia reivindicación 9 para Ia recuperación de suelos o áreas degradadas.
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