ES2343235B1 - Hongo formador de micorrizas arbusculares y su uso para estimular el crecimiento de plantas. - Google Patents
Hongo formador de micorrizas arbusculares y su uso para estimular el crecimiento de plantas. Download PDFInfo
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- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
Abstract
Hongo formador de micorrizas arbusculares y su
uso para estimular el crecimiento de plantas.
La presente invención se encuentra dentro del
campo de la recuperación de áreas degradadas, revegetación,
producción de inoculantes micorrícicos y biofertilizantes,
agricultura ecológica y producción viverística. Se refiere a un
nuevo hongo micorrícico arbuscular (HMA) que establece simbiosis
micorrícica con la mayoría de plantas de interés económico y
ecológico (horto-frutícolas, ornamentales,
utilizadas para revegetación, etc.) y que aumenta su supervivencia,
vitalidad y producción, especialmente en condiciones de altas
concentraciones de metales pesados y otros xenobióticos, y reduce la
necesidad de aplicación de fertilizantes químicos, pesticidas y
fitosanitarios.
Description
Hongo formador de micorrizas arbusculares y su
uso para estimular el crecimiento de plantas.
La presente invención se encuentra dentro del
campo de la recuperación de áreas degradadas, revegetación,
producción de inoculantes micorrícicos y biofertilizantes,
agricultura ecológica y producción viverística. Se refiere a un
nuevo hongo micorrícico arbuscular (HMA) que establece simbiosis
micorrícica con la mayoría de plantas de interés económico y
ecológico (horto-frutícolas, ornamentales,
utilizadas para revegetación, etc.) y que aumenta su supervivencia,
vitalidad y producción, especialmente en condiciones de altas
concentraciones de metales pesados y otros xenobióticos, y reduce la
necesidad de aplicación de fertilizantes químicos, pesticidas y
fitosanitarios.
Las micorrizas arbusculares, una de las
simbiosis mas ampliamente extendidas en el mundo, aparecen en un
amplio rango de hábitats, desde ecosistemas templados hasta los que
soportan las condiciones mas extremas, como las selvas tropicales o
suelos antárticos. Los hongos implicados en esta interacción
micorrícica pertenecen al recientemente descrito taxon
Glomeromycota (Schussler et al., 2001. Mycol.
Res. 105:1413-1421), que incluye menos de 200
especies descritas, distribuidas por todo el mundo. Los beneficios
que los hongos formadores de micorrizas arbusculares (HMA) reportan
al sistema suelo-planta han sido de sobra
contrastados y descritos, de manera que su uso potencial como
biofertilizantes ecológicos y herramientas útiles en programas de
biorremediación y recuperación de áreas contaminadas y/o degradadas
está ampliamente aceptado. Aumentan la superficie absorbente del
sistema radicular y mejoran las propiedades físicas de los suelos
mediante la formación de agregados estables. A su vez, la glomalina,
una glicoproteína específica de estos hongos, acelera los procesos
de formación de micro agregados estables en el suelo, mejorando así
su estructura física, incrementando los niveles de oxígeno, y
facilitando una mejor colonización del organismo. De hecho se han
obtenido buenos resultados utilizando los HMA para recuperar suelos
desertificados, áreas naturales afectadas por estreses hídricos o
salinos y, en particular, áreas contaminadas naturalmente o bien por
la mano del hombre con metales pesados (Vivas et al., 2003.
Env. Pollution 126:179-189).
Es conocido que, de forma general, la presión
evolutiva que se produce sobre los organismos que habitan en
condiciones extremas origina la adquisición de caracteres
particulares por parte de estos, muchos de ellos adecuados para la
supervivencia en dichos medios. Un área natural que puede ser
considerada como paradigmática como ecosistema degradado por efecto
natural y antropogénico es la cuenca minera del Río Tinto (Huelva,
España). Este río discurre por mas de 90 km a través de un cinturón
pirítico que confiere a sus aguas un pH de 2, elevadísimas
concentraciones de Fe (2 g/l), Mg (1.3 g/l), Cu (390 mg/l), Zn (280
mg/l) y Mn (100 mg/l) entre otros metales pesados, de los que
proviene su color rojo. A pesar de estas condiciones extremas, las
aguas del Río Tinto contienen una sorprendentemente elevada
diversidad microbiana que consisten no sólo en bacterias, sino
también organismos eucarióticos como algas, amebas y hongos (entre
otros).
Son muy pocas las plantas capaces de crecer en
determinadas condiciones adversas, como suelos degradados,
contaminados por el hombre o regados/afectados por aguas altamente
contaminadas por metales pesados, suelos con elevado contenido en
carbonatos, etc., dificultando la implantación de sistemas de
biorremediación en estos suelos. La adición de hongos formadores de
micorrizas arbusculares capaces de establecer simbiosis con plantas
en suelos con estas características, como se ha dicho, aumentaría la
superficie absorbente del sistema radicular de las plantas y
mejoraría las propiedades físicas de los suelos mediante la
formación de agregados estables, facilitando su biorremediación así
como la presencia de una cubierta vegetal estable y autóctona que
mejorase globalmente estos ecosistemas dañados.
Los autores de la presente invención han aislado
y puesto en cultivo in Vitro continuo un nuevo hongo formador
de micorrizas arbusculares (HMA) de los bancales del Río Tinto
(Huelva, España). Los autores han realizado ensayos que demuestran
que el establecimiento de la simbiosis micorrícica entre este nuevo
hongo y diversas plantas confiere protección especial a éstas cuando
crecen en condiciones adversas, tales como suelos regados por aguas
altamente contaminadas por metales pesados, suelos con elevado
contenido en carbonatos, o en condiciones de producción viverística.
Esta protección se muestra especialmente en un incremento importante
de la supervivencia de estas plantas en esas condiciones, además de
notables efectos positivos sobre su crecimiento y desarrollo.
La presente invención describe una nueva especie
de HMA (hongos micorrízicos arbusculares) al que le ha sido asignado
el código MUCL 51732, en el Belgian Co-ordinated
Collection of Microorganims (BCCMTM). Esta nueva especie ha sido
caracterizada taxonómicamente por una combinación de técnicas
morfológicas y moleculares.
Muchas plantas presentan micorrizas para
aumentar la absorción de agua y sales minerales del suelo. Las
micorrizas son la asociación entre raíces de una planta y el micelio
de un hongo, de forma que toda la extensión del micelio participa en
la absorción de nutrientes para la planta. En la Naturaleza esta
simbiosis se produce espontáneamente. Se estima que entre el 90 y el
95% de las plantas superiores presentan micorrizas de forma
habitual.
Es posible que un mismo hongo forme la micorriza
con más de una planta a la vez, estableciéndose de este modo una
conexión entre plantas distintas; esto facilita la existencia de
plantas parásitas, que extraen todo lo que necesitan del hongo
micobionte y las otras plantas con las que éste también establece
simbiosis. Así mismo, varios hongos (en ocasiones de especies
diferentes) pueden micorrizar una misma planta al mismo tiempo.
El hongo de la presente invención es del género
Glomus que pertenece al Superreino Eukaryota, (grupo
Metazoa/Fungi), Reino Fungi, Phylum
Glomeromycota, Clase Glomeromycetes, Orden
Glomerales, Familia Glomeraceae.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se
refiere a un hongo del género Glomus, depositado bajo el
Tratado de Budapest en el Belgian Co-ordinated
Collection of Microorganims (BCCMTM), con el código MUCL 51732.
A partir de ahora, hongo objeto de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
espora o una hifa del hongo de la invención a partir de las cuales
se generaría dicho hongo. A partir de ahora, esporas o hifas de la
invención.
Entendiéndose por espora una célula reproductiva
del hongo que emitir un tubo germinativo y micorrizar plantas hasta
reproducirse y las hifas, los filamentos que, reunidos, forman el
micelio del hongo. Una hifa típica micorrícica consiste en un
filamento cilíndrico, ya sea intrarradical o extrarradical,
constituido por un plasmalema cenocítico (tipicamente aseptado en la
mayor parte de su ciclo vital) multinucleado envuelto en una pared
celular de quitina que puede dar origen a diversas estructuras
intrarradicales (arbúsculos, ovillos arbusculados, ovillos,
vesículas) o extrarradicales (estructuras ramificadas de absorción
ligadas o no a esporas, etc.).
El hongo objeto de la invención produce una
fuerte colonización arbuscular que comienza con la entrada de una
hifa guía en la raíz, formando un grueso apresorio.
El apresorio corresponde a una estructura plana,
como un bulbo, que se forma cuando la hifa establece el contacto con
la superficie e incrementa su diámetro, aumentando la zona de unión
entre los dos organismos, lo cual permite que el patógeno se una con
mayor firmeza a la planta.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
célula de la raíz de una planta que comprende el hongo de la
invención, así como o raíz micorrizada de dicha planta.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
composición que comprende el hongo, la espora o la hifa de la
invención. Dicha composición opcionalmente comprende, al menos, otro
microorganismo, preferiblemente otro hongo micorrícico arbuscular
(HMA) y más preferiblemente del género Glomus. Además, esta
composición puede incluir aditivos o nutrientes así como otros
compuestos seleccionados de entre fertilizantes orgánicos o
inorgánicos, insecticidas, nematicidas o bactericidas o agentes de
promoción del crecimiento, la nutrición o la protección de las
plantas, cualquiera que sea su origen.
Esta composición, serviría como inoculante, o
medio de micorrización. Por ejemplo, la composición podría ser un
inoculante micorrícico líquido, tipo gel o sólido que, además del
hongo de la invención, bien como esporas de resistencia, como
micelio extraradical arbuscular, raíces micorrizadas o como todos
ellos, comprendiera otras sustancias utilizadas de forma común en el
cultivo de hongos HMA.
Por otro lado, bien la composición, bien el
hongo, esporas, hifas o raíces micorrizadas de la invención pueden
ser útiles para la formación de un sustrato, o cualquier material
usado como soporte para cultivar plantas o germinar semillas. Por
tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un
sustrato que comprende la composición, el hongo, esporas, hifas o
raíces micorrizadas de la invención así como cualquier soporte útil
en el cultivo o germinación, que se puede seleccionar de la lista
que comprende, pero sin limitarse, turba, arena, perlita,
vermiculita, sepiolita, minerales de arcilla, fibra de coco, corteza
de pino o cualquiera de sus combinaciones.
El objeto de la presente invención es asimismo
la utilización de esta nueva especie de HMA tanto sólo, como en
combinación con otros microorganismos cualesquiera, en formulados a
base de micorrizas para su posterior aplicación como
biofertilizantes, inoculantes, enmendantes, recuperadores de suelos,
fitofortificantes, etc.
Es objeto de la presente invención el uso en
solitario o en combinaciones cualesquiera con otro material químico
o biológico de la nueva especie de HMA para su uso como
biofertilizante micorrícico, bioenmendante, recuperación de áreas
degradadas, remediación de suelo o de aguas, producción agrícola,
viverística, adyuvante para la supervivencia de plantas en
condiciones de estrés oxidativo y especialmente en presencia de
metales pesados, contaminación química, petrolífera, etc.
Constituye otro objeto de la presente invención
el cultivo, propagación y producción del HMA, en cualquier tipo de
medio de cultivo o biofilm, ya sean éste aséptico o no, químico o
físico, o su utilización en cualquier tipo de soporte con fines
biológicos, fisiológicos, químicos, físicos o ecológicos.
El HMA objeto de la invención se puede utilizar
para su inclusión en semilleros, alvéolos, macetas, contenedores, o
cualquier otro sistema similar conocido por un experto en la
materia, en los que se vayan a cultivar cualquier tipo de planta,
preferentemente en sus estadios más juveniles. También puede
utilizarse de manera extensiva para la recuperación de suelos o
áreas degradadas por actividad antropopogénica, especialmente como
consecuencia de actividad minera, industrial, petrolífera, pero
también como consecuencia de explanaciones de terrenos (obras
civiles, taludes de carreteras y vías ferroviarias, estaciones de
esquí, parques temáticos, etc.) y obras de jardinería pública o
privada. Su aplicación se puede llevar a cabo mediante la aplicación
de alícuotas individualizadas de inoculante al sustrato donde se
coloca la semilla o el plantón de vivero, siendo dicho sustrato
cualquiera de los utilizados habitualmente en los viveros, por
ejemplo turba, arena, suelo, vermiculita, perlita, sepiolita,
terragreen, minerales de la arcilla y sus derivados, y las mezclas
de dichos sustratos en proporciones variables; o bien mediante la
breve inmersión de las raíces y/o de las semillas de las plantas en
él antes de su transplante al semillero. El HMA objeto de la
invención también se puede aplicar a gran escala mediante su
distribución por agua de riego o mediante camiones cuba,
hidrosiembra o cualquier forma de implantación similar.
Por todo lo anterior, un aspecto de la presente
invención se refiere al uso de la composición de la invención para
su aplicación a un sustrato de cultivo, al agua de riego, a raíces
y/o a semillas así como para estimular el crecimiento de una planta
o parte de una planta, para proteger dicha planta del ataque de
patógenos y/o para la recuperación de suelos o áreas degradadas.
Preferiblemente suelos con altas concentraciones de metales
pesados.
Es de reseñar que como plantas susceptibles de
ser micorrizadas por el HMA objeto de la invención se encuentran
(pero no se limitan a): plantas leñosas, arbustivas, de interés
hortofrutícola, ornamentales, flores, vid, plantas aromáticas,
plantas medicinales, cultivos tropicales y subtropicales, cereales,
leguminosas, forrajeras o plantas silvestres.
Preferiblemente el hongo objeto de la invención
estimula el crecimiento, la nutrición, la supervivencia, la
resistencia a diferentes estreses abióticos y el desarrollo
eco-fisiológico en la inmensa mayoría de los
miembros de todas las familias de plantas terrestres.
Preferiblemente las plantas en las que se
estimula el crecimiento a partir del uso del hongo de la invención,
pertenecen a la Familia Leguminoseae, Compositeae, Boraginaceae,
Cistaceae, Alliaceae, Apiaceae o Graminaceae.
Si la planta pertenece a la Familia
Leguminoseae, esta se selecciona, pero sin limitarse, de entre los
géneros Cicer, Vicia, Pisum, Lens, Phaseolus, Glycine, Trifolium,
Medicago, Lotus o Sophora. Si la planta pertenece a la
Familia Compositeae, esta se selecciona, pero sin limitarse,
de entre los géneros Chamaemelum, Carduus o
Chrisanthemum. Y por último, si pertenece a la Familia
Boraginaceae, Cistaceae, Alliaceae, Apiaceae o
Graminaceae, la planta es preferiblemente del género
Echium, Cistus, Allium, Daucus y Avena,
respectivamente.
La utilización del HMA objeto de la invención en
las formas arriba indicadas promueve el establecimiento temprano de
la simbiosis micorrícica arbuscular, con el consiguiente beneficio
en términos de viabilidad, supervivencia, resistencia a estreses
bióticos y abióticos, mejora nutricional, adaptabilidad,
productividad, etc. que presentan las plantas micorrizadas con
respecto a las que no lo están. Además favorece la recuperación del
equilibrio del suelo, de sus características
físico-químicas, de su biodiversidad y de los ciclos
bio-geodinámicos. Todo lo anterior conlleva la más
rápida y mejor reimplantación de la cubierta vegetal en las zonas
tratadas con el HMA objeto de la invención, favoreciendo su
recuperación. Asimismo el HMA colabora en el secuestro o retención
de elementos químicos potencialmente nocivos para la salud de las
plantas, animales, microorganismos beneficiosos y medio
ambiente.
El HMA objeto de la invención se puede aplicar
así mismo como potenciador del reestablecimiento (recuperación y
restauración) de la cubierta vegetal de suelos degradados, y para la
revegetación de zonas alteradas sometidas a estreses bióticos y
abióticos. En este sentido los suelos a revegetar pueden ser, entre
otros, taludes de carreteras, zonas mineras, zonas quemadas, zonas
desertificadas, suelos contaminados, suelos infestados, suelos
degradados por exceso de sales, suelos calcáreos, suelos de pH
extremos, etc. La inoculación de plantas con aislados HMA
originarios de los suelos a recuperar, y su reintroducción en esos
mismos suelos, asegura el mantenimiento de la biodiversidad de los
mismos, así como de sus condiciones físico-químicas,
favoreciendo la reinstauración de la cubierta vegetal propia del
área en cuestión.
Asimismo, constituye otro aspecto de la presente
invención los procedimientos de micorrización, in vitro
(plantas micropropagadas durante o inmediatamente después de su fase
de enraizamiento, y antes de la fase de aclimatación) y ex
vitro (plantas micropropagadas durante la fase de aclimatación,
y semilleros, alvéolos, plantones, plantas de vivero o cualquier
otra planta obtenible a partir de técnicas convencionales), que
utilicen el hongo objeto de la presente invención. Es decir,
desarrollar una planta (o células de una planta) en una solución de
cultivo que contiene el hongo de la invención, o a la que se aplique
el hongo objeto de la invención en cualquiera de sus estadios de
desarrollo.
Aunque la adición de hongos formadores de
micorrizas arbusculares capaces de establecer simbiosis con plantas
se haya utilizado con anterioridad con los mismos propósitos, lo que
se demuestra en los ejemplos y figuras que se adjuntan a
continuación es que el hongo objeto de la invención presenta
resultados claramente sorprendentes al compararlo con otros hongos
del mismo género y de gran similitud (ver tabla 1). Por ejemplo, al
comparar los resultados obtenidos tras la inoculación de plantas con
el hongo objeto de la invención así como con G. intraradices
MUCL43194, una cepa cuya secuencia SSU presenta un 99.8% de
similitud con la secuencia SSU (SEQ ID NO:1) del hongo de la
invención, se demuestra que el hongo objeto de la invención en
condiciones adversas (e.g. riego con agua conteniendo elevadas
concentraciones de metales pesados y otros xenobióticos) incrementa
significativamente la supervivencia de las plantas con respecto a
los otros HMA que no están adaptados a dichas condiciones
extremas.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se
pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig. 1: Microscopía óptica y electrónica de
esporas juveniles del hongo objeto de la invención cultivado en
condiciones in vitro. 1.1 grupo de dos esporas con hifas de
sustentación. Barra de escala=20 \mum; 1.2., separación de la
pared celular de la espora en las capas sw1, sw2 y sw3. Barra de
escala=20 \mum; 1.3. vista de las tres capas sw a microscopio
electrónico. Barra de escala=0.5 \mum; 1.4., esporas deformes pero
perfectamente viables formadas por el hongo objeto de la invención
en reactivo de Melzer. Barra de escala=50 \mum; 1.5, detalle de
espora deforme. Barra de escala=20 \mum; 1.6., detalle de espora
deforme en que se distinguen perfectamente sus capas sw. Barra de
escala=20 \mum.
Fig. 2: Microscopía óptica y electrónica de
esporas maduras del hongo objeto de la invención cultivado en
condiciones in vitro. 2.7., espora con hifa de sustentación.
Barra de escala=20 \mum; 2.8. a 2.10., arquitectura de la pared
esporal. Barra de escala=20 \mum; 2.11., ultraestructura de la
pared esporal a microscopía electrónica de transmisión. Barra de
escala=1.
Fig. 3. Fotomicrografías de la colonización
intrarradical de raíces de zanahoria (Daucus carota L., clon
DC2) creciendo en cultivo in Vitro (monoxénico) con el hongo
objeto de la invención (a-d) y del crecimiento
extrarradical de éste (e-h). a, puntos de entrada y
vesículas, b, colonización arbuscular masiva, c, detalle de hifa con
vesículas intrarradicales. d, detalle de ovillos arbusculados.
Fig. 4 y 5. Árboles filogenéticos en los que se
comparan el resultado del análisis SSU del hongo objeto de la
invención con las secuencias publicadas de otros miembros de la
familia Glomeraceae.
Fig. 6. Huellas genéticas del hongo objeto de la
invención y de otros miembros de referencia de la familia
Glomeraceae obtenidas por rep-PCR y su
comparación electroforética.
Fig. 7. Diferentes imágenes comparativas del
crecimiento de plantas en distintos suelos en el que se muestran las
propiedades del hongo objeto de la invención (H) con respecto el
hongo G. intraradices.
- (a)
- suelos naturales contaminados (ver tabla 2)
- (b)
- control, plantas no inoculadas.
- (c)
- Plantas inoculadas con el hongo de la invención (H)
- (d)
- Plantas inoculadas con el hongo G. intraradices.
Fig. 8. Gráfica comparativa de los resultados de
supervivencia y crecimiento obtenidos en el Experimento 2.
El eje de las Y representa el peso medio seco de
las plantas en gramos (g)
H representa el hongo de la invención
Con el fin de comprobar los efectos del objeto
de la invención descrito anteriormente, se realizaron diversas
pruebas aplicando el inoculante sobre semillas y plantas
micropropagadas en condiciones in vitro y ex vitro.
Los resultados se muestran en los siguientes ejemplos.
Ejemplo
1
Se aislaron esporas (de una muestra de suelo) y
micelio extrarradical (ERM) de todos los estadios de desarrollo del
hongo propagado in vitro, y esporas maduras fueron
recuperadas de cultivo de macetas (cultivo ex vitro). El
material fúngico fue montado en portas con alcohol
polivinílico/ácido láctico/glicerol (PVLG) y también con una mezcla
de PVLG y reactivo de Melzer (1:1, v/v). Las esporas (tanto intactas
como aplastadas) fueron observadas con un microscopio Nikon Eclipse
800 equipado con óptica de contraste de fases Normarski. Se tomaron
microfotografías con una cámara Nikon Coolpix 4500. Se siguió la
terminología de las esporas de Walker (1983) (Walker, 1983.
Mycotaxon 18: 443-455) y Stürmer & Morton
(1997) (Stürmer y Morton, 1997. Mycologia 89,
72-81). Las observaciones de color se hicieron en
base al código de cuadro de colores del International Culture
Collection of Arbuscular and vesicular-arbuscular
mycorrhizal Fungí (INVAM).
Para la microscopía electrónica de transmisión
(TEM) las esporas se trataron con un buffer fosfato al 0.2M con 2,8%
de glutaraldehido, y 1.5% de p-formaldehido a 4ºC
durante 18 horas, lavadas y centrifugadas en agua doblemente
destilada, post-fijadas en un 2% de ácido ósmico
acuoso, deshidratadas, teñidas con acetato de uranilo, y embebidas
en LRWhite (London Resin Company Ltd.). Se montaron secciones
ultrafinas en parrillas y se observaron en un microscopio
electrónico Zeiss EM902 a 80 kv.
Resultados (Descripción morfológica) Fig. 1 y
2:
Los hongos de la presente invención tienen
esporocarpo ignoto, esporas aisladas o en agregados lábiles de 2 a 5
esporas, producidas distal o intercalarmente a lo largo de las
ramificaciones de las hifas, la hifa distal rápidamente septada y
colapsada, diferenciadas en su producción intra o extraradical. Las
esporas juveniles (cultivos in vitro de 4 meses, Fig. 1) son
hialinas a amarillo pálido, globosas, de 42-90
\mum de diámetro, ovoides a piriformes, 62-67 -
72-77 \mum de diámetro, de superficie lisa. La
pared de las esporas jóvenes constituye una única pared con tres
capas detectables con un grosor total de 2.0-4.8
\mum. La pared externa (sw1) es hialina, de
0.5-1.0 \mum de grosor, mucilaginosa, evanescente,
débilmente reactiva al reactivo de Melzer; la capa intermedia (sw2)
es hialina, de 1.0-1.5 \mum de grosor, rígida, a
veces doble, distinguible pero no fácilmente diferenciable de la
capa 1, y no reacciona frente al reactivo de Melzer; la pared
interna (sw3) es hialina a amarillo pálido, 1.6-2.8
\mum de grosor, laminada con una débil ordenación de las láminas,
no reactiva frente a Melzer.
La hifa de sustentación de las esporas jóvenes
persiste en la espora, y es recta a ligeramente acampanada, de
6.4-(9.6-14.4) \mum de diámetro en la base de la
espora. El poro está abierto, de 6.4 a 7.2 \mum. Las paredes de la
hifa de sustentación son continuas con la pared de la espora, y de
3.6 - 4.8 \mum de grosor en el punto de unión con la espora,
decreciendo a 1.5 - 2.0 \mum de grosor a las 30-35
\mum desde la espora. La pared externa (sw1) adelgaza en
rápidamente, entre 5-10 \mum desde la hifa de
sustentación, mientras que las paredes media e interna (sw
2-3) se detectan hasta 30 \mum desde la espora.
Las esporas maduras extrarradicales (cultivos in vitro y
ex vitro de 12 meses) son de amarillas pálidas (0/0/60/0), a
amarillas-pardas (0/30/100/0), globosas a
subglobosas, de 110-172 \mum de diámetro (tamaño
medio 125-140 \mum), ovoides a elipsoides, a veces
amigdalazas a tuberculadas, de 72-91 x
104-124 \mum de tamaño.
Las paredes de las esporas maduras (Fig. 2)
están hechas de 5 capas en tres grupos: el grupo 1 lo constituyen
las capas sw 1-2, con la capa externa (sw 1)
hialina, mucilaginosa, evanescente, de grosor irregular
(0.8-2.5 \mum de grosor), rojiza al reactivo de
Melzer, siempre presente en esporas obtenidas in vitro,
generalmente ausente o mucho mas delgada en esporas obtenidas ex
vitro. La capa sw2 es hialina a amarilla (0/0/60/0), rígida, de
1.6 - 2.9 \mum de grosor, con la superficie externa lisa y la
superficie interna ocasionalmente granular según se observa en
esporas cultivadas ex vitro, ninguna de ellas reactiva al
reactivo de Melzer, y fácilmente separables de la sw1. El grupo 2 lo
constituyen la capa sw3, que es hialina, rígida, de superficie lisa,
1.5-2.8 \mum de grosor, que se rompe en piezas
poligonales cuando se le aplica presión y no reactiva al Melzer. El
grupo 3 está constituido por las capas sw 4-5,
siendo la sw 4 amarilla (0/10/80/0) a amarilla-parda
(0/30/100/0), laminada, de superficie lisa y 2.6-4.8
\mum de grosor, muy reactiva al Melzer; y la sw 5 hialina,
semi-rígida a flexible, de superficie lisa, y de 0.8
- 1.0 \mum de grosor, no fácilmente separable de la capa 4 y no
reactiva al Melzer.
Las capas de la pared de las esporas con formas
irregulares están hechas de 3 capas detectables similares a las de
las esporas juveniles. La hifa de sustentación de las esporas
maduras es cilíndrica, de 9.6-12.8 \mum de
diámetro en la espora, o ligeramente acampanada de
12.8-14.4 \mum de diámetro, de igual color que la
espora. La pared de las hifas de sustentación tiene un grosor de
3.2-4.8 \mum al nivel del poro y está hecha de las
capas de la pared esporal con la excepción de la capa sw5 que
permaneció indetectable y sw1 que decrecía en grosor entre los
primeros 5-10 \mum desde la espora. Poro abierto
de 1.5-2.6 \mum de diámetro, ocasionalmente
cerrado por el engrasamiento de las paredes de la hifa de
sustentación, raramente cerrado por un septo curvo al nivel del poro
provocado por la capa sw5. Esporóforo único, de 35 a 300 \mum de
longitud, 6.5-12.0 \mum de anchura con la pared en
continuidad directa con la de las hifas exploradoras. Las esporas
intrarradicales se diferencian en grupos laxos que deforman los
tejidos de la raíz y modifican las capas epidérmicas hasta su
liberación desde la raíz. Las esporas juveniles son amarillas
pálidas a amarillas doradas de 68-74 \mum de
diámetro; las esporas maduras son amarillas a amarillas pardas,
globosas a subglobosas, de 100-156 \mum de
diámetro, nunca ovoides, amigdaloides o tuberculadas. Esporas
juveniles o maduras pueden producirse en el mismo segmento de raíz y
ser encontradas en los mismos grupos de esporas. La pared esporal,
hifa de sustentación y red de hifas de las esporas intrarradicales
juveniles o maduras son similares a las descritas para las esporas
extrarradicales.
Estado micorrícico: El hongo objeto de la
invención produce una fuerte colonización arbuscular que comienza
con la entrada de una hifa guía en la raíz, formando un grueso
apresorio. La colonización intraradical recuerda a la micorriza de
tipo Paris. Los arbúsculos se forman a menudo de célula a célula, y
no son frecuentes las hifas intercelulares o están ausentes (Fig. 3a
y c). Los arbúsculos son bastante especiales, recordando más a
ovillos arbusculares ("arbusculate cols") (Fig. 3b y d), y
recordando a los formados por G. mosseae más que a los
formados por G. intrarradices. Las vesículas no son
frecuentes, aunque se encuentran a veces en bajo número. Tienen
forma de pera y se forman intercelularmente, tiñéndose más
débilmente que las esporas cuando se tiñe con azul de tripán.
Asociación micorícica: en el campo, el
hongo objeto de la invención ha sido aislado de la rizosfera de un
consorcio de plantas pertenecientes principalmente a las familias
Compositae (Chamaemelum sp., Carduus sp., Chrisanthemum sp.),
pero que también incluía plantas de las familias Boraginaceae
(Echium sp.), Cistaceae (Cistus sp.) y
Graminaceae (Avena sp.). Tras seis semanas en cultivo
monoxénico utilizando el medio mínimo "M" (Chabot et
al., 1992. Mycologia
84(3):315-321) con raíz de zanahoria
transformada (Daucus carota L., clon DC-2) la
colonización media de las raíces fue del 42.0% (21.8 s.d.) (Fig. 3).
En cultivo de macetas (cultivo ex vitro) en invernadero junto
con diferentes hospedadores como Allium porrum L., y
Trifolium sp. la colonización micorrícica media de las raíces
fue de un 50-80%.
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Ejemplo
2
Análisis por PCR de la región 18S del
ADN: Se muestrearon aproximadamente 1000 esporas a partir de
cultivo monoxénico, disolviendo el medio de cultivo de acuerdo con
el método de Doner y Bécard (1991) (Doner y Bécard (1991).
Biotechnology Techniques 5: 25-28). La
extracción de ADN se llevó a cabo siguiendo un protocolo que utiliza
el buffer de extracción CTAB, extracción de proteínas con
fenol-cloroformo y precipitación con isopropanol. El
ADN fue resuspendido en 50 \muL de buffer TE (10 mM
Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5).
Las reacciones PCR se llevaron a cabo con 1/10
del extracto de ADN. Los siguientes reactivos fueron adicionados: 1x
PCR buffer (20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl,
Invitrogen, USA), 1.5 mM MgCl_{2}, 0.2 \muM de cada rADN primer,
200 \muM de cada dNTP (Finnzymes Oy, Finland), 2.5 unidades de Taq
ADN polymerase (Invitrogen, USA). Los dos primers usados fueron
VANs1 (Simon et al., 1993. Appl. Environ. Microbiol.
59, 4211-4215) y NS8 (White et al., 1990. In:
PCR protocols: a guide to methods and applications. Part 3. Academic
Press, Inc. 315-322). La amplificación fue llevada a
cabo en una máquina PTC200 DNA (MJ Research, USA) bajo el siguiente
protocolo: una primera etapa de desnaturalización a 94ºC durante 5
min., seguido de 40 ciclos a 94ºC durante 30 s., 55ºC durante 1 min.
y 72ºC durante 2 min. La amplificación terminaba con un paso final
de elongación a 72ºC durante 10 min.
El producto PCR fue clonado en Escherichia
coli utilizando el sistema de clonado Gateway
(Invitrogen, USA) y secuenciado usando el kit de secuenciación
"DYEnamic ET terminador cycling" (cat nº US 810 50, Amersham
Pharmacia Biotech, GB). Los clones fueron secuenciados
utilizando los siguientes primers: NS1, NS2, NS3, NS4, NS5, NS6,
NS7, NS8 (White et al., 1990. In: PCR protocols: a guide to
methods and applications. Part 3. Academic Press, Inc.
315-322). Las secuencias fueron analizadas con un
secuenciador automático (CEQ^{TM} 2000 XL DNA analysis
system, Beckam Coulter Inc., USA), editadas con Sequencher
v.4.1.4 (Gene Code Corporation, Ann Arbor, MI), alineadas con
Clustal X 1.5 (Thompson et al., 1997. Nucleic Acids
Research, 25:4876-4882) y corregidas
manual-
mente.
mente.
Para completar el análisis las secuencias SSU
obtenidas fueron comparadas con el alineamiento (ALIGN_000124)
utilizado por Schwarzott et al. (2001) (Schwarzott et
al., 2001. Mol. Phylogen. Evol.
21:190-197). Los árboles filogenéticos fueron
obtenidos mediante análisis "neighbor joining" bajo la
biparamétrica de Kimura en PAUP v.4.0b10 (Swofford, 2003. PAUP.
Phylogenetic analysis using parsimony. Versión 10. Sinauer,
Sunderland, MA). Los árboles fueron evaluados por análisis
"bootstrap" (1000 repeticiones para "neighbor
joining").
Análisis por rep-PCR: El
ADN total fue extraído a partir de esporas obtenidas de cultivo
monoxénico utilizando el kit FastDNA (Carlsbad, CA, USA) siguiendo
las instrucciones del fabricante para material fúngico. La
amplificación PCR fue ajustada para obtener un volumen final de 20
\muL. Se empleó con aproximadamente 1-10 ng del
ADN de base utilizando los siguientes reactivos: tampón 1X Titanium
Taq (BD Biosciences); 0.5 \muM del primer ERIC IR:1R (SEQ ID NO:
1); 21 (SEQ ID NO: 2) (Invitrogen); 2 mM de cada dNTPs (Invitrogen);
1X Titanium Taq mix (Ultratherm Taq DNA polymerase 250 \mu; BD
Titanium Taq DNA polymerase 1:9). La amplificación se llevó a cabo
en un termociclador de ADN (Mastercycler ep Gradient S) utilizando
el siguiente protocolo: desnaturalización a 95ºC durante 7 min, 35
ciclos a 94ºC durante 3 s, 92ºC durante 30 s, 50ºC durante 1 min,
65ºC durante 1 min 30 s, y una etapa de elongación a 65ºC durante 8
min.
\vskip1.000000\baselineskip
Análisis por PCR de la región 18S del
ADN: La secuencia obtenida para el hongo objeto de la invención
por análisis PCR de la subunidad ribosomal 18S SEQ ID NO: 3. Las
secuencias SSU de los clones seleccionados fueron insertadas en los
alineamientos de genes SSU de hongos micorrícicos arbusculares
publicados por Schwarzott et al. (2001) (Schwarzott et
al., 2001. Mol. Phylogen. Evol.
21:190-197). El árbol filogenético obtenido (Fig. 4
y 5) usando el análisis "neighbour joining" mostró que las
secuencias del hongo objeto de la invención se agrupaba en el Grupo
1 de la familia Glomeraceae descrita por Schussler et
al. (2001) (Schussler et al., 2001. Myc. Res. 105,
1413-1421), y está próximamente relacionado con las
secuencias de G. intraradices (Tabla 1): 99,6% de similitud
con la secuencia de G. intraradices DAOM 197198 (que es un
consenso de las secuencias con nº de acceso GeneBank AJ301859 y
X58725) proveniente de esporas obtenidas ex Vitro; y 99,8 de
similitud con G. intraradices MUCL 43194 AFTOL proveniente de
esporas en cultivo in Vitro (Lutzoni et al., 2004.
American Journal of Botany 91(10):
1446-1480).
1446-1480).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las huellas genéticas obtenidas a partir de la
comparación mediante rep-PCR entre el hongo objeto
de la invención y cepas de referencia de G. intraradices
Schenck & Smith, G. clarum Nicolson & Schenk y G. claroideum
Schenck & Smith permitieron segregar el hongo objeto de la
invención de las otras especies de Glomus ensayadas (Fig. 6a). Las
huellas genéticas obtenidas revelaron que el perfil genético del
hongo objeto de la invención difería considerablemente de las otras
especies de Glomus, que compartían entre ellas la totalidad de las
bandas expresadas (Fig. 6b).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Semillas de trébol (Trifolium pretense
L., var. Violeta) fueron esterilizadas en superficie (lejía diluida
al 5% con agua) y pregerminadas en vermiculita autoclavada (121ºC,
20 min.). Tras una semana las pántulas fueron transferidas a macetas
de 300 mi de volumen conteniendo bien suelo natural de las orillas
del Río Tinto (a su paso por Nerva, Huelva, España) (Tabla 2)
(Experimento 1), o bien suelo agrícola mezclado con arena de cuarzo
(1 parte de suelo por 9 de arena v:v) tindalizado durante tres días
consecutivos (Experimento 2). En ambos casos una tercera parte de
las macetas fueron inoculadas con el hongo objeto de la invención,
otra tercera parte con el hongo micorrícico de referencia G.
intraradices DAOM197198, y la otra tercera parte fueron dejadas
sin inocular (controles). Se prepararon ocho repeticiones por
tratamiento. Las macetas del Experimento 1 se regaron tres veces en
semana con agua corriente, mientras que las del Experimento 2 se
regaron tres veces en semana con 0, 25, 50 y 100% de agua del Río
Tinto diluida en su caso con agua corriente. En el Experimento 2 los
riegos comenzaron una semana después del transplante de las
plántulas. Tres semanas tras el inicio del experimento se redujo el
número de plantas por maceta para que quedasen 3 plántulas en cada
una de ellas. Los dos experimentos (1 y 2) se mantuvieron en cámara
de cultivo (24º/18ºC día/noche, 12 horas de fotoperiodo) durante
cuatro meses.
Pasado este tiempo la parte aérea de las plantas
de cada tratamiento fue recolectada y su peso fresco anotado.
Muestras de las raíces de cada tratamiento fueron evaluadas para
constatar su colonización micorrícica de acuerdo con el método de
tinción y recuento de Philips y Hayman.
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\vskip1.000000\baselineskip
Las plantas de trébol se desarrollaron
inicialmente bien en ambos Experimentos. Sin embargo, seis semanas
tras el inicio del ensayo ya se observaban diferencias claras entre
los tratamientos. En el experimento 1 (suelo natural del Río Tinto)
todas las plantas parecían saludables, pero las inoculadas con el
objeto de la invención eran las mayores, mientras que las plantas
control (no inoculadas) eran las mas pequeñas (Fig. 7a). En el
experimento 2 (agua del Río Tinto) las plantas no inoculadas
(control) eran mas pequeñas que las inoculadas, y dos meses después
del inicio del experimento las que estaban siendo regadas con el
100% de agua del Río Tinto empezaron a morir (Fig. 7b, columna
derecha de macetas). Para este tiempo las plantas inoculadas tanto
con el objeto de la invención como por G. intraradices se
desarrollaban aún correctamente (Fig. 7c, 7d) con las tratadas con
el objeto de la invención y regadas con el 25% de agua del Río Tinto
siendo las mayores; y las inoculadas con G. intraradices y
regadas con el 100% del agua del Río Tinto siendo las menores y
comenzando a mostrar algunos síntomas de toxicidad (Fig. 7d,
inserto).
inserto).
Transcurridos cuatro meses tras el inicio del
ensayo no se observaban diferencias entre las plantas inoculadas o
no en el experimento 1 (datos no mostrados), y sus pesos secos
oscilaban entre 0,40 y 0,65 g. En este tiempo todas las plantas
regadas con el 100% de agua del Río Tinto (Experimento 2) habían
muerto (ya hubiesen sido inoculadas o no, Fig. 8, porcentajes en la
parte superior de las columnas). Las plantas no inoculadas y
aquellas inoculadas con el aislado no autóctono (G.
intrarradices) que habían sido regadas con agua de Río Tinto al
50% habían muerto también; mientras que el 12,5% de las plantas
inoculadas con el hongo autóctono (objeto de la invención)
sobrevivieron (Fig. 8). Las tasas de supervivencia fueron 62,5%
tanto para las plantas no inoculadas (control) y las inoculadas con
G. intraradices que habían sido regadas con agua del Río
Tinto al 50%, mientras que para las inoculadas con el objeto de la
invención alcanzaron un 87,5% (Fig. 8). En el caso de las plantas
regadas con el 0% de agua del Río Tinto (es decir, plantas regadas
con agua corriente) todas las plantas inoculadas sobrevivieron,
mientras que sólo el 87,5% de las plantas no inoculadas lo hicieron
(Fig. 8).
Tras cosechar las plantas la colonización
micorrícica de las raíces fue analizada (Tabla 3). Todas las plantas
del experimento 1, ya fueran inoculadas o no, presentaban
colonización por micorrizas arbusculares, sin que existiesen
diferencias estadísticas en términos de colonización entre ellas. En
el caso del experimento 2, las plantas control no presentaron
colonización micorrícica. Las plantas inoculadas con G.
intraradices o con el hongo objeto de la invención presentaron
diferencias estadísticas en la colonización, con G.
intraradices se mostró una mayor tasa de colonización que el
hongo objeto de la invención en todos los casos. Es importante
remarcar que el incremento en la concentración de agua del Río Tinto
afectó muy negativamente la colonización del hongo no autóctono
G. intrarradices. Por el contrario, la colonización
micorrícica por el hongo autóctono objeto de la invención se mantuvo
en todos los tratamientos. Las raíces de las plantas tratadas con el
100% del agua del Río Tinto en todos los tratamientos, así como
aquellas tratadas con el 50% de agua del Río Tinto en los
tratamientos control y G. intraradices fueron imposibles de
analizar en cuanto a su colonización micorrícica debido a su
importante estado de degradación.
No se encontraron diferencias estadísticas entre
plantas inoculadas o no en el experimento 1 en lo que se refiere a
peso seco al final del ensayo. Los resultados de los análisis de
peso seco en el experimento 2 se muestran en la Fig. 8. Se
obtuvieron diferencias significativas entre las plantas control y
las inoculadas con ambos hongos micorrícicos en los tratamientos 0%
y 25% del agua del Río Tinto. No hubo diferencias significativas
entre las plantas inoculadas con G. intraradices o el hongo
objeto de la invención, aunque estas últimas fueron ligeramente mas
grandes. Las únicas plantas regadas con el 50% de agua del Río Tinto
que fueron capaces de sobrevivir fueron las inoculadas con el hongo
objeto de la invención; aún así permanecieron pequeñas y mostraron
ciertos síntomas de toxicidad.
<110> Consejo superior de investigaciones
científicas
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Hongo formador de micorrizas
arbusculares y su uso para estimular el crecimiento de plantas
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1641.247
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> DNA
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<213> artificial sequence
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Primer ERIC IR:1R
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgtaagctc ctggggattc ac
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer 2I
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagtaagtga ctggggtgag cg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1745
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SSU (18s) del Hongo de la
invención
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip0.8cm
Claims (15)
1. Un hongo perteneciente a la cepa con número
de depósito MUCL 51732.
2. Célula de raíz que comprende el hongo según
la reivindicación 1.
3. Raíz micorrizada que comprende la célula
según la reivindicación 2.
4. Una espora o una hifa del hongo según la
reivindicación 1.
5. Composición que comprende el hongo según la
reivindicación 1.
6. Composición según la reivindicación 5 que
además comprende otro hongo micorriza arbuscular (HMA).
7. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 5 o 6 que además comprende otro microorganismo.
8. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 7 que además comprende un aditivo seleccionado
de entre fertilizantes orgánicos o inorgánicos, agentes químicos o
biológicos promotores del crecimiento de las plantas, agentes
químicos o biológicos protectores de las plantas, insecticidas,
nematocidas o bactericidas.
9. Sustrato que comprende la composición según
cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8.
10. Uso de la a composición según cualquiera de
las reivindicaciones 5 a 8 para su aplicación a un sustrato de
cultivo, al agua de riego, a raíces y/o a semillas.
11. Uso del hongo según reivindicación 1, de la
composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 o del
sustrato según la reivindicación 9 para estimular el crecimiento de
una planta o parte de una planta.
12. Uso del hongo según reivindicación 1, de la
composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 o del
sustrato según la reivindicación 9 para proteger una planta del
ataque de patógenos.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
11 o 12 donde la planta se selecciona de entre la familia
Leguminoseae, Compositeae, Boraginaceae, Cistaceae o
Graminaceae.
14. Uso según reivindicación 12 donde la planta
se selecciona de entre los géneros Trifolium, Chamaemelum,
Carduus, Chrisanthemum, Echium, Cistus, Allium o
Avena.
15. Uso del hongo según reivindicación 1, de la
composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 o del
sustrato según la reivindicación 9 para la recuperación de suelos o
áreas degradadas.
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| ES2343235B8 ES2343235B8 (es) | 2011-12-28 |
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| ES200900194A Expired - Fee Related ES2343235B8 (es) | 2009-01-23 | 2009-01-23 | Hongo formador de micorrizas arbusculares y su uso para estimular el crecimiento de plantas. |
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