CN109706084B

CN109706084B - 一种丹参内生真菌及其在促进丹参生长/或有效成分合成中的应用

Info

Publication number: CN109706084B
Application number: CN201811526820.9A
Authority: CN
Inventors: 陈海敏; 梁宗锁; 吴红霞; 严彬; 余鸿宇; 张海花; 胡秀芳; 杨东风
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2018-12-13
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2038-12-13
Also published as: CN109706084A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种丹参内生真菌及其在促进丹参生长和/或有效成分合成中的应用。本发明提供一种丹参内生真菌，保藏名称为草茎点霉(Phomaherbarum)D603，保藏编号为CGMCC No.16884，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。本发明同时公开了该丹参内生真菌的用途，不仅能有效地促进丹参生长，使得丹参主根增粗和侧根发育，根部表面颜色变红；还能有效促进丹参根中丹参酮I，隐丹参酮，二氢丹参酮I，丹参酮IIA，丹参素，迷迭香酸，丹酚酸B的合成。

Description

一种丹参内生真菌及其在促进丹参生长/或有效成分合成中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种丹参内生真菌及其在促进丹参生长和/ 或有效成分合成与积累中的应用。

背景技术

草茎点霉(Phomaherbarum)不仅是某些动植物的病原菌，也是一种可用于杂草防治的生防菌。据报道，吴庆禹等发现草茎点霉是某些动植物的病原菌，如由草茎点霉引起的动植物病害有植物黑胫病和鲑鳟鱼类的鳔真菌病(吴庆禹等，东北林业大学学报，2005，33(2)：43-45；Mohamed Faisal et al，2007，Mycopathologia(2007)163：41-48)，还会导致荞麦轮纹病、睡莲黑斑病等；而谷祖敏等发现草茎点霉也是一种可用于杂草防治的生防菌，如草茎点霉对鸭跖草和藜有很好的抑制作用(谷祖敏，草茎点霉粗毒素的除草活性和杀草谱研究，沈阳农业大学学报，2009,4:431-434)，且RC Orlandelli的研究突出了草茎点霉具有的蛋白水解活性，其分泌的酶可以促进它们对植物组织的定殖以及对病原微生物的直接作用(RC Orlandellietal，Antifungal and proteolytic activities ofendophytic fungi isolated from Piperhispidum，Brazilian Journal ofMicrobiology,2015,46 (2):359-366)。此外有报道，从黄海海域内海底50m深处的淤泥分离出了草茎点霉，其能产生抗肿瘤多糖(陈菁蓉，1株能产生抗肿瘤多糖的海洋真菌YS4108的鉴定，中国生化药物杂志，2007,1:8-10)。Sanae等从纤维素材料中分离得到一株产生洋红色素的草茎点霉，可以用于对织物进行染色(SanaeChibaetal，Magenta pigmentproduced by fungus， Journal of General&Applied Microbiology，2006,52(4):201-207)。截至目前，尚未见草茎点霉促进植物生长和有效成分合成的相关报道。

中药丹参(学名：Salvia miltiorrhizaBge.)为唇形科植物丹参的根。具有活血化瘀，凉血消痈、止痛、清心除烦等多种功效。根据其传统功效，丹参在现代广泛用于心脑血管疾病的治疗，并取得显著疗效。丹参的药用成分包括水溶性的丹酚酸类和脂溶性的丹参酮类成分。水溶性的酚酸类化合物，主要有丹酚酸A、B、C、咖啡酸、丹参素等，具有抗血栓形成、抗氧化、保护细胞、抗凝血及调节血脂等作用。丹参酮类成分主要包括丹参酮I、二氢丹参酮I、丹参酮II A、丹参酮II B、隐丹参酮、羟基丹参酮等，具有抗炎、抗菌及改善血液循环等功效。

由于丹参的市场需求大，而野生资源日益减少，栽培品种退化严重。人工引种栽培存在引种困难和环境制约等因素的影响，植物中次生代谢产物的含量不稳定，药材的质量得不到保证。因此，如何利用新的技术和手段大幅提高活性产物含量，更有效、可持续和低成本的获得丹参中有效化学成分，已成为丹参资源及活性产物研究的重要内容和发展方向。近年来国内外开展了对丹参组织与细胞培养的研究，表明通过丹参的细胞或组织培养可以直接获得丹参的主要生物活性成分。其中，由发根农杆菌感染植物形成的丹参毛状根系统，其生长速度较快，遗传性稳定，成为了生产丹参活性物质的良好培养系统。但是毛状根活性成分产量低，影响着毛状根的扩大培养乃至工业化生产。为解决这一矛盾，近年来许多研究者利用诱导系统刺激毛状根，通过诱导相关代谢通路酶系统的表达，促进有效次级代谢的积累从而提高产量。能够诱导植物产生次生代谢物的物质叫做诱导子(Elicitor)，分为非生物诱导子和生物诱导子。非生物诱导子包括Ag+等金属离子，而生物诱导子包括酵母提取物及某些真菌发酵液等。如CN104830717A公开了具有诱导丹酚酸B积累作用的丹参内生细菌，为耐冷假单胞菌Pseudomonas psychrotoleransLG4，其保藏号为：CCTCC NO:M2015085，可促进丹参毛状根中酚酸类物质(丹酚酸B)含量的积累。CN102676392A公开了一种丹参内生真菌及其应用，是从丹参植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为木霉 Trichoderma atroviride，保藏号为CGMCC No.4712，通过其液体发酵，产生了丹参酮化合物丹参酮I和丹参酮II A。CN103992961A公开了一株提高丹参产量及酚酸类成分含量的真菌，它是保藏编号为CGMCCNo.6627的拟青霉(Paecilomycessp.)，栽培丹参时在每株丹参幼苗根部分别施予固体培养的菌材0.5-1.5g，经与丹参幼苗共生栽培4-6月，能提高收获期时丹参的产量和丹参总酚酸及丹酚酸B的含量。CN 106801014A公开了能提高丹参产量及其有效成分含量的内生真菌，分类命名为球毛壳菌D68 (Chaetomiumglobosum)，保藏号为CGMCC No.12622，通过和丹参植株共培养能够有效地提高丹参根生物量，且对植株的冠幅、株高以及单个叶面积均有显著提高，还可有效促进丹参中丹参酮类和酚酸类有效成分的生物合成，具有较大的应用价值。

目前尚未见文献报道从丹参中分离能促进丹参生长，同时促进丹参有效成分如隐丹参酮、丹参酮IIA和丹酚酸B合成的草茎点霉。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，一方面提供一种丹参内生真菌，另一方面提供所述丹参内生真菌在促进丹参生长和/或有效成分合成中的应用。

一种丹参内生真菌，保藏名称为草茎点霉(P.herbarum)D603，是从唇形科鼠尾草属植物丹参种子中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的。该菌株已保藏，保藏日期为2018年11月26日，保藏编号为CGMCC No.16884，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

本发明所述的丹参内生真菌平板及显微特征为：菌落直径34mm，质地絮状，白色，铺展，后期会分泌液珠；菌落背面呈红色，产生色素；具有大量菌丝，宽约6.8μm，菌丝具有横膈膜；未见有孢子形成。

本发明所述的丹参内生真菌的ITS碱基序列如SEQ ID No.1所示。将测序结果于NCBI网站进行序列比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，同草茎点霉(P.herbarum)的相似性为98％。

一种上述所述的丹参内生真菌在促进丹参生长和/或有效成分合成中的应用。

作为优选的，所述有效成分包括：丹参酮I，隐丹参酮，二氢丹参酮I，丹参酮IIA，丹参素，迷迭香酸，丹酚酸B，。

作为优选的，所述应用方式：将所述丹参内生真菌与无菌组培苗进行二元共培养。

更为优选的，所述二元共培养为：将丹参无菌组培苗种于培养基质内，在培养基质内接种所述丹参内生真菌的菌悬液，于24-26℃温室环境下培养58-62d。

更为优选的，所述丹参内生真菌的菌悬液的浓度为10⁶-10⁷CFU/ml，接种量为1-3mL。

所述的二元共培养具体包括以下步骤：

(A)取本发明的丹参内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的马铃薯葡萄糖液体培养基中，于28℃活化培养5-6天，形成菌悬液，使得丹参内生真菌的浓度为10⁶-10⁷CFU/ml；其中马铃薯葡萄糖液体培养基的组成为：马铃薯 200g，葡萄糖20g，去离子水1000mL；

(B)将丹参无菌组培苗种于培养基质内，在根部的培养基质内接种所述丹参内生真菌的菌悬液，然后在24-26℃温室环境下培养58-62d，栽培器具为组培玻璃瓶。

作为优选的，所述培养基质为腐殖土、珍珠岩和蛭石的混合物。

更为优选的，所述培养基质为腐殖土、珍珠岩和蛭石之间质量比为(1～3)：(1～2)： (1～3)的混合物，使用之前，混合基质121℃，灭菌30min。

更为优选的，所述腐殖土、珍珠岩和蛭石的质量比为3：1：1。

本发明的有益效果是：

1.本发明所述的丹参内生真菌，通过和无菌组培苗共培养能够有效地促进有效地促进丹参主根增粗和侧根发育，根部表面颜色变红，进而促进丹参整株的生长发育；

2.本发明所述的丹参内生真菌，还可有效促进丹参根系中丹参酮I，隐丹参酮，二氢丹参酮I，丹参酮IIA，丹参素，迷迭香酸，丹酚酸B的合成。

附图说明

图1为本发明所述丹参内生真菌在PDA平板培养基上的形态图，其中A为正面图， B为背面图；

图2为本发明所述丹参内生真菌在光学显微镜10×100倍下的形态图；

图3为本发明所述丹参内生真菌与丹参植株共培养60天后的根系照片；

图4为本发明所述丹参内生真菌与丹参植株共培养60天后的根系生物量测定图；

图5为本发明所述丹参内生真菌与丹参植株共培养60天后的丹参酮类和酚酸类含量图，其中CT为隐丹参酮；DTⅠ为二氢丹参酮Ⅰ；TⅠ为丹参酮Ⅰ；TⅡA为丹参酮 ⅡA；DSS为丹参素，RA为迷迭香酸，SAB为丹酚酸B；

图中CK为对照，D603为本发明丹参内生真菌处理组。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：丹参内生真菌的分离培养

本发明的丹参内生真菌按以下步骤分离获得：

1)75％乙醇浸没丹参种子1min，5％NaClO处理1min，使用无菌水洗涤3次，每次1min，2.5％PBS-Tween20溶液灭菌后，加泡种子过夜；

2)在无菌环境中，继续将步骤1所得供试材料用无菌水冲洗3次，取100μl最后1 次冲洗的无菌水冲洗液涂布接种于PDA平板上，30℃培养24h后，进行无菌验证；

3)如无菌落产生，则继续后续的步骤4；如有菌落产生，则返回步骤1继续表面消毒处理；

4)在超净台将之前表面灭菌处理过的种子置于无菌研钵中，加入经过灭菌处理的石英砂，研磨成粉末，并加入5mL无菌水混匀，静置15min，取100μl上清稀释涂布于改良马丁氏培养基中，置于28-32℃培养1-3天；

5)挑取步骤4中的单菌种于改良马丁氏培养基进行划线纯化分离，置于28-32℃培养1-3天，最终得到本发明的丹参内生真菌菌株，进行ITS测序并经序列比对，其分类命名为草茎点霉(P.herbarum)D603，保藏编号为CGMCC No.16884。本发明所述的丹参内生真菌菌株的形态特征见图1和图2，菌落直径34mm，质地絮状，白色，铺展，后期会分泌液珠；菌落背面呈红色，产生色素；具有大量菌丝，宽约6.8μm，菌丝具有横膈膜；未见有孢子形成。

实施例2：丹参无菌组培苗的获得

1)选取丹参生长饱满的种子，经流水冲洗、75％酒精处理、无菌水漂洗、5％NaClO溶液处理、无菌水漂洗后，用无菌滤纸吸去多余水分，播种于空白MS培养基中，获得丹参无菌苗；

2)无菌苗长出芽后，剪取1.5～2.0cm的带叶片茎段置入MS培养基中培植，扩繁得到丹参的无菌组培苗。

实施例3：丹参内生真菌与无菌组培苗二元共培养

1)取本发明的丹参内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的马铃薯葡萄糖液体发酵瓶中，于28℃活化培养6天，形成菌悬液，使得丹参内生真菌的浓度为10⁷CFU/ml；其中马铃薯葡萄糖液体培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，去离子水1000mL；

2)将丹参无菌组培苗种于培养基质内，在根部的培养基质内接种所述丹参内生真菌的菌悬液1ml，对照组接种无菌马铃薯葡萄糖液体培养基1ml；用灭菌的基质将丹参无菌组培苗根部埋好，用无菌水将植株浇透；移入温室，60天后观察植株生长情况；所述丹参内生真菌与丹参无菌组培苗共培养的培养基质为腐殖土：珍珠岩：蛭石＝3：1： 1的混合物。栽培器具：组培玻璃瓶；温室培养温度：25℃。

实施例4：丹参株高和根长的测定

将所述丹参内生真菌与丹参无菌组培苗在无菌共培养60天后的丹参植株收获，测量株高和根长。从图3和4中数据可以看出，本发明所述的丹参内生真菌能够有效地促进丹参主根增粗和侧根发育，根部表面颜色变红，表明该菌株能在一定程度上促进根系发育。

实施例5：丹参根中有效成分含量的测定

将实施例3中共培养后的丹参根干燥至恒重并研磨成粉，用甲醇提取(20mg丹参根粉末溶于2ml 70％甲醇(V/V))，在超声下处理60分钟，用高效液相色谱(HPLC) 对隐丹参酮，二氢丹参酮Ⅰ，丹参酮I，丹参酮IIA，丹参素，迷迭香酸，丹酚酸B等有效成分含量进行分析，具体结果见图5。

从图5中的数据可以看出，本发明所述的丹参内生真菌对丹参植株中有效成分的含量影响更为显著，隐丹参酮，二氢丹参酮Ⅰ，丹参酮I，丹参酮IIA，丹参素，迷迭香酸，丹酚酸B分别为对照组的3.10倍，1.89倍，2.07倍，6.45倍，4.85倍，1.53倍和 3.02倍，说明本发明所述的丹参内生真菌可有效促进丹参根中有效成分的合成。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江理工大学

<120> 一种丹参内生真菌及其在促进丹参生长/或有效成分合成中的应用

<130> 2018.12.13

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 510

<212> DNA

<213> 草茎点霉(PhomaherbarumD603)

<400> 1

ttttcgccta gagtgtaggc tttgcctgct atctcttacc catgtctttt gagtacctta 60

cgtttcctcg gtgggttcgc ccaccgattg gacaaattta aaccctttgc agttgaaatc 120

agcgtctgaa aaaacttaat agttacaact ttcaacaacg gatctcttgg ttctggcatc 180

gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta gtgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg 240

aatctttgaa cgcacattgc gccccttggt attccatggg gcatgcctgt tcgagcgtca 300

tttgtacctt caagctctgc ttggtgttgg gtgtttgtct cctgtagact cgccttaaaa 360

caattggcag ccggcgtatt gatttcggag cgcagtacat ctcgcgcttt gcactcataa 420

cgacgacatc caaaagtaca tttttacact cttgacctcg gatcaggtag ggatacccgc 480

tgaacttaag catatcaata agccggagga 510

Claims

1.一种丹参内生真菌，其特征在于，所述丹参内生真菌的保藏名称为草茎点霉(Phomaherbarum)D603，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年11月26日，保藏编号为CGMCC No. 16884。

2.根据权利要求1所述的丹参内生真菌，其特征在于，所述草茎点霉(P.herbarum)D603的ITS碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种权利要求1或2所述的丹参内生真菌在促进丹参生长和/或有效成分合成中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述有效成分包括：丹参酮I，隐丹参酮，二氢丹参酮I，丹参酮IIA，丹参素，迷迭香酸和丹酚酸B。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用方式为：将所述丹参内生真菌与丹参无菌组培苗进行二元共培养。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述二元共培养为：将丹参无菌组培苗种于培养基质内，在培养基质内接种所述丹参内生真菌的菌悬液，于24-26℃温室环境下培养58-62d。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述丹参内生真菌的菌悬液的浓度为10⁶-10⁷CFU/ml，接种量为1-3mL。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述培养基质为腐殖土、珍珠岩和蛭石的混合物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述腐殖土、珍珠岩和蛭石的质量比为(1～3)：(1～2)：(1～3)。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述腐殖土、珍珠岩和蛭石的质量比为3：1：1。