CN111235037B - 一种amf+dse组合菌剂及其在促进生姜生长与抗青枯病中的应用 - Google Patents

一种amf+dse组合菌剂及其在促进生姜生长与抗青枯病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物保护技术领域，具体公开了一种AMF+DSE组合菌剂及其在促进生姜生长与抗青枯病中的应用。本发明设置不同的菌剂处理对生姜进行接种试验，分析了不同菌剂处理的侵染率、对生姜生长发育及对青枯病的影响。通过试验结果确定最佳的促生姜生长和抗青枯病的菌剂为幼套近明球囊霉+绿色木霉组合，此组合处理的株高、叶片数、地上部干重、根系干重和单株产量最高、而病情指数最低。

Description

一种AMF+DSE组合菌剂及其在促进生姜生长与抗青枯病中的 应用
【技术领域】
本发明涉及植物保护技术领域，特别涉及一种AMF+DSE组合菌剂及其在促进生姜生长与抗青枯病中的应用。
【背景技术】
丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是陆地生态系统中的重要成员，能与植物根系建立互惠共生体。AMF可改善植物的矿质营养、增强植物抗病性、提高植物在极端环境中的抗逆性，有助于植物抵御病原菌的侵害，并改善土壤团粒结构、促进作物的高产稳产、优质高效。AMF侵染植物根尖的特性，表明该真菌的生态位与土传病原物相同，这就为拮抗病原物创造了得天独厚的条件。更为重要的是由根内伸展至根外于土壤中形成的巨大菌丝网络，以及由此形成的菌根网路为其发挥生理生态功能(如水分养分吸收等)奠定了坚实的生物学和生态学基础。AMF在农业可持续发展、生态保护、环境与食品安全等方面亦具重要意义。
深色有隔内生真菌(dark septate endophytes,DSE)广泛定殖于植物根系皮层细胞内或细胞间隙，形成深色有隔的菌丝和微菌核。DSE通常可以促进植物生长，改善养分吸收，提高植物抗病性，增强抵御不良环境条件的能力。自然环境下DSE和AMF可以同时侵染植物根系。 DSE与其他土壤微生物有协同互助关系，DSE可以在根内或根间与AMF形成致密菌丝桥，扩大根系养分吸收范围，有效进行物质交换与信息传递，共同促进植物根围微生物活动，改善植物根围土壤微环境，从而促进植物的生长发育。
生姜起源于热带雨林地区，是我国重要的出口创汇蔬菜。生姜连作障碍中最突出的病害是细菌性青枯病，青枯病严重影响了我国生姜产业的发展，造成了严重损失，常年减产达20％～ 30％，重病年高达50％～70％及以上，甚至绝产。目前国内对于生姜青枯病的防治手段主要依赖于化学防治，但是化学防治对环境危害大且会改变土壤中微生物的群落组成和结构，导致生姜青枯病更加难以防治。
针对生姜青枯病化学防治存在的问题，有研究已经提出了一些绿色防控方法，例如，刘贵猛等(刘贵猛，谭树朋，孙文献，等.PGPR和AMF对生姜青枯病的影响[J].菌物研究，2017， 15(1):1-7.)中公开了AMF地表球囊霉Gv与PGPR假单胞菌S3－11菌株组合能够通过相互促进对方的侵染与定殖，协同抑制生姜青枯病菌的繁殖和侵染，进而改善生姜的抗病性、降低危害程度，同时促进了生姜的生长和增加生姜经济产量；还例如尹恩等(尹恩,王明跃,武际, 宋朝伟,李琳,张娜娜.蚯蚓粪+AMF对连作生姜的影响[J].韶关学院报，2017，(第9期).)公开了以蚯蚓粪为基础，配合接种AMF摩西球囊霉GM菌剂可有效防治生姜青枯病、促进生姜生长从而提升生姜产量的方案；此外，汪茜等(汪茜,包涵,张金莲,宋娟,刘增亮,黄京华,陈廷速. 不同丛枝菌根真菌种类对生姜生长的影响[J].热带作物学报,2019,(第7期).)在前期还研究了不同AMF菌种对生姜生长的影响，得出了AMF中的细凹无梗囊霉(Acaulospora scrobiculata)、网状球囊霉(Glomus reticulatum)、隐形球囊霉(Paraglomus occltum)、摩西球囊霉(Glomus mosseae)为能够促进生姜生长，是适宜生姜生长的优良AMF菌株的结论。
即现有技术中对生姜生长发育及抗青枯病的研究为AMF、AMF和营养物质结合以及AMF和 PGPR结合在对生姜株高、产量、干鲜重等生长指标，以及青枯病发病指标的测定上，而对 AMF+DSE组合对生姜生长以及青枯病的影响鲜有研究。
虽然目前已经有关于将AMF和DSE结合用于其他作物种植保护的研究，例如，中国发明专利申请CN104877913A一种AMF+DSE组合菌剂及其在制备促进黄瓜生长与抗根结线虫的制剂中的应用，通过将AMF+DSE组合的制剂施用于黄瓜中可有效促进黄瓜的生长以及降低线虫发病率以及减少根内线虫数量，防御南方根结线虫的效果最佳。但是上述AMF+DSE组合菌剂虽然能有效促进黄瓜的生长以及降低线虫发病率以及减少根内线虫数量，但是其对生姜的体现并不是促生作用，也无法抵抗生姜的的青枯病病菌。此外，由于不同AMF与不同的DSE存在一定相互选择性，即有的AMF能和有的DSE能协同发挥生理生态作用，但是有的AMF和有的DSE却存在竞争或拮抗作用，因此，提供一种对生姜生长和抗生姜青枯病起协同作用的AMF+DSE组合对于我国生姜产业的发展具有一定的意义。
【发明内容】
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种AMF+DSE组合菌剂及其在促进生姜生长与抗青枯病中的应用。本发明筛选得到的AMF+DSE组合菌剂具有促进生姜生长，降低生姜连作障碍，提高生姜品质、产量以及抗病抗逆性，同时改善土壤特性的效果。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种AMF+DSE组合菌剂，包括AMF菌剂和DSE菌剂，所述AMF菌剂为幼套近明球囊霉菌株制成的菌剂，所述DSE菌剂为绿色木霉菌株制成的菌剂；
其中，幼套近明球囊霉Claroideoglomus etunicatum，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为 2019年6月6日，保藏编号为：CGMCC No.17987；绿色木霉Trichoderma viride，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏日期为2019年3月21日，保藏编号为：CGMCC No.17196。
进一步的，所述AMF菌剂的孢子数为20-25个/g，所述DSE菌剂中的菌落总数为 5×105cfu/mL。
进一步的，所述AMF菌剂的具体制备方法为：
(1)培养基质制备：将粒径为2mm的沸石和粒径≤2mm的河沙按质量比1:1混合后，于 95℃的蒸汽下灭菌1-2h后，间隔24h，然后再进行第二次灭菌，最后，放置1-2周，即得所述培养基质；
(2)培养：将培养基质装至培养盆中的2/3处，然后加入孢子或培养物，再播种玉米20粒/盆，最后覆盖2cm的培养基质、浇水；
(3)管理收集：每周往所述培养盆中浇Hoagland营养液，于28℃的恒温下培养至少4 个月后，收集所述培养盆内的培养物，即得孢子数为20-25个/g AMF菌剂。
所述DSE菌剂的具体制备方法为：将活化后的绿色木霉菌块接入PDB(PotatoDextrose Broth)培养基中，于25℃、120r/min下震荡培养14d，然后用灭菌纱布过滤收集菌丝，再用灭菌水洗涤菌丝数次后，将菌丝打碎配制成5×105cfu/mL的菌液，即得所述DSE菌剂。
本发明进一步提供了一种AMF+DSE组合菌剂在促进生姜生长中的应用。
更进一步的，所述组合菌剂的施用方法为：每两株生姜苗接种25g所述AMF菌剂；每两株生姜苗灌根50mL所述DSE菌剂，且每隔15d灌1次，共灌3次。
更进一步的，所述组合菌剂能提高生姜的株高、叶片数、地上部分鲜重和干重以及地下部分茎块重。
本发明进一步提供了一种AMF+DSE组合菌剂在抗生姜青枯病中的应用。
更进一步的，所述生姜青枯病是由土壤青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum引起的。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明设置不同的菌剂处理对生姜进行接种试验，分析了不同菌剂处理的侵染率、对生姜生长发育及对姜瘟病(即青枯病)的影响。通过试验结果确定最佳的抗姜瘟病的菌剂为幼套近明球囊霉+绿色木霉组合，此组合处理的株高、叶片数、地上部鲜重、地上部干重和单株产量最高，而病情指数最低、防效最高，分别为21.5和77.5％。表明该最佳组合菌剂具有促进生姜生长，降低生姜连作障碍，提高生姜品质、产量以及抗病抗逆性，同时改善土壤特性的效果。
【附图说明】
图1是CK处理的根系染色图像。
图2是Ce处理的根系染色图像。
图3是Tv处理的根系染色图像。
图4是Ce+Tv处理的根系染色图像。
如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。
【具体实施方式】
下面将结合具体实施例来对本发明作进一步的说明。
1.试验材料
本发明中所使用的试验材料具体如下：
(1)生姜组织培养种苗:品种来自广西柳州市柳江县当地种植品种，也可采用其它常见生姜品种；
(2)AMF菌株：摩西球囊霉Glomus mosseae(简称Gm)、细凹无梗囊霉Acaulosporascrobiculata(简称As)、网状球囊霉Glomus reticulatum(简称Gr)、隐形球囊霉Paraglomus occltum(简称Po)和幼套近明球囊霉Claroideoglomus etunicatum(简称Ce)均由广西农业科学院微生物研究所土壤微生物课题组采样分离保藏；
(3)DSE菌株：绿色木霉Trichoderma viride(简称Tv)由广西农业科学院微生物研究所土壤微生物课题组采样分离保藏；
(4)青枯病菌：青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum(简称Rs)菌株采自田间发病植株，经广西农业科学院微生物研究所分离和鉴定。
本发明的试验在广西农业科学院微生物研究所的温室进行。
2.试验设计
1)处理设置
本试验设12个处理，分别为Gm、As、Gr、Po、Ce、Tv、Gm+Tv、As+Tv、Gr+Tv、Po+Tv、 Ce+Tv和不接种对照组(CK)，每个处理15个重复，共180盆。
2)接种
选取生长健壮、大小一致的生姜组织培养种苗，用多菌灵冲洗消毒。将消毒后的生姜种苗移栽至洗净晾干的花盆(花盆盆口直径为15cm、深度为12.5cm)中，每盆移栽两株生姜苗，并接入相应的处理菌剂。具体操作如下：在花盆内底部垫上和其底部大小一致的圆形塑料纸后，放入1/3灭菌基质，然后每盆移栽2株生姜种苗；在生姜根系附近放入25g/盆的AMF菌剂后(须保证根系与AMF菌剂相接触)，继续往花盆倒入灭菌基质至花盆的3/4，保证培养基质没过生姜根系、茎块；然后再采用灌根的方法接种DSE菌剂50mL/盆，且每隔15d灌1次，共灌3次；在生姜成熟期接种青枯病病菌，即按照刘波等(刘波，林营志，朱育菁，曹宜，肖荣凤，葛慈斌.青枯雷尔氏菌多态性研究[M].福建:福建科学技术出版社，2005.)描述的方法，将生姜青枯病病原菌制成浓度为2×108cfu/mL的菌液，取5mL用蒸馏水稀释到 100mL，然后均匀倒入生姜的根围。
3)栽培管理
将上述盆栽放置于25℃恒温的玻璃温室内，定期观察，每隔1d适量浇水，每周浇一次营养液。
3.数据处理
采用Excel软件和DPS统计软件对实验数据进行分析，置信水平为95％(P<0.05)。
4.试验结果
1)不同处理对生姜生长的影响
于生姜幼苗期、发根期以及块茎膨大期以常规方法测定各组生姜的株高和叶片数，结果见表1：
表1不同处理对生姜生长的影响
Figure RE-GDA0002438339030000051
注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05).
由表1可知，单独接种AMF菌或DSE菌都能促进生姜的生长，在不同的组合菌剂处理中，只有Po+Tv和Ce+Tv的各指标显著高于单接种处理，其中，Ce+Tv组合处理的生姜株高和叶片数显著高于其它处理组，说明Ce和Tv之间存在相互作用，产生1+1>2的效果，从而显著促进了生姜的生长。
2)不同处理对生姜产量的影响
在生姜种植90d后，对其地上部分鲜重及干重、地下部分茎块重进行处理和统计(处理方法为现有技术的常规技术手段)后，其结果如表2所示：
表2不同处理对生姜产量的影响
Figure RE-GDA0002438339030000061
注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05).
由表2可知，单独接种AMF菌或DSE菌都能有效增加生姜的地上部分鲜重、地上部分干重和茎块重，在不同的组合菌剂处理中，只有Gm+Tv和Ce+Tv的各指标显著高于单接种处理，其中，Ce+Tv组合处理的地上部分鲜重、地上部分干重和茎块重显著高于其它处理组，说明 Ce和Tv之间存在相互作用，产生1+1>2的效果，从而显著提高了生姜的产量。
3)不同处理对生姜青枯病的影响
生姜青枯病的发病程度分级：0级，无症状；1级，1/4叶片萎焉枯死；2级，1/4～1/2叶片萎焉枯死；3级，1/2～3/4叶片萎焉枯死；4级，整片叶片萎焉枯死，其中：
病情指数＝(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)×100；
防治效果＝(对照区病情指数×处理区病情指数)/对照区病情指数×100；
结果如表3所示：
表3不同处理对生姜青枯病的影响
Figure RE-GDA0002438339030000071
由表3可知，接种Ce+Tv组合处理的生姜青枯病病情指数最低、仅为21.5，同时防效高达77.5％，与对照或其他处理组差异显著，表明Ce+Tv组合处理相比较其他AMF、DSE或AMF+DSE 组合在一定程度上可更显著减轻青枯病菌对生姜造成的危害。
4)部分处理的生姜根系侵染情况
于生姜发根期，采集Ce、Tv、Ce+Tv以及CK处理的生姜根系进行侵染检测，具体的浸染检测方法见汪茜等(汪茜,包涵,张金莲,宋娟,刘增亮,黄京华,陈廷速.不同丛枝菌根真菌种类对生姜生长的影响[J].热带作物学报,2019,40(7):1272-1277.)中记载的方法，在此为节约篇幅就不详述了，染色图像见图1-4。
侵染结果表明，Ce菌剂处理的根系中有大量Ce菌丝、泡囊以及孢子结构，侵染率最高可达到55％(图2)；Tv菌剂处理的根系也发现有隔菌丝及微菌核结构，侵染率为42％(图3)； Ce+Tv混合菌剂的处理中有Ce和Ce+Tv共同侵染的结构，侵染率高达63％(图4)；而对照组 CK均未观察到根外菌丝、根内菌丝和泡囊结构(图1)。由此可说明，本发明中的Ce+Tv组合菌剂与生姜具有高亲和性，可在土壤中形成大量菌丝网，从而提高生姜的抗病能力，降低青枯病的发病率。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (6)

1.一种AMF+DSE组合菌剂，包括AMF菌剂和DSE菌剂，其特征在于，所述AMF菌剂为幼套近明球囊霉菌株制成的菌剂，所述DSE菌剂为绿色木霉菌株制成的菌剂；
其中，幼套近明球囊霉Claroideoglomus etunicatum，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年6月6日，保藏编号为：CGMCC No.17987；绿色木霉Trichoderma viride，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年3月21日，保藏编号为：CGMCC No.17196。
2.根据权利要求1所述一种AMF+DSE组合菌剂，其特征在于，所述AMF菌剂的孢子数为20-25个/g，所述DSE菌剂中的菌落总数为5×105cfu/mL。
3.如权利要求1所述一种AMF+DSE组合菌剂在促进生姜生长中的应用。
4.根据权利要求1所述一种AMF+DSE组合菌剂在促进生姜生长中的应用，其特征在于，所述组合菌剂的施用方法为：每两株生姜苗接种25g所述AMF菌剂；每两株生姜苗灌根50mL所述DSE菌剂，且每隔15d灌1次，共灌3次。
5.根据权利要求4中所述一种AMF+DSE组合菌剂在促进生姜生长中的应用，其特征在于：所述组合菌剂能提高生姜的株高、叶片数、地上部分鲜重和干重以及地下部分茎块重。
6.如权利要求1所述一种AMF+DSE组合菌剂在抗生姜青枯病中的应用。
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