KR102262309B1

KR102262309B1 - 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과 식물 배양근의 생산 방법

Info

Publication number: KR102262309B1
Application number: KR1020180123159A
Authority: KR
Inventors: 이은정; 강영규; 김동현; 김용진
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2018-10-16
Filing date: 2018-10-16
Publication date: 2021-06-09
Also published as: KR20200042701A

Abstract

본 발명은 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과 식물 배양근의 생산 방법으로서, (1) 콩과 식물 종자를 배양 배지에서 발아시켜 기내 식물체를 유도하는 단계; (2) 상기 유도된 기내 식물체를 배양 배지에서 배양하여 배양근을 유도하는 단계; 및 (3) 상기 유도된 배양근을 생물반응기 내의 배양 배지에 위치시켜 광 조사 조건 하에서 증식시키는 단계를 포함하는, 방법을 개시한다. 구체적으로, 본 발명에 따르면, 대량의 쿠메스트롤을 연중 균일하게 고함량으로 얻을 수 있으며, 단시간에 대량의 쿠메스트롤 생산이 가능하므로, 기존 방법에 비하여 비용 및 시간을 절약할 수 있으며, 합성이 아닌 천연물을 이용하여 생산된 쿠메스트롤이므로 이렇게 생산된 쿠메스트롤은 약학, 식품 또는 화장품을 예로 들 수 있는 다양한 분야에 안전하게 활용이 가능하다.

Description

쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과 식물 배양근의 생산 방법{PRODUCTION METHOD FOR CULTURED ROOT OF LEGUMINOUS PLANTS COMPRISING HIGH-CONTENT OF COUMESTROL}

본 발명은 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과 식물 배양근의 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 배양근의 증식 단계에서 광 처리를 함으로써 쿠메스트롤의 함량이 크게 증가될 수 있는 콩과 식물 배양근의 배양 방법에 관한 것이다.

갱년기 여성들을 위한 에스트로겐 요법에서 강력한 에스트로겐 효과를 갖고 있는 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol; DES) 등의 저렴한 합성 에스트로겐의 사용이 미국 FDA에 의해 전면 금지된 이후로 여성호르몬을 대체해 줄 수 있는 천연의 식물성 에스트로겐(phytoestrogen)에 관심이 모아지고 있다. 그러나 이러한 물질들은 천연에 극미량으로 존재하기 때문에 대량 확보가 매우 어려운 실정이다. 또한 과거 반세기에 걸쳐 이러한 물질들의 대량 합성 기술개발에 미온적이었기 때문에 두드러진 성과는 없었으며 비록 간헐적으로나마 합성법 개발에 대한 보고가 있기는 하나 이 역시 실험실적 수준에 그치고 있기 때문에 현재까지 이렇다 할 만한 손쉬운 대량 제조방법이 전무한 상태이다.

쿠메스트롤(coumestrol)은 식물성 에스트로겐 중에서 현재까지 가장 강력한 것으로 알려져 있는 물질로서 주로 콩과(leguminosae), 국화과(compositae) 식물의 씨앗, 뿌리 그리고 잎에서 발견되는 물질로써 이소플라보노이드(isoflavonoid)의 일종으로 일반적으로는 쿠메스탄(coumestan) 계열 화합물로 분류되고 있다. 쿠메스트롤은 식물이 외상을 입었을 때 상처 부위에 짙은 농도로 분비되어 항산화, 항염 및 항독소 작용을 통해 항균, 항진균 및 항바이러스 작용을 하여 감염을 방지하는 역할을 하는 것이 알려지면서 주목을 받았던 물질이다. 이러한 현상은 다양한 박테리아 및 곰팡이류, 바이러스 등의 감염이 쿠메스트롤을 포함한 다양한 방향족 화합물(aromatic compounds)의 합성을 유도하기 때문이다. 이러한 쿠메스트롤의 항생 작용의 근원은 항산화제로서의 화학적 기본 골격인 페놀성 구조를 보유하고 있어 프리 라디칼성(free radicals) 산화제의 유입을 억제하여 생체 내 과산화 화합물 생성을 저지하기 때문으로 알려지고 있다. 또한 다양한 천연 쿠메스탄 계열의 유도체들 중에서 오직 쿠메스트롤만이 에스트로겐 효과를 갖고 있는 것으로 알려지고 있다. 에스트로겐 효과에 대한 실험은 미숙한 쥐에게 경구 투여한 후 자궁의 무게 변화에 기초하여 평가되었다. 이러한 실험 결과에서 특기할 만한 사항으로 쿠메스트롤은 어린 암쥐에서는 효과적으로 에스트로겐 효과가 나타났지만 성숙한 수컷 동물들에게는 활성을 나타내지 않았으며 독성이 전혀 없는 것으로 나타났다.

그러나, 쿠메스트롤은 일부 식물체에 극미량으로 존재하므로 현재 상용되는 천연 쿠메스트롤은 고가로 시판되고 있다. 이러한 이유로 합성을 통해 쿠메스트롤을 얻으려는 연구가 간헐적으로 시도되어 왔으나 여러 개의 방향족 고리가 융합되어 있는 다소 복잡한 화학 구조 때문에 손쉬운 합성법 개발에 대한 접근법이 소개되지 않고 있으며, 비록 몇 가지의 합성법이 보고되고 있으나 각 합성법들은 다양한 문제점을 내포하고 있어 상용화에 많은 어려움이 따르고 있다. 또한 최근에 화학적 합성법에 의해 생산한 성분 보다는 천연에서 생산한 성분이 안전성 측면에서 좋은 이미지를 가지고 있기 때문에 천연 물질에서 대량으로 생산 할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.

대한민국 등록특허공보 제10-1018843호 대한민국 등록특허공보 제10-0706279호

본 발명의 일 측면은, 쿠메스트롤의 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면은, 천연 원료를 이용하여 효율적이면서도 연중 균일하게 쿠메스트롤의 생산이 가능한 쿠메스트롤의 함량이 증가된 콩과 식물 배양근의 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면은, 쿠메스트롤의 대량 생산이 가능한 쿠메스트롤의 함량이 증가된 콩과 식물 배양근의 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 측면은, 쿠메스트롤의 함량이 증가된 콩과 식물 배양근을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과 식물 배양근의 생산 방법으로서,

(1) 콩과 식물 종자를 배양 배지에서 발아시켜 기내 식물체를 유도하는 단계; (2) 상기 유도된 기내 식물체를 배양 배지에서 배양하여 배양근을 유도하는 단계; 및 (3) 상기 유도된 배양근을 생물반응기 내의 배양 배지에 위치시켜 광 조사 조건 하에서 증식시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.

본 발명의 일 측면에 따른 배양 방법은 대량의 쿠메스트롤을 연중 균일하게 고함량으로 얻을 수 있으며, 단시간에 대량의 쿠메스트롤 생산이 가능하므로, 기존 방법에 비하여 비용 및 시간을 절약할 수 있으며, 합성이 아닌 천연물을 이용하여 생산된 쿠메스트롤이므로 이렇게 생산된 쿠메스트롤은 약학, 식품 또는 화장품을 예로 들 수 있는 다양한 분야에 안전하게 활용이 가능하다.

도 1은 시험예 1에 따라 엑스플랜테이션 기술을 이용하여 4주간 배양하면서 수확 전 각각 0일(대조군), 3일, 7일, 14일 및 28일 간의 기간 동안 광 처리하여 콩 배양근을 배양한 모습을 나타낸 것이다.
도 2는 시험예 2에 따라 광 처리하지 않은 경우와 28일 간 광 처리한 경우의 콩 배양근 내 쿠메스트롤을 HPLC 크로마토그램으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 명세서에서, 엑스플랜테이션(explantation)이란, 외식(外植) 또는 체외배양이라고도 하고, 주로 동식물 개체의 일부를 분리하여 체외에서 배양하는 기술이다. 주로 일정 기간에 걸쳐 체외에서 생존하며 차차 어떤 발생적 변화가 보일 정도로 시간을 두고 배양을 하는 것을 포함한다. 일반적인 조직배양(組織培養)도 체외배양의 한 방법이다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 기내 배양도 체외배양에 포함되며, 무균배양 혹은 식물 줄기세포 배양 등으로도 불릴 수 있다.

본 명세서에서 엑스플랜테이션 기술은, 원형질체, 세포, 조직, 기관, 배, 종자, 배양근 및 식물체의 일부를 포함하는 군에서 선택된 하나 이상을 적출하여 기내(in-vitro)에서 영양분이 함유되어 있는 배양 배지 등의 인공 배양 기구를 이용하여 무균적으로 배양함으로써 캘러스(callus)나 단세포 집단을 유기 또는 완전한 기능을 가진 식물체로 재생시키는 것을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

쿠메스트롤은 외부 자연환경의 변화에 따라 콩 식물체 내 함량이 변화하며, 같은 속/ 종/ 품종에 따라 함량차이가 크고 특히, 식물체 내 극미량 존재하는 콩의 주요 생리활성물질이다. 본 발명의 배양방법으로 광 처리된 콩과 식물 배양근을 이용하여 쿠메스트롤을 생산 할 경우, 원료의 연중 균일한 생산이 가능하며 배양공정 조절을 통한 기내 쿠메스트롤 대량생산이 가능하다.

본 발명에서 사용되는 "콩과 식물"은 쿠메스트롤을 생산할 수 있는 콩과 식물을 사용할 수 있다.

본 명세서에서 콩과 식물의 종자는 콩과 식물에서 유래되는 씨(씨앗)이다. 구체적으로, 콩과 식물의 종자는 "콩"일 수 있다.

일 구현예로서, 상기 콩은 대두, 납작콩, 서리태, 서목태, 흑태, 청태, 황태, 울타리콩, 강낭콩, 얼룩강낭콩, 적두, 거두, 신화콩 및 콩나물콩 중 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 대두, 납작콩, 서리태, 서목태, 흑태, 청태, 황태, 울타리콩, 적두, 거두 및 신화콩 중 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 콩의 품종은 제한이 없으나, 일 측면에서 장류 및 두부용, 나물용, 밥밑용 또는 풋콩용 품종일 수 있다. 장류 및 두부용 품종으로는, 대풍(大豊), 호장(湖醬), 장원(壯元), 대황(大潢), 소담, 송학(松鶴), 대원(大元), 진품(眞品), 단백(蛋白), 두유(豆油), 신팔달(新八達), 태광(太光), 만리(萬里), 장수(長壽), 무한(無限), 백운(白雲), 새알, 황금(黃金) 및 장엽(長葉) 등이 있다. 나물용 품종으로는, 신화, 소원, 안평(安平), 서남(西南), 다채(多彩), 소록(小綠), 소호(小湖), 소명(疏明), 다원(多元), 풍산(豊産)나물, 익산(益山)나물, 소백(小白)나물, 광안(光安), 단엽(短葉) 및 은하(銀河) 등이 있다. 밥밑용 품종으로는, 청자(靑磁), 흑청(黑靑), 갈미(褐味), 선흑(鮮黑), 검정콩 및 일품(一品)검정콩 등이 있다. 또한, 풋콩용 품종으로는, 다올, 신록(新綠), 새을, 검정을, 석량(夕凉)풋콩, 화엄(華嚴)풋콩 및 큰을 등이 있다. 본 발명의 다른 일 측면에서, 콩은 발아가 가능하고 병충해에 강한 품종인 것이 바람직하다. 그와 같은 콩으로는, 예를 들어 신화, 소원, 안평(安平), 서남(西南), 다채(多彩), 소록(小綠), 소호(小湖), 소명(疏明), 다원(多元), 풍산(豊産)나물, 익산(益山)나물, 소백(小白)나물, 광안(光安), 단엽(短葉) 및 은하(銀河) 등이 있다. 그러나 본 발명의 일 측면에 따른 콩이 상기 콩 품종에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 측면에 따른 납작콩은 납떼기콩, 납데기콩, 납쪼레기콩, 납드레콩 등으로 다양하게 불린다.

본 발명은 일 측면에서, 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과 식물 배양근의 생산 방법으로서, (1) 콩과 식물 종자를 배양 배지에서 발아시켜 기내 식물체를 유도하는 단계; (2) 상기 유도된 기내 식물체를 배양 배지에서 배양하여 배양근을 유도하는 단계; 및 (3) 상기 유도된 배양근을 생물반응기 내의 배양 배지에 위치시켜 광 조사 조건 하에서 증식시키는 단계를 포함하는, 방법일 수 있다.

일 구현예로서, 상기 단계 (3)의 광 조사는 수확일을 기준으로 수확 전 1일 내지 35일 간 실시하는 것일 수 있다. 이때, 수확일은 상기 단계 (3)에서의 배양근의 증식이 완료되는 시점을 의미하며, 구체적으로, 상기 단계 (3)의 광 조사는 콩 배양근의 수확일을 기준으로 수확 전 1일 이상, 4일 이상, 7일 이상, 10일 이상, 14일 이상, 17일 이상, 21일 이상, 25일 이상, 28일 이상, 또는 30일 이상의 기간 동안 실시할 수 있으며, 35일 이하, 30일 이하, 28일 이하, 25일 이하, 21일 이하, 17일 이하, 14일 이하, 10일 이하, 7일 이하, 또는 4일 이하의 기간 동안 실시할 수 있다. 바람직하게는 수확 전 14일 내지 28일 간 실시할 수 있다. 상기 단계 (3)에서의 광 조사 기간이 상기 범위 내일 때 배양근의 증식이 우수하며, 배양근 내 쿠메스트롤의 함량이 보다 증진될 수 있다.

일 구현예로서, 상기 단계 (3)에서의 광 조사의 광원으로는 LED, 백열등, 형광등 등을 사용할 수 있으며, 본 발명의 일 측면에 따른 광량의 광을 배양근에 조사할 수 있다면, 이에 한정되지 않고 어느 광원이든 사용할 수 있다.

일 구현예로서, 상기 단계 (3)의 광 조사는 30 내지 100 PPFD(Photosynthesis Photon Flux Density)의 광량으로 실시하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 단계 (3)의 광 조사는 30PPFD 이상, 35PPFD 이상, 40PPFD 이상, 45PPFD 이상, 50PPFD 이상, 60PPFD 이상, 65PPFD 이상, 70PPFD 이상, 75PPFD 이상, 80PPFD 이상, 85PPFD 이상, 90PPFD 이상, 또는 95PPFD 이상의 광량으로 실시할 수 있고, 100PPFD 이하, 95PPFD 이하, 90PPFD 이하, 85PPFD 이하, 80PPFD 이하, 75PPFD 이하, 70PPFD 이하, 65PPFD 이하, 60PPFD 이하, 55PPFD 이하, 50PPFD 이하, 45PPFD 이하, 40PPFD 이하, 또는 35PPFD 이하의 광량으로 실시할 수 있다. 바람직하게는 50 내지 70 PPFD의 광량으로 실시할 수 있다. 상기 단계 (3)에서의 광 처리량이 상기 범위 내일 때 배양근의 증식이 우수하며, 배양근 내 쿠메스트롤의 함량이 보다 증진될 수 있다.

일 구현예로서, 상기 단계 (3)의 광 조사는 명조건 및 암조건을 번갈아 가면서 실시할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 단계 (3)의 광 조사는, 14 내지 18 시간의 명조건 및 6 내지 10 시간의 암조건을 번갈아 가면서 교차 실시하는 것일 수 있으며, 명조건 및 암조건 각각의 지속 시간의 총 합이 24 시간일 수 있다.

예를 들어, 상기 명조건은 14 시간 이상, 15 시간 이상, 16 시간 이상 또는 17 시간 이상 동안 지속되고, 18 시간 이하, 17 시간 이하, 16 시간 이하 또는 15 시간 이하 동안 지속될 수 있다. 바람직하게는 15 내지 17 시간 동안 지속될 수 있다. 또한, 상기 암조건은 6 시간 이상, 7 시간 이상, 8시간 이상 또는 9 시간 이상 동안 지속되고, 10 시간 이하, 9 시간 이하, 8 시간 이하 또는 7 시간 이하 동안 지속될 수 있다. 바람직하게는 7 내지 9 시간 동안 지속될 수 있다. 상기 단계 (3)에서의 명조건 및 암조건의 지속 시간이 상기 범위 내일 때 배양근의 증식이 우수하며, 배양근 내 쿠메스트롤의 함량이 보다 증진될 수 있다.

본 발명은 일 측면에서, 상기 단계 (3)에서 콩 배양근에 물리적 외부 인자(elicitor)로서 광을 조사를 함에 따라 콩 배양근의 바이오매스와 배양근 내 쿠메스트롤의 함량을 증가시킬 수 있으며, 콩과 식물 배양근의 품질을 균일하게 유지하며 대량 생산하는 엑스플랜테이션 방법과 이러한 물리적 외부 인자로서의 광 조사의 기술적 특징을 접목함으로써, 쿠메스트롤의 수율이 현저히 향상되면서도 균일하게 유지될 수 있는 것이다.

일 구현예로서, 상기 배양 배지 내 질산암모늄(NH₄NO₃)의 농도는 650 mg/L 이상, 660 mg/L 이상, 700mg/L 이상, 740mg/L 이상, 760mg/L 이상, 800mg/L 이상, 825mg/L 이상, 850mg/L 이상, 900mg/L 이상, 1000mg/L 이상, 1200mg/L 이상 또는 1400mg/L 이상일 수 있고, 1500mg/L 이하, 1400mg/L 이하, 1200mg/L 이하, 1000mg/L 이하, 990mg/L 이하, 900mg/L 이하, 850mg/L 이하, 825mg/L 이하, 800mg/L 이하, 760mg/L 이하, 740mg/L 이하, 700mg/L 이하 또는 660mg/L 이하일 수 있다.

일 구현예로서, 상기 배양 배지 내 염화칼슘(CaCl₂·2H₂O)의 농도는 175mg/L 이상, 176mg/L 이상, 190mg/L 이상, 200mg/L 이상, 220mg/L 이상, 240mg/L 이상, 260mg/L 이상, 264mg/L 이상, 270mg/L 이상, 280mg/L 이상, 300mg/L 이상, 350mg/L 이상 또는 380mg/L 이상일 수 있고, 400mg/L 이하, 380mg/L 이하, 350mg/L 이하, 300mg/L 이하, 280mg/L 이하, 270mg/L 이하, 264mg/L 이하, 260mg/L 이하, 240mg/L 이하, 220mg/L 이하, 200mg/L 이하, 190mg/L 이하 또는 176mg/L 이하일 수 있다.

일 구현예로서, 상기 배양 배지 내 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O)의 농도는 145mg/L 이상, 148mg/L 이상, 150mg/L 이상, 160mg/L 이상, 180mg/L 이상, 185mg/L 이상, 190mg/L 이상, 200mg/L 이상, 215mg/L 이상, 222mg/L 이상, 240mg/L 이상, 280mg/L 이상 또는 300mg/L 이상일 수 있고, 320mg/L 이하, 300mg/L 이하, 280mg/L 이하, 240mg/L 이하, 222mg/L 이하, 215mg/L 이하, 200mg/L 이하, 190mg/L 이하, 185mg/L 이하, 180mg/L 이하, 160mg/L 이하, 150mg/L 이하 또는 148mg/L 이하일 수 있다.

일 구현예로서, 상기 배양 배지 내 인산칼륨(KH₂PO₄)의 농도는 65 mg/L 이상, 68mg/L 이상, 70mg/L 이상, 75mg/L 이상, 80mg/L 이상, 85mg/L 이상, 90mg/L 이상, 95mg/L 이상, 100mg/L 이상, 102mg/L 이상, 120mg/L 이상 또는 140mg/L 이상일 수 있고, 150　mg/L 이하, 140mg/L 이하, 120mg/L 이하, 110mg/L 이하, 102mg/L 이하, 100mg/L 이하, 95mg/L 이하, 90mg/L 이하, 85mg/L 이하, 80mg/L 이하, 75mg/L 이하, 70mg/L 이하 또는 68mg/L 이하일 수 있다.

일 구현예로서, 상기 배양 배지 내 질산칼륨(KNO₃)의 농도는 750mg/L 이상, 760mg/L 이상, 800mg/L 이상, 850mg/L 이상, 900mg/L 이상, 950mg/L 이상, 1000mg/L 이상, 1140mg/L 이상, 120mg/L 이상 또는 1400mg/L 이상일 수 있고, 1500mg/L 이하, 1400mg/L 이하, 1300mg/L 이하, 1140mg/L 이하, 1000mg/L 이하, 980mg/L 이하, 950mg/L 이하, 900mg/L 이하, 850mg/L 이하, 800mg/L 이하 또는 760mg/L 이하일 수 있다.

일 구현예로서, 상기 배양 배지는 MS 배지(Murashige and Skoog medium)일 수 있다. 구체적으로, 배지 내 무기물의 농도에 따라, 0.25 MS 배지, 0.5 MS 배지, 0.75 MS 배지, 1 MS 배지, 1.5 MS 배지 또는 2 MS 배지를 사용할 수 있다.

일 구현예로서, 상기 단계 (1)에서의 종자 배양 배지는 수크로오스를 배지 전체 부피를 기준으로 10 내지 100 g/L 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 수크로오스의 농도는 배양배지 전체 부피를 기준으로 10 g/L 이상, 20 g/L 이상, 21 g/L 이상, 22 g/L 이상, 23 g/L 이상, 24 g/L 이상, 25 g/L 이상, 26 g/L 이상, 27 g/L 이상, 28 g/L 이상, 29 g/L 이상 또는 30 g/L 이상일 수 있다. 또한, 상기 수크로오스의 농도는 배양배지 전체 부피를 기준으로 100 g/L 이하, 80 g/L 이하, 60 g/L 이하, 50 g/L 이하, 40 g/L 이하, 39 g/L 이하, 38 g/L 이하, 37 g/L 이하, 36 g/L 이하, 35 g/L 이하, 34 g/L 이하, 33 g/L 이하, 32 g/L 이하, 31 g/L 이하 또는 30 g/L 이하일 수 있다. 단계 (1)에서 수크로오스의 농도가 상기 범위 내일 때 기내 식물체의 유도율이 우수하다.

일 구현예로서, 상기 단계 (1)의 기내 식물체 유도는 명조건에서 유도할 수 있다.

일 구현예로서, 상기 단계 (1)의 기내 식물체 유도는 1일 내지 25일 동안 유도할 수 있다. 구체적으로, 상기 단계 (1)의 기내 식물체 유도 기간은 1일 이상, 1.5일 이상, 2일 이상, 2.5일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 14일 이상 또는 15일 이상일 수 있다. 또한, 25일 이하, 24일 이하, 23일 이하, 22일 이하, 21일 이하, 20일 이하, 19일 이하, 18일 이하, 17일 이하 또는 16일 이하일 수 있다.

일 구현예로서, 상기 단계 (2)에서는 상기 유도된 기내 식물체의 유근으로부터 배양근을 유도하는 것일 수 있다.

일 구현예로서, 상기 단계 (2)에서의 식물체 배양 배지는 IBA(Indole-3-Butyric Acid) 및 NAA(Naphthalene Acetic Acid) 중 어느 하나 이상을 배양 배지 전체 부피를 기준으로 0.1 내지 10 mg/L 포함하며, 수크로오스를 배양 배지 전체 부피를 기준으로 10 내지 100 g/L 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 IBA 또는 NAA의 농도는 배양 배지 전체 부피를 기준으로 0.1 mg/L 이상, 0.5mg/L 이상, 1mg/L 이상, 2mg/L 이상, 3mg/L 이상, 3.5mg/L 이상, 3.6mg/L 이상, 3.7mg/L 이상, 3.8mg/L 이상, 3.9mg/L 이상, 4mg/L 이상 또는 5mg/L 이상일 수 있다. 또한, 상기 IBA 또는 NAA의 농도는 배양 배지 전체 부피를 기준으로 10mg/L 이하, 9 mg/L 이하, 8 mg/L 이하, 7 mg/L 이하, 6 mg/L 이하, 5 mg/L 이하, 4.5 mg/L 이하, 4.3 mg/L 이하, 4.1 mg/L 이하, 3.5 mg/L 이하 또는 3 mg/L 이하일 수 있다.

다른 구현예로서, 상기 단계 (2)에서의 식물체 배양 배지는 IBA(Indole-3-Butyric Acid)를 배양 배지 전체 부피를 기준으로 2 내지 8 mg/L 포함할 수 있다. 구체적으로, IBA를 배양 배지 전체 부피를 기준으로 2mg/L 이상, 3mg/L 이상, 3.6mg/L 이상, 3.7mg/L 이상, 3.8mg/L 이상, 3.9mg/L 이상, 4mg/L 이상 또는 5mg/L 이상 포함할 수 있으며, 또한, 8 mg/L 이하, 7 mg/L 이하, 6 mg/L 이하, 5 mg/L 이하, 4.5 mg/L 이하, 4.3 mg/L 이하, 4.1 mg/L 이하, 3.5 mg/L 이하 또는 3 mg/L 이하 포함할 수 있다.

한편, 상기 단계 (2)에서의 식물체 배양 배지 내 수크로오스의 농도는 상기 단계 (1)의 종자 배양 배지에서의 농도와 동일하게 포함할 수 있다.

일 구현예로서, 상기 단계 (3)에서의 배양근 배양 배지는 IBA(Indole-3-Butyric Acid)를 배양 배지 전체 부피를 기준으로 3 내지 5 m/L 포함하며, 수크로오스를 배양 배지 전체 부피를 기준으로 10 내지 100 g/L 포함할 수 있다.

구체적으로 상기 IBA를 배양 배지 전체 부피를 기준으로 3mg/L 이상, 3.6mg/L 이상, 3.7mg/L 이상, 3.8mg/L 이상, 3.9mg/L 이상, 4mg/L 이상 또는 4.5mg/L 이상 포함할 수 있으며, 또한, 5mg/L 이하, 4.5mg/L 이하, 이하, 4mg/L 이하, 3.9mg/L 이하, 3.8mg/L 이하, 3.7mg/L 이하, 3.6mg/L 이하 또는 3.5 mg/L 이하 포함할 수 있다. 또한 상기 수크로오스의 농도는 상기 단계 (1)의 종자 배양 배지에서의 농도와 동일하게 포함할 수 있다.

일 구현예로서, 상기 단계 (3)에서의 배양 배지는 0.5 내지 1.5 MS 배지일 수 있다. 구체적으로, 상기 단계 (3)에서의 배양 배지는 무기물 농도에 따라 0.5 MS 배지, 0.6 MS 배지, 0.7 MS 배지, 0.75 MS 배지, 0.8 MS 배지, 0.9 MS 배지, 1.0 MS 배지 또는 1.5 MS 배지일 수 있다.

일 구현예로서, 상기 단계 (3)에서 상기 유도된 배양근을 배양 배지에 위치시킬 때의 배지의 pH는 4.8 내지 6.8일 수 있다. 구체적으로, 상기 pH는 4.8이상, 5이상, 5.2이상, 5.4이상, 5.6이상, 5.8이상, 6.0이상, 6.2이상, 6.4이상, 또는 6.6이상일 수 있다. 또한, 상기 pH는 6.8이하, 6.6이하, 6.4이하, 6.2이하, 6.0이하, 5.8이하, 5.6이하, 5.4이하, 5.2이하, 5.0이하일 수 있다.

일 구현예로서, 상기 단계 (3)에서 상기 유도된 배양근을 배양 배지에 위치시킬 때의 접종 밀도는 2 내지 6 g/L일 수 있다. 구체적으로, 상기 밀도는 2g/L이상, 3g/L이상, 4g/L이상, 또는 5g/L이상일 수 있다. 또한, 상기 밀도는 6g/L이하, 5g/L이하, 4g/L이하, 또는 3g/L이하일 수 있다.

일 구현예로서, 상기 단계 (3)은 19 내지 25℃에서 실시하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 온도는 19℃이상, 20℃이상, 21℃이상, 22℃이상, 23℃이상, 또는 24℃이상일 수 있다. 또한, 상기 온도는 25℃이하, 24℃이하, 23℃이하, 22℃이하, 21℃이하, 또는 20℃이하일 수 있다.

일 구현예로서, 상기 단계 (3)의 생물반응기는 스터드 탱크 리액터(Stirred Tank Reactor), 버블 컬럼 리액터(Bubble Column Reactor), 에어 리프트리액터(Air Lift Reactor), 플루다이즈드 베드 리액터(Fludized Bed Reactor), 픽스트/팩드 베드 리액터(Fixed/Packed Bed Reactor), 또는 타워 퍼멘터(Tower Fermenter)일 수 있고, 바람직하게는 벌브형 기포 생물반응기(Bulb Type bubble bioreactor)일 수 있다.

일 구현예로서, 상기 단계 (3)은 상기 생물반응기 내의 공기공급량을 일정하게 유지하며 실시하는 것이고, 상기 공기공급량은 0.05 내지 0.4 vvm(air volume/culture volume per min)일 수 있다. 구체적으로, 상기 생물반응기 내에서 일정하게 유지되는 공기공급량은 0.05vvm이상, 0.08vvm이상, 0.1vvm이상, 0.12vvm이상, 0.14vvm이상, 0.16vvm이상, 0.18vvm이상, 0.2vvm이상, 0.22vvm이상, 0.24vvm이상, 0.26vvm이상, 0.28vvm이상, 0.3vvm이상, 0.32vvm이상, 0.34vvm이상, 0.36vvm이상, 또는 0.38vvm 이상 일 수 있다. 또한, 상기 공기공급량은 0.4vvm이하, 0.38vvm이하, 0.36vvm이하, 0.34vvm이하, 0.32vvm이하, 0.3vvm이하, 0.28vvm이하, 0.26vvm이하, 0.24vvm이하, 0.22vvm이하, 0.2vvm이하, 0.18vvm이하, 0.16vvm이하, 0.14vvm이하, 0.12vvm이하, 0.1vvm이하, 0.08vvm이하, 또는 0.06vvm이하일 수 있다.

일 구현예로서, 상기 단계 (3)의 증식은 3 내지 5주간 실시하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 단계 (3)의 증식은 3주 이상 또는 4주 이상 실시하는 것일 수 있으며, 또한, 5주 이하 또는 4주 이하 실시하는 것일 수 있다.

본 발명은 다른 측면에서, 쿠메스트롤의 함량이 증가된 콩과 식물 배양근에 관한 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 콩과 식물 배양근은 쿠메스트롤을 건조된 배양근 전체 중량에 대하여 0.05 중량% 이상으로 함유할 수 있다. 일 구현예로서, 상기 콩과 식물 배양근은 쿠메스트롤을 건조된 배양근 전체 중량에 대하여 0.05 중량% 이상, 0.06 중량% 이상, 0.07 중량% 이상, 0.08 중량% 이상, 0.09 중량% 이상, 0.1 중량% 이상, 0.12 중량% 이상, 0.14 중량% 이상, 0.16 중량% 이상 또는 0.18 중량% 이상일 수 있으며, 또한, 1 중량% 이하, 0.9 중량% 이하, 0.8 중량% 이하, 0.7 중량% 이하, 0.6 중량% 이하, 0.5 중량% 이하, 0.4 중량% 이하, 0.3 중량% 이하 또는 0.2 중량% 이하일 수 있다. 다른 구현예로서, 상기 콩과 식물 배양근은 쿠메스트롤을 건조된 배양근 전체 중량에 대하여 0.05 내지 0.1 중량%의 양으로 함유할 수 있다.

일 구현예로서, 상기 콩과 식물 배양근은 본 발명의 일 측면에 다른 상기 쿠메스트롤의 함량이 증가된 콩과 식물 배양근 생산 방법에 의해 생산된 것일 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이러한 실시예 및 시험예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이러한 실시예 및 시험예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.

[제조예 1-1] 콩 종자발아 및 기내 식물체 유도

신화콩 종자(Glycine max)를 2중량% 치아염소산나트륨(Sodium Hypochlorite) 수용액으로 20분간 표면을 살균한 뒤 멸균수로 3회 세척하였다. 그 후 수크로오스 30g/L가 첨가된 0.5 MS 배지(Murashige and Skoog Medium, Haarlem, 네덜란드)를 이용하여 기내에서 25±1℃가 유지되는 명조건으로 2주간 식물체를 유도하였다.

[제조예 1-2] 콩 배양근 유도, 증식 및 광 조사

기내에서 발아된 식물체의 유근으로부터 IBA(indole-3-butyric acid, Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, 독일)와 NAA(Naphthalene Acetic Acid; Duchefa, 네덜란드)가 각각 4mg/L, 수크로오스 30g/L가 첨가된 1MS 배지에서 배양근을 유도하였으며, 기타 배양조건은 22±1℃가 유지되는 암조건으로 2주간 유지하였다. 그 뒤, 공기 용적이 3L인 벌브형(Bulb Type) 생물반응기(시중에서 일반적으로 입수 가능, 도 1 참조) 내에서 IBA(indole-3-butyric acid, Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, 독일) 4mg/L, 수크로스 30g/L가 첨가된 2L의 0.5 MS 배지(Murashige and Skoog medium, Duchefa, 네덜란드)를 이용하여 배양근을 4주간 증식시켰다. 이때 배지는 1N NaoH를 이용하여 pH 5.8로 조정 후 121℃, 1.2 기압에서 35분 간 멸균한 것을 사용하였으며, 상기 배양근을 1-1.5cm로 절단하여 생체중을 기준으로 4g/L 접종밀도로 배양근을 접종한 후 22±1℃가 유지되는 암조건에서 실시하였다. 공기공급량은 배양 전 기간 동안 에어플로우 미터(air flow meters, RMA series; Dwyer Instruments, Inc., 미국)를 이용하여 0.1vvm(air volume/culture volume per min)으로 일정하게 조절하였으며, 생물반응기 내부로 공급하는 공기는 일정한 온도 유지를 위하여 압축공기를 응축시킬 수 있는 공기응축기와 불순물을 제거할 수 있는 필터 및 공기 건조기 등을 순차적으로 통과시킨 후 기름을 사용하지 않는 공기 압축기를 이용하여 생물반응기 내부로 공급하였다.

또한, 광 처리는 수확일, 즉, 증식 완료 시점인 배양 4주 후를 기준으로 수확 전 0일(대조군), 3일, 7일, 14일 및 28일 간 처리하였으며, 형광등(모델명: OSRAM FHF32W/865, 제조사: OSRAM GmbH 社, 중국)을 60PPFD(Photosynthesis Photon Flux Density)의 광량으로 처리하였고, 16시간의 명조건 및 8시간의 암조건을 번갈아 가면서 실시하였다.

상기와 같은 생물반응기 등을 사용할 경우의 광 조사 기간에 따른 콩 배양근이 증식하는 모습은 도 1과 같고, 이 경우 광을 처리하지 않은 경우에 비하여 광을 처리한 경우 콩 배양근의 바이오매스 생산량 및 쿠메스트롤의 함량이 증가할 수 있음을 성분 분석 등을 통해 확인하였다.

[시험예 1] 광 조사에 따른 콩 배양근의 바이오매스 생산량 분석

상기 제조예 1-1 및 1-2에 따라 4주간 배양 후, 생물 반응기로부터 수확한 콩 배양근을 흡습지를 이용하여 여분의 수분을 제거한 다음 생체중(fresh weight, g/L)을 측정하였으며, 생체중을 측정한 콩 배양근을 60℃로 고정시킨 열풍 건조기에서 48시간 건조 후 건물중(dry weight, g/L)을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었으며, 광 노출기간은 광 조사 기간으로서, 수확일을 기준으로 수확 전 광 조건 아래에서 배양한 기간을 의미한다.

광 노출기간(일)	생체중(g/L)	건물중(g/L)	건물중 비율(%)
0 (대조군)	60.2±0.56	5.1±0.02	8.4±0.11
3	61.1±0.44	5.2±0.06	8.5±0.03
7	67.2±1.31	5.7±0.06	8.5±0.08
14	70.6±0.35	6.4±0.11	9.0±0.11
28	71.3±0.36	7.0±0.08	9.9±0.16

상기 표 1의 결과로부터, 60PPFD의 광량으로 수확 전 14일간 광 조사 시, 암배양(대조군) 조건에 비하여 콩 배양근의 건물 생산성이 25% 이상 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 특히, 수확 전 28일간 광 조사 시, 암배양 조건에 비하여 콩 배양근의 건물 생산성이 37% 이상 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명에 따라 콩 배양근을 광 처리 하에 배양할 경우 암조건으로 배양하는 경우에 비하여 콩 배양근의 바이오매스, 특히 건물 생산성이 크게 증가하는 것을 확인할 수 있다.

[시험예 2] 광 조사에 따른 쿠메스트롤 생산성 분석

상기 제조예 1-1 및 1-2에 따라 4주간 배양 후 생물반응기로부터 수확하여 건조시킨 콩 배양근을 80%(w/v) 에탄올 수용액에 콩 배양근:에탄올 수용액 중량비율이 1:30이 되도록 침지하여 상온에서 24시간 추출하였다. 추출액은 여과지를 이용하여 여과한 다음 용매를 증발 건조시켜 분말을 수득한 후, 1% 용액으로 희석하여 최종 추출물을 조제하였다. 배양근 내 쿠메스트롤의 함량은 추출액 2mL를 0.45μm Filter로 여과한 다음 UV detector가 장착된 High Performance Liquid Chromatography(HPLC)에 10μL씩 주입하며 분석하였다. 컬럼은 Mightysil RP-18 GP 250-4.6 (5 μm, KANTO CHEMICALS, JAPAN)을 사용하였으며, 추출물 내 쿠메스트롤 함량은 342nm 파장에서 측정하였다. 측정 결과는 하기 표 2 및 도 2에 나타내었다.

하기 표 2는 광 처리를 하지 않은 경우(대조군) 및 수확일을 기준으로 수확 전 28일 동안 광 조건 아래에서 배양한 경우의 콩 배양근 추출물 내 쿠메스트롤 함량을 비교한 것이다. 표 1에서 수율이라 함은 콩 배양근 투입 중량 대비 상기 대조군 추출물 및 광 처리 군의 추출물의 중량을 각각 백분율(%)로 나타낸 것이다.

광 노출기간(일)	수율(%)	쿠메스트롤
광 노출기간(일)	수율(%)	쿠메스트롤 평균 함량 (mg/g DW)	총 생산량 (mg/L)
0 (대조군)	32.9±1.55	0.65±0.01	3.3±0.05
28	37.1±1.88	0.97±0.05	6.8±0.38

(상기 표 2에서, 총 생산량(mg/L) = 각 처리군의 평균 건물중(mg/L) x 쿠메스트롤의 평균 함량(mg/g DW) 이다.)

또한, 도 2는 광 처리를 하지 않은 경우(대조군) 및 수확일을 기준으로 수확 전 28일 동안 광 조건 아래에서 배양한 경우의 콩 배양근 추출물 내 쿠메스트롤에 대해 HPLC 크로마토그램으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

상기 표 2 및 도 2의 결과로부터, 60PPFD의 광량으로 수확 전 28일간 광 조사 시, 암배양(대조군) 조건에 비하여 쿠메스트롤 생산성이 100% 이상 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

아울러, 생물반응기 등을 사용할 경우, 노지나 야외에서 재배한 통상의 콩(종자, 식물체 유래) 추출물과는 달리, 연중 균일한 품질의 콩 배양근 추출물을 생산할 수 있으므로, 그러한 엑스플랜테이션 기술을 광 조사 배양과 접목시키면, 이러한 고함량의 쿠메스트롤을 균일하고도 지속적으로 생산할 수 있음을 알 수 있다.

Claims

쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과 식물 배양근의 생산 방법으로서,
(1) 콩과 식물 종자를 종자 배양 배지에서 발아시켜 기내 식물체를 유도하는 단계;
(2) 상기 유도된 기내 식물체를 식물체 배양 배지에서 배양하여 배양근을 유도하는 단계; 및
(3) 상기 유도된 배양근을 생물반응기 내의 배양근 배양 배지에 위치시켜 광 조사 조건 하에서 증식시키는 단계를 포함하며,
상기 단계 (3)의 광 조사는 수확일을 기준으로 수확 전 17일 내지 35일 간 실시하는, 방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 단계 (3)의 광 조사는 30 내지 100 PPFD(Photosynthesis Photon Flux Density)의 광량으로 실시하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (3)의 광 조사는 명조건 및 암조건을 번갈아 가면서 실시하는 것인, 방법.
제4항에 있어서,
상기 단계 (3)의 광 조사는 14 내지 18 시간의 명조건 및 6 내지 10 시간의 암조건을 번갈아 가면서 실시하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 콩과 식물은 대두, 납작콩, 서리태, 서목태, 흑태, 청태, 황태, 울타리콩, 적두, 거두 또는 신화콩 중에서 선택된 어느 하나인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (1) 내지 (3)의 배양 배지 내 질산암모늄(NH₄NO₃)의 농도는 650 내지 1500 mg/L이고, 염화칼슘(CaCl₂·2H₂O)의 농도는 175 내지 400 mg/L이며, 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O)의 농도는 145 내지 320 mg/L이고, 인산칼륨(KH-₂PO₄)의 농도는 65 내지 150 mg/L이며, 질산칼륨(KNO₃)의 농도는 750 내지 1500 mg/L인, 방법.
제7항에 있어서,
상기 단계 (1) 내지 (3)의 배양 배지는 MS 배지(Murashige and Skoog medium)인, 방법.
제7항에 있어서,
상기 단계 (1)에서의 종자 배양 배지는 수크로오스를 배지 전체 부피를 기준으로 10 내지 100 g/L 포함하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (2)에서는 상기 유도된 기내 식물체의 유근으로부터 배양근을 유도하는 것인, 방법.
제7항에 있어서,
상기 단계 (2)에서의 식물체 배양 배지는 IBA(Indole-3-butyric Acid) 및 NAA(Naphthalene Acetic Acid) 중 어느 하나 이상을 배양 배지 전체 부피를 기준으로 0.1 내지 10 mg/L 포함하며, 수크로오스를 배양 배지 전체 부피를 기준으로 10 내지 100 g/L 포함하는, 방법.
제7항에 있어서,
상기 단계 (3)에서의 배양근 배양 배지는 IBA(Indole-3-butyric Acid)를 배양 배지 전체 부피를 기준으로 3 내지 5 mg/L 포함하며, 수크로오스를 배양 배지 전체 부피를 기준으로 10 내지 100 g/L 포함하는, 방법.
제8항에 있어서,
상기 단계 (3)에서의 배양근 배양 배지는 0.5 내지 1.5 MS 배지인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (3)에서 상기 유도된 배양근을 배양근 배양 배지에 위치시킬 때의 배지의 pH는 4.8 내지 6.8인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (3)에서 상기 유도된 배양근을 배양근 배양 배지에 위치시킬 때의 접종 밀도는 2 내지 6 g/L인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (3)은 19 내지 25℃에서 실시하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (3)의 생물반응기는 벌브형 기포 생물반응기(Bulb Type bubble bioreactor)인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (3)은 상기 생물반응기 내의 공기공급량을 일정하게 유지하며 실시하는 것이고, 상기 공기공급량은 0.05 내지 0.4 vvm(air volume/culture volume per min)인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (3)의 증식은 3 내지 5주간 실시하는 것인, 방법.
제1항, 제3항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과 식물 배양근.
제20항에 있어서,
상기 콩과 식물 배양근은 쿠메스트롤을 건조된 배양근 전체 중량에 대하여 0.05 중량% 이상으로 함유하는, 콩과 식물 배양근.
삭제