CN103733829A - 一种丹参人工栽培方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种丹参人工栽培方法，利用丹参内生真菌对宿主植物丹参生长的影响，采用真菌发酵液浸种法，丹参种子的发芽势和发芽率均显著高于对照；采用丹参苗与真菌进行共培养法，促进丹参苗生长；采用真菌发酵液喷洒，促进丹参生长及品质提高，本发明在丹参人工栽培中有效地利用内生真菌，促进丹参种子的萌发和丹参苗生长，显著地提高人工栽培丹参生长状态，为丹参的人工种植和移栽奠定基础。

Description

一种丹参人工栽培方法
技术领域
本发明属于丹参栽培领域，具体涉及一种丹参人工栽培方法。
背景技术
内生真菌(endophytic fungi)是指在生活史中的某一个阶段存在于健康植物组织内部，不会引起宿主明显病症或者对宿主造成明显伤害的真菌。研究发现植物内生真菌可以通过改善植物的营养条件，促进植物生长，表现在增加植物的总生物量、提高种子发芽率、幼苗存活率以及抑制病原菌等多个方面；还可以通过产生次生代谢物及快速激活宿主的逆境反应系统，增强宿主对环境的生态适应能力。内生真菌在生物制药、农业生产、工业发酵等方面上表现出美好的应用前景，已受到世界各国专家的广泛关注。
原料药丹参为唇形科植物丹参Salvia mihiorrhiza Bunge的干燥根及根茎，用于治疗冠心病、脑血管疾病和诱导各种癌细胞凋亡等，随着丹参新药的不断研制开发及市场需求量的增加，对丹参需求量亦明显攀升。丹参的需求量逐渐增加，野生资源不能满足需要，人工栽培成为解决药源的根本途径。丹参繁殖方法有种子繁殖、分根繁殖、扦插繁殖和芦头繁殖等，由于分根繁殖、扦插繁殖和芦头繁殖能够缩短丹参生长周期而为人们所常用，但种植的丹参由于长期的无性繁殖，有效成分含量极不稳定、感染病毒病等现象导致品质和产量的下降，严重影响了临床应用和制药工业的发展。丹参以种子繁殖能很好的解决由于长期的无性繁殖导致品质和产量下降等问题。然而在自然条件下丹参种子萌发率低，不耐贮藏，常温干燥贮藏丹参种子，每放置30天种子发芽率就下降10％，贮藏时间超过半年，其发芽率低于40%，从而严重影响了丹参的人工栽培。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丹参人工栽培方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。
一种丹参人工栽培方法，该丹参人工栽培方法包括以下步骤：
1）浸种：将丹参种子消毒后置于经过灭菌的丹参内生真菌发酵液中浸泡10-12h；
2）萌发：浸种后用无菌水冲洗丹参种子，然后用无菌滤纸吸干丹参种子表面水分，然后放在超净工作台内晾干，将晾干后的丹参种子静置于平皿中的衬垫物上，衬垫物包括铺于平皿底部的经无菌水浸润的若干层滤纸以及铺于所述若干层滤纸上的若干层纱布，静置过程中定时向平皿中喷无菌水以保持衬垫物湿润；
3）萌发后的丹参种子经过育苗后移栽。
所述丹参种子为当年的新种子或者贮藏一年至两年的种子。
所述静置过程中采用全天光照，温度控制在25-27℃。
所述育苗包括以下步骤：
将萌发后的丹参种子转接到MS培养基中进行培养得丹参苗，培养条件为：温度为昼/夜=23-25℃/16-18℃，光照周期为12/12h，照度为1800-2000Lx。
所述丹参人工栽培方法还包括以下步骤：
在育苗阶段，待丹参苗生长至株高2～3cm后，将丹参内生真菌打成菌饼，将菌饼接种于与丹参苗相距1-2cm处的培养基上进行共培养，共培养条件为：温度为昼/夜=23-25℃/16-18℃，光照周期为12/12h，照度为1800-2000Lx。
所述丹参内生真菌为茴香裸胞壳（Emericella foeniculicola）。
所述丹参内生真菌为茴香裸胞壳（Emericella foeniculicola）TR21菌株、茴香裸胞壳（Emericella foeniculicola）N157菌株、茴香裸胞壳（Emericella foeniculicola）NU152菌株或茴香裸胞壳（Emericella foeniculicola）U104菌株。
移栽15-20天后用丹参内生真菌发酵液进行喷洒处理，每4-5株苗一次喷洒10-15mL丹参内生真菌发酵液，每周喷洒一次。
用于喷洒处理的丹参内生真菌发酵液为茴香裸胞壳（Emericella foeniculicola）TR21菌株、茴香裸胞壳（Emericella foeniculicola）N157菌株或茴香裸胞壳（Emericellafoeniculicola）U104菌株的发酵液。
所述丹参内生真菌发酵液的制备方法包括以下步骤：将丹参内生真菌接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，然后置于恒温摇床中于25-28℃、130-160r/min条件下振荡培养三到四周得菌培养液，将菌培养液中的菌丝体经真空抽滤除去，然后以4000-5000r/min离心20-30min，得丹参内生真菌发酵液。
本发明的有益效果体现在：本发明在丹参人工栽培中有效地利用内生真菌，促进丹参种子的萌发，并且可以进一步促进丹参苗生长以及显著地提高人工栽培丹参生长状态和品质，为丹参的高效人工种植奠定基础。
附图说明
图1为各菌株对2010年丹参种子发芽势的影响；
图2为各菌株对2010年丹参种子发芽率的影响；
图3为各菌株对2011年丹参种子发芽势的影响；
图4为各菌株对2011年丹参种子发芽率的影响；
图5为各菌株对2012年丹参种子发芽势的影响；
图6为各菌株对2012年丹参种子发芽率的影响；
图中：**表示与对照组（CK）比较极显著，*表示与对照组（CK）比较显著。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作详细说明。
在本发明的前期工作中，分离出一株产丹参酮ⅡA内生真菌TR21，以TR21为出发菌株通过诱变方法诱变出3株能够高产丹参酮ⅡA的内生真菌（参见文献1），本发明旨在观察这4株菌对丹参生长的影响作用，从内源角度解决丹参人工栽培品质下降等问题。
文献（1）Caixia Ma,Dongliang Jiang,Xiying Wei.Mutation breeding of Emericellafoeniculicola TR21for improved production of tanshinone IIA.Process Biochemistry,2011,46(10):2059～2063.
1材料与方法
1.1材料
1.1.1培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH自然（即不做PH的调整）；
马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH自然；
MS培养基：配方见表1，调pH为5.7～6。
表1
大量元素成分 分子量 使用浓度(mg/L)
硝酸钾KNO3 101.21 1900
硝酸铵NH4NO3 80.04 1650
磷酸二氢钾KH2PO4 136.09 170
硫酸镁MgSO4·7H2O 246.47 370
氯化钙CaCl2·2H2O 147.02 440
微量元素成分
碘化钾KI 166.01 0.83
硼酸H3BO3 61.83 6.2
硫酸锰MnSO4·4H2O 223.01 22.3
硫酸锌ZnSO4·7H2O 287.54 8.6
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 241.95 0.25
硫酸铜CuSO4·5H2O 249.68 0.25
氯化钴CoCl2·6H2O 237.93 0.025
铁盐成分
乙二胺四乙酸二钠Na2.EDTA 372.25 37.25
硫酸亚铁FeSO4·7H2O 278.03 27.85
有机成分
肌醇 100
甘氨酸 2
盐酸硫胺素VB1 0.1
盐酸吡哆醇VB6 0.5
烟酸VB5或VPP 0.5
蔗糖sucrose 342.31 30g/L
琼脂agar 7g/L
1.1.2丹参内生真菌菌种
所用菌株TR21从丹参根部分离得到，TR21菌株属于子囊菌门、散囊菌纲、散囊菌目、发菌科、散囊菌属、茴香裸胞壳（Emericella foeniculicola）；U104是以TR21为出发菌株，通过紫外诱变获得的菌株；N157是以TR21为出发菌株，通过硝酸钠诱变的菌株；NU152是由TR21通过紫外复合亚硝酸钠诱变的菌株，该3株诱变菌株均能产丹参酮ⅡA，由陕西师范大学应用微生物学实验室分离并保藏。将上述内生真菌接种于平板PDA培养基中活化，培养至菌落布满培养基表面。
1.1.3丹参内生真菌发酵液制备
供试菌株（所述菌株中的任意一种）活化后接种于100mL的PDB中，然后置于恒温摇床中在28℃、160r/min条件下振荡培养三周得菌培养液。菌培养液中的菌丝体经真空抽滤除去得滤液，然后将滤液以4000r/min离心30min，取离心后的上清液密封放置在4℃冰箱中保存备用。
1.1.4供试种子
本发明所用丹参种子购自陕西天士力商洛植物药业公司基地，为2010、2011和2012年的种子（即贮藏2年、1年以及当年的新种子），由陕西师范大学国家重点实验室保存。
1.2方法
1.2.1丹参内生真菌发酵液对种子萌发的影响
在丹参种子中选取50粒饱满、无病虫害、整齐一致的种子，用质量分数0·1%的升汞水常规消毒后分别浸入用0.22μm水系滤膜过滤除菌后的丹参内生真菌发酵液50倍稀释液和蒸馏水中，于室温浸泡12h。浸种后弃去浸液，用无菌水冲洗种子以冲去浸液残留，再用无菌滤纸吸干表面水分，然后放在超净工作台内尽量晾干，晾干后置于装有被无菌水浸润的双层滤纸且上铺2层纱布的平皿中，每株菌设3个重复。定时向平皿中喷无菌水保持纱布湿润。每天观察并记录种子的萌发情况（采用全天光照，温度控制在25-27℃）。7天统计发芽数并计算发芽势；14天统计最终发芽率。
种子萌发试验以发芽势和发芽率表示。
公式一：种子发芽势=M1/M×100%
公式二：种子发芽率=M2/M×100%
式中M表示供试种子粒数；M1表示发芽势天数内发芽粒数；M2表示最终发芽粒数。
1.2.2丹参苗的获得
在含有100mL MS培养基的组培瓶中，将萌发后的丹参种子以“品字形”垂直接入组培瓶中，每瓶接种3个，培养1-2周后得株高2～3cm的丹参苗，培养条件为：温度为昼/夜=25℃/18℃，光照周期为12/12h，照度为2000Lx。
1.2.3真菌菌株对丹参苗生长的作用观察
选取生长一致的丹参苗（株高2～3cm）进行试验。将4℃保藏的菌株取出，接种到PDA平皿上活化，28℃培养5天。将活化好的真菌菌株分别打成直径约为2mm的菌饼，并接种于与苗相距2cm处的培养基（MS培养基）上进行共培养。设对照(不接种真菌)，每组重复处理5瓶。培养温度昼/夜=25℃/18℃，光照周期为12/12h，照度2000为Lx。培养3周后把丹参苗从组培瓶中取出，用蒸馏水把支持物冲洗干净，滤纸吸干水分，测苗的鲜重，测量地上部分的高度，采用Epson根系扫描仪及WinRHIZO分析软件测定根系总长、根尖数、根表面积和体积。然后将丹参苗放入70℃烘箱，烘干至恒重，称量各组丹参干重。苗的生长参数分别与对照进行比较，采用t检验进行统计学分析，结果以“均值±偏差”表示。
1.2.4丹参内生真菌发酵液对丹参盆栽苗生长的影响（试验地点：陕西师范大学格物楼）
2013年4月中旬用采集的丹参种子育苗（参考上述方法），当丹参苗生长至株高约6-7cm后炼苗（时间为1-2周），并于5月中旬移栽至盆钵(17cm×15cm)中，移栽后丹参的生长条件与自然天气状况一致，移栽基质为未灭菌的自然土。自然土的配方为砂子：珍珠岩∶蛭石的体积比=2∶1∶1，5株苗/盆，移栽20天后用丹参内生真菌发酵液进行接种，接种方式为喷洒，每盆苗接种15mL发酵液，每周接种一次，每处理设7个平行，以施加清水为对照。3个月后测量各处理的苗高、鲜重、叶绿素含量和根冠比等各项生长指标，苗的生长参数分别与对照进行比较，采用单因素方差分析，结果以“均值±标准偏差”表示。
1.2.5丹参酮ⅡA含量测定
目前对丹参主要有效成分研究得较多的是以丹参酮ⅡA为代表的脂溶性成分，因此本发明选取丹参酮ⅡA含量作为丹参品质判断的一项指标。将收获的各处理盆栽丹参根干燥后粉碎成细粉，称取0.2g。各处理三个重复。以100%甲醇为溶剂，超声提取30min。静置过夜，滤过，定容至10mL，离心(10000r/min)后，用0.22μm有机系滤膜过滤后置于进样瓶中以备HPLC检测。
色谱条件：色谱柱为Diamonsil-C18柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇-水(75:25)；流速：0.8mL/min；检测波长：270nm；柱温：30℃，进样量20μL。以保留时间定性，峰面积定量。
1.3数据处理:用SPSS16.0软件，采用单因素方差分析，用LSD确定组间差异性。
2结果与分析
2.1种子萌发试验
确保试验的统一性，各菌株发酵液稀释50倍（稀释50倍后效果较好）。各菌株发酵液对不同年份种子萌发作用效果如图1-图6所示。结果表明，TR21和N157处理的2010年种子发芽势和发芽率要明显高于对照组；TR21、N157和U104处理的2011年的种子发芽势和发芽率要明显高于对照组；TR21和U104处理的2012年的种子发芽势和发芽率要明显高于对照组；总体来说这4株菌的发酵液对2010、2011、2012年的种子萌发均有较好的促进作用。
2.2共生试验
在真菌和丹参苗三周的共培养过程中，各菌株对丹参苗生长各生长指标都起到了不同程度的促进作用。菌株TR21、N157、NU152对丹参苗鲜重有较明显作用，分别是对照的1.31、1.56、1.33倍；N157对株高有较明显的促进作用；叶柄显著伸长；叶片也显著增大；干重和根直径都比不接菌的丹参苗有显著增加，接种NU152的总根尖数目是对照的1.154倍；真菌促进丹参苗根系的形态建成形成较多的分支，促进根表面积的增大和根直径加粗。内生真菌对丹参苗的影响结果见表2。
表2内生真菌对丹参苗生长的影响(x±s,n=15）
Figure BDA0000430521130000071
注：**表示P<0.01水平上差异显著，*表示P<0.05水平上差异显著。
2.3对丹参盆栽苗生长的影响
表3内生真菌发酵液对丹参盆栽苗生长的影响(x±s,n=35，x为平均值，s为标准偏差）
Figure BDA0000430521130000072
注：**表示P<0.01水平上差异显著，*表示P<0.05水平上差异显著。
从表3可看出，通过接种丹参内生真菌（例如TR21）发酵液，可以显著促进盆栽丹参的生长。
2.4丹参酮ⅡA含量测定结果
表4丹参酮ⅡA含量测定
Figure BDA0000430521130000081
从表4可以看出，在保证秤取丹参根部细粉量一样的前提下，本发明方法所用的菌株发酵液对丹参根部丹参酮ⅡA含量积累有一定程度的促进作用。其中经N157和U104的发酵液接种处理后，丹参酮ⅡA含量与对照组相比有显著的提高。
3结论与讨论
本发明中，经内生真菌发酵液处理过的储藏2年、1年和当年的丹参种子发芽率均有不同程度提高。有研究表明，真菌发酵液促进种子萌发的效果和菌株某些初生产物氨基酸、蛋白质、糖、微量元素等所含物质量有一定相关性。尽管内生真菌发酵液中对种子萌发起决定作用的物质有待进一步研究，但是采用本发明的基于内生真菌的处理方法可以解决丹参种子萌发率低，生长缓慢及品质下降等难题，从而为丹参栽培开辟一条新途径，这对丹参的人工栽培具有重大意义。
丹参苗接种内生真菌后，真菌在培养基表面生长，白色，致密，5天后有稀疏的基内菌丝围绕植物根的生长，菌丝包围根的基部扩散至苗根部，待菌株长满培养基表面，TR21和N157对应的培养基呈红色，而与之共生的植株的根变成红褐色；NU152和U104为深黄色；对照组培养基没有颜色变化。据有关文献报道称，内生真菌次级代谢可产生植物生长素、抗生素、激素、生物碱、毒素、维生素及色素等，可促进宿主植物对氮、磷等营养元素的吸收；也可通过与病原菌竞争营养和空间或直接产生拮抗物质而抑制病原菌，从而促进植物生长，据丹参苗与真菌进行双重培养试验推测共培养后真菌可能产生某些能促进植物生长的代谢产物并分泌到培养基中，从而影响苗生长。

Claims (10)

1.一种丹参人工栽培方法，其特征在于：该丹参人工栽培方法包括以下步骤：
1）浸种：将丹参种子消毒后置于经过灭菌的丹参内生真菌发酵液中浸泡10-12h；
2）萌发：浸种后用无菌水冲洗丹参种子，然后用无菌滤纸吸干丹参种子表面水分，然后放在超净工作台内晾干，将晾干后的丹参种子静置于平皿中的衬垫物上，静置过程中定时向平皿中喷无菌水以保持衬垫物湿润；
3）萌发后的丹参种子经过育苗后移栽。
2.根据权利要求1所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于：所述丹参种子为当年的新种子或者贮藏一年至两年的种子。
3.根据权利要求1所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于：所述静置过程中采用全天光照，温度控制在25-27℃。
4.根据权利要求1所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于：所述育苗包括以下步骤：
将萌发后的丹参种子转接到MS培养基中进行培养得丹参苗，培养条件为：温度为昼/夜=23-25℃/16-18℃，光照周期为12/12h，照度为1800-2000Lx。
5.根据权利要求4所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于：所述丹参人工栽培方法还包括以下步骤：
在育苗阶段，待丹参苗生长至株高2～3cm后，将丹参内生真菌打成菌饼，将菌饼接种于与丹参苗相距1-2cm处的培养基上进行共培养，共培养条件为：温度为昼/夜=23-25℃/16-18℃，光照周期为12/12h，照度为1800-2000Lx。
6.根据权利要求1或5所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于：所述丹参内生真菌为茴香裸胞壳（Emericella foeniculicola）。
7.根据权利要求1或5所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于：所述丹参内生真菌为茴香裸胞壳（Emericella foeniculicola）TR21菌株、茴香裸胞壳（Emericellafoeniculicola）N157菌株、茴香裸胞壳（Emericella foeniculicola）NU152菌株或茴香裸胞壳（Emericella foeniculicola）U104菌株。
8.根据权利要求1所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于：移栽15-20天后用丹参内生真菌发酵液进行喷洒处理，每4-5株苗一次喷洒10-15mL丹参内生真菌发酵液，每周喷洒一次。
9.根据权利要求8所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于：用于喷洒处理的丹参内生真菌发酵液为茴香裸胞壳（Emericella foeniculicola）TR21菌株、茴香裸胞壳（Emericella foeniculicola）N157菌株或茴香裸胞壳（Emericella foeniculicola）U104菌株的发酵液。
10.根据权利要求1或8所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于：所述丹参内生真菌发酵液的制备方法包括以下步骤：将丹参内生真菌接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，然后置于恒温摇床中于25-28℃、130-160r/min条件下振荡培养三到四周得菌培养液，将菌培养液中的菌丝体经真空抽滤除去，然后以4000-5000r/min离心20-30min，得丹参内生真菌发酵液。
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