KR100706279B1

KR100706279B1 - 쿠메스트롤을 함유한 비만 개선 및 예방용 조성물

Info

Publication number: KR100706279B1
Application number: KR1020050108080A
Authority: KR
Inventors: 이소현; 신의석; 조시영; 염명훈; 박찬웅; 이태룡; 이병곤; 장이섭
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2005-11-11
Filing date: 2005-11-11
Publication date: 2007-04-12

Abstract

본 발명은 쿠메스트롤을 함유하여 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제1A(Carnitine Palmitoyl Transferase1A) 유전자 발현을 촉진시킴으로써 지방산 베타 산화를 증가시키는 비만 개선 및 예방용 의약 조성물과 비만 개선 및 예방용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 비만 개선 및 예방용 의약 조성물과 비만 개선 및 예방용 식품 조성물은 쿠메스트롤을 함유하여 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제1A의 발현을 세포 독성 없이 효과적으로 증가시킴으로써, 세포질 내 지방산이 미토콘드리아 내로 이동하는 것을 촉진하여 결과적으로 지방산의 베타 산화 증가에 도움이 된다. 따라서 본 발명에 의한 쿠메스트롤을 함유한 비만 개선용 조성물은 체지방의 과도한 축적을 예방 또는 개선하는데 도움이 된다.

쿠메스트롤, 제니스테인, 다이드제인, CPT1A, 지방산, 베타 산화

Description

쿠메스트롤을 함유한 비만 개선 및 예방용 조성물{Medicine and Food Compositions for Improvement of Obesity}

도 1은 CPT1A 프로모터-루시퍼라제 융합 구조물을 함유하는 단일 세포에서의 대두 추출물과 콩나물 추출물 에틸아세테이트(Ethyl acetate) 층에 의한 루시퍼라제 활성 증가를 나타내는 그래프이다.

도 2는 CPT1A 프로모터-루시퍼라제 융합 구조물을 함유하는 단일 세포에서의 쿠메스테롤에 의한 루시퍼라제 활성 증가를 나타내는 그래프이다.

도 3은 쿠메스트롤에 의한 HepG2 세포주에서의 CPT1A 발현 증가를 mRNA 수준에서 나타내는 그래프이다.

도 4는 쿠메스트롤에 의한 HePG2에서의 CPT1 효소의 활성 증가를 나타내는 그래프이다.

도 5는 쿠메스트롤에 의한 HepG2 세포주에서의 지방산 베타 산화 증가를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 쿠메스트롤을 함유하여 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제1A(Carnitine Palmitoyl Transferase1A) 유전자 발현을 촉진시킴으로써 지방산 베타 산화를 증가시키는 비만 개선 및 예방용 의약 조성물과 비만 개선 및 예방용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 비만 개선 및 예방용 의약 조성물과 비만 개선 및 예방용 식품 조성물은 쿠메스트롤을 함유하여 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제1A의 발현을 세포 독성 없이 효과적으로 증가시킴으로써, 세포질 내 지방산이 미토콘드리아 내로 이동하는 것을 촉진하여 결과적으로 지방산의 베타 산화 증가에 도움이 된다. 따라서 본 발명에 의한 쿠메스트롤을 함유한 비만 개선 및 예방용 의약 조성물과 비만 개선 및 예방용 식품 조성물은 체지방의 과도한 축적을 예방 또는 개선하는데 도움이 된다.

카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제1A(Carnitine Palmitoyl Transferase1A, 이하 ‘CPT1A’라 한다)는 간세포에서 발현되는 단백질로 세포 내 미토콘드리아에 위치하여 세포질 내의 지방산을 베타 산화의 장소인 미토콘드리아 내로 이동시키는 기능을 한다고 보고되었다(Mamm.Genome 9, 608-610;J Biochem 119, 533;PNAS 92, 1984;Genomics 40, 209-211). 상기 CPT1A는 미토콘드리아 외막의 접촉부(contact sites)에 존재하며, 아세틸 Co-A 카복실라아제 2(acetyl Co-A carboxylase 2)에 의해 그 활성이 조절되는 CPT1A는 지방산의 베타 산화과정의 속도 결정 단계 효소이고, 세포 및 조직에 따라 서로 다른 이소타입의 발현이 보고되었다(Mamm.Genome 9, 608-610;J Biochem 119, 533;PNAS 92, 1984;Genomics 40, 209-211).

장기적인 금식으로 유발되는 지방산의 베타 산화와 케톤 형성은 간에서의 지방산 대사의 중요한 부분으로, 저장된 글루코겐의 고갈과 함께 지방세포 내에 축적되어 있는 자유 에너지를 중추신경이 사용 가능한 케톤체로 변화시키는 과정이다. 금식 동안 간세포에 의한 지방산의 베타 산화는 최고치에 도달하게 되고, 미토콘드리아의 옥살로아세테이트의 양이 줄어들어 크렙스사이클 활성이 제한되고, 결과적으로 베타 산화에 의해 생성된 아세틸 Co-A가 케톤체 형성에 투입되었다(Biochem Biophys Acta 1092:277-283). 금식 동안 지방산 베타 산화의 활성은 일차적으로 CPT1A의 활성 증가에 의해 일어나며, 상기 CPT1A 효소에 의해 매개되어 미토콘드리아 내부로의 지방산 이동은 지방산 베타 산화의 속도 결정 단계로 보고되었다(Proc Natl Acad Sci USA 72:4385-4388: J Bio Chem 259:12030-12033).

CPT1A 효소 활성은 알로스테릭 저해제인 말로닐 Co-A의 세포질 내에서의 농도, L-카르니틴의 세포질 농도에 의해 조절됨이 보고되었다(Proc Natl Acad Sci USA 72:4385-4388: J Bio Chem 254:8163-8168). 상기 말로닐 Co-A는 아세틸 Co-A 카복실라아제에 의해 생성되는 것으로, 크렙스사이클의 산물인 시트릭산으로부터 생성된 아세틸 Co-A가 그 기질로 작용하며, 상기의 조절 기작을 통하여 CPT1A의 활성에 의한 지방산의 베타 산화 진행이 세포 내의 ATP 합성 요구에 의해 조절된다. 간세포 내의 L-카르니틴은 정상 식이 동안 매우 낮은 농도이므로, CPT1A의 활성을 유도하지 못하나, 장기 금식 동안에는 골격근 내의 L-카르니틴이 간세포 내로 이동 하여 간세포 내 L-카르니틴의 농도가 급격히 증가함으로써, CPT1A의 활성 유도와 이로 인한 지방산의 베타 산화를 증가시키게 된다(Biochem J 310:853-858).

상기 CPT1A 효소의 활성 증가 이외에, CPT1A 유전자 발현의 유도에 따른 CPT1A의 양적 증가도 지방산의 베타 산화를 유도할 수 있는데, CPT1A 유전자 발현은 인슐린, 글루카곤과 같은 생체 내의 호르몬에 의해 일차적으로 조절되며, 금식 시 체내 글루카곤의 증가와 인슐린의 감소로 인하여 CPT1A 유전자 발현의 증가를 유도한다(Biochem J 310:853-858). 그 외 생선유의 주된 오메가-3 성분인 eicopentaenoic acid(EPA)는 정확한 기작은 알려져 있지 않지만, CPT1A의 발현을 증가시킴으로서, 지방산의 베타 산화를 증가시킨다고 보고 되었고(Metabolism 48:1303-1313), PPAR-α를 활성화시키는 피브레이트 약물 또한 CPT1A 유전자의 발현을 증가시킨다고 보고 되었다(J Lipid Res 38:1851-1858).

따라서 섭취된 지방의 축적을 저해하고 연소를 활성화 시키는 방법으로, 지방산의 베타 산화 속도를 결정하는 주요 효소인 CPT1A의 발현을 조절함으로서 지방산의 대사를 촉진시킬 수 있다. 그러나 CPT1A를 증가시켜 지방의 연소를 증가시키고 비만을 억제하는 방법에 대한 연구는 아직 미흡한 상태이다(McCarty, Medical Hypotheses 57(3):324-336, 2001).

한편, 쿠메스트롤은 주로 콩과(leguminosae), 국화과(compositae) 식물의 씨 앗, 뿌리 그리고 잎에서 발견되는 물질로서 이소플라보노이드(isoflavonoid)의 일종으로 일반적으로는 쿠메스탄(coumestan)계열 화합물로 분류되고 있다. 쿠메스트롤은 일반 콩에는 거의 없거나 아예 없는 성분으로, 콩을 발아시킬 때 비로소 생성되며(Food Sci. Biotechnol., 12(3), 278-284, 2003), 초기 발아일이 증가함에 따라 그 함량도 증가하는 것으로 알려져 있다(J Agric Food Chem., 48(6), 2167-2172, 2000). 또한 쿠메스트롤은 제니스테인보다 더욱 강력한 에스트로겐 리셉터(estrogen receptor, 이하 ER이라 한다) 결합능을 갖는 것으로 알려져 있다(J Steroid Biochem Mol Biol., 91(3), 99-109, 2004). 그러므로 ER-α 혹은 ER-β에 대한 친화도의 차이는 있을지라도, 쿠메스트롤의 경우에도 제니스테인과 유사한 생리활성을 나타낼 것으로 생각되어 각종 연구가 진행, 보고 되고 있다. 또한 쿠메스트롤은 온화한 항산화 효과를 가지고 있어, 식물이 외부 상처를 입었을 때 항균, 항진균 및 항바이러스 작용을 하여 감염을 방지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Darbarwar, M., et al., J. Sic. Ind. Res., 35, 297(1982); Jeffrey, B. H., et al., Phytochemical Dictionary, Taylor&Francis, London, pp418(1933)). 또한 정확한 메카니즘은 알려져 있지 않지만, 피부 및 장기 조직의 콜라겐 등의 결합조직 생성을 촉진시키는 것으로 알려져 있어 조직학적 측면에서 노화 혹은 주름 생성 억제 효과가 있는 것으로 추정된다(Bickoff, E. M., et al., J. Anim. Sic., 19, 4(1960)).

또한 일본특허 평5-286865호에서는 쿠메스트롤을 함유하는 자주개나리 추출물을 이용하여 심혈관계 질환 및 심근경색의 가장 중요한 위험인자인 콜레스테롤과 중성지방의 혈중 지방 농도를 감소시킨 제제 조성물에 대해 기재하였고, 대한민국특허 제 10-2002-0000980호에는 쿠메스트롤을 합성한 후 페룰산과 상기 합성된 쿠메스트롤을 에스테르 결합을 시켜 강력한 항산화 작용을 가지면서 피부 결합조직 부활을 촉진시켜 피부 노화 방지 작용과 피부 미백 작용을 나타내는 3, 9-디페룰릴쿠메스트롤을 합성하여, 상기 3, 9-디페룰릴쿠메스트롤을 함유하는 피부 화장료에 대해 기재하였다.

그러나 상기의 종래 발명에서는 쿠메스트롤이 CPT1A 유전자의 발현을 증가시킴으로서 지방산의 베타 산화를 증가시켜, 체지방의 과도한 축적을 예방하거나 감소시키는 것에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 CPT1A의 활성과 발현 조절에 대해 세포 수준에서의 기초연구를 바탕으로, CPT1A 발현을 촉진시키는 화합물의 검색을 위한 ‘CPT1A 유전자의 발현을 특이적으로 전사단계에서 조절하는 화학물질의 스크린닝 방법’을 이용하여, 콩나물 추출물의 에틸아세테이트(Ethyl acetate, 이하 EtOAc라 한다) 층 분획물이 콩 추출물의 EtOAc 층 분획물 보다 더 높은 CPT1A 유전자 발현 증가능이 나타내는 사실을 발견하였고, 최종적으로 그 원인 성분이 쿠메스트롤임을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 CPT1A 유전자의 발현을 증가시킴으로써 지방산의 베타 산화를 효과적으로 촉진시켜 체지방의 과도한 축적을 예방하거나 감소시키는 비만 개 선 및 예방용 의약 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 CPT1A 유전자의 발현을 증가시킴으로써 지방산의 베타 산화를 효과적으로 촉진시켜 체지방의 과도한 축적을 예방하거나 감소시키는 비만 개선 및 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서는 지방산 산화 작용의 속도 제한 효소인 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제1A(CPT1A) 유전자의 발현을 증가시키는 쿠메스트롤을 함유하고 있어 체지방의 과도한 축적을 예방하거나 개선시키는 비만 개선 및 예방용 의약 조성물과 비만 개선 및 예방용 식품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

지방의 구성 성분인 지방산은 세포 내로 들어가 베타 산화, TCA 사이클 및 산화적 인산화 반응을 거치면서 다량의 산소를 사용해 ATP를 생산하고, 에너지로 이용하기 쉬운 형태가 된다. 그러나 지방산은 큰 분자이기 때문에 단독으로 미토콘드리아 막을 통과하는 것이 불가능하다. 혈중에서 세포기질(cytosol)로 들어오는 이러한 장쇄지방산(long chain fatty acid)은 다음과 같은 일련의 3가지 효소반응을 거쳐 미토콘드리아 내부로 들어올 수 있다.

1. 세포기질에 존재하는 장쇄지방산은 미토콘드리아 외막에 존재하는 아실-CoA 합성효소(acyl-CoA synthetase)에 의해 지방산 카르복실기(fatty acid carboxyl group)와 조효소 A(coenzyme A)의 티올기(thiol group) 사이에 티올 에스테르(thiol ester)결합을 형성한다. 이렇게 생성된 지방 아실 CoA(fatty acyl-CoA)는 아세틸-CoA처럼 고에너지 물질(high energy compound)의 특성을 갖는다.

2. 미토콘드리아 외막에서 형성된 지방 아실-CoA 에스테르는 내부의 미토콘드리아 막을 통과할 수 없기 때문에, 지방산을 미토콘드리아 내로 이동시키기 위해 미토콘드리아 내막의 바깥표면에 존재하는 CPT1A가 CoA에서 카르니틴으로 지방 아실기(fatty acyl group)의 transesterification을 촉매한다. 이렇게 생성된 지방 아실-카르니틴 에스테르(fatty acyl carnitine ester)는 아실-카르니틴/카르니틴 운반체(acyl-carnitine/carnitine transporter)를 통과하여 촉진 확산(facilitated diffusion)에 의해 내부 미토콘드리아막에서 매트릭스(matrix)로 이동된다.

3. 지방 아실-카르니틴(fatty acyl-carnitine)은 카르니틴 아실트랜스퍼라아제 II(carnitine acyltransferase II)에 의해 촉매되어 지방 아실-CoA로 전환된다.

이러한 3가지 단계를 거쳐 들어온 지방산은 베타-산화를 통해 아세틸-CoA로 전환되고 이것은 시트르산 사이클을 거쳐 최종 산물인 전자와 CO₂로 전환되며, 여기 에서 생긴 전자는 다시 호흡 연쇄(respiratory chain)과정을 거쳐 ATP를 생산하게 된다(Principles of Biochemistry 479-505 1993).

본 발명에서 사용하는 쿠메스트롤은 상기 지방 분해 대사를 촉진하기 위하여 CPT1A 유전자의 발현을 증가시키는 주요 활성 성분이며, 하기 화학식 1로 표시된다.

[화학식 1]

본 발명에서는 상기 쿠메스트롤을 함유하여 CPT1A 유전자의 발현을 촉진시킴으로써 결과적으로 지방산의 베타-산화를 증가시켜 체지방의 과도한 축적을 예방하거나 치료하는데 도움이 되는 비만 개선 및 예방용 의약 조성물과 비만 개선 및 예방용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 비만 개선 및 예방용 의약 조성물과 비만 개선 및 예방용 식품 조성물로 쿠메스트롤, 쿠메스트롤이 함유되어 있는 천연물 및 그의 추출물을 사 용하고 있으며, 상기 쿠메스트롤이 함유되어 있는 천연물로는 대두 완두 및 녹두로부터 선택되는 두류 및 이로부터 발아한 발아콩, 붉은 토끼풀, 자주개나리(알팔파) 또는 싹양배추 등이 있고, 쿠메스트롤이 함유되어 있는 천연물의 추출물은 상기 쿠메스트롤이 함유되어 있는 천연물을 70% 에탄올로 상온 냉침 혹은 온침하여 얻은 추출물을 완전히 농축한 후 다시 물에 분산하고 동량의 헥산, 다이클로로메탄, 클로르포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 에탄올, 메탄올 및 물로부터 선택되는 한가지 또는 두가지 이상의 용매로 분획하여 쿠메스트롤이 함유되어 있는 천연물의 추출물을 얻는다. 그러나 추출 방법이 이에 한정되는 것은 아니며 최종 추출물 중에 쿠메스테롤이 함유되도록 하는 모든 추출 방법을 사용할 수 있다.

또한 CPT1A 유전자의 발현을 촉진시킴으로써 결과적으로 지방산의 베타-산화를 증가시켜 체지방의 과도한 축적을 예방하거나 치료하는데 도움이 되는 쿠메스트롤, 쿠메스트롤이 함유되어 있는 천연물 및 그의 추출물을 함유하는 본 발명의 비만 개선 및 예방용 의약 조성물은 쿠메스트롤 이외에 통상적으로 사용하는 성분들을 적절하게 선정한 후 약제 제형으로 제형화 될 수 있다.

약제 제형으로 대두유, 팜유, 식물성 경화유, 황납, 레시틴, 갈락토올리고당 , 유당, 맥아당, 당 에스테르(sugar ester), 무수결정 포도당 및 전분 등의 통상적으로 사용되는 성분들과 통상적인 방법으로 정제, 캡슐제, 연질캡슐제, 환제 또는 과립제로 제형화 되며, 쿠메스트롤 함량은 9 내지 29 중량%로 함유된다.

또한 CPT1A 유전자의 발현을 촉진시킴으로써 결과적으로 지방산의 베타-산화를 증가시켜 체지방의 과도한 축적을 예방하거나 치료하는데 도움이 되는 쿠메스트롤, 쿠메스트롤이 함유되어 있는 천연물 및 그의 추출물을 함유하는 본 발명의 비만 개선 및 예방용 식품 조성물은 쿠메스트롤 이외에 통상적으로 사용하는 성분들을 적절하게 선정한 후 식품 제형으로 제형화 될 수 있다.

식품 제형으로는 포도당, 구연산, 액상 올리고당, 옥수수 시럽(corn syrup), 대두 레시틴, 버터, 식물성 경화유, 탈지우유, 설탕, 마가린, 식염, 전분, 밀가루, 물엿, 맥아당, 중조 및 당 에스테르 등의 통상적으로 사용되는 성분들과 통상적인 방법으로 드링크제, 다이어트바, 쵸콜렛, 캬라멜 제형 또는 과자류로 제형화 되며, 쿠메스트롤 함량은 전체 조성물에 대하여 0.02 내지 10 중량%로 함유된다.

이하, 시험예 및 제형예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명하지만 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다. 이들 시험예 및 제형예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 시험예 및 제형예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.

[시험예 1] 대두 추출물과 콩나물 추출물의 에틸아세테이트층 분획물의 CPT1A 프로모터(promoter) 활성 분석

(1단계) 세포주와 세포 배양

CPT1A 프로모터-루시퍼라아제 융합 유전자를 함유하는 Huh7 세포주를 10% 우 혈청(fetal calf serum)을 함유한 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 37℃의 배양온도로 5%이산화탄소 배양기에서 수행하였다.

(2단계)

상기 1 단계에서 배양된 세포주를 각각 트립신 처리하여 단일세포 현탁액을 만들고 96 well plate에서 24시간 배양하였다. 그 후 우혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지를 처리하여 24시간 동안 배양한 후 우혈청이 포함되지 않은 배지에 대두 추출물과 콩나물 추출물의 에틸아세테이트층 분획물을 50 ppm 농도로 각각 세포에 24시간 처리한 후 promega사의 Luciferase assay kit을 이용해 발현되는 루시퍼라아제의 활성을 측정함으로써, 프로모터의 활성을 측정할 수 있었다. CPT1A 프로모터의 활성 분석을 해 본 결과, 도 1에서 보여지는 바와 같이, 대두 추출물과 콩나물 추출물의 에틸아세테이트층 분획물을 각각 처리하였을 때에 루시퍼라아제 활성 효과는 대조군에 비하여 각각 2배와 2.7배정도 증가하였다. 따라서 콩나물 추출물 에틸아세테이트층 분획물이 대두 추출물 에틸아세테이트층 분획물보다 더 우수한 CPT1A 프로모터 활성 증가능을 보유한 것을 알 수 있었다.

콩나물의 경우 일반 콩과는 다르게 발아에 의해 쿠메스트롤이 생성 및 증가한다는 사실(Food Sci. Biotechnol., 12(3), 278-284, 2003)을 고려하여 시그마에서 쿠메스트롤을 구입하여 이의 활성을 확인해 보기로 하였다.

[시험예 2] 쿠메스트롤의 CPT1A 프로모터 활성 분석

상기 시험예 1과 동일한 방법으로 10, 50μM의 쿠메스트롤의 CPT1A 프로모터 활성 분석을 해 본 결과, 도 2에서 보여지는 바와 같이, 대조군에 비하여 각각 2.6배와 3.3배의 루시퍼라아제 활성 증가 효과를 나타내고 있고, 10μM의 쿠메스트롤은 기존의 유효 성분인 제니스테인 10μM과 비슷한 정도의 효과를 갖고 있음을 알 수 있었다.

[시험예 3] 쿠메스트롤에 의한 HepG2에서의 CPT1A mRNA 합성 증가

(1단계) 세포주와 세포 배양

인체 간암 세포주(human hepatoma cell line)인 HePG2를 10% 우혈청(fetal calf sefum)을 함유한 DMEM 배지(Dulbecco's modifided Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 37℃의 배양온도로 5%이산화탄소 배양기에서 수행하였다.

(2단계) 쿠메스트롤에 의한 CPT1A mRAN 합성 증가

상기 1 단계에서 배양된 세포주를 각각 트립신 처리하여 단일세포 현탁액을 만들고 T75 플라스크에 1x10⁶개씩 분주하여 24시간 배양하였다. 그 후 우혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지를 처리하여 24시간 동안 배양한 후 우혈청이 포함되지 않은 배지에 10, 50μM 농도의 쿠메스트롤을 녹여 처리한다. 쿠메스트롤 처리 후 24 시간 경과 시점에서 세포를 회수하여 냉각된 인산완충용액(PBS)으로 세척하고 TRIzolTM reagent(Life Technologies, Inc.) 1ml를 첨가하여 총 RNA를 추출하여 정량적인 real-time PCR을 수행하였다. Real-time PCR 수행을 위한 CPT1A의 두 프라이머와 내부 프로브는 Applied Biosystems사에서 제공한Assay-on-Demand system을 이용하였다. 총 RNA 중 CPT1A의 mRNA양은 Roter Gene 3000 (Corbett Research)에서 측정된 형광의 강도와 비례한다. 50mM KCl, 10mM tris-HCl(pH 8.3), 5mM MgCl₂, 100μM dNTP의 PCR 반응 완충액 50㎕에 600nM의 프라이머 프로브 혼합용액을 첨가하고 0.5U의 Taq DNA 중합효소를 활성화 시킨 후 PCR 반응은 95℃에서 15초, 60℃에서 1분의 40사이클을 통해 진행되었다. 상기 PCR 반응은 Roter Gene 3000(Corbett Research)내에서 진행되었고, PCR 반응 과정에서 검출되는 형광의 강도는 Roter Gene 3000 (Corbett Research)을 통해 측정되었으며, 그 정량적인 결과는 사이클 역치(cycle threshold, Ct) 값으로 계산되었다. 사이클 역치는 샘플의 형광 강도가 초기값과 유의한 차이가 나는 시점의 사이클 수를 의미하며, 이로부터 GAPDH 값을 이용하여 표준화 시킨 CPT1A의 상대적인 양을 얻을 수 있었다. 도 3에 나타낸 바와 같이 쿠메스트롤 10, 50μM을 처리한 후 24시간 경과 시점에서 CPT1A의 유전자 발현이 mRNA 수준에서 각각 2.7, 3.5배 이상 증가하였음을 알 수 있었다.

[시험예 4] 쿠메스트롤에 의한 HepG2에서의 CPT1A 효소 활성 증가

(1단계) 세포주와 세포 배양

인체 간암 세포주(human hepatoma cell line)인 HepG2를 10% 우혈청(fetal calf serum)을 함유한 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 37℃의 배양온도로 5%이산화탄소 배양기에서 수행하였다.

(2단계) 쿠메스트롤에 의한 CPT1A 효소 활성 증가

단계 1에서 배양된 세포주를 각각 트립신 처리하여 단일세포 현탁액을 만들고 T75 플라스크에 1x106개씩 분주하여 24시간 배양한다. 그 후, 우혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지를 처리하여 24시간 동안 배양한 후 우혈청이 포함되지 않은 배지에 10, 50μM 농도의 쿠메스트롤을 녹여 처리한다. 쿠메스트롤 처리 후 48시간 경과 시점에서 세포를 회수하여 냉각된 0.5M Tris (pH 7.4), 0.15M KCl 단백질 추출 완충용액으로 3회 세척한 후 완충용액 3ml을 첨가하여 세포를 스크래퍼(scrapper)로 긁어내어 수거하였다. 그 후 소니케이터로 세포를 파쇄한 후 4℃에서 10분간 15,000g의 중력가속도로 원심분리하고, 상층액을 수거하여 활성 분석에 이용하였다. CPT1A 효소의 활성측정은 DTNB(5,5'- dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)를 이용하여 palmitoyl-CoA로부터 방출되는 CoA-SH의 양을 분광학적으로 측정함으로써 이루어진다. 850㎕의 Tris-HCl-DTNB buffer (116nM Tris, 2.5 mM EDTA, 2mM DTNB, 0.2% Triton X-100, pH 8.0)에 50㎕의 단백질 추출 완충용액과 50㎕의 상층액을 첨가하여 30℃에 5분간 방치한 후 50㎕의 1mM palmitoyl-CoA를 넣고 1.2 mM의 L-carnitine을 첨가하여 반응을 진행시켰고, 반응이 종료된 후 반응용액의 흡광도를 파장 412nm에서 180초간 Genova MK3 Life science analyzer(Jenway)를 이용하여 측정하였다. 반응 전후의 흡광도 차이를 비교함으로써 효소의 활성을 측정할 수 있었으며, 그 결과는 도 4에 나타낸 바와 같이, 쿠메스테롤 10, 50μM을 처리함으로서 효소의 활성이 각각 2.0, 3.5배 증가하였음을 알 수 있었다.

[시험예 5] 쿠메스트롤에 의한 지방산 베타 산화 증가

(1단계) 세포주와 세포 배양

(2단계) 쿠메스트롤에 의한 지방산 베타 산화 증가

단계 1에서 배양된 세포주를 각각 트립신 처리하여 단일세포 현탁액을 만들고 6 well 플라스크에 분주하여 24시간 배양하였다. 그 후 우혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지를 처리하여 24시간 동안 배양한 후 우혈청이 포함되지 않은 배지에 10, 50μM 농도의 쿠메스트롤을 녹여 처리한다. 쿠메스트롤 처리 후 24 시간 경과 시점에 배지를 제거하고 PBS 로 세척한 후 우혈청이 포함되지 않은 DMEM배지에 1mM의 L-carnitine과 [9,10]-³H palmitic acid 3μCi를 첨가하여 3시간 반응시킨 후 배지를 수거하여 Scintillation counter를 이용해 배지에 함유된 ³H₂O를 정량함으로써 베타 산화를 측정하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 쿠메스트롤 10, 50μM의 경우 대조군과 비교해 유의하게 지방산 베타 산화를 증가시키는 것을 확인할 수 있었으며, 양성 대조군인 제니스테인과 비슷한 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

[제형예 1] 연질캅셀제

쿠메스트롤 80mg, 대두유 180mg, 팜유 2mg, 식물성 경화유 8mg, 황납 4mg 및 레시틴 6mg을 혼합하고 통상의 방법에 따라 1 캡슐당 400mg씩 충진하여 연질캅셀을 제조하였다.

[제형예 2] 정제

쿠메스트롤 80mg, 갈락토올리고당 200mg, 유당 60mg 및 맥아당 140mg을 혼합하고 유동층 건조기를 이용하여 과립화 한 후 당 에스테르(sugar ester) 6mg을 첨가하여 타정기로 타정하였다. 내용물의 최종 중량은 600mg으로 한다.

[제형예 3] 과립제

쿠메스트롤 80mg, 무수결정 포도당 250mg 및 전분 550mg을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하였다. 내용물의 최종 중량은 1g 으로 한다.

[제형예 4] 드링크제

쿠메스트롤 80mg, 포도당 10g, 구연산 0.6g 및 액상 올리고당 25g을 혼합한 후 정제수 300ml를 가하여 각 병에 200ml씩 되게 충진한다. 병에 충진한 후 130℃에서 4~5초간 살균하여 음료를 제조하였다.

[제형예 5] 캬라멜 제형

쿠메스트롤 80mg, 옥수수 시럽(corn syrup) 1.8g, 탈지우유 0.5g, 대두 레시틴 0.5g, 버터 0.6g, 식물성 경화유 0.4g, 설탕 1.4g, 마가린 0.58g 및 식염 20mg을 혼합하여 캬라멜 성형을 하였다. 내용물의 최종 중량은 6g으로 한다.

[제형예 6] 다이어트 바(bar) 제형

쿠메스트롤 80mg, 전분 20g, 밀가루 9g, 물엿 11g, 맥아당 11.6g, 마가린 6g, 식염 30mg, 구연산 30mg, 중조 140mg 및 당 에스테르 2g을 혼합하여 캬라멜 성형을 하였다. 내용물의 최종 중량은 60g으로 한다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의한 비만 개선 및 예방용 의약 조성물과 비만 개선 및 예방용 식품 조성물은 CPT1A 유전자의 발현 증가를 유도하는 쿠 메스트롤을 함유함으로써 지방산 베타 산화를 효과적으로 촉진시키게 되며, 상기의 지방산 베타 산화로 인하여 과도한 체지방의 축적을 예방 또는 감소시키는 기능을 한다.

Claims

쿠메스트롤, 쿠메스트롤이 함유된 천연물 또는 그의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 개선 및 예방용 의약 조성물.
제1항에 있어서,

상기 유효성분은 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제1A (Carnitine Palmitoyl Transferase1A) 유전자의 발현을 촉진시켜, 지방산의 베타 산화를 증가시키는 것을 특징으로 하는 비만 개선 및 예방용 의약 조성물.
제 1항에 있어서,

쿠메스트롤의 함량은 전체 조성물 총 중량에 대하여 9 내지 29 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 비만 개선 및 예방용 의약 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 쿠메스트롤이 함유된 천연물은 대두 완두 및 녹두로부터 선택되는 두류 및 이로부터 발아한 발아콩, 붉은 토끼풀, 자주개나리 또는 싹양배추로부터 선택되 는 것을 특징으로 하는 비만 개선 및 예방용 의약 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 쿠메스트롤이 함유된 천연물의 추출물은 대두 완두 및 녹두로부터 선택되는 두류 및 이로부터 발아한 발아콩, 붉은 토끼풀, 자주개나리 또는 싹양배추로부터 선택되는 쿠메스트롤이 함유된 천연물을 헥산, 다이클로로메탄, 클로르포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 에탄올, 메탄올 및 물로부터 선택되는 한가지 또는 두가지 이상의 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 비만 개선 및 예방용 의약 조성물.
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