CN106856713A - 一种促进金线莲种子萌发成苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种促进金线莲种子萌发成苗的方法，该技术方案首先通过实验手段发现金线莲种子需与真菌共生才能萌发，在这一思路的指引下，本发明摸索了一套真菌获取方法及共生培养条件，同时明确了一株在木屑基质上对金线莲种子萌发成苗具有突出促进作用的菌株。具体来看，该方法首先从野生金线莲的根中分离得到内生真菌，而后取混生的真菌菌落或纯化的特定菌落与消毒后的金线莲种子在无菌的木屑基质中混合，混合后先在黑暗条件下培养1周，而后以特定的光照时间、光照强度及温度培养，直至种子萌发。该技术方案极大的提升了金线莲种子的萌发速率，同时由于其原理明确因此具有良好的可重复性。

Description

一种促进金线莲种子萌发成苗的方法
技术领域
本发明涉及植物栽培技术领域，进一步涉及兰科植物金线莲种子的萌发诱导技术，具体涉及一种促进金线莲种子萌发成苗的方法。
背景技术
金线莲(Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.)属于兰科(Orchidaceae)开唇兰属(Anoectochilus)植物，为地生兰。金线莲不仅药用价值高，在民间素有“药王”、“金草”等美誉，同时也是一种极具观赏价值的室内观赏珍品。金线莲种子发育不全，没有胚乳，自然条件下很难独立萌发成苗，再加上近年自然环境遭受严重破坏，鸟、虫、蛇等为害，人工的过度挖掘，使野生金线莲濒临灭绝。
在这种情况下，金线莲的人工培养技术显得尤为重要，而人工培养条件下，种子萌发成苗仍然是整个培养过程的技术瓶颈之一，由于缺乏有效的诱导方法，因此现有技术中金线莲种子的萌发率较低。尽管有研究者进行了大量尝试，但目前仍未取得有效的萌发促进方法，严重制约了金线莲培养技术的规模化应用。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种促进金线莲种子萌发成苗的方法，以解决现有技术中金线莲种子自然萌发成苗效率低的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中缺乏一种促进金线莲种子萌发成苗的人工干预手段。
本发明要解决的再一技术问题是当采用与真菌共生的手段来促进金线莲种子萌发成苗时，缺乏一套有效的真菌获取方法及共生培养条件。
本发明要解决的又一技术问题是当采用与真菌共生的手段来促进金线莲种子萌发成苗时，有效真菌的类别不明确。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种促进金线莲种子萌发成苗的方法，该方法是从金线莲植株的根部分离真菌，再将所得的真菌与消毒后的金线莲种子在无菌基质中共生培养。
作为优选，所述从金线莲植株的根部分离真菌包括以下步骤：取野生金线莲根，洗净后利用浓度为75％的酒精表面消毒30s，再利用0.1％升汞消毒5min，而后无菌水洗净；将0.5～1cm长度的根段平放在无菌的PDA平板培养基上，封口膜封好后于28℃条件下避光培养；挑取菌落，即为分离得到的真菌。
作为优选，所述从金线莲植株的根部分离真菌包括以下步骤：
1)取野生金线莲根，洗净后利用浓度为75％的酒精表面消毒30s，再利用0.1％升汞消毒5min，而后无菌水洗净；将0.5～1cm长度的根段平放在无菌的PDA平板培养基上，封口膜封好后于28℃条件下避光培养；
2)挑取菌落，通过划线的方法进行纯化，得到若干纯培养的不同种菌落；
3)分别挑取步骤2)所得的不同种菌落，即为若干分离得到的真菌。
作为优选，步骤3)中所挑取的菌落仅有一种，该菌是立枯丝核菌。
作为优选，所述无菌基质中含有木屑。
作为优选，所述无菌基质是通过以下方法制备的：取发酵的木屑基质，加入蒸馏水润湿，分装于培养瓶中灭菌，冷却。
作为优选，所述共生培养的条件为：先于28℃、黑暗条件下培养1周；而后以12h/d的光照时长、2000-2500Lux的光照强度、24～28℃的温度，培养至种子萌发。
本发明提供了一种促进金线莲种子萌发成苗的方法，该技术方案首先通过实验手段发现金线莲种子需与真菌共生才能萌发，在这一思路的指引下，本发明摸索了一套真菌获取方法及共生培养条件，同时明确了一种在木屑基质上对金线莲种子萌发成苗具有突出促进作用的菌株。具体来看，该方法首先从野生金线莲的根中分离得到内生真菌，而后取混生的真菌菌落或纯化的特定菌落与消毒后的金线莲种子在无菌的木屑基质中混合，混合后先在黑暗条件下培养1周，而后以特定的光照时间、光照强度及温度培养，直至种子萌发。该技术方案极大的提升了金线莲种子的萌发速率，同时由于其原理明确因此具有良好的可重复性。本发明为金线莲资源保护和规模化人工培养奠定了坚实的技术基础。
附图说明
图1是本发明实施例1中种子萌发进程图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
实施例1
1材料
野生金线莲，购自江西省铜鼓县
2研究方法
2.1内生真菌的获得
将野生金线莲的根采下，自来水洗净泥沙，肥皂水浸泡10-20min，冲洗干净，75％酒精表面消毒30s，0.1％升汞消毒5min，最后无菌水冲洗5遍。将每条根剪成若干0.5-1.0cm的根段，平放在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA平板培养基，事先灭菌，分装在无菌的培养皿中)上，每个培养皿接5个根段。对照组为最后一次的清洗液，涂在培养皿中，接种40个培养皿，封口膜封好放于28℃恒温培养箱中进行暗培养。
待菌长出后，通过划线的方法进行纯化。在超净工作台上，用接种针轻轻挑起少许菌丝，在PDA平板培养基上划斜线，随后用封口膜封好培养皿。观察菌产生的菌落形态，合并相同形态的菌，将分离出的纯菌继续用PDA平板培养基培养，纯菌接种于试管中于-20℃冰箱中保存。
待金线莲种子成熟时，将真菌从冰箱中取出，用接种针逐一挑出真菌接种在PDA培养基上，放于28℃恒温培养箱中进行暗培养。培养7-10d后进行共生培养研究。
2.2真菌与种子共生培养
将发酵好的牛粪和木屑基质，加入少量蒸馏水，用手握基质湿润又捏不出水即可，分装在若干培养瓶中，高温高压灭菌冷却，备用。
按照常规兰科种子消毒方法对金线莲蒴果进行消毒，用解剖刀将蒴果划开，将种子抖落在灭好菌的牛粪和木屑基质中。分别在PDA培养基上截取1cm×1cm真菌小块，放于播完种的牛粪和木屑基质中，每种真菌在2种基质中各接种3瓶。空白对照只播种不接种真菌。将接完菌和种子的培养瓶放于28℃黑暗条件下培养1周，随后培养条件为光照时间12h/d，光照强度为2000-2500lx，培养温度26±2℃，观察种子萌发情况。
3结果
3.1内生真菌分离
共分离得到35株真菌，去掉部分生长过于旺盛的真菌，确定了25株真菌用于共生培养。
3.2内生真菌与种子共生培养
接种15d后，有17种真菌长满了基质，有8种真菌在基质中生长缓慢，均未见有种子膨大现象(见图1中A部分、B部分)。30d，在菌丝生长缓慢的基质中有种子吸水略微膨大的现象，尤其是在第20号真菌在木屑基质中种子膨大明显，可以看到菌丝明显缠绕在种子上，60d，种子形成原球茎并开始变绿，体视显微镜下观察，可见菌丝紧密接触着原球茎(见图1中C部分)，90d，部分原球茎顶部分化出芽，并开始伸长，长出茎，但是原球茎变绿数量不到原球茎总数的一半(见图1中D部分)，120d，部分原球茎已变成幼苗，而有的原球茎老化，基部变黄(见图1中E部分)。空白对照种子均不萌发，另外，在牛粪基质中，25种真菌始终未见种子的萌发(见图1中F部分)。
实施例2
一种促进金线莲种子萌发成苗的方法，该方法是从金线莲植株的根部分离真菌，再将所得的真菌与消毒后的金线莲种子在无菌基质中共生培养。
所述从金线莲植株的根部分离真菌包括以下步骤：取野生金线莲根，洗净后利用浓度为75％的酒精表面消毒30s，再利用0.1％升汞消毒5min，而后无菌水洗净；将0.5cm长度的根段平放在无菌的PDA平板培养基上，封口膜封好后于28℃条件下避光培养；挑取菌落，即为分离得到的真菌。
所述无菌基质中含有木屑。
所述无菌基质是通过以下方法制备的：取发酵的木屑基质，加入蒸馏水润湿，分装于培养瓶中灭菌，冷却。
所述共生培养的条件为：先于28℃、黑暗条件下培养1周；而后以12h/d的光照时长、2000Lux的光照强度、24℃的温度，培养至种子萌发。
实施例3
一种促进金线莲种子萌发成苗的方法，该方法是从金线莲植株的根部分离真菌，再将所得的真菌与消毒后的金线莲种子在无菌基质中共生培养。
所述从金线莲植株的根部分离真菌包括以下步骤：
1)取野生金线莲根，洗净后利用浓度为75％的酒精表面消毒30s，再利用0.1％升汞消毒5min，而后无菌水洗净；将1cm长度的根段平放在无菌的PDA平板培养基上，封口膜封好后于28℃条件下避光培养；
2)挑取菌落，通过划线的方法进行纯化，得到若干纯培养的不同种菌落；
3)从步骤2)所得的若干菌落中挑取立枯丝核菌菌落，即为分离得到的真菌。
所述无菌基质是通过以下方法制备的：取发酵的木屑基质，加入蒸馏水润湿，分装于培养瓶中灭菌，冷却。
所述共生培养的条件为：先于28℃、黑暗条件下培养1周；而后以12h/d的光照时长、2500Lux的光照强度、28℃的温度，培养至种子萌发。
实施例4
一种促进金线莲种子萌发成苗的方法，该方法是从金线莲植株的根部分离真菌，再将所得的真菌与消毒后的金线莲种子在无菌基质中共生培养。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种促进金线莲种子萌发成苗的方法，其特征在于是从金线莲植株的根部分离真菌，再将所得的真菌与消毒后的金线莲种子在无菌基质中共生培养。
2.根据权利要求1所述的一种促进金线莲种子萌发成苗的方法，其特征在于所述从金线莲植株的根部分离真菌包括以下步骤：取野生金线莲根，洗净后利用浓度为75％的酒精表面消毒30s，再利用0.1％升汞消毒5min，而后无菌水洗净；将0.5～1cm长度的根段平放在无菌的PDA平板培养基上，封口膜封好后于28℃条件下避光培养；挑取菌落，即为分离得到的真菌。
3.根据权利要求1所述的一种促进金线莲种子萌发成苗的方法，其特征在于所述从金线莲植株的根部分离真菌包括以下步骤：
1)取野生金线莲根，洗净后利用浓度为75％的酒精表面消毒30s，再利用0.1％升汞消毒5min，而后无菌水洗净；将0.5～1cm长度的根段平放在无菌的PDA平板培养基上，封口膜封好后于28℃条件下避光培养；
2)挑取菌落，通过划线的方法进行纯化，得到若干纯培养的不同种菌落；
3)分别挑取步骤2)所得的不同种菌落，即为若干分离得到的真菌。
4.根据权利要求3所述的一种促进金线莲种子萌发成苗的方法，其特征在于步骤3)中所挑取的菌落仅有一种，该菌是立枯丝核菌。
5.根据权利要求1所述的一种促进金线莲种子萌发成苗的方法，其特征在于所述无菌基质中含有木屑。
6.根据权利要求5所述的一种促进金线莲种子萌发成苗的方法，其特征在于所述无菌基质是通过以下方法制备的：取发酵的木屑基质，加入蒸馏水润湿，分装于培养瓶中灭菌，冷却。
7.根据权利要求1所述的一种促进金线莲种子萌发成苗的方法，其特征在于所述共生培养的条件为：先于28℃、黑暗条件下培养1周；而后以12h/d的光照时长、2000-2500Lux的光照强度、24～28℃的温度，培养至种子萌发。
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