CN104560730B - 一株高效降解阿特拉津、促进植物生长的丛枝菌根真菌及其应用 - Google Patents

一株高效降解阿特拉津、促进植物生长的丛枝菌根真菌及其应用 Download PDF

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Abstract

一株高效降解阿特拉津、促进植物生长的丛枝菌根真菌及其应用，它涉及一种真菌及其应用，尤其涉及一种无梗囊霉属丛枝菌根真菌及其应用。解决了现有修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌对植物生物量的积累作用有限的问题。本发明一株高效降解阿特拉津、促进植物生长的丛枝菌根真菌为浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9907。本发明浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4用于修复被阿特拉津污染的土壤，经试验证明其效果良好，并且能够有效的提高被阿特拉津污染的土壤中植物的生长量。

Description

一株高效降解阿特拉津、促进植物生长的丛枝菌根真菌及其 应用
技术领域
本发明涉及一种真菌及其应用，尤其涉及一种无梗囊霉属丛枝菌根真菌及其应用。
背景技术
阿特拉津，又名莠去津，是选择性内吸传导型苗前、苗后除草剂，适用于玉米、高梁、果园、林地等，可防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草，对某些多年生杂草也有一定的抑制作用。由于阿特拉津成本低且除草效果好，被广泛使用于农业种植中。而长期的使用导致其在土壤中大量残留，使农作物大幅减产。阿特拉津污染土壤的修复可采用物理、化学和生物方法，由于物理处理方法只是将污染物转移，不能彻底消除阿特拉津，且成本昂贵；而化学处理方法则易造成其它环境介质的次生污染；所以目前主要采用生物方法处理阿特拉津。
生物修复阿特拉津污染土壤分为两类：第一类方法是选用具有阿特拉津降解能力的微生物修复阿特拉津污染土壤，微生物通过酶促反应，将阿特拉津氧化、还原、水解、脱卤、缩合、脱羧、异构化，但是由于目前微生物修复菌株在土壤中竞争不过土著微生物种群，所以易导致其代谢活性丧失，而且当土壤中的阿特拉津浓度过低无法满足微生物对降解底物需求时，就无法正常发挥其降解功能。第二类方法是选用植物修复阿特拉津污染土壤，植物可以通过根收获、叶表挥发和植物降解的方法消除有机污染物，但存在可忍耐和超量积累阿特拉津的植物种类少，且植物的生物量小、生长缓慢、生长周期长的问题。因此，目前采用生物修复阿特拉津污染土壤的效果并不理想。
研究发现有些球囊霉具有降解阿特拉津的作用，例如幼套球囊霉Glomusetunicatum和根内球囊霉Glomus intraradices，其降解阿特拉津的能力差强人意。有些球囊霉对阿特拉津具有较好的降解能力，如专利号为200910072348.0的一株修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌，其为摩西球囊霉，施加于土壤中能够与植物共生，有效的降低阿特拉津含量，但对植物生物量的积累作用有限。
发明内容
本发明要解决现有修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌对植物生物量的积累作用有限的问题，而提供的一株可以高效降解阿特拉津、有效促进植物生长的丛枝菌根真菌及其应用。
本发明一株高效降解阿特拉津、促进植物生长的丛枝菌根真菌为浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9907。
本发明上述的丛枝菌根真菌——浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4用于修复被阿特拉津污染的土壤、促进污染土壤中的植物生长。
直接将含有浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4孢子的土或培养基播撒到需要修复的土壤中即可。
本发明一株高效降解阿特拉津、促进植物生长的丛枝菌根真菌，浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的孢子为圆形或近圆形，孢子土中单生，侧生在连孢菌丝上，橙棕色至暗褐色，直径80～130μm。孢壁2层，W1为无色、厚0.5μm，W2为橙棕色至暗褐色、层状壁，内外表面布满规则或不规则锥形、碟形凹坑。芽壁2层，第一层为无色膜状、厚0.5μm，第二层无色膜状、表面有珠状纹饰、厚0.5～1μm。浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的孢子与Melzer’s试剂反应呈深紫红色；在乳酸浮载剂中加入Melzer’s试剂变浅紫红色。浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的孢子壁中W1为易逝壁，孢子成熟时脱落，与Melzer’s试剂无反应；W2壁厚2μm，表面分布不均匀凹陷，凹陷直径为(0.2～3)μm×(0.2～6)μm、深0.2～2μm，与Melzer’s试剂无反应。浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的芽壁中第一层与Melzer’s试剂无反应，第二层表面有珠状纹饰，与Melzer’s试剂反应呈深紫红色；所述的第二层在乳酸浮载剂中，加Melzer’s试剂变浅紫红色。浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的孢子囊多为球形，孢子成熟时，从孢子囊上脱落，留下一脱落痕，圆形至卵圆形，直径5～9μm，孢子囊空瘪。
本发明浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4具有如下有益效果：
1、本发明浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4，不受被修复土壤中土著微生物种群的影响，抗干扰性强。
2、本发明浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4在土壤中阿特拉津浓度较低的情况下，能够高效的降解土壤中的阿特拉津，在土壤中阿特拉津浓度较高的情况下，仍保持生物活性，并具有良好的生物降解能力。
3、本发明浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4能够在较高浓度阿特拉津浓度下，帮助植物降低阿特拉津毒害，使植物的生物量、脉酶活性、过氧化氢酶活性均明显提高，同时能够提高根系土壤中细菌、放线菌和真菌的量。
4、本发明浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4用于修复被阿特拉津污染的土壤，经试验证明其效果良好，并且能够有效的提高被阿特拉津污染的土壤中植物的生长量。
高效降解阿特拉津、促进植物生长的丛枝菌根为真菌浅窝无梗囊霉(Acaulosporalacunosa)HDSF4，属于无梗囊霉属(Acaulospora)；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2014年10月30日，保藏号为CGMCC No.9907。
附图说明
图1为浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的成熟孢子在400倍显微镜下的镜检图；
图2为浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的孢子壁及芽壁在400倍显微镜下的镜检图；
图3为浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4表面纹饰400倍显微镜下的镜检图。
具体实施方式
实施例1
如图1-3所示，本实施例的一株高效降解阿特拉津、促进植物生产的丛枝菌根真菌为浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的孢子为圆形或近圆形，孢子土中单生，侧生在连孢菌丝上，橙棕色至暗褐色，直径80～130μm；孢壁2层，W1为无色、厚0.5μm，W2为橙棕色至暗褐色、层状壁，内外表面布满规则或不规则锥形、碟形凹坑；芽壁2层，第一层为无色膜状、厚0.5μm，第二层无色膜状、表面有珠状纹饰、厚0.5～1μm。
本实施例中浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的孢子壁中W1为易逝壁，孢子成熟时脱落，与Melzer’s试剂无反应；W2壁厚2μm，表面分布不均匀凹陷，凹陷直径为(0.2～3)μm×(0.2～6)μm、深0.2～2μm，与Melzer’s试剂无反应。
本实施例中浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的芽壁中第一层与Melzer’s试剂无反应，第二层表面有珠状纹饰，与Melzer’s试剂反应呈深紫红色；所述的第二层在乳酸浮载剂中，加Melzer’s试剂变浅紫红色。
本实施例中浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的的孢子囊多为球形，孢子成熟时，从孢子囊上脱落，留下一脱落痕，圆形至卵圆形，直径5～9μm，孢子囊空瘪。
实施例2
浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4筛选于齐齐哈尔受阿特拉津残留污染的农田土壤。
本实施中浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的收集、筛选、纯化按以下步骤进行：
一、取2～20cm土层中植物根围受农药阿特拉津残留污染的土壤，采用湿筛倾析–蔗糖离心法从土壤中分离出不同丛枝菌根真菌孢子，将不同丛枝菌根真菌孢子进行分类，并筛选出其中的优势丛枝菌根真菌孢子；其中，将AM真菌优势度按重要值(I)划分为4个等级，I>50％为优势属(种)，30％<I≤50％为亚优势属(种)，10％<I≤30％为伴生属(种)，I≤10％为罕见属(种)；
二、将步骤一中筛选出的优势丛枝菌根真菌饱子浸泡在2％的氯胺T和200mg/L链霉素溶液中15min，然后用无菌水冲洗数次；
三、采用单孢子分离培养法获得纯系，并观察菌体形态特征鉴定为浅窝无梗囊霉，进行扩培，即得到浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4纯菌种。
实施例3
本实施例浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的扩培方法，包括以下步骤：
一、培养基质的制备：将草炭土、蛙石和沙子按体积比为2:3:5称重、混合均匀，121℃高温蒸汽灭菌1.5h；
二、菌种的扩培：将高粱种子催芽，播种在步骤一中制备的培养基质上，同时接种浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4菌种，覆土0.8-1.2cm，浇水，光照培养4个月，即得到含有浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的孢子、菌丝片段及受真菌侵染的宿主根系，作为繁殖用的菌种。
本实施例的扩繁方法得到的基质中浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的孢子密度为20个/g土。
验证试验
进行植株盆栽试验：实验土壤均取自呼兰试验田，并测定其阿特拉津残留量为0mg/kg。将以上阿特拉津残留量为0mg/kg的土壤分成六组进行盆栽进行试验，然后分别加入阿特拉津。第一组盆栽土壤中阿特拉津中浓度为50mg/kg，不加浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4；第二组盆栽土壤中阿特拉津中浓度为10mg/kg，加实施例3扩培的含浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4土60g；第三组盆栽土壤中阿特拉津中浓度为20mg/kg，加实施例3扩培的含浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4土60g；第四组盆栽土壤中阿特拉津中浓度为50mg/kg，加实施例3扩培的含浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4土60g；第五组盆栽土壤中阿特拉津中浓度为100mg/kg，加实施例3扩培的含浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4土60g；第六组盆栽土壤中阿特拉津中浓度为100mg/kg，加含摩西球囊霉HDSF1(专利“一株修复阿特拉津污染土壤的丛枝菌根真菌”，专利号为200910072348.0中摩西球囊霉，保藏号为CGMCC No.3012)的土60g，土中摩西球囊霉HDSF1的孢子密度为20个/g。每个浓度做3个平行组。试验模拟自然条件，在0～25℃环境中进行。
在接种后在第30天、45天、60天和75天分别取样检测植株生物量、菌根真菌对宿主植物的侵染率、土壤中阿特拉津的残留量、土壤中各类酶活性变化情况和土壤根际微生物总体活性变化情况。
实验结果如表1所示，第4组各项测定指标的实验数据均优于第1组，说明本发明浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4能够在较高浓度阿特拉津浓度下帮助高粱降低阿特拉津毒害，使高粱的生物量、阿特拉津降解、脉酶活性、过氧化氢酶活性、根系土壤细菌、放线菌和真菌等指标均高于不接种浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的处理。第2～3组数据说明浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4在土壤中阿特拉津浓度较低的情况下，高效的降解土壤中的阿特拉津。第5组数据说明浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4可以在土壤中阿特拉津浓度较高的情况下，保持良好的生物降解性，保持生物活性。第6组接种摩西球囊霉HDSF1，第5组浅窝无梗囊霉(Acaulosporalacunosa)HDSF4与之相比具有和摩西球囊霉HDSF1相近的阿特拉津降解效果，但浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4对植物生物量的促进效果明显强于摩西球囊霉HDSF1。浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4能于细菌与真菌的大量存在的生境下高效的降解阿特拉津并能促进植物的生长和发育，证明浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4可以很好的与土壤中的土著微生物种群相适应。三次重复实验数据也说明浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4不受被修复土壤中土著微生物种群的影响，抗干扰性强；在土壤中阿特拉津浓度较高的情况下具有较高活性，并且与不加入浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的对照组对比鲜明的促进了植物的生长，植物的株高有了较为明显的增加，与此同时植物的鲜重得到了有效的积累。
表1
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式作出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一株高效降解阿特拉津、促进植物生长的丛枝菌根真菌，其为浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9907。
2.根据权利要求1所述的一株高效降解阿特拉津、促进植物生长的丛枝菌根真菌，其特征在于：浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的孢子为圆形或近圆形，孢子土中单生，侧生在连孢菌丝上，橙棕色至暗褐色，直径80～130μm；孢壁2层，W1为无色、厚0.5μm，W2为橙棕色至暗褐色、层状壁，内外表面布满规则或不规则锥形、碟形凹陷；芽壁2层，第一层为无色膜状、厚0.5μm，第二层无色膜状、表面有珠状纹饰、厚0.5～1μm。
3.根据权利要求1或2所述的一株高效降解阿特拉津、促进植物生长的丛枝菌根真菌，其特征在于：浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的孢子与Melzer’s试剂反应呈深紫红色；在乳酸浮载剂中加入Melzer’s试剂变浅紫红色。
4.根据权利要求2所述的一株高效降解阿特拉津、促进植物生长的丛枝菌根真菌，其特征在于：浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的孢子壁中W1为易逝壁，孢子成熟时脱落，与Melzer’s试剂无反应；W2壁厚2μm，表面分布不均匀凹陷，凹陷直径为(0.2～3)μm×(0.2～6)μm、深0.2～2μm，与Melzer’s试剂无反应。
5.根据权利要求2所述的一株高效降解阿特拉津、促进植物生长的丛枝菌根真菌，其特征在于：浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的芽壁中第一层与Melzer’s试剂无反应，第二层表面有珠状纹饰，与Melzer’s试剂反应呈深紫红色；所述的第二层在乳酸浮载剂中，加Melzer’s试剂变浅紫红色。
6.根据权利要求1所述的一株高效降解阿特拉津、促进植物生长的丛枝菌根真菌，其特征在于：浅窝无梗囊霉(Acaulospora lacunosa)HDSF4的孢子囊多为球形，孢子成熟时，从孢子囊上脱落，留下一脱落痕，圆形至卵圆形，直径5～9μm，孢子囊空瘪。
7.一种权利要求1所述的丛枝菌根真菌的应用，其特征在于用于修复被阿特拉津污染的土壤、促进污染土壤中的植物生长。
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