CN108419605A - 一种丛枝菌根真菌菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物制剂及植物栽培技术领域，具体涉及一种丛枝菌根真菌菌剂及其制备方法与应用。本发明采集钼矿区植物的根际土壤，采用湿筛法分离丛枝菌根真菌的成熟孢子，然后接种到玉米幼苗的根系上，接种后的玉米幼苗在培养基质上生长3～4个月，将培养基质和玉米根系分离，玉米根系剪碎，然后与培养基质混合，得到丛枝菌根真菌原种菌剂；将原种菌剂接种至扩繁基质中播种玉米种子，对玉米培养6～10周，将扩繁基质和玉米根系分离，玉米根系剪碎，然后与扩繁基质混合，得到丛枝菌根真菌菌剂，该菌剂可促进玉米在钼污染土壤中生长。

Description

一种丛枝菌根真菌菌剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物制剂及植物栽培技术领域，具体涉及一种丛枝菌根真菌菌剂及其制备方法与应用。

背景技术

钼不仅是动植物生长所必需的营养元素之一，同时作为稀有元素，广泛应用于钢铁、电子、航天等产业，是非常重要的战略资源。我国钼储量居世界前列，辽宁、陕西、山西、河南、福建、江西等省均有钼矿，且储量大、开发条件好。钼矿及伴生钼矿开采和选矿产生的尾矿和采选矿废水可造成严重的水体和土壤钼污染。自Ferguson等首先报道反刍动物因食用高钼草导致钼中毒开始，环境的钼污染问题已引起国内外学者的高度重视。一般认为动物容易产生钼中毒症状，而植物对钼的抗性较强，但过量钼污染仍会对植物造成毒害作用，也必然会对玉米等植物的生长、产量以及品质造成较大的影响。

玉米是一个广域的植物品种，易栽培、生长快，具有很高的生物量，针对我国人多地少、土壤中低度污染突出的问题，利用分布广、易生长、生物量大的能源和经济作物开展生态修复具有“边生产-边修复”的明显优势，因此玉米成为了在土壤修复中的理想作物。根据发表于《环境科学》(0250-3301(2008)03-0709-05)的《玉米对受污染河道复合沉积物的修复》，玉米的根际作用促使沉积物中微生物种类和数量增加，酶活性的提高也促进了玉米对沉积物中污染物的修复进程；根据发表于《辽宁工程技术大学学报》(1008-0562(2010)02-0313-03)的《污染河道沉积物的植物修复》，玉米的根际作用增加了沉积物中微生物的数量，增强了酶活性，对修复沉积物中重金属污染具有良好效果。因此，需要找到促进玉米在重金属污染的环境中生长的方法。

丛枝菌根真菌不仅能够改善植物营养，对植物的抗逆能力也具有极大地促进作用。根据发表于《环境科学》(0250-3301(2013)05-1915-07)的《丛枝菌根真菌对稀土尾矿中大豆生长和稀土元素吸收的影响》，在稀土尾矿中，接种AM真菌G.versiforme与大豆成功建立了共生关系；接种显著提高了大豆植株对P和K吸收，降低了C:P与N:P比，促进了大豆的生长。根据发表于《草业学报》(2017.26(2):69-77)的《镉污染和接种丛枝菌根真菌对紫花苜蓿生长和氮吸收的影响》，在镉浓度为12mgCd/kg条件下，接种丛枝菌根真菌Gv菌种显著增加了紫花苜蓿的株高、根瘤菌数量、地上部分生物量，总生物量，地上部分和全株吸氮量。

中国发明专利CN2015102328763公开了一种提高沙枣抗盐碱能力的丛枝菌根真菌，提供一株丛枝菌根真菌，该菌株具有较高的承受盐碱胁迫的能力，为利用菌根-植物联合修复盐碱地提供理论依据。

中国发明专利CN201310004329.0公开了一种用丛枝菌根真菌菌剂促进大田甘蔗生长的方法，采用该发明生产的丛枝菌根菌剂作为大田甘蔗接种物，促进甘蔗对土壤中养分和水分的吸收，提高甘蔗的抗旱性，产量提高10％以上。

丛枝菌根真菌可以通过改善植物的营养状况来提高植物的产量和品质，也可以提高抗旱性、抗盐碱、抗病或抗重金属等。但是上述文章或公开的发明专利没有涉及到丛枝菌根真菌在重钼污染的条件下使用，利用丛枝菌根真菌促进玉米在重钼污染条件下生长还未见报道和专利公开。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种丛枝菌根真菌菌剂的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法制得的丛枝菌根真菌菌剂，该菌剂可以促进重钼污染土壤中玉米的生长。

本发明的再一目的在于提供上述丛枝菌根真菌菌剂的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种丛枝菌根真菌菌剂的制备方法，包含如下步骤：

(1)采集钼矿区植物的根际土壤，采用湿筛法分离根际土壤中的丛枝菌根真菌的成熟孢子，得到丛枝菌根真菌孢子；将丛枝菌根真菌孢子接种到玉米幼苗的根系上，接种后的玉米幼苗在培养基质上生长3～4个月，然后去除玉米地上部分，将培养基质和玉米根系分离，玉米根系剪碎，然后与培养基质再次混合，得到丛枝菌根真菌原种菌剂；

(2)将步骤(1)制得的丛枝菌根真菌原种菌剂接种至扩繁基质中，混匀，得到含有丛枝菌根真菌原种菌剂的扩繁基质；然后将含有丛枝菌根真菌原种菌剂的扩繁基质铺覆至厚度为10～20cm，浇水至田间持水量的50～70％，播种玉米种子，播种后表面覆盖厚度为1～2cm的含有丛枝菌根真菌原种菌剂的扩繁基质；对玉米培养6～10周，其中，每天在光照8000～12000lux、温度28～35℃的条件下培养13～14h，在黑暗18～25℃的条件下培养10～11h；玉米生长过程中，浇灌含有1/2磷营养元素的Hoagland营养液并根据干湿状况进行浇水，控制基质含水量为田间持水量的30～70％；

(3)玉米生长6～10周后，去除玉米地上部分，将扩繁基质与玉米根系分离，玉米根系剪碎，然后与扩繁基质再次混合，得到丛枝菌根真菌菌剂；

步骤(1)中所述的玉米幼苗优选为播种2周的玉米幼苗；

步骤(1)中所述的培养基质优选为包含细河沙和蔗渣的混合基质；

所述的细河沙和蔗渣的质量比优选为(4～6)：1；

所述的细河沙优选通过如下预处理：

细河沙过2mm筛子，用水冲洗至水清，然后用蒸馏水浸泡3天，并再用蒸馏水冲洗3次；然后在121℃条件下，灭菌2h，冷却，在无菌环境下铺成小于1cm的薄层，自然风干1周；

所述的蔗渣优选通过如下预处理：

将蔗渣粉碎，过10～100目筛，灭菌；

步骤(1)中所述的培养基质的厚度优选为10～15cm；

步骤(1)中所述的生长的具体操作优选为：

在玉米生长过程中每2周一次浇灌1次Hoagland营养液；

步骤(1)中所述的丛枝菌根真菌原种菌剂为经丛枝菌根真菌孢子繁殖后所获得的菌剂，包括培养基质以及培养基质中的丛枝菌根真菌孢子、菌丝以及玉米根系；

步骤(2)中所述的丛枝菌根真菌原种菌剂的接种量优选为15～20wt％；

步骤(2)中所述的扩繁基质的厚度优选为15cm；

步骤(2)中所述的扩繁基质优选为细河沙；

所述的细河沙优选通过如下预处理：

细河沙过2mm筛子，用水冲洗至水清，然后用蒸馏水浸泡3天，并再用蒸馏水冲洗3次；然后在121℃条件下，灭菌2h，冷却，在无菌环境下铺成小于1cm的薄层，自然风干1周；

步骤(2)中所述的玉米的培养条件优选为：每天在光照10000lux、温度30℃的条件下培养14h，在黑暗20℃的条件下培养10h；

步骤(2)中所述的浇水的条件优选为：控制基质含水量为田间持水量的40～50％，每2天浇一次；

步骤(2)中所述的含有1/2磷营养元素的Hoagland营养液优选每1周浇灌1次，用量按照补足基质含水量达到田间持水量的30～70％为止；

步骤(3)中所述的玉米根系剪碎后长度小于0.5cm；

步骤(3)中所述的丛枝菌根真菌菌剂的含水量不低于田间持水量的30％；

步骤(3)中所述的丛枝菌根真菌菌剂优选随时收获，随时施用；若需要存放，要存放于0～4℃的条件下，并在1周内施用；

一种丛枝菌根真菌菌剂，通过上述制备方法制备得到；

所述的丛枝菌根真菌菌剂在钼污染土壤改良及玉米栽培领域中的应用；

一种利用上述丛枝菌根真菌菌剂促进玉米在钼污染土壤中生长的方法，包括如下步骤：

将上述丛枝菌根真菌菌剂施加到钼污染土壤中，然后再进行玉米栽培；

所述的丛枝菌根真菌高效菌剂的接种量优选为10～15wt％；

本发明的原理：

重钼污染土壤中的重金属离子是抑制玉米生长的主要因素，会抑制植物根系发育及其对养分的吸收，从而影响整株植物的生长。本发明利用钼矿污染土壤中分离到的丛枝菌根真菌作为钼污染条件下提高玉米生长菌剂的来源，接种至玉米幼苗并在含有蔗渣和细河沙的培养基质上繁殖，得到丛枝菌根真菌原种菌剂；利用该原种菌剂与玉米混合栽培，得到丛枝菌根真菌菌剂。其中，培养基质不仅透气性、保水性好，满足玉米对水、肥和氧的需求，促进玉米根系生长，利于丛枝菌根真菌的繁殖以及玉米根系分泌物的分泌；而且，该基质利于玉米根部与基质分离，方便后续玉米根部的破碎以及丛枝菌根真菌的释放。寄主植物玉米为禾本科，高粱属一年生草本植物，须根粗壮，发达，可在短期内获得大量丛枝菌根真菌，在玉米生产旺盛期收获还保障了玉米分泌的根系分泌物不仅可以促进以后栽植玉米的生长而且改变了原有栽培基质的特性，更有利于玉米的生长发育。

本发明将制得的丛枝菌根真菌菌剂用于钼污染土壤中玉米的栽培，可显著提高植物的株高、茎粗等指标，促进植物生长，显著提高了叶绿素的积累量，减少了钼对植物的毒害，减缓了叶片受钼污染毒害而加速衰老的过程，使玉米植株在重钼污染土壤上生长正常，而未接种处理的玉米植株在4周时已经开始死亡。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的培养基质及扩繁基质不仅透气性、保水性好，满足玉米对水、肥和氧的需求，促进玉米根系生长，进而利于丛枝菌根真菌的繁殖。

(2)本发明采用玉米作为寄主植物在培养基质的基础上可大量繁殖根系，进而可在短期内获得大量丛枝菌根真菌。

(3)本发明制得的丛枝菌根真菌菌剂活性高，不仅含有大量的丛枝菌根真菌，还含有玉米根系分泌物，能够有效调节土壤结构，提高土壤保水保肥能力，有效促进重钼污染的土地中玉米的生长，显著降低金属离子的毒害，可显著提高植物的株高、茎粗等指标，促进植物生长，显著提高叶绿素的积累量，减少钼对植物的毒害，减缓叶片受钼污染毒害而加速衰老的过程，达到提高玉米产量和品质。

(4)本发明所得到的丛枝菌根菌剂来源于钼矿污染区域，具有抗钼性强的特点。

(5)本发明所获得的菌剂是来自于土壤中分离到的丛枝菌根真菌孢子的繁殖而获取，能保证没有其它类型微生物的污染。

(6)本发明源自于土壤中的多种类丛枝菌根真菌孢子，具有适应性强的特点。

(7)本发明工艺简单，操作简单，对环境友好，没有副作用。

附图说明

图1是实验组和对照组单叶片的叶绿素积累量分析图。

图2是实验组和对照组重钼污染玉米生长情况分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中细河沙通过如下预处理：细河沙过2mm筛子，用水冲洗至水清，然后用蒸馏水浸泡3天，并再用蒸馏水冲洗3次；然后在121℃条件下，灭菌2h，冷却，在无菌环境下铺成小于1cm的薄层，自然风干1周；

蔗渣通过如下预处理：将蔗渣粉碎，过50目筛，121℃条件下，灭菌2h，自然风干；

实施例1

(1)采集洛阳某钼矿区植物的根际土壤，采用湿筛法分离根际土壤中的丛枝菌根真菌的健康成熟孢子，将丛枝菌根真菌孢子接种到播种2周的玉米幼苗的根系上，接种后的玉米幼苗在培养基质(细河沙和蔗渣的质量比5：1，培养基质的厚度为13cm)上生长3.5个月，在生长过程中每2周一次浇灌1次Hoagland营养液；然后去除玉米地上部分，将培养基质和玉米根系分离，玉米根系剪碎，然后与培养基质再次混合，得到丛枝菌根真菌原种菌剂，该原种菌剂含有丛枝菌根真菌孢子、菌丝及被侵染根段的培养基质；

(2)将步骤(1)制得的丛枝菌根真菌原种菌剂按照接种量15wt％的比例，接种至扩繁基质细河沙中，混匀，得到含有丛枝菌根真菌原种菌剂的扩繁基质；然后将含有丛枝菌根真菌原种菌剂的扩繁基质均匀铺覆在长方体的培养盒内，扩繁基质厚度为15cm，然后浇蒸馏水至田间持水量的70％，播种玉米种子，播种后表面覆盖厚度为1.5cm的含有丛枝菌根真菌原种菌剂的扩繁基质；对玉米培养8周，其中，每天在光照10000lux、温度30℃的条件下培养14h，在黑暗20℃的条件下培养10h；生长过程中，根据干湿状况进行浇水，控制基质含水量为田间持水量的40％，每2天浇一次；每1周浇灌1次含有1/2磷营养元素的Hoagland营养液，用量按照补足基质含水量达到田间持水量的40％为止；

(3)玉米生长8周后，剪掉玉米地上部分植株，将扩繁基质与玉米根系分离，玉米根系剪碎至小于0.5cm，然后与扩繁基质再次混合，得到丛枝菌根真菌菌剂，该菌剂的含水量不低于田间持水量的30％。

实施例2

(1)采集洛阳某钼矿区植物的根际土壤，采用湿筛法分离根际土壤中的丛枝菌根真菌的健康成熟孢子，将丛枝菌根真菌孢子接种到播种2周的玉米幼苗的根系上，接种后的玉米幼苗在培养基质(细河沙和蔗渣的质量比4：1，培养基质的厚度为10cm)上生长3个月，在生长过程中每2周一次浇灌1次Hoagland营养液；然后去除玉米地上部分，将培养基质和玉米根系分离，玉米根系剪碎，然后与培养基质再次混合，得到丛枝菌根真菌原种菌剂，该原种菌剂含有丛枝菌根真菌孢子、菌丝及被侵染根段的培养基质；

(2)将步骤(1)制得的丛枝菌根真菌原种菌剂按照接种量20wt％的比例，接种至扩繁基质细河沙中，混匀，得到含有丛枝菌根真菌原种菌剂的扩繁基质；然后将含有丛枝菌根真菌原种菌剂的扩繁基质均匀铺覆在长方体的培养盒内，扩繁基质厚度为20cm，然后浇蒸馏水至田间持水量的50％，播种玉米种子，播种后表面覆盖厚度为1cm的含有丛枝菌根真菌原种菌剂的扩繁基质；对玉米培养10周，其中，每天在光照12000lux、温度28℃的条件下培养13h，在黑暗18℃的条件下培养11h；生长过程中，根据干湿状况进行浇水，控制基质含水量为田间持水量的30％，每2天浇一次；每1周浇灌1次含有1/2磷营养元素的Hoagland营养液，用量按照补足基质含水量达到田间持水量的30％为止；

(3)玉米生长10周后，剪掉玉米地上部分植株，将扩繁基质与玉米根系分离，玉米根系剪碎至小于0.5cm，然后与扩繁基质再次混合，得到丛枝菌根真菌菌剂，该菌剂的含水量不低于田间持水量的30％。

实施例3

(1)采集洛阳某钼矿区植物的根际土壤，采用湿筛法分离根际土壤中的丛枝菌根真菌的健康成熟孢子，将丛枝菌根真菌孢子接种到播种2周的玉米幼苗的根系上，接种后的玉米幼苗在培养基质(细河沙和蔗渣的质量比6：1，培养基质的厚度为15cm)上生长4个月，在生长过程中每2周一次浇灌1次Hoagland营养液；然后去除玉米地上部分，将培养基质和玉米根系分离，玉米根系剪碎，然后与培养基质再次混合，得到丛枝菌根真菌原种菌剂，该原种菌剂含有丛枝菌根真菌孢子、菌丝及被侵染根段的培养基质；

(2)将步骤(1)制得的丛枝菌根真菌原种菌剂按照接种量10wt％的比例，接种至扩繁基质细河沙中，混匀，得到含有丛枝菌根真菌原种菌剂的扩繁基质；然后将含有丛枝菌根真菌原种菌剂的扩繁基质均匀铺覆在长方体的培养盒内，扩繁基质厚度为10cm，然后浇蒸馏水至田间持水量的60％，播种玉米种子，播种后表面覆盖厚度为2cm的含有丛枝菌根真菌原种菌剂的扩繁基质；对玉米培养6周，其中，每天在光照8000lux、温度35℃的条件下培养14h，在黑暗25℃的条件下培养10h；生长过程中，根据干湿状况进行浇水，控制基质含水量为田间持水量的50％，每2天浇一次；每1周浇灌1次含有1/2磷营养元素的Hoagland营养液，用量按照补足基质含水量达到田间持水量的50％为止；

(3)玉米生长6周后，剪掉玉米地上部分植株，将扩繁基质与玉米根系分离，玉米根系剪碎至小于0.5cm，然后与扩繁基质再次混合，得到丛枝菌根真菌菌剂，该菌剂的含水量不低于田间持水量的30％。

效果实施例

(1)试验材料与方法

玉米品种为伟科702号，市场上购买所得。试验场所为河南科技大学农学院。将过2mm筛子的沙子放在121℃条件下进行高压蒸汽灭菌2个小时，灭菌后冷却至室温。

(2)试验方案

将灭菌的土壤中加入钼酸铵使钼的浓度达到4000mg/kg，然后将实施例1制得的丛枝菌根真菌菌剂按照接种量10wt％的比例加入到混有钼酸铵的土壤中进行逐级混匀后作为实验组，并以灭菌后的丛枝菌根真菌高效菌剂按照相同比例加入到混有钼酸铵的土壤中进行逐级混匀后作为对照组(CK)。每盆装1kg的混合土壤进行盆栽实验，设置4个重复。每盆播种7颗玉米种子，待出苗一周后间苗成5棵玉米。生长期间试验视需要进行水分等处理，保证玉米正常生长。28天时，测定株高、茎粗、单叶重、叶绿素含量等生理指标。

(3)试验结果

结果如图1所示，对照组中单叶片叶绿素积累量平均值为0.26，施用丛枝菌根真菌菌剂的实验组中单叶片叶绿素积累量平均值为1.01，显著的提高了叶绿素的含量，增加了光合效应，促进了玉米的生长(图2)。

此外，施用丛枝菌根真菌菌剂的玉米的株高，茎粗，单叶重都显著高于没有经过丛枝菌根真菌菌剂的玉米，表明丛枝菌根真菌菌剂能够显著的提高玉米的生长势，促进玉米的生长(表1)。

表1重钼污染条件下接种与不接种玉米生长的反应

本发明制得的菌剂要随时收获，随时施用；若需要存放，要存放于4℃的冰箱中，并在1周内施用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种丛枝菌根真菌菌剂的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)采集钼矿区植物的根际土壤，采用湿筛法分离根际土壤中的丛枝菌根真菌的成熟孢子，得到丛枝菌根真菌孢子；将丛枝菌根真菌孢子接种到玉米幼苗的根系上，接种后的玉米幼苗在培养基质上生长3～4个月，然后去除玉米地上部分，将培养基质和玉米根系分离，玉米根系剪碎，然后与培养基质再次混合，得到丛枝菌根真菌原种菌剂；

(2)将步骤(1)制得的丛枝菌根真菌原种菌剂接种至扩繁基质中，混匀，得到含有丛枝菌根真菌原种菌剂的扩繁基质；然后将含有丛枝菌根真菌原种菌剂的扩繁基质铺覆至厚度为10～20cm，浇水至田间持水量的50～70％，播种玉米种子，播种后表面覆盖厚度为1～2cm的含有丛枝菌根真菌原种菌剂的扩繁基质；对玉米培养6～10周，其中，每天在光照8000～12000lux、温度28～35℃的条件下培养13～14h，在黑暗18～25℃的条件下培养10～11h；玉米生长过程中，浇灌含有1/2磷营养元素的Hoagland营养液并根据干湿状况进行浇水，控制基质含水量为田间持水量的30～70％；

(3)玉米生长6～10周后，去除玉米地上部分，将扩繁基质与玉米根系分离，玉米根系剪碎，然后与扩繁基质再次混合，得到丛枝菌根真菌菌剂。

2.根据权利要求1所述的丛枝菌根真菌菌剂的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的玉米幼苗为播种2周的玉米幼苗。

3.根据权利要求1所述的丛枝菌根真菌菌剂的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的培养基质为包含细河沙和蔗渣的混合基质；

所述的细河沙和蔗渣的质量比为(4～6)：1。

4.根据权利要求1所述的丛枝菌根真菌菌剂的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的培养基质的厚度为10～15cm。

5.根据权利要求1所述的丛枝菌根真菌菌剂的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的丛枝菌根真菌原种菌剂的接种量为15～20wt％。

6.根据权利要求1所述的丛枝菌根真菌菌剂的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的玉米的培养条件为：每天在光照10000lux、温度30℃的条件下培养14h，在黑暗20℃的条件下培养10h。

7.根据权利要求1所述的丛枝菌根真菌菌剂的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的含有1/2磷营养元素的Hoagland营养液每1周浇灌1次，用量按照补足基质含水量达到田间持水量的30～70％为止。

8.一种丛枝菌根真菌菌剂，其特征在于通过权利要求1～7任一项所述的制备方法制备得到。

9.权利要求8所述的丛枝菌根真菌菌剂在钼污染土壤改良及玉米栽培领域中的应用。

10.一种利用丛枝菌根真菌菌剂促进玉米在钼污染土壤中生长的方法，其特征在于包括如下步骤：

将权利要求1～7任一项所述的丛枝菌根真菌菌剂施加到钼污染土壤中，然后再进行玉米栽培。