CN103146638B - 一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，它包括获得珊瑚菜无菌苗；培养供感染用的发根农杆菌；转化外植体进行共培养；诱导毛状根发生和毛状根的培养增殖。本发明利用发根农杆菌感染诱导珊瑚菜毛状根的形成，建立离体毛状根培养系统，并分析测定了其药用成分香豆素的含量，与不定根和人工栽培的珊瑚菜根中香豆素的含量进行了对比，以毛状根中香豆素的含量最高，本发明中珊瑚菜毛状根具有生长迅速，周期短，次级代谢产物相对产量高等优点，可用于工业化生产珊瑚菜香豆素；为将来利用毛状根工业化生产珊瑚菜次级代谢产物提供了新的途径，从另一方面保护该濒危植物，有利于维护生态平衡。

Description

一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，尤其涉及一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法。

背景技术

植物组织培养包括器官培养、愈伤组织培养、茎尖组织培养、细胞培养、原生质体培养等。其中愈伤组织培养最常见，因为除茎尖分生组织培养和少数器官培养外，其它类型都要经历愈伤组织阶段才能产生再生植株，其原理是利用植物细胞的全能性，愈伤组织的形成在组织培养技术中有着至关重要的地位，许多药用植物中的活性成分可直接通过愈伤组织进行合成。

珊瑚菜是生长在北太平洋沿海地区沙滩地的一种伞形科多年生草药。在我国分布于辽宁、山东、江苏等地，生长于海边沙滩或人工栽培，原为海滩沙生植物群落的建群种之一，对海岸固沙和盐碱土改良具重要作用，但随着海滩的滥用开发和对该植物的过度采挖，使其数量日趋减少，已经处于濒临灭绝的境地，被列为中国珍稀濒危保护植物。而人工栽培技术要求高，种子萌发率低，生长周期长，掠夺式的采集野生资源又会危及生态平衡。珊瑚菜具有较高的药用价值，其根状茎和根可作生药，被收入日本和中国药典。珊瑚菜根（北沙参）中含有多种香豆素和香豆素苷，主要有欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、佛手素、花椒毒酚、花椒毒素、补骨脂素、东莨菪素、紫花前胡苷元等。其中补骨脂素、欧前胡素和异欧前胡素三种香豆素的含量可作为评价北沙参不同部位质量及产地加工方法的标准。研究表明，北沙参在体内具有抗癌作用的主要活性成分为呋喃香豆素，其中浓度为50μg/mL的欧前胡素和异欧前胡素抑制活性最强。

大多数药用植物的根不仅可提供生物药学成分，而且也是农药、风味调料、染料和香料的重要来源，而根中的有效成分是植物的次级代谢产物，具有较高的应用价值，因此利用根的体外培养生产次级代谢产物越来越受到学者们的关注。毛状根培养技术是20世纪80年代后期，在植物细胞培养技术领域中发展起来的一项新技术，目前美国、英国、加拿大、日本、中国及韩国都在对药用植物毛状根的诱导培养进行着大量的基础研究，研究表明，毛状根具有细胞培养和一般器官培养所不能兼备的特点，几乎所有双子叶植物中由根部合成的次级代谢物质都可以通过毛状根来生产，这一生物技术为植物有用成分的大量生产提供了新的途径，日益引起人们的关注。

利用发根农杆菌感染诱导药用植物形成毛状根，并对毛状根进行离体培养增殖，是对药用资源植物可持续利用的有效途径之一。毛状根具有生长速度快、培养增殖不需要加入激素、分化程度高、产生次生代谢产物的能力强、可以通过基因工程的手段来增加次生代谢产物的含量、并能够合成某些悬浮细胞培养所不能合成的次生代谢产物等优点，越来越受诸多专家研究者的重视。但是目前对于珊瑚菜活性物质的诱导及生产还处于利用常规组织培养及细胞培养手段的水平，关于珊瑚菜毛状根的诱导尚未有人研究。

发明内容

本发明提供了一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，利用本发明所述方法诱导的珊瑚菜毛状根具有生长迅速，周期短，次级代谢产物相对产量高等特点，可用于工业化生产珊瑚菜香豆素。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，它包括以下步骤：

（1）获得珊瑚菜无菌苗；

（2）培养供感染用的发根农杆菌；

（3）转化外植体进行共培养：取长势较好的珊瑚菜无菌苗，切取根、叶柄或叶片作为外植体，在其表面划出伤口用于感染，放入发根农杆菌菌液中浸泡，然后放入MS固体培养基中共培养，直至外植体周边出现菌斑；

（4）诱导毛状根发生：将出现菌斑的外植体清洗后，放入含有头孢噻肟钠的1/2MS培养基中培养，定期更换1/2MS培养基，在更换的培养基中逐步降低头孢噻肟钠的浓度，直到在完全除掉头孢噻肟钠的1/2MS培养基中继续培养，获得除菌的毛根系；

（5）毛状根的培养增殖：将除菌完全、生长快速的毛状根接种在1/2MS液体培养基中，振荡培养增殖，获得大量毛状根。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（1）中选择饱满的珊瑚菜种子，灭菌，后接种于MS固体培养基中培养获得无菌苗。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（2）中所用菌种为发根农杆菌1.2556。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（2）中发根农杆菌的感染菌液最佳浓度为OD₆₀₀=0.08。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（3）中所述外植体优选为无菌苗的根，其次为叶柄，再次为叶片。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（3）中珊瑚菜无菌苗放入发根农杆菌菌液中浸泡15-30min。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（3）中共培养时间为2-5d。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（4）中将外植体放入含有头孢噻肟钠300mg/L的1/2MS培养基中，于25℃黑暗培养13-16d。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤（4）中在1/2MS培养基中培养每7-10d换一次培养基，最初头孢噻肟钠的浓度为300mg/L，逐步降低Cef的浓度为每换一次培养基降低50mg/L头孢噻肟钠。

对上述技术方案的进一步改进：利用分光光度法测定珊瑚菜毛状根中香豆素含量的波长为325nm。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

本发明以珊瑚菜叶片为实验材料，诱导愈伤组织的生成，并利用石蜡切片技术对其发生进行了跟踪观察，为珊瑚菜组织培养提供理论依据，并为后续实验奠定基础。

本发明利用已形成的愈伤组织，通过调节激素浓度筛选不定根的最佳诱导条件，以探索获得大量珊瑚菜不定根的组织培养条件，并对形成的不定根进行了扩增培养，为提高珊瑚菜药用活性部位的产量及工业化生产提供理论依据。

本发明利用发根农杆菌感染诱导珊瑚菜毛状根的形成，并建立离体毛状根培养系统，分析测定了珊瑚菜毛状根中主要药用成分香豆素的含量，并与不定根和人工栽培的珊瑚菜根中香豆素的含量进行了对比，以毛状根中香豆素的含量最高，珊瑚菜毛状根具有生长迅速，周期短，次级代谢产物相对产量高等特点，在不含激素的条件下一个多月便可获得大量的毛状根，可用于工业化生产珊瑚菜香豆素；为将来利用毛状根工业化生产珊瑚菜次级代谢产物提供了新的途径，从另一方面保护该濒危植物，有利于维护生态平衡。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1为珊瑚菜叶片在诱导培养基上培养过程的照片，表明珊瑚菜叶片形成愈伤组织过程中外部形态变化，其中图1-1、1-2、1-3、1-4分别为培养时间7d、14d、20d和40d的照片。

图2为珊瑚菜愈伤组织诱导不定根的照片，其中2-1表明含IBA3mg/L的1/2MS培养基上不定根的生长情况；其中2-2表明含IBA5mg/L的1/2MS培养基上不定根的生长情况；其中2-3表明不定根在液体培养基中培养10d的生长状态；其中2-4表明不定根在液体培养基中培养50d的生长状态。

图3为珊瑚菜种子的萌发情况，其中3-1为培养10d的种子，示胚芽突破种子开始萌发；3-2为培养20d的种子，示两片子叶逐渐从种子中冒出；3-3为培养25d的种子，示第一片真叶；3-4为培养40d的种子，示珊瑚菜无菌苗。3-5为诱导培养15d的外植体，白色透明的毛状根；3-6为高浓度菌液处理下外植体生长情况，示褐化死亡的外植体。

图4为毛状根在液体培养基中的生长过程，4-1为培养10d的毛状根，4-2为培养20d的毛状根，4-3为培养35d的毛状根，4-4为毛状根PCR检测结果，图中M为Marker，1为发根农杆菌1.2556T-DNA PCR扩增条带，2为毛状根DNA PCR扩增条带，3为不定根DNA PCR扩增条带，4为无菌苗DNA PCR扩增条带。

图5为伞形花内酯标准品溶液的光谱扫描图。

图6为珊瑚菜毛状根溶液的光谱扫描图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

一、珊瑚菜叶片愈伤组织发生

1、实验材料

植物材料选用无病虫害的珊瑚菜叶片。

MS(Murashige and Skoog)培养基中蔗糖浓度为30g/L，琼脂含量为8g/L。

愈伤组织的诱导培养基为MS+2,4-D0.15mg/L+6-BA1.8mg/L+NAA0.2mg/L。

2、生化试剂和主要仪器

MS培养基所用各成分以及酒精、甲醛、冰乙酸、二甲苯等试剂为国产分析纯试剂。细胞分裂素6-BA以及生长素NAA、2,4-D均为上海生物工程公司化学分析纯产品。

组织培养常用仪器：无菌操作台、手提式压力蒸汽消毒器、HPG-280B光照培养箱等。

3、实验方法

3.1外植体的处理方法

取珊瑚菜叶片若干，洗净表面尘土，放入烧杯中，流水冲洗1h，再用无菌水冲洗2-3次，将经过上述处理的叶片放在无菌操作台上，用滤纸吸干表面的水分，用75%的酒精消毒20s，无菌水冲洗3-5次，然后放入含有3-4滴吐温20的10%的次氯酸钠（有效氯1%）中消毒15min，无菌水冲洗3-5次，将叶片放在无菌滤纸上，切割成0.25cm²大小备用。

3.2愈伤组织的诱导

采用常规的组织培养方法（潘瑞炽.植物组织培养.第三版.广州：广东高等教育教出版社,2003,64）培养珊瑚菜叶片，诱导愈伤组织生成。愈伤组织的诱导培养基为MS+2,4-D0.15mg/L+6-BA1.8mg/L+NAA0.2mg/L，光照周期为16h：8h（光/暗），其中光照温度为25±2℃，黑暗温度为20±2℃。

4、实验结果

离体培养和外源激素是形成愈伤组织的关键条件，珊瑚菜叶片经含有2,4-D0.15mg/L+6-BA1.8mg/L+NAA0.2mg/L的MS培养基成功诱导培养出浅黄色透明的愈伤组织。叶片经培养3d后吸水膨胀，实验结果如图1所示，7d左右长出颗粒状愈伤组织（图1-1）；随后愈伤组织逐渐积累（图1-2）；20d左右形成愈伤组织团（图1-3）；40d后形成疏松的愈伤组织团（图1-4）。

二、珊瑚菜不定根的诱导

1、实验材料

以上述获得的长势均匀健康的珊瑚菜叶片愈伤组织为实验材料。

1/2MS培养基为大量元素减半，其它元素不变的MS培养基，蔗糖浓度为30g/L，琼脂含量为6g/L。

不定根诱导的培养基为含不同浓度IBA的1/2MS培养基。

2、生化试剂和主要仪器

MS培养基所用各成分等常规试剂为国产分析纯试剂。IBA为上海生物工程公司化学分析纯产品。

主要仪器：无菌操作台、手提式压力蒸汽消毒器、HPG-280B光照培养箱等组织培养常用仪器。

3、实验方法

采用常规组织培养方法，通过含不同浓度IBA的1/2MS培养基诱导愈伤组织形成不定根，IBA分为5个浓度梯度，分别为：1、2、3、4、5mg/L，并以不含IBA的1/2MS培养基作对照，每个浓度及对照分别培养30块大小均匀的愈伤组织块，并设三个平行。黑暗培养，培养温度为25±2℃。

记录各条件下最早生根时间，并培养至生根稳定，统计不同条件下愈伤组织块的生根率及平均根长，获得的实验数据采用DPS数据处理软件进行方差分析。

4、结果与分析

将愈伤组织切割转移至对照及不同浓度IBA的1/2MS培养基中，各培养条件下均生成了不定根。10d左右愈伤组织在含有各浓度IBA的培养基上相继长出不定根，浓度较高的培养基生根时间相对较早，对照组生成不定根的时间最晚。记录最早生根时间，45d后生根率稳定，不再有新的不定根生成，统计各浓度下生根率及平均根长，实验结果见表1。

表1不同IBA浓度下珊瑚菜不定根的诱导结果

注：不同小写字母表示不同处理间在0.05水平差异显著。

由表1可知，对照组及低浓度条件下不定根的生根时间晚，生根率相对较低，且不定根的平均根长较短；方差分析表明，不同IBA浓度下生根率差异显著，含IBA3mg/L和4mg/L的1/2MS培养基中的愈伤组织块最早生根时间相同，平均根长也相近，但3mg/L的IBA条件下的生根率显著高于4mg/LIBA条件下的生根率，且不定根的生长状态最好（图2-1）。含IBA5mg/L的1/2MS培养基中的愈伤组织块在培养第8d即长出不定根，生根率为55.6%，但该条件下形成的不定根较细（图2-2），生根率显著低于IBA浓度为3mg/L条件下的生根率。

结果表明，当IBA浓度≤3mg/L时，生根率随着IBA浓度的增大而增大；当IBA浓度≥3mg/L时，生根率随着浓度的增大而减小。IBA浓度为3mg/L时，生根率最高，高达88.9%，且不定根的生长状态最好。

生长素是促进不定根形成的主要激素。吲哚丁酸(IBA)是比吲哚乙酸(IAA)生根作用更强的一类生长素，原因是IBA比IAA稳定。IBA是一种由IAA转变而来的内源生长素，可以促进细胞的分裂和伸长，可以有效地诱导不定根的形成。不同浓度的IBA会影响到愈伤组织形成不定根的快慢和不定根的生长状态，本发明实验结果说明，由珊瑚菜叶片愈伤组织诱导生成不定根所需IBA的最佳浓度为3mg/L；本发明中5mg/L的IBA也成功地诱导出了不定根，但长出的不定根细长，且生根率较低。在不含IBA的1/2MS培养基中愈伤组织经长时间培养也会产生不定根，这说明愈伤组织经长时间的培养，薄壁细胞进行了再分化。

在植物组织培养过程中，对于大多数植物，降低培养基中的大量元素浓度，有利于提高植物的生根能力。MS培养基浓度对试管苗生根影响较大，相对于2MS、MS、1/4MS培养基，试管苗在1/2MS培养基中生根效果最好，根多且长，生根率达95%。本发明选用1/2MS培养基进行珊瑚菜不定根的诱导。在此后的毛状根的培养液也是选用的有利于根生长的1/2MS培养基。

三、珊瑚菜不定根的培养增殖

1、实验材料

以上述所获得的不定根为实验材料。

1/2MS液体培养基为大量元素减半，其它元素不变的MS液体培养基，蔗糖浓度为30g/L。

2、生化试剂和主要仪器

MS培养基所用各成分等常规试剂为国产分析纯试剂。IBA为上海生物工程公司化学分析纯产品。

主要仪器：无菌操作台、手提式压力蒸汽消毒器、全温振荡培养箱等组织培养技术常用仪器。

3、实验方法

采用常规组织培养方法，切取所述获得的长势较好的不定根，根部留有少量愈伤组织，将切取的不定根转移至含IBA3mg/L的1/2MS液体培养基中，25℃，黑暗条件下，80-90r/min振荡培养增殖。每10d换一次培养基。

4、结果与分析

上述实验表明IBA对珊瑚菜不定根的最佳诱导浓度为3mg/L，故直接选择含3mg/L IBA的1/2MS液体培养基进行珊瑚菜不定根的培养繁殖。在该培养条件下，珊瑚菜不定根的培养增殖获得了理想的结果。不定根在液体培养基中的生长速度明显高于固体培养基中的生长速度，且根的生长状态较茁壮。经培养10d根的体积翻倍增长，随着根的生长，愈伤组织逐渐脱落，根生长速度快，生长稳定，分支少或无分支，具有向地性（图2-3）；40d后根的生长速度减缓；50d后便基本不再生长（图2-4）。

四、珊瑚菜毛状根的诱导

1、实验材料

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)1.2556购自中国普通微生物菌种保藏中心。

MS培养基，蔗糖浓度为30g/L，琼脂含量为6g/L。

1/2MS培养基为大量元素减半，其它元素不变的MS培养基，蔗糖浓度为30g/L，琼脂含量为6g/L。

YEB培养基：牛肉浸膏5g/L，酵母粉1g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，硫酸镁0.5g/L，PH7.2，固体YEB培养基中琼脂浓度为15g/L。

2、生化试剂及主要仪器

植物组织培养试剂均为国产分析纯试剂。头孢噻肟钠(Cef)购自上海生物工程公司。

主要仪器：分光光度计、无菌操作台、手提式压力蒸汽消毒器、全温振荡培养箱、光照培养箱等组织培养常规仪器。

3、实验方法

3.1无菌苗的获得

选择饱满的珊瑚菜果实，去掉果皮取出种子，冲洗，浸泡24h，流水冲洗1h，再用无菌水冲洗2-3次，将经过上述处理的种子放在无菌操作台上用滤纸吸干表面的水分，用75%的酒精消毒20s，无菌水冲洗3-5次，然后放入含有3-4滴土温20的10%的次氯酸钠（有效氯1%）中消毒20min，无菌水冲洗3-5次，将种子放在无菌滤纸上吸干表面水分。切除多余胚乳部位，然后接种于不含激素的MS固体培养基中，25℃下培养，获得无菌苗。

3.2发根农杆菌的培养

将装有发根农杆菌1.2556菌种的安瓿瓶开封，加入0.5mL的无菌水，使冷冻菌体溶解呈悬浮状，取0.2mL菌体悬浮液，移植于YEB琼脂培养基上，28℃黑暗倒置培养，活化2-3次，划四区，挑取单菌落转接到YEB液体培养基中，至摇床上，28℃，160～170r/min振荡培养24h。用分光光度计测量菌液的OD600，并用灭菌后的YEB液体培养基调整，获得OD₆₀₀分别为0.04、0.08、0.12左右的三种菌液，供感染用。

3.3外植体的转化

取长势较好的珊瑚菜无菌苗，切取叶片、叶柄及根作为外植体材料，在其表面划出伤口用于感染。而后放入已准备好的三种浓度的菌液中浸泡20min，间歇轻微震荡。取出已灭菌的滤纸吸干外植体表面的菌液后，放入MS固体培养基中共培养，共培养至外植体周边出现菌斑。

3.4毛状根的诱导培养

待外植体周围出现菌斑，将外植体分别用无菌水清洗3-5次，用已灭菌的滤纸吸干外植体表面的水，将外植体放入含有头孢噻肟钠（Cef）300mg/L的1/2MS培养基中，25℃黑暗培养。每7-10d换一次培养基，逐步降低Cef的浓度，多次继代直到完全除菌后去掉抗菌素，在不含激素的1/2MS培养基中继续培养，获得除菌的毛根系。待生根稳定后，统计叶、叶柄和根在三种浓度发根农杆菌感染下的生根情况：

毛状根诱导率=产生毛状根外植体数/总外植体数×100%。

4、结果与分析

无菌苗的获得如图3所示。珊瑚菜种子经灭菌培养后，10d左右胚芽突破种子开始萌发（图3-1）；20d左右，两片子叶逐渐从种子中冒出（图3-2）；25d左右长出第一片真叶，并开始长根（图3-3）；40d左右获得无菌苗（图3-4）。

毛状根的获得如图3所示。外植体被感染后，共培养时间为4d，第4d外植体周围出现菌斑，将外植体转移至含有头孢噻肟钠（Cef，300mg/L）的1/2MS固体培养基中，15d左右，开始有白色透明的毛状根形成（图3-5）；30d左右完全除菌且生根稳定，不再有新的毛状根形成，统计各条件下的生根率，结果见表2。

由表2可见，珊瑚菜不同外植体的毛状根诱导率由高到低分别为无菌苗的根、叶柄、叶片；发根农杆菌的最佳浓度为OD₆₀₀=0.08，其次为OD₆₀₀=0.04；OD₆₀₀=0.12时，发根农杆菌的浓度过高，容易导致外植体死亡（图3-6）。

珊瑚菜毛状根诱导的最佳外植体为无菌苗的根，不仅出根快，而且诱导率高，再依次为叶柄、叶片；发根农杆菌1.2556的最佳诱导浓度为OD₆₀₀=0.08，浓度过低感染力度不够，毛状根诱导率较低，浓度过高，发根农杆菌影响外植体的生长，导致部分外植体死亡，其中高浓度的菌液对叶片的影响最大，导致叶片全部褐化死亡，未长出毛状根。

表2不同外植体及菌液浓度对珊瑚菜毛状根诱导的影响

注：-----外植体褐化死亡

在发根农杆菌感染转化过程中，菌种、外植体、外植体的预培养、感染菌液浓度、共培养时间以及抗生素浓度等因素对转化率均有明显的影响。

外植体的差异主要表现在对发根农杆菌的感受态和转化为易感受细胞的能力，即使同一种植物，在相同的转化条件下，不同外植体部位对发根农杆菌的感受态也不同，转化为易感受细胞的能力也不同，从而具有不同的毛状根诱导率。一般幼嫩的、易脱分化的植物组织较易于被农杆菌感染，而且在感染农杆菌后，感受态细胞一般比其它部位多，因而易于进行遗传转化。本发明中珊瑚菜毛状根诱导的最佳外植体为无菌苗的根，其次为叶柄和叶片，分析原因是由于无菌苗的根在培养基中，相对于具有角质层的叶柄、叶片更易于被感染转化。

共培养是指发根农杆菌与外植体共同培养，在此期间，植物细胞的分裂、生长和农杆菌的生长是同步进行的，这一过程是发根农杆菌对植物进行感染转化过程中相当重要的一环，因为发根农杆菌附着在外植体上、T-DNA转移并整合至外植体细胞内都在这一时期内完成，因此共培养时间是转化的关键。

共培养的时间由外植体和农杆菌的生长情况决定，农杆菌的生长情况与能否实现转化直接有关，如果在侵染时发根农杆菌增殖生长状态不良，外植体切口周围只有少量的农杆菌生长，那么转化的机会就会很小；然而如果发根农杆菌在外植体四周过度增长繁殖，则会引起对外植体的毒害，导致外植体发生褐化甚至死亡，感染转化的机会同样也会很小。本发明共培养时间（4d）是通过观察外植体和菌斑的形成来确定的，相对于其他植物较长。

菌液浓度为毛状根诱导的另一重要因素，决定着农杆菌侵染转化效果。菌液的浓度过高，附着在外植体表面，不易除菌，且容易导致外植体发生褐化甚至死亡；浓度过低又达不到感染的目的，Ri质粒无法侵入外植体中。本实验结果表明，OD₆₀₀为0.08时，转化效果最好，浓度过低感染力度不够，毛状根诱导率较低，浓度过高，发根农杆菌影响外植体的生长，导致部分外植体的死亡，其中高浓度的菌液对叶片的影响最大，导致叶片全部褐化死亡，未长出毛状根，分析原因是由于叶片表面积相对于叶柄和根较大，伤口多，易于农杆菌侵染，而菌液浓度过大，生长过快，与叶肉细胞形成竞争，导致叶肉细胞的老化死亡。

毛状根诱导过程中，有的植物需要进行预培养，外植体的预培养对诱导率也有较大的影响，发根农杆菌感染外植体后，伤口处褐化会影响毛状根的形成及诱导率，一般经过预培养会较好地解决褐化问题，提高诱导率。不同植物体所需的预培养时间也是不同的，有的植物外植体感染前需要的预培养时间较长，而有些植物不需要预培养。珊瑚菜外植体中曾报含有较多的酚类物质，本实验中珊瑚菜外植体不需要进行预培养，可以成功的获得珊瑚菜毛状根。

五、珊瑚菜毛状根的培养增殖

1、实验材料

以上述获得的毛根系为实验材料。

含IBA3mg/L的1/2MS液体培养基，其中1/2MS培养基为大量元素减半，其它元素不变的MS培养基，蔗糖浓度为30g/L。

2、生化试剂和主要仪器

MS培养基所用各成分等常规试剂为国产分析纯试剂。IBA为上海生物工程公司化学分析纯产品。

主要仪器：无菌操作台、手提式压力蒸汽消毒器、全温振荡培养箱等组织培养技术常用仪器。

3、实验方法

统一选择以根作为外植体经感染诱导所形成的除菌完全、生长快速的毛状根系，接种在1/2MS液体培养基中，80-90r/min振荡培养增殖。每10d换一次培养基。

4、实验结果分析

毛状根在含有头孢噻肟钠的固体培养基上完全除菌后，移至不含激素和抗生素的1/2MS液体培养基中进行培养增殖，毛状根生长速度明显快于固体培养基，10d左右外植体周围长满了放射状毛状根，不断形成细嫩的次级毛状根（图4-1）；20d左右形成一团毛状根，毛状根呈淡黄色、透明、细长并逐渐失去向地性或有弱的向地性（图4-2）；35d左右毛状根即长满250ml锥形瓶的平底，增长逐渐缓慢，形成的毛状根多分枝，多根毛，无向地性（图4-3）。

在毛状根转移之前，发现抗生素在抑制发根农杆菌生长的同时，对毛状根的发生和生长也有影响，长时间生长在含有抗生素的培养基上，珊瑚菜外植体会逐渐褐化，不再产生新的毛状根，已形成的毛状根的生长也会出现生长减缓或停止的现象，所以选择了除菌完全的珊瑚菜毛状根作为毛状根扩大培养的实验材料。

毛状根是发根农杆菌Ri质粒感染诱导的结果，属于单细胞起源，在无激素培养基上具有迅速生长、自主生长、持续生长等特性，且遗传稳定、次生代谢产物含量高，周立刚等曾在总结植物毛状根培养的研究进展时指出，毛状根和正常根在形态上存在着很大的差异，毛状根在无激素的培养基上具有多根毛、多分枝、无向地性等特点。毛状根在液体培养基中生长速度，往往大于相应的细胞培养物或未转化的根培养物，这些表型为判定毛状根提供了简单而又方便的依据。

本发明中被诱导出的毛状根和不定根以及无菌苗的根在形态上也存在着很大的差异性，珊瑚菜毛状根在无激素的培养基上即生长迅速，并同样具有多分枝、多根毛、无向地性等特点，无菌苗的根生长速度缓慢，不定根的分支较少，且后两种根都具有明显的向地性。同时实验发现毛状根在生长45d左右便不再产生新的毛状根，生长处于停滞状态，而未出现持续生长的特性，分析原因可能是由于受生长空间的影响。

六、珊瑚菜毛状根的分子鉴定

1、实验材料

以培养繁殖所获得的毛状根为材料，并以所获得不定根和获得的无菌苗做对照。

2、生化试剂和主要仪器

植物基因组DNA提取所用仪器试剂为Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒及配套试剂，质粒提取、PCR扩增等所用分子实验试剂均采购于上海生物工程科技有限公司。

台式高速微型离心机，电泳仪，垂直板电泳槽PCR仪，微量移液器，恒温水浴锅，紫外可见分光光度计等常规分子试验仪器。

3、实验方法

3.1植物基因组DNA提取与纯化

a、取50-100mg的新鲜植物组织，放入液氮中，研磨充分成粉末状，转移至1.5mL的离心管中。

b、加入600μL65℃预热的12μLβ-巯基乙醇和Buffer PCB，震荡混匀，放入65℃水浴25min，不断混匀。

c、取出，冷却至室温，加入等体积的氯仿，颠倒充分混匀，12000rpm离心5min。小心吸取上层水相，移至一个灭菌的1.5mL的离心管中。

d、加入等体积的Buffer BD，颠倒混匀数次，然后加入等体积的无水乙醇，充分混匀，用移液器吸取全部液体，移至吸附柱中，静置2min，10000rpm离心1min，舍弃收集管中的废液。

e、将吸附柱放入收集管中，加入PW Solution500μL，10000rpm离心1min，舍弃收集管中的废液。

f、将吸附柱放入收集管中，加入Wash Solution500μL，10000rpm离心1min，舍弃收集管中的废液。

g、将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min。

h、取出吸附柱，放到一个新的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入TEBuffer50μL，室温静置3min，12000rpm离心2min，即得到DNA溶液，置于-20℃保存备用。

3.2质粒DNA的提取

a、将农杆菌1.2556于YEB液体培养基中养12-16h后，12000rpm离心30s，弃上清液，收集菌液。

b、加入250uL RNaseAI的Buffer S1充分使悬浮的农杆菌沉淀。

c、加入250uL Buffer S2，轻轻的翻转混合4-6次，充分混合均匀，但不宜超过5min。

d、加入400uL Buffer S3，上下颠倒混匀8-10次，室温静置2min。12000rpm离心10min。

e、将DNA-prep Tube置于2mL Microfuge Tube中，将步骤4中经离心所得的上清液加入DNA-prep Tube中，2500rpm离心lmin。

f、舍去滤液，将DNA-prep Tube放入原2mLMicrofuge Tube中，加入500uL Buffer W l，2500rpm离心lmin。

g、舍弃滤液，将DNA-prep Tube放入原2mL Microfuge Tube中，加入700uL含有无水乙醇的Buffer W2，2500rpm离心l min，以同样的方法再用700uLBuffer W2洗涤一次。

h、将DNA-prep Tube置于1.5mL离心管中，12000rpm离心2min。

i、将DNA-prep Tube置于新的洁净的1.5mL离心管中，在silica膜中央加60Ul Eluent，室温静置1min。12000rpm离心lmin，获得质粒DNA，置于-20℃保存备用。

3.3毛状根的PCR检测

以所获得的毛状根总DNA为材料，以无菌苗根和不定根作为对照。参考步怀宇等人的研究成果，由上海生物工程有限公司合成发根农杆菌1.2556中rolB基因的PCR引物，上游引物：5'-CGCAAGCTACAACATCATAG-3'，下游引物：5'-CAGTAGATCTCACTCCAGCA-3'。

PCR反应体系20μL，其中DNA模板1μg，上下游引物各1μL(终浓度20pmol/L)。PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性50s；52℃退火50s；72℃，延伸1min；循环5次；94℃变性50s；50℃退火50s；72℃延伸1min；30次循环；72℃，延伸10min。

扩增产物检测：取PCR产物10μl，0.8%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成相分析。

4、实验结果与分析

Rol B是发根农杆菌Ri质粒TL-DNA(T-DNA左臂)上的一个生根基因。利用合成的rol B PCR引物，对特异性片段T-DNA rolB进行扩增。以含有T-DNArolB的发根农杆菌1.2556为阳性对照，以珊瑚菜未转化的无菌苗根和不定根为阴性对照。通过PCR扩增可以从发根农杆菌1.2556和珊瑚菜毛状根中得到长度为700bp左右的特异性DNA片段（图4-4）。而珊瑚菜未转化的无菌苗根和不定根的基因组DNA中扩增不到该片段，从而在分子水平上说明了发根农杆菌1.2556的Ri质粒DNA已整合进入珊瑚菜毛状根基因组中，成功获得了珊瑚菜毛状根。

七、珊瑚菜三种根中香豆素含量的测定分析

珊瑚菜的主要药用成分为香豆素，香豆素具有抗HIV、抗菌、抗凝血、扩张血管、增强免疫力等多种生物活性，在制药行业中常被用作中间体和药物。珊瑚菜含有多种香豆素，并且部分香豆素的含量已成为评价北沙参不同产地的质量和加工方法的依据。

香豆素属于邻羟桂皮酸内脂，母核为苯骈α-吡喃酮，根据环上取代基的位置和类型不同，通常将香豆素分为简单香豆素类、呋喃香豆素类（线型和角型）、吡喃香豆素类以及其他香豆素类，由于绝大多数香豆素在C7位都有含氧官能团存在，因此，伞形花内酯（7-羟香豆素）可以认为是香豆素类成分的母体，利用示踪实验等方法研究表明：在植物体内，伞形花内酯来源于顺式-对-香豆酸（cis-p-coumaric acid），然后在各种生物酶的作用下，经羟基化、内酯化、甲基转移等过程合成各种香豆素，可见伞形花内酯是各种香豆素的前体物，故本实验选用伞形花内酯（7-羟香豆素）作为标准品来测定珊瑚菜根中香豆素的总含量。

本申请人分析当年生珊瑚菜栽培后期不同采收期珊瑚菜根中香豆素的含量，多次分析比较了根、叶中补骨脂素、欧前胡素、异欧前胡素及香豆素总含量，测定分析10月15号为最佳采收期，此时珊瑚菜根中总香豆素的含量和产量最高，分别为0.0772mg/g和1.0878mg/株，九月份采收的珊瑚菜根中香豆素的含量为0.04mg/g左右。

本发明诱导珊瑚菜毛状根形成的目的是希望从毛状根中获得较高的珊瑚菜药用活性成分-香豆素，故本发明对培养所得的珊瑚菜三种根中香豆素的含量进行了测定分析比较，为珊瑚菜不定根和毛状根的开发利用提供理论依据。

1、实验材料

植物材料以上述培养增殖的珊瑚菜不定根和上述培养增殖获得的珊瑚菜毛状根以及栽培一年的珊瑚菜根为实验材料。

2、化学试剂和主要仪器

伞形花内酯（7-羟基香豆素）标准品纯度≥98%，乙醇等试剂均为国产分析纯。

主要仪器有植物粉碎机，VARIAN CARY100紫外分光光度计，SARTORIUS BP211D电子分析天平，水浴锅，螺旋冷凝管等。

3、实验方法

3.1样品处理

分别取培养获得的珊瑚菜不定根、毛状根，阴干粉碎，过60目筛，备用；取盆栽一年的珊瑚菜根，洗净，阴干，粉碎过60目筛，备用。

3.2样品液的获得

分别精密称取粉碎后的三种根的样品0.5g，加95%乙醇40mL，80℃加热回流1h，过滤，残渣再加95%乙醇40mL，加热回流1h，过滤，合并两次滤液，用少量95%乙醇洗涤药渣，合并滤液与洗液，冷却至室温，定容至100mL，摇匀，精密吸取上述溶液1mL于25mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，摇匀，即得待测样品液，每个样品做三个重复。

3.3对照品溶液的获得

向20mg标准品中注入95%乙醇溶解，定容至100ml，即得0.2mg/mL的母液，精密吸取20mL母液于100mL容量瓶中，95%乙醇定容，即得0.04mg/mL的对照品溶液。

3.4测定波长的选择

将对照品溶液和样品溶液在250-450nm的波长范围内扫描，观察分析光谱图形，选择两种溶液共有的最大吸收峰所处的波长作为珊瑚菜香豆素测定波长。

3.5线性回归分析

精密吸取对照品溶液0.5mL，1.0mL，1.5mL，2.0mL，2.5mL置于25mL容量瓶中，95%乙醇定容摇匀，以95%乙醇为空白对照，在扫描所得的波长处测定各溶液的吸光值，利用excel2007软件，以吸光值为横坐标，对照品溶液中羟基香豆素的含量为纵坐标，进行线性回归分析。

3.6数据处理

以95%乙醇为空白对照，在扫描所得的波长处测定三种根的样品液的吸光值，代入标准曲线所得的方程，即得测定液中香豆素的含量。采用DPS数据处理软件进行方差分析。

试样中香豆素的百分含量按下式计算：

ω（%）=（m1×100）/m0×100

其中，m1为测定液中香豆素的质量（g），m0为所称样品的质量（g），第一个100为测定液中香豆素含量与样品中香豆素质量的转换系数，第二个100为百分含量转换系数。

2实验结果

2.1光谱扫描

将对照品溶液和毛状根样品溶液在250-450nm的波长范围内进行光谱扫描，获得光谱图，分别见图5和图6。

由图1伞形花内酯标准品的光谱扫描图和图2珊瑚菜毛状根溶液的光谱扫描图，我们可以看出，毛状根溶液和对照品溶液均在325nm处出现最高吸收峰，故得出分光光度法测定香豆素含量的测定波长为325nm。

2.2回归方程的获得

在325nm处测定所配各浓度的标准品溶液的吸光度，利用excel2007软件以吸光值为横坐标，对照品溶液中羟基香豆素的含量为纵坐标，求得回归方程y=0.188x-0.005，R2=0.986。

2.3样品中香豆素的含量

利用分光光度计测定珊瑚菜三种根的样品液在325nm处的吸光值，代入回归方程，转换计算珊瑚菜三种根中香豆素的含量，结果见表3。

表3珊瑚菜三种根中香豆素的含量

注:不同小写字母表示不同处理间在0.05水平差异显著

由表3我们可以看出，三种根中香豆素的含量由高到低分别为毛状根、不定根、正常根，三种根中香豆素含量差异显著，其中毛状根中香豆素的含量高达0.56%，约是正常根中香豆素含量的2.3倍，不定根中香豆素含量的1.2倍，不定根中香豆素的含量约是正常根中香豆素含量的2倍，珊瑚菜不定根和毛状根合成香豆素的能力显著高于正常根。

由结果我们可知珊瑚菜三种根中，毛状根和不定根中香豆素含量均高于盆栽一年的珊瑚菜正常根中香豆素的含量，以毛状根中香豆素的含量最高，并且具有是生长速度快，生长周期短等特点，在不含激素的条件下一个多月便可获得大量的毛状根，综合分析珊瑚菜毛状根具有生长迅速，周期短，次级代谢产物相对产量高等特点，可用于工业化生产珊瑚菜香豆素；不定根中香豆素的含量也相对较高，但是生长速度相对较慢，且生长过程中需要激素的作用，不适合工业化培养生产香豆素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (3)

1.一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，其特征在于它包括以下步骤：

（1）获得珊瑚菜无菌苗；

（2）培养供感染用的发根农杆菌；所用菌种为发根农杆菌1.2556，发根农杆菌的感染菌液最佳浓度为OD₆₀₀=0.08；

（3）转化外植体进行共培养：取长势较好的珊瑚菜无菌苗，切取根作为外植体，在其表面划出伤口用于感染，放入发根农杆菌菌液中浸泡20min，然后放入MS固体培养基中共培养4天，直至外植体周边出现菌斑；

（4）诱导毛状根发生：将出现菌斑的外植体清洗后，放入含有300mg/L头孢噻肟钠的1/2MS培养基中培养，于25℃黑暗培养13-16d，在1/2MS培养基中培养每7-10d换一次培养基，最初头孢噻肟钠的浓度为300mg/L，逐步降低头孢噻肟钠的浓度为每换一次培养基降低50mg/L头孢噻肟钠，直到在完全除掉头孢噻肟钠的1/2MS培养基中继续培养，获得除菌的毛根系；

（5）毛状根的培养增殖：将除菌完全、生长快速的毛状根接种在1/2MS液体培养基中，振荡培养增殖，获得大量毛状根。

2. 根据权利要求1所述的珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，其特征在于：所述步骤（1）中选择饱满的珊瑚菜种子，灭菌，后接种于MS固体培养基中培养获得无菌苗。

3. 根据权利要求1所述的珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法，其特征在于：利用分光光度法测定珊瑚菜毛状根中香豆素含量的波长为325nm。