CN109757331A - 一种拟野生生境兰科菌根真菌与春剑种子共生培养法 - Google Patents

一种拟野生生境兰科菌根真菌与春剑种子共生培养法 Download PDF

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李�杰
匡萍
张巧
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Abstract

本发明公开了一种拟野生生境兰科菌根真菌与春剑种子共生培养法。本发明利用分离自兰科植物菌根的内生真菌兰科丝核菌(Orchidaceous rhizoctonia)，将其与春剑根状茎的组织匀浆物混合做为接种剂，将春剑蒴果内成熟种子播于接种剂上萌发，于春剑原生野生环境建立菌植共生体系，获得春剑幼苗。具体包括兰科丝核菌培养、接种剂准备、蒴果表面消毒、共生体系建立、接种后管理、菌植体系镜检、菌根检验和幼苗回归等步骤。本发明技术可以实现春剑有性大量繁殖，对春剑育种和春剑资源的持续利用有重要理论与应用价值。

Description

一种拟野生生境兰科菌根真菌与春剑种子共生培养法
技术领域
本发明属于植物生物学领域。具体来说涉及一种利用兰科丝核菌(Orchidaceousrhizoctonia)和春剑组织匀浆物制作接种剂与春剑种子拟野生生境共生培养法，获得春剑幼苗的方法。
背景技术
春剑为兰科兰属植物，是十分重要的植物资源，具有较高的生态价值和经济价值，在野生资源中发掘的诸如“皇梅”、“玉海棠”等多次在兰博会上荣获金奖。长期以来，因盲目的、掠夺性的采挖，使得野生春剑资源濒临灭绝。但春剑的种子非常细小，没有胚乳，在自然条件下种子萌发需要依靠特定的共生真菌来获取营养物质，且在5年内由其种子萌发成幼苗的几率一般低于5%。目前兰科植物种子的萌发，多采用人工培养基在无菌条件下进行非共生萌发，萌发率虽高，但在进行野外回归时，幼苗移植到自然环境中存活率较低，并且由于无法与自然界中的真菌建立共生关系从而导致后续生长严重受限。通过种子和其有效萌发真菌在自然条件下的共生萌发，可有效地提高春剑杂交种子的萌发和发育，为春剑原生地增强型再引入和春剑突破性育种提供了简便的操作路径。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种有效兰科菌根真菌与春剑种子拟野生共生培养法，为实现春剑原生地增强型再引入和春剑突破性育种创造条件。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。
本发明的技术方案主要是基于以下认识。
本发明将分离自兰科植物菌根的兰科丝核菌与春剑根状茎的组织匀浆物混合做为接种剂，把春剑蒴果内成熟种子播于接种剂上萌发，建立菌植共生体系，获得春剑幼苗，从而实现了本发明的目的。
一种拟野生兰科菌根真菌与春剑种子共生培养法，包括以下步骤：
(1) 兰科丝核菌培养：将冷冻保藏于试管斜面上的兰科丝核菌活化后接于PAD培养基平板上，在恒温培养箱中25℃倒置培养10天；用打孔器打出直径为5mm的菌丝块备用；
(2)接种剂准备：剪取健康完整的春剑肉质根经表面消毒后，与去离子水1：0.5（质量比)混合打成组织匀浆物后，接种直径为5mm的菌丝块，28℃暗培养7天作为接种剂备用；
(3)蒴果表面消毒：用70%的酒精棉花擦拭蒴果外部后，将整个蒴果浸入加有少数展著剂的1.0%次氯酸钠溶液中消毒10min后备用；
(4)混合接种：将表面灭菌后的蒴果，放在培养皿中以4号解剖刀将蒴果纵切开，并刮出种胚。用长镊子夹住蒴果中的棉絮状胎座束，在准备好的接种剂上来回轻扫，把种胚均匀播在接种剂上，然后将播有种胚的接种剂均匀撒在装有新鲜苔藓的育苗盘上；
(5)共生体系培养：将接种后的育苗盘，放入自然环境中培养，培养条件为：自然光照，自然温度，苔藓湿度控制在75-85%，苔藓保持浅绿色缓慢生长；
(6)共生体系镜检：获得完整的春剑幼苗后，用水洗净并剪取基部根段，滤纸吸干多余水分，用刀片拉片成薄且透明的切片，在显微镜下观察。同种横向切开根段，切面朝上，粘于铜面上后放置在扫描电子显微镜下观察并照像。可观察到根内有典型兰科丝核菌特征，表明共生培养成功；
步骤(2)中肉质根表面消毒条件为：自来水冲洗干净后纯水再冲洗3-4次，75%酒精浸泡3-5min左右，0.1%升汞消毒5min后无菌水冲洗干净，取根中部切成1-2mm薄片；
步骤(3)中的蒴果为春剑人工异花授粉后180天左右，果荚绿熟后切下，在4℃下干燥保存备用的春剑结实蒴果；
步骤(6)中的拉片是将根段用刀片与根段切面平行，均匀快速地拉片，将切下的切片用毛笔迅速刷入准备的无菌水中，用毛笔蘸取形态完整、薄且透明的切片。
本发明相对于现有技术具有以下优点:虽然国内外都有专利和文献报道有关兰科植物种子共生的方法，但这些方法多采用从兰科种子原地共生萌发的原球茎中分离真菌后，再在室内条件下进行接种验证萌发效果，无法实现濒危兰科植物的野生放归。本发明方法直接利用利用兰科丝核菌和春剑根状茎的组织匀浆物制作接种剂，通过拟野生环境实现春剑种子的大量共生萌发，为春剑原生地增强型再引入和春剑突破性育种提供了简便的操作路径。
附图说明
图1是绿熟春剑杂交蒴果图。
图2是春剑杂种F1代种子播种24个月后的共生萌发图。
图3是春剑根状茎共生超微结构图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步地详细说明，但实施例并不是对本发明技术方案的限制。所有基于本发明教导所作的变换，均应属于本发明的保护范围。
实施例所用兰科丝核菌(Orchidaceous rhizoctonia)来源于西南科技大学兰科植物繁育实验室。
实施例1：
春剑蒴果准备：采用正反杂交育种法, 杂交组合形式为‘玉海棠’ (♀)ב皇梅’(♂)，当母本花刚开放时用无菌镊子除去花药, 开花3d 后进行人工授粉, 用无菌镊子取下父本的花粉块, 将花粉块移至母本合蕊柱顶端的柱头上, 让蕊腔分泌出的粘液将花粉块粘住,每个花莛授粉2-3朵, 授粉后套上无菌的纱布袋, 挂牌标明授粉时间，隔离管理。授粉1个月后剪去弱小蒴果, 每盆保留1-2 个粗壮的蒴果，蒴果开始膨大期施磷酸二氢钾1000倍液2-3 次, 以促进种子发育。授粉后180天左右，果荚绿熟，凹皱，将果荚切下，在4℃下干燥保存备用（图1）；
兰科丝核菌培养：将冷冻保藏于试管斜面上的兰科丝核菌活化后接于PAD培养基平板上，在恒温培养箱中25℃倒置培养10天；用打孔器打出直径为5mm的菌丝块备用；
接种剂准备：剪取健康完整的春剑肉质根经表面消毒后，与去离子水1：0.5（质量比)混合打成组织匀浆物后，接种直径为5mm的菌丝块，28℃暗培养7天作为接种剂备用；
蒴果表面消毒：用70%的酒精棉花擦拭蒴果外部后，将整个蒴果浸入加有少数展著剂的1.0%次氯酸钠溶液中消毒10min后备用；
混合接种：将表面灭菌后的蒴果，放在培养皿中以4号解剖刀将蒴果纵切开，并刮出种胚。用长镊子夹住蒴果中的棉絮状胎座束，在准备好的接种剂上来回轻扫，把种胚均匀播在接种剂上，然后将播有种胚的接种剂均匀撒在装有新鲜苔藓的育苗盘上；
共生体系培养：将接种后的育苗盘，放入自然环境中培养，培养条件为：自然光照，自然温度，苔藓湿度控制在75-85%，苔藓保持浅绿色缓慢生长，直到24个月后，春剑种子萌发如图1所示；
共生体系镜检：获得完整的春剑幼苗后，用水洗净并剪取基部根段，滤纸吸干多余水分，用刀片拉片成薄且透明的切片，在显微镜下观察。同种横向切开根段，切面朝上，粘于铜面上后放置在扫描电子显微镜下观察并照像。可观察到根内有典型兰科丝核菌特征（图3），表明共生培养成功。

Claims (2)

1.一种拟野生生境兰科菌根真菌与春剑种子共生培养法，利用春剑根状茎的组织匀浆物培养兰科丝核菌为接种材料，接种经表面消毒的春剑蒴果，建立菌植共生体系，获得野外回归春剑幼苗，主要包括以下步骤：
(1) 兰科丝核菌培养：将冷冻保藏于试管斜面上的兰科丝核菌活化后接于PAD培养基平板上，在恒温培养箱中25℃倒置培养10天；用打孔器打出直径为5mm的菌丝块备用；
(2)接种剂准备：剪取健康完整的春剑肉质根经表面消毒后，与去离子水1：0.5（质量比)混合打成组织匀浆物后，接种直径为5mm的菌丝块，28℃暗培养7天作为接种剂备用；
(3)蒴果表面消毒：用70%的酒精棉花擦拭蒴果外部后，将整个蒴果浸入加有少数展著剂的1.0%次氯酸钠溶液中消毒10min后备用；
(4)混合接种：将表面灭菌后的蒴果，放在培养皿中以4号解剖刀将蒴果纵切开，并刮出种胚，用长镊子夹住蒴果中的棉絮状胎座束，在准备好的接种剂上来回轻扫，把种胚均匀播在接种剂上，然后将播有种胚的接种剂均匀撒在装有新鲜苔藓的育苗盘上；
(5)共生体系培养：将接种后的育苗盘，放入春剑拟野生自然环境中培养，培养条件为：自然光照，自然温度，苔藓湿度控制在75-85%，苔藓保持浅绿色缓慢生长；
(6)共生体系镜检：获得完整的春剑幼苗后，用水洗净并剪取基部根段，滤纸吸干多余水分，用刀片拉片成薄且透明的切片，在显微镜下观察，同时种横向切开根段，切面朝上，粘于铜面上后放置在扫描电子显微镜下观察并照像，可观察到根内有典型兰科丝核菌特征，表明共生培养成功。
2.根据权利要求1所述的一种拟野生生境兰科菌根真菌与春剑种子共生培养法，其特征在于步骤(2)中肉质根表面消毒条件为：自来水冲洗干净后纯水再冲洗3-4次，75%酒精浸泡3-5min左右，0.1%升汞消毒5min后无菌水冲洗干净，取根中部切成1-2mm薄片；根据权利要求1所述的一种拟野生生境兰科菌根真菌与春剑种子共生培养法，其特征在于步骤(3)中的蒴果为春剑人工异花授粉后180天左右，果荚绿熟后切下，在4℃下干燥保存备用的春剑结实蒴果；根据权利要求1所述的一种拟野生生境兰科菌根真菌与春剑种子共生培养法，其特征在于步骤(6)中的拉片是将根段用刀片与根段切面平行，均匀快速地拉片，将切下的切片用毛笔迅速刷入准备的无菌水中，用毛笔蘸取形态完整、薄且透明的切片。
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