KR101065610B1

KR101065610B1 - 둥근마 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는비만증의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101065610B1
Application number: KR1020080131924A
Authority: KR
Inventors: 박주현; 김진웅; 윤기동; 양민혜
Original assignee: 동양물산기업 주식회사
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2008-12-23
Publication date: 2011-09-20
Also published as: KR20100073293A

Abstract

본 발명은 둥근마 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 생체 내 실험(in vivo)을 통하여 본 발명의 둥근마 조추출물 또는 분획물이 체중 및 사료섭취효율을 감소시키고, 분변 중 지질함량을 증가시키며, 혈장 및 간조직의 지질함량을 감소시킴을 확인하였고, 시험관 내 실험(in vitro)을 통하여 둥근마 조추출물 또는 분획물이 췌장 지방분해효소(pancreatic lipase) 저해 활성을 나타냄을 확인함으로써, 비만증의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용될 수 있다.

둥근마, 비만, 췌장 지방분해효소, 사료섭취효율

Description

둥근마 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 치료용 조성물 {Composition comprising the extract of Dioscorea opposita Thunb. or the fraction isolated therefrom for preventing and treating obesity}

본 발명은 둥근마 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Harrold, J. A. et al., Neuroendocrine targets for the treatment of obesity : physiological roles and unrealized opportunities. Current Medicinal Chemistry: Central Nervous System Agents, 3, pp.141-155, 2003

[문헌 2] Shi, Y. G. et al., Lipid metabolic enzymes: Emerging drug targets for the treatment of obesity. Nature Reviews Drug Discovery, 3, pp.695-710, 2004

[문헌 3] Das, S. K. et al., Antiobesity therapy : emerging drugs and targets. Current Medicinal Chemistry, 13, pp.1429-1460, 2006

[문헌 4] Luque, C. A. et al., Sibutramine: a serotonin - norepinephrine reuptake-inhibitor for the treatment of obesity. Annals of Pharmacotherapy, 33, pp.968-978, 1999

[문헌 5] Shrestha, S. et al., Mono and disalicylic and derivatives: PTP1B inhibitors as potential anti-obesity drugs, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 15, pp.6535-6548, 2007

[문헌 6] Vettor, R., et al., Effect of sibutramine on weight management of metabolic control in type 2 diabetes: a meta-analysis of clinical studies. Diabetes Care, 28, pp.942-949, 2005

[문헌 7] King, D. J. et al., Clinical pharmacology of sibutramine hydrochloride (BTS 54524), a new antidepressant, in healthy volunteers. British Journal of Clinical Pharmacology, 26, pp.607-611, 1998

[문헌 8] Weigle, D. S., Pharmacological therapy of obesity: Past, present, and future. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 88, pp.2462-2469, 2003

[문헌 9] Weibel, E. K. et al., Lipstatin, an inhibitor of pancreatic lipase, produced by Streptomyces toxytricini. I. Producingorganism, fermentation, isolation and biological activity. Journal of Antibiotics, 40, pp.1081-1085, 1987

[문헌 10] Hadvary, P. et al., The lipase inhibitor tetrahydrolipstatin binds covalently to the putative active site serine of pancreatic lipase. The Journal of Biological Chemistry, 266, pp.2021-2027, 1991

[문헌 11] Zhi, J., et al., Long-term systemic exposure of orlistat, a lipase inhibitor, and its metabolites in obese patients. Journal of Clinical Pharmacology, 39, pp.41-46, 1999

[문헌 12] Birari, R. B. et al., Pancreatic lipase inhibitors from natural sources: unexplored potential. Drug Discovery Today, 12, pp.879-889, 2007

[문헌 13] 생약학교재편찬위원회, 생약학, pp.250-251. 동명사, 서울, 2007

[문헌 14] 한국생약학교수협의회, 본초학, pp.724-728. 사단법인 대한약사회, 서울, 1995

[문헌 15] Yang, M. H. et al., Phenolic compounds with radical scavenging and acetylcholinesterase inhibitory activities from Dioscorea opposita. Food Chemistry, submitted for publication, 2008

[문헌 16] Nagai, T. et al., Functional properties of dioscorin, a soluble viscous protein from Japanese yam (Dioscorea opposita Thunb.) tubermucilage tororo. Zeitschriftfuer Naturforschung, C: Journal of Biosciences, 61, pp.792-798, 2006

[문헌 17] Gao, X. et al., Dioscorea opposita reverses dexamethasone induced insulin resistance. Fitoterapia, 78, pp.12-15, 2007

[문헌 18] Wang, S., et al., Characterization and preliminary lipid-lowering evaluation of starch from Chinese yam. Food Chemistry, 108, pp.176-181, 2008

[문헌 19] Kwon, C. S. et al., Anti-obesity effect of Dioscorea nipponica Makino with lipase - inhibitory activity in rodents. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 67, pp.1451-1456, 2003

[문헌 20] Kawaguchi, K. et al., Hesperidin as an inhibitor of lipases from porcine pancreas and Pseudomonas. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 61, pp.102-104, 1997

[문헌 21] Zhao, H. L. et al., Cholesterol - lowering effect of platycodin D in hypercholesterolemic ICR mice, European Journal of Pharmacology, 537, pp.166-173 2006

[문헌 22] Friedwald, W. T. et al., Estimation of the concentration of low density lipoprotein cholesterol in plasma without use of the preparative ultracentrifuge, Clin. Chem., 18, p.499, 1972

[문헌 23] Aziz, N. et al., Antihypertensive, antioxidant, antidyslipidemic and endothelial modulating activities of a polyherbal formulation (POL-10), Vascular Pharmacology, 50, pp.57-64, 2009

[문헌 24] Bligh, E. G. and Dyer, W. J., A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol., 37, pp.911-917, 1959

비만은 대표적인 선진국형 영양성 질환으로 오늘날 전세계적으로 10억이 넘는 인구가 과체중으로 추산되고 있으며 이 중 3억은 임상학적인 비만 환자로 분류된다(Harrold, J. A. et al., Neuroendocrine targets for the treatment of obesity : physiological roles and unrealized opportunities. Current Medicinal Chemistry: Central Nervous System Agents, 3, pp.141-155, 2003; Shi, Y. G. et al., Lipid metabolic enzymes: Emerging drug targets for the treatment of obesity. Nature Reviews Drug Discovery, 3, pp.695-710, 2004). 비만에 의한 체지방 증가는 2형 당뇨, 인슐린 저항성 증후군, 고지혈증, 고혈압, 심혈관계 질환, 뇌졸중, 수면 무호흡증, 골관절염, 고요산혈증, 암 등의 합병증을 유발하기 때문에 삶의 질을 현저히 저하시키고 수명을 단축시키는 주원인으로 작용한다(Das, S. K. et al., Antiobesity therapy : emerging drugs and targets. Current Medicinal Chemistry, 13, pp.1429-1460, 2006). 이 같은 이유로 항비만 약물에 투자되는 비용은 해마다 거대 규모로 성장하여 2008년 현재까지 미국의 항비만 치료제 관련 시장은 전체 건강보조식품, 의약품 시장의 2~6%에 달하며 미화 37억 달러에 달할 것으로 추정되고 있다(Luque, C. A. et al., Sibutramine: a serotonin - norepinephrine reuptake-inhibitor for the treatment of obesity. Annals of Pharmacotherapy, 33, pp.968-978, 1999). 이 같은 높은 관심과 비용 투자에도 불구하고 최근까지 미 FDA에 장기적 비만 치료를 목적으로 승인 받은 약물은 올리스 타트(orlistat)과 시부트라민(sibutramine) 단 두 가지에 불과하다. 이 중 시부트라민(sibutramine)은 신경전달물질인 노르에피네프린(norepinephrine)과 세로토닌(serotonin)이 시냅스에서 재흡수 되는 것을 막아 식욕을 억제하는 것으로 알려진 대표적인 중추신경계 작용 약물로(Shrestha, S. et al., Mono and disalicylic and derivatives: PTP1B inhibitors as potential anti-obesity drugs, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 15, pp.6535-6548, 2007; Vettor, R., et al., Effect of sibutramine on weight management of metabolic control in type 2 diabetes: a meta-analysis of clinical studies. Diabetes Care, 28, pp.942-949, 2005) 기존의 암페타민(amphetamine) 계열 약물 관련 원발성 폐 고혈압(primary pulmonary hypertension)이나 판막성 심장질환(valvular heart disease)을 야기하지는 않으나, 장기적으로 복용 하였을 경우 심박수 증가, 혈압상승 등의 합병증을 수반하는 것으로 보고되어 있다(King, D. J. et al., Clinical pharmacology of sibutramine hydrochloride (BTS 54524), a new antidepressant, in healthy volunteers. British Journal of Clinical Pharmacology, 26, pp.607-611, 1998; Weigle, D. S., Pharmacological therapy of obesity: Past, present, and future. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 88, pp.2462-2469, 2003). 또한 단기적 사용 시에도 심계항진(palpitation), 빈맥(tachycardia), 불면증(insomnia), 고혈압(hypertension), 구갈(dry mouth), 변비(constipation)(Weibel, E. K. et al., Lipstatin, an inhibitor of pancreatic lipase, produced by Streptomycestoxytricini. I. Producingorganism, fermentation, isolation and biological activity. Journal of Antibiotics, 40, pp.1081-1085, 1987) 등의 부작용을 수반할 수 있다는 연구 결과도 있어 장기적인 비만치료를 위한 새로운 약물학적 기전 연구가 필요한 실정이다.

올리스타트(Orlistat)는 천연물인 스트렙토마이세스 톡시트리시니(Streptomyces toxytricini)에서 분리된 립스타틴(lipstatin)의 합성유도체로 위장관에서 췌장 지방분해효소(pancreatic lipase)와 위 지방분해효소(gastric lipase)의 세린(serine)기와 공유결합을 형성하여 식이지방(dietary fat)이 체내에 흡수되는 것을 막는 지방분해효소(lipase) 비가역적 저해제이다(Hadvary, P. et al., The lipase inhibitor tetrahydrolipstatin binds covalently to the putative active site serine of pancreatic lipase. The Journal of Biological Chemistry, 266, pp.2021-2027, 1991; Zhi, J., et al., Long-term systemic exposure of orlistat, a lipase inhibitor, and its metabolites in obese patients. Journal of Clinical Pharmacology, 39, pp.41-46, 1999).

지방분해효소(lipase)란 중성지방(triacylglycerol), 인지질(phospholipids) 등을 포함하는 식이지방 분해 효소를 통칭하는 말로, 사람이 가지고 있는 지방분해효소는 전-십이지장 지방분해효소(pre-duodenal lipase)인 혀(lingual) 및 위 지방분해효소(gastric lipase)와 십이지장 외 지방분해효소(extra-duodenal lipase)인 췌장(pancreatic), 간장(hepatic), 지단백(lipoprotein) 및 내피 지방분해효소(endothelial lipase)로 나눌 수 있으며(Birari, R. B. et al., Pancreatic lipase inhibitors from natural sources: unexplored potential. Drug Discovery Today, 12, pp.879-889, 2007), 이 중 췌장 지방분해효소(pancreatic lipase)는 전체 식이지방(dietary fat)의 50-70%를 2-모노아실글리세롤(2-monoacylglycerol)과 지방산으로 가수분해 시키는 대표적인 지방분해효소이다. 올리스타트(Orlistat) 또는 테트라하이드로립스타틴(tetrahydrolipstatin)은 위장관계에 작용, 췌장 지방분해효소를 저해하여 지방의 흡수를 감소시키는 것을 주된 기전으로 하는 약물로(Weibel, E. K. et al., Lipstatin, an inhibitor of pancreatic lipase, produced by Streptomyces toxytricini. I. Producingorganism, fermentation, isolation and biological activity. Journal of Antibiotics, 40, pp.1081-1085, 1987), 일반적인 비만치료용 중추신경계 작용 약물들이 수반하는 전신적인 부작용이 나타나지 않는다는 것이 가장 큰 장점이지만 고창(flatulence), 설사, 복통, 대소변 실금, 지방질 분변으로 인한 oily spotting, oily stool 등의 부작용이 나타나 이를 보완해 줄 만한 대체약물 개발이 필요한 실정이다. 근래에는 강력한 췌장 지방분해효소 저해제이면서 동시에 기존의 소화기계 관련 부작용을 보완해 줄 수 있는 새로운 비만치료약물 개발을 위해 천연물 추출물을 비롯하여 여기에서 분리된 사포닌, 폴리페놀, 테르펜(terpene), 락톤(lactone) 골격을 가진 다양한 성분들에 대한 연구가 활발히 진행 중이다(Birari, R. B. et al., Pancreatic lipase inhibitors from natural sources: unexplored potential. Drug Discovery Today, 12, pp.879-889, 2007).

둥근마(Dioscorea opposita Thunb. Dioscoreaceae)는 한국, 중국, 일본 등에 걸쳐 널리 분포하는 아열대성 식물로 예로부터 자양, 강장, 지사, 건비, 거담의 목적으로 널리 사용하여 왔다(생약학교재편찬위원회, 생약학, pp.250-251. 동명사, 서울, 2007; 한국생약학교수협의회, 본초학, pp.724-728. 사단법인 대한약사회, 서울, 1995). 주요 성분으로는 전분 (10~15%), 점액성 당단백질 외에도 약리활성을 나타내는 사포닌(saponin), 알란토인(allantoin), 바타타신(batatasin), 콜린(choline) 등과 함께 다양한 폴리 페놀성 성분들을 함유하고 있다(Yang, M. H. et al., Phenolic compounds with radical scavenging and acetylcholinesterase inhibitory activities from Dioscorea opposita. Food Chemistry, submitted for publication, 2008; Nagai, T. et al., Functional properties of dioscorin, a soluble viscous protein from Japanese yam (Dioscorea opposita Thunb.) tubermucilagetororo. Zeitschriftfuer Naturforschung, C: Journal of Biosciences, 61, pp.792-798, 2006). 최근의 연구에 따르면 둥근마의 특정 추출물 및 단일 성분이 기존의 항산화, 위장관 기능 강화, 항염 활성 외에도 혈당강하,혈중 지질 농도를 감소시키는 등의 효과가 있는 것으로 밝혀져 항비만 활성에 대한 기대 역시 증가하고 있다(Gao, X. et al., Dioscorea opposita reverses dexamethasone induced insulin resistance. Fitoterapia, 78, pp.12-15, 2007; Wang, S., et al., Characterization and preliminary lipid-lowering evaluation of starch from Chinese yam. Food Chemistry, 108, pp.176-181, 2008). 또한 오랜 세월 식용·약용 되어 왔으며 독성이 거의 없어 장기적인 치료제로서의 복용이 가 능하고, 식욕부진, 소화불량, 설사 등 소화기계 병변을 치료하기 위한 목적으로 널리 사용되어 왔으므로 올리스타트(orlistat)가 수반하는 위장관계 부작용을 완화시킬 수 있다는 점은 둥근마의 천연물 유래 비만치료약물 개발 대상으로서의 가능성을 높여주고 있다.

이 같은 문헌적 고찰을 근거로 본원 발명자들은 둥근마 조추출물 또는 분획물에 의한 비만증 예방 및 치료 효과에 대해 지속적으로 연구한 결과, 생체 내 실험(in vivo)을 통하여 본 발명의 둥근마 조추출물 또는 분획물이 체중 및 사료섭취효율을 감소시키고, 분변 중 지질함량을 증가시키며, 혈장 및 간조직의 지질함량을 감소시킴을 확인하였고, 시험관 내 실험(in vitro)을 통하여 둥근마 조추출물 또는 분획물이 췌장 지방분해효소(pancreatic lipase) 저해 활성을 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 수행하기 위하여, 본 발명은 둥근마 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 둥근마 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 둥근마는 자연산, 재배산 또는 조직배양으로 생산된 둥근마, 바람직하게는 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)를 생장점 배양 및 바이러스 검정을 거쳐 대량 증식된 우량 경삽묘를 얻고; 삽목법에 의해 우량 경삽묘를 정식 하여 순화 또는 페트리 디쉬 내에서 소구를 생산하며; 정식된 경삽묘에 양액을 공급하여 지상부를 생육시킨 후; 씨마(종우)를 생산하는 등의 단계를 통하여 무병종우를 대량생산하는 조직배양 기술(한국특허공개 제 10-2005-279호)을 이용한 공정을 통하여 얻어진 종우를 재배하여 생산된 둥근마를 포함한다.

본원에서 정의되는 상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 주정, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물, 주정, 에탄올 또는 이들의 혼합용매, 보다 바람직하게는 주정 또는 물 및 에탄올 혼합용매, 가장 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 조추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 상기 분획물은 상기 조추출물을 부탄올 용매로 분획공정을 수행하여 수득된 부탄올 가용 분획물(1) 및 이 분획물을 헥산, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드 및 에틸아세테이트 등의 비극성용매로 상호 혼합된 비극성용매 혼합용매 또는 상기 비극성 용매 및 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 알콜 용매와의 혼합용매, 바람직하게는, 헥산 및 메틸렌 클로라이드와의 혼합용매 또는 상기 메틸렌 클로라이드 및 메탄올과의 혼합용매, 보다 바람직하게는, 헥산 및 메틸렌 클로라이드와의 혼합용매(1:1 ~ 3:1 (v/v)) 또는 상기 메틸렌 클로라이드 및 메탄올과의 혼합용매(1:1 ~ 100:1 (v/v)), 보다 더 바람직하게는, 헥산 및 메틸렌 클로라이드와의 혼합용매(1:1 ~ 2:1 (v/v)) 또는 상기 메틸렌 클로라이드 및 메탄올과의 혼합용매(1:1 ~ 50:1 (v/v)), 가장 바람직하게는, 헥산 및 메틸렌 클로라이드와의 혼합용매(1:1 (v/v)) 또는 상기 메틸렌 클로라이드 및 메탄올과의 혼합용매(20:1 ~ 30:1 (v/v))로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 분획하여 수득되는 비극성 용매간 혼합용매 분획물(2) 및 비극성 및 극성용매간 혼합용매 분획물(3)을 포함한다.

이하, 본 발명의 조추출물 또는 분획물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 둥근마 조추출물 또는 분획물은 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)를 생장점 배양 및 바이러스 검정을 거쳐 대량 증식된 우량 경삽묘를 얻고; 삽목법에 의해 우량 경삽묘를 정식하여 순화 또는 페트리 디쉬 내에서 소구를 생산하며; 정식된 경삽묘에 양액을 공급하여 지상부를 생육시킨 후; 씨마(종우)를 생산하는 등의 단계를 통하여 무병종우를 대량생산하는 한국특허공개 제 10-2005-279호에 기재된 조직배양 기술을 이용한 공정을 통하여 얻어진 종우를 재배하여 생산된 둥근마를 수득하는 제 1단계;

상기 수득한 둥근마 구근을 건조하고 마쇄하고 2배 내지 10배, 바람직하게는 6배의 물, 주정, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매를 가하여, 1시간 내지 5시간동안, 바람직하게는 3시간동안 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류추출, 가열추출, 바람직하게는 환류추출하고 여과한 후, 여액을 60℃ 이하의 온도에서 감압 농축하고, -5℃ 내지 -30℃, 바람직하게는 -10℃ 내지 -20℃에서 12시간 내지 76시간, 바람직하게는 48시간동안 동결건조하여 조추출물을 수득하는 제 2단계;

상기 수득한 조추출물에 조추출물 중량의 1 내지 100배(v/w), 바람직하게는 20 내지 40배(v/w)의 부탄올을 가하여 1회 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복 분획하여 얻어진 부탄올층을 감압 농축하고, -5℃ 내지 -30℃, 바람직하게는 -10℃ 내지 -20℃에서 12시간 내지 76시간, 바람직하게는 48시간동안 동결건조하여 부탄올 가용 분획물(1)을 수득하는 제 3단계;

상기 수득한 부탄올 가용 분획물(1)에 헥산, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드 및 에틸아세테이트 등의 비극성용매로 상호 혼합된 비극성용매 혼합용매 또는 상기 비극성 용매 및 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 알콜 용매와의 혼합용매를 흘려주어 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 -5℃ 내지 -30℃, 바람직하게는 -10℃ 내지 -20℃에서 12시간 내지 76시간, 바람직하게는 48시간동안 동결건조하여 비극성 용매간 혼합용매 분획물(2) 및 비극성 및 극성용매간 혼합용매 분획물(3)을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 둥근마 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 조추출물 또는 분획물을 함유하는 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 조추출물 또는 분획물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 조추출물 또는 분획물 자체는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조추출물 또는 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁 제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 건조물은 1일 0.5 g/kg 내지 5 g/kg으로, 바람직하게는 1 g/kg 내지 3 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 둥근마 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 조추출물 또는 분획물을 포함하는 조성물은 비만증의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 조추출물 또는 분획물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 조추출물 또는 분획물은 비만증의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 조추출물또는 분획물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 1 내지 5 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 둥근마 조추출물 또는 분획물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트 산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

생체 내 실험(in vivo)을 통하여 본 발명의 둥근마 조추출물 또는 분획물이 체중 및 사료섭취효율을 감소시키고, 분변 중 지질함량을 증가시키며, 혈장 및 간조직의 지질함량을 감소시킴을 확인하였고, 시험관 내 실험(in vitro)을 통하여 둥근마 조추출물 또는 분획물이 췌장 지방분해효소(pancreatic lipase) 저해 활성을 나타냄을 확인함으로써, 비만증의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 둥근마의 배양

둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)를 생장점 배양 및 바이러스 검정을 거쳐 대량 증식된 우량 경삽묘를 얻고; 삽목법에 의해 우량 경삽묘를 정식하여 순화 또는 페트리 디쉬 내에서 소구를 생산하며; 정식된 경삽묘에 양액을 공급하여 지상부를 생육시킨 후; 씨마(종우)를 생산하는 등의 단계를 통하여 무병종우를 대량생산하는 한국특허공개 제 10-2005-279호에 기재된 조직배양 기술을 이용한 공정을 통하여 얻어진 종우를 재배하여 생산된 둥근마(동양물산기업 주식회사, 서울)를 수득하여, 하기 실험예의 시료로 사용하였다.

실시예 2. 둥근마의 조추출물 제조

상기 실시예 1에서 수득한 둥근마 구근 930kg을 건조 후, 마쇄하고 6배(v/w)의 95% 에탄올 혼합용매(대한주정라이프)을 가하여, 3시간동안 2회 환류추출하고 상층액을 여과지(데일인더스트리)로 여과한 후, 여액을 60℃ 이하의 온도에서 감압 농축(신성플랜트, 3M³ 농축기)하고, -15℃에서 48시간동안 수분함량이 5% 내외가 되도록 동결건조(일신랩, PVTFD200R)하여 둥근마의 95% 에탄올 혼합용매 조추출물 19.5kg을 수득하였고(수율:0.02%), 하기 실험예의 시료로 사용하였다(이하, “DO-E"라 명명함).

실시예 3. 둥근마의 부탄올 가용 분획물 제조

상기 실시예 2에서 수득한 95% 에탄올 혼합용매 조추출물(DO-E) 19.5kg에 600L의 부탄올을 넣어 분획하였으며, 이 과정을 3회 반복하였다. 감압 농축(신성플랜트, 3M³ 농축기)하고, -15℃에서 48시간동안 수분함량이 5% 내외가 되도록 동결건조(일신랩, PVTFD200R)하여 둥근마의 부탄올 분획물 2.46kg(수율: 0.0026%)을 수득하였고, 하기 실험예의 시료로 사용하였다(이하,‘DO-B'라 명명함).

실시예 4. 둥근마의 메틸렌 클로라이드 및 헥산 혼합용매 가용 분획물 제조

상기 실시예 3에서 수득한 부탄올 분획물(DO-B) 50g을 500ml의 메탄올에 용해하여 실리카겔(230-400 mesh, Merck) 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 극성지향적 분리기법에 따라 메틸렌 클로라이드와 헥산을 1:1의 비율(v/v)로 섞은 혼합용매 2L를 흘려주어 둥근마의 메틸렌 클로라이드 및 헥산 1:1 혼합용매 분획물 9.3g(수율: 0.186%)을 수득하였고, 하기 실험예의 시료로 사용하였다(이하, 'DO-CH'라 명명함).

실시예 5. 둥근마의 메틸렌 클로라이드 및 메탄올 혼합용매 가용 분획물 제조

5-1. 둥근마의 메틸렌 클로라이드 및 메탄올 50:1 혼합용매 가용 분획물 제조

상기 실시예 4의 남아있는 실리카겔 흡착물에 대하여 메틸렌 클로라이드와 메탄올을 50:1의 비율(v/v)로 섞은 혼합용매 2L를 흘려주어 둥근마의 메틸렌 클로 라이드 및 메탄올 50:1 혼합용매 분획물 10.7g(수율: 0.214%)을 수득하였고, 하기 실험예의 시료로 사용하였다(이하, 'DO-50CM'라 명명함).

5-2. 둥근마의 메틸렌 클로라이드 및 메탄올 25:1 혼합용매 가용 분획물 제조

상기 실시예 5-1의 남아있는 실리카겔 흡착물에 대하여 메틸렌 클로라이드와 메탄올을 25:1의 비율(v/v)로 섞은 혼합용매 2L를 흘려주어 둥근마의 메틸렌 클로라이드 및 메탄올 25:1 혼합용매 분획물 5g(수율: 0.1%)을 수득하였고, 하기 실험예의 시료로 사용하였다(이하, 'DO-25CM'라 명명함).

5-3. 둥근마의 메틸렌 클로라이드 및 메탄올 12.5:1 혼합용매 가용 분획물 제조

상기 실시예 5-2의 남아있는 실리카겔 흡착물에 대하여 메틸렌 클로라이드와 메탄올을 12.5:1의 비율(v/v)로 섞은 혼합용매 2L를 흘려주어 둥근마의 메틸렌 클로라이드 및 메탄올 12.5:1 혼합용매 분획물 13.9g(수율: 0.278%)을 수득하였고, 하기 실험예의 시료로 사용하였다(이하, 'DO-12.5CM'라 명명함).

5-4. 둥근마의 메틸렌 클로라이드 및 메탄올 6.25:1 혼합용매 가용 분획물 제조

상기 실시예 5-3의 남아있는 실리카겔 흡착물에 대하여 메틸렌 클로라이드와 메탄올을 6.25:1의 비율(v/v)로 섞은 혼합용매 2L를 흘려주어 둥근마의 메틸렌 클로라이드 및 메탄올 6.25:1 혼합용매 분획물 3.6g(수율: 0.072%)을 수득하였고, 하기 실험예의 시료로 사용하였다(이하, 'DO-6.25CM'라 명명함).

5-5. 둥근마의 메틸렌 클로라이드 및 메탄올 3:1 혼합용매 가용 분획물 제조

상기 실시예 5-4의 남아있는 실리카겔 흡착물에 대하여 메틸렌 클로라이드와 메탄올을 3:1의 비율(v/v)로 섞은 혼합용매 2L를 흘려주어 둥근마의 메틸렌 클로라이드 및 메탄올 3:1 혼합용매 분획물 4.4g(수율: 0.088%)을 수득하였고, 하기 실험예의 시료로 사용하였다(이하, 'DO-3CM'라 명명함).

5-6. 둥근마의 메틸렌 클로라이드 및 메탄올 1:1 혼합용매 가용 분획물 제조

상기 실시예 5-5의 남아있는 실리카겔 흡착물에 대하여 메틸렌 클로라이드와 메탄올을 1:1의 비율(v/v)로 섞은 혼합용매 2L를 흘려주어 둥근마의 메틸렌 클로라이드 및 메탄올 1:1 혼합용매 분획물 9.3g(수율: 0.186%)을 수득하였고, 하기 실험예의 시료로 사용하였다(이하, 'DO-1CM'라 명명함).

참고예 1. 실험동물 준비

3주령 암첫 ICR 계 흰쥐((주) 오리엔트, 한국)를 분양받아, 정상식이군(normal diet), 고지방식이군(high-fat diet), 상기 실시예3에서 수득한 둥근마 부탄올 분획(DO-B) 투여군, 올리스타트 투여군을 각 7마리씩으로 나누어 1 주일간 환경 및 먹이 적응기간을 거친 후 사용하였다. 실험기간 동안 동물 사육실은 일정온도(20 ± 2℃)와 습도(50 ± 5%)로 유지하며, 낮과 밤의 주기가 12시간이 되도록 자동 조절하였으며 물과 식이는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 둥근마 부탄올 분획(DO-B) 투여군은 DO-B을 매일 100 mg/kg 중량으로 8주간 처치하였으며, 올리스타트군은 올리스타트를 매일 15 mg/kg 중량으로 8주간 처치하였다.

실험군	식이구성
정상식이군	일반식이
고지방식이군	고지방식이
둥근마 부탄올 분획(DO-B) 투여군	고지방식이 + DO-B (100mg/kg 중량)
올리스타트군	고지방식이 + 올리스타트 (15mg/kg 중량)

참고예 2. 실험재료 준비

동물실험에 사용된 60% kcal 지방을 함유한 고지방 사료(high-fat diet, D12492) 및 일반사료는 각각 (주)Research Diets사(New Brunswick, NJ)와 (주)퓨리나(#38057)로부터 공급받아 사용하였다. 동물실험을 통해 얻은 혈장과 간지질 중 중성지방(triglyceride), 총콜레스테롤(total cholesterol), 고밀도 콜레스테롤(high-density lipoprotein cholesterol), 아스팔테이트 아미노트랜스퍼라제(aspartate aminotransferase), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase) 분석은 측정용 키트(아산제약, 한국)를 사용하여 측정하였다. In vivo 실험을 위한 4-MU 올레이트와 췌장 지방분해효소(pancreatic lipase; Type Ⅱ, from porcine pancreas)는 (주)시그마사(Sigma-Aldrich co., St. Louis, MO)로부터, 올리스타트(Orlistat)는 (주)로슈(Zenical^®, Roche Pharm Ltd., Reinach, Switzerland)로부터 공급받아 사용하였다.

참고예 3. 통계학적 분석

모든 측정값은 평균±표준편차로 나타내었다. 동물실험(in vivo test) 결과 체중에 대한 날(day) 및 군 간의 유의성은 이원배치 분산분석법(2-way ANOVA)을 통해 검정하였으며 사후검정 및 췌장지방분해효소 활성 유의성 검정을 위해 일원배치 분산분석법(1-way ANOVA)을 실시하였다.

실험예 1. 체중, 먹이 섭취량 및 사료섭취효율 평가

체중 및 먹이 섭취량은 1주일에 한 번, 일정한 시간에 비공복 상태에서 측정하였으며, 문헌에 기재된 방법에 따라, 체중증가량을 사료섭취량으로 나누어 사료섭취효율(food intake efficiency)을 계산하였다(Zhao, H. L. et al., Cholesterol - lowering effect of platycodin D in hypercholesterolemic ICR mice, European Journal of Pharmacology, 537, pp.166-173 2006).

실험결과, 도 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, DO-B 투여군과 올리스타트군의 소비한 먹이량에 대한 몸무게 증가량은 각각 0.041±0.012 (P<0.05)과 0.042±0.018 (P<0.05)로 고지방식이군(0.061±0.013 (P<0.001))에 비해 현저히 낮았다. 결과적으로 DO-B 투여군의 경우, 둥근마 부탄올 분획을 투여하지 않은 군에 비하여 현저한 체중감소 효과가 나타났으며, 사료섭취효율 역시 낮은 것을 확인할 수 있었다.

사료섭취효율 평가
실험군	정상식이군	고지방식이군	DO-B 투여군	올리스타트군
체중증가량(g/8주)	5.64±1.14	15.00±3.59^a	8.10±2.30^d	8.05±2.68^c
사료섭취량(g/8주)	1650±14.28	1719±10.62	1302±17.00^d	1218±11.56^d
사료섭취효율	0.024±0.005	0.061±0.013^a	0.041±0.012^b	0.042±0.018^b
모든 값은 각 군당 7마리에 해당하는 값의 평균±표준편차로 나타내었다. ^a P<0.001는 정상식이군에 비교하여 유의성 평가가 이루어졌으며, ^b P<0.05, ^c P<0.01, ^d P<0.001는 고지방식이군에 비교하여 유의성 평가가 이루어졌다.

실험예 2. 혈장, 간 및 분변의 시료 채취 및 성분 분석

2-1. 혈장, 간 및 분변 시료 채취

실험 마지막 날 실험용 ICR계 흰쥐를 12시간 절식시킨 후 경추탈골로 안락사 시켰다. 개복하여 복부대동맥으로부터 혈액을 채취한 후 원심분리기에 넣고 1500 × g 에서 15분간 원심 분리하여 혈장과 적혈구를 분리하고 -70℃에서 저장하였다. 간을 적출한 후 무게를 재고 -70℃에 보관하였으며 자궁방결합조직성 지방(parametrial adipose tissue)은 수거하여 무게를 측정하였다. 분변은 각각 실험 4주째와 마지막 날 공복 시 수거하여 동결건조한 후 무게를 측정하고 냉장보관 하였다.

실험결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 8주 후 고지방식이군의 평균무게는 40.07±3.55 g으로 정상식이군에 비해 32.64% (P<0.001) 증가하였으며, 간 무게는 22.87% (P<0.05)감소하였다. 이와는 반대로 자궁방결합조직성 지방은 정상식이군에 비해 171.43% (P<0.001)증가하였다. 이에 비해 DO-B 투여군과 올리스타트 처치군은 각각 최종무게 32.70±2.65 g(P<0.05)와 32.70±2.02 g(P<0.05)로 고지방식이군 대비 18.39%의 체중감소효과를 보였다. 특히 DO-B 투여군의 경우, 처치일에 대해 ((F(7,162)=62.00), P<0.001), 정상식이군과 고지방식이군에 대해 ((F(2,162)=159.74), P<0.001), 그리고 날(day)과 실험군 간의 상관관계((F(16,162)=5.21), P<0.001)에 있어 유의성있는 증가를 보였다. 적출한 간 및 자궁방결합 조직성 지방의 체중 상대중량 역시 고지방식이군에 대해 유의성 있는 감소효과를 나타내었다. 올리스타트군의 체중 100 g에 대한 상대적인 간의 무게는 고지방식이군에 비해 2.96% (P<0.05)감소하였으며, DO-B 투여군의 경우 9.29% (P<0.05)로 현저한 감소효과를 보였다. 자궁방결합 조직성 지방의 경우, 고지방식이군에 대해 DO-B 투여군(29.56%, P<0.01)과 올리스타트 처치군(39.53%, P<0.01)에서 모두 현저하게 유의성 있는 감소 효과가 나타났다.

체중, 간 및 지방 무게 변화
실험군	최종무게(g)	적출한 간의 무게(g/100g 중량)	자궁방 결합조직성 지방의 무게(g/100g 중량)
정상식이군	32.50±1.11	5.06±1.51	3.29±0.58
고지방식이군	40.07±3.55^b	6.56±0.49^a	8.93±1.67^b
DO-B 투여군	32.70±2.65^e	4.59±1.55^c	6.92±1.86^d
올리스타트군	32.70±2.02^e	4.91±0.84^c	5.40±1.55^d
모든 값은 각 군당 7마리에 해당하는 값의 평균±표준편차로 나타내었다. ^a P<0.05, ^b P<0.001는 정상식이군에 비교하여 유의성 평가가 이루어졌으며, ^c P<0.05, ^d P<0.01, ^e P<0.001는 고지방식이군에 비교하여 유의성 평가가 이루어졌다.

2-2. 혈장 성분 분석

혈장 중 중성지방, 총콜레스테롤, 고밀도 지단백 콜레스테롤의 양 및, 아스팔테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)와 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)에 대한 활성 연구는 분석용 kit(아산제약, #AM157S-2, #AM202-2, #AM203-K, #AM101-K)을 사용하여 측정하였으며, 저밀도 지단백 콜레스테롤 수치는 Friedwald 등(Friedwald, W. T. et al., Estimation of the concentration of low density lipoprotein cholesterol in plasma without use of the preparative ultracentrifuge, Clin. Chem., 18, p.499, 1972)에 의한 하기 수학식 1을 사용하여 간접적으로 구하였다. 또한, 동맥경화지수(AI; atherogenic index)는 Aziz 등의 방법(Aziz, N. et al., Antihypertensive, antioxidant, antidyslipidemic and endothelial modulating activities of a polyherbal formulation (POL-10), Vascular Pharmacology, 50, pp.57-64, 2009)에 의거하여 하기 수학식 2를 이용하여 계산하였다.

저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL) = 총 콜레스테롤(TC) - 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL) - 중성지방(TG)/5

동맥경화지수(AI) = (총 콜레스테롤 - 고밀도 지단백 콜레스테롤)/(고밀도 지단백 콜레스테롤)

실험결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 8주간 고지방 식이를 섭취한 7마리의 실험동물로부터 분리한 혈장 지질 중 중성지방의 수치는 정상식이군에 비해 68.71% (P<0.001)증가하였다. 이에 대해 올리스타트군과 DO-B 투여군의 혈중 중성지방은 각각 35.28% (P<0.01), 18.83% (P<0.05)감소하였다. 또한 총 콜레스테롤 수치 역시 각각 23.47% (P<0.01), 15.39% (P<0.01)의 고지방식이군 대비 감소효과를 보여 둥근마 추출물의 항비만 활성을 예측할 수 있었다. 특히 혈중 콜레스테롤 수치에 있어 DO-B 투여군의 고밀도지단백 콜레스테롤(34.20%, P<0.05)은 올리스타트군(35.92%, P<0.01)과 비슷한 정도의 증가량을 보였으며, 이를 토대로 DO-B 투여군의 동맥경화지수(1.80±0.35, P<0.01)가 크게 감소하였음을 확인할 수 있었다.

또한, 표 5에 나타난 바와 같이, AST, ALT 모두 DO-B 투여군에서 고지방식이군보다 각각 34.12% (P<0.05), 24.80% (P<0.05) 낮은 활성을 보였으며, 특히 ALT의 경우, 정상식이군(40.11±3.93)의 수치에 가까운 감소효과를 확인할 수 있었다. 이상의 결과들로부터 둥근마 분획물이 간 기능 상태 지표효소인 AST, ALT활성을 낮춰 간 조직 손상에 대한 억제 효과가 있는 것으로 판단되었다.

혈장 성분 분석
	정상식이군	고지방식이군	DO-B 투여군	올리스타트군
중성지방 (mg/100 ml)	87.41±12.49	147.47±23.86^b	119.70±11.84^c	94.71±11.23^d
총 콜레스테롤 (mg/100 ml)	86.52±18.15	130.74±8.24^a	110.62±4.62^d	100.05±13.90^d
고밀도지단백 콜레스테롤 (mg/100 ml)	39.31±1.57	30.32±7.70^a	40.69±5.02^c	41.21±2.59^d
저밀도지단백 콜레스테롤(mg/100 ml)	38.99±6.65	77.67±10.27^b	50.68±10.50^e	49.33±14.88^d
동맥경화지수	1.20±0.34	3.55±1.05^b	1.80±0.35^d	1.44±0.32^e
모든 값은 각 군당 7마리에 해당하는 값의 평균±표준편차로 나타내었다. ^a P<0.01, ^b P<0.001는 정상식이군에 비교하여 유의성 평가가 이루어졌으며, ^c P<0.05, ^d P<0.01, ^e P<0.001는 고지방식이군에 비교하여 유의성 평가가 이루어졌다.

AST, ALT 활성
	정상식이군	고지방식이군	DO-B 투여군	올리스타트군
AST	26.32±7.31	89.82±9.52^b	59.17±8.24^c	120.43±11.01^c
ALT	40.11±3.93	53.35±7.19^a	40.12±3.68^c	48±9.23
모든 값은 각 군당 7마리에 해당하는 값의 평균±표준편차로 나타내었다. ^a P<0.05, ^b P<0.001는 정상식이군에 비교하여 유의성 평가가 이루어졌으며, ^c P<0.05는 고지방식이군에 비교하여 유의성 평가가 이루어졌다.

2-3. 간 및 분변으로부터 지질 추출 및 성분분석

Bligh & Dyer 법을 변형하여 간 및 분변으로부터 지질을 분리하였다(Bligh, E. G. and Dyer, W. J., A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol., 37, pp.911-917, 1959). 상기 실험예 2-1에서 적출한 간 조직 200mg에 1ml의 증류수를 넣고 균질화한 후, 여기에 증류수 1.25ml와 메탄올-클로로포름 1:1(v/v) 혼합용액을 넣고 10분간 수평으로 흔들어주었다. 이를 다시 2000 × g 에서 10분간 원심분리한 후, 하층(클로로포름층)을 취하여 질소 하에서 건조시켜 무게를 측정하였으며, 추출한 간 지질을 시료로 하여 간의 중성지방 및 총콜레스테롤 양을 분석용 kit(아산제약, #AM157S-2, #AM202-2)을 이용하여 측정하였다.

또한, 상기 실험예 2-1에서 동결 건조한 분변 0.5g에 증류수 2ml를 넣고 균질화한 후, 클로로포름-메탄올 2:1(v/v) 혼합용액 7.5ml을 첨가하여 30분간 혼화하였다. 균질액에 다시 증류수, 클로로포름을 각각 2.5ml 씩 넣고 10분간 혼화한 후, 2000 × g 에서 10분간 원심 분리하여 하층(클로로포름층)을 질소 하에서 건조시켜 무게를 측정하였다. 추출한 분변 지질을 시료로 하여 분변의 중성지방 및 총콜레스테롤 양을 분석용 kit을 이용하여 측정하였다.

실험결과, 분변 중 지질함량 및 분리한 지질 시료의 성분분석 결과를 표 6에 나타내었다. 변으로 배설된 총 지질량은 DO-B 투여군의 경우 고지방식이군에 비해 32.50% 유의성 있게 증가하였으나 올리스타트 군(111.50% (P<0.01))에 비해서는 현저히 낮은 수치였다. 분변으로부터 분리한 지질의 중성지방 및 총 콜레스테롤 함량을 측정한 결과, DO-B 투여군의 분변 무게에 대한 상대적인 중성지방과 총 콜레스테롤의 무게는 고지방식이군에 대해 각각 66.85%(P<0.01), 37.41%(P<0.05)증가하여 둥근마의 지방흡수 억제활성을 통한 체중 및 체지방 감소효과를 예측할 수 있었다.

또한, 표 7에 나타난 바와 같이, DO-B 투여군의 경우 적출한 간 1 g에 해당하는 지질의 양 역시 고지방식이군 (87.45±6.23, P<0.001)보다 28.24% (P<0.05)줄어들었다. 또한, 고지방식이로 증가한 간 중 중성지방 및 총 콜레스테롤 수치는 둥근마 섭취로 인하여 각각 50% 가까이 감소하였음을 확인할 수 있었다. 모든 결과는 고지방식이군에 비하여 유의한 것으로 나타났다.

분변 지질 성분 분석
	정상식이군	고지방식이군	DO-B 투여군	올리스타트군
총지질양(mg/g 분변/일)	11.26±2.31	17.91±2.22^a	23.73±2.03^c	37.88±4.10^d
중성지방 (mg/g 분변/일)	9.86±3.53	43.29±1.41^b	72.23±6.84^d	90.55±16.65^d
총 콜레스테롤 (mg/g 분변/일)	3.97±1.34	4.33±0.74	5.95±0.31^c	7.00±1.08^c
모든 값은 각 군당 7마리에 해당하는 값의 평균±표준편차로 나타내었다. ^a P<0.05, ^b P<0.001는 정상식이군에 비교하여 유의성 평가가 이루어졌으며, ^c P<0.05, ^d P<0.01는 고지방식이군에 비교하여 유의성 평가가 이루어졌다.

간 지질 성분분석
	정상식이군	고지방식이군	DO-B 투여군	올리스타트군
총지질양(mg/g liver)	41.45±1.14	87.45±6.23^a	62.75±2.13^b	42.38±0.84^d
중성지방(mg/g liver)	14.05±1.22	42.08±13.76^a	21.84±2.44^c	17.41±6.57^c
총 콜레스테롤 (mg/g liver)	13.80±1.11	39.29±12.51^a	20.88±2.22^c	16.85±5.97^c
모든 값은 각 군당 7마리에 해당하는 값의 평균±표준편차로 나타내었다. ^a P<0.001는 정상식이군에 비교하여 유의성 평가가 이루어졌으며, ^b P<0.05, ^c P<0.01, ^d P<0.001는 고지방식이군에 비교하여 유의성 평가가 이루어졌다.

실험예 3. 둥근마 조추출물 또는 분획물의 췌장 지방분해효소 저해 활성 측정

상기 실시예에서 수득한 둥근마 조추출물 또는 분획물의 췌장 지방분해효소 저해 활성을 4-메틸움벨리페릴 올레이트(4-methylumbelliferyl oleate; 4-MU oleate)를 기질로 사용하여 문헌에 기재된 방법(Kwon, C. S. et al., Anti-obesity effect of Dioscoreanipponica Makinowithlipase - inhibitoryactivityinrodents. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 67, pp.1451-1456, 2003; Kawaguchi, K. et al., Hesperidin as an inhibitor of lipases from porcine pancreas and Pseudomonas. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 61, pp.102-104, 1997)에 따라 하기와 같이 측정하였다.

상기 실시예에서 수득한 둥근마 조추출물 또는 분획물 100μg을 DMSO 1ml에 용해하여 최종농도 10μg/ml가 되도록 사용하였으며, 양성대조군으로 올리스타트를 사용하였다.

각 농도별 시료 10ul에 McIlvane buffer(0.1 M citric acid-Na₂HPO₄, pH7.4) 40 ul 및 0.1 mM의 4-MU 올레이트(Sigma-Aldrich co., St. Louis, MO) 100 ul와 혼합하여 이를 반응액으로 하였다. 반응액에 췌장 지방분해효소(pancreatic lipase; Type Ⅱ, from porcine pancreas; Sigma-Aldrich co., St. Louis, MO) 50 ul를 가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 0.1 N 염화수소(HCl) 1ml와 0.1 M 구연산나트륨(sodium citrate) 2ml를 가하여 반응을 종결시켰다. 지방분해효소에 의해 유리된 4-MU의 양을 형광광도계(Molecular device, US/Gemini XS)로 Ex. 320 nm, Em. 450 nm에서 측정하였다. 활성분획의 농도 대 저해활성 곡선을 통해 둥근마 조추출물 또는 분획물의 지방분해효소 50 % 저해 활성 농도(IC₅₀)를 구하였다.

지방분해효소 활성 저해율(%)= (1-A/B) x 100

(A ; 시료가 존재할 때의 효소의 활성, B ; 시료가 존재하지 않을 때 효소의 활성)

실험결과, 표 8에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예에서 수득한 둥근마 조추출물 또는 분획물과 올리스타트(Orlistat)를 10μg/ml로 DMSO에 녹여 췌장 지방분해효소 저해율(%)을 비교한 결과, 양성대조군인 올리스타트가 98.3%의 저해율을 나타낼 때, DO-B는 35.3%의 활성을 보였으며, 올리스타트의 활성을 100%로 환산하였을 때 35.9%의 저해능을 나타냄을 확인할 수 있었다.

또한, 표 9에 나타낸 바와 같이, DO-B의 췌장 지방분해효소 50% 저해농도(IC₅₀)는 20μg/ml로 이는 양성대조군인 올리스타트(IC₅₀=0.2μg/ml)에 비해서는 높은 수치이지만, 천연물 추출물 수준에서 보았을 때 현저히 높은 정도의 활성을 보이는 것으로 관찰되었다. DO-B를 다시 하위 분획들로 나누어 실험 한 결과, 총 7개의 하위 분획 중 6개의 하위분획이 DO-B에 비해 활성이 높았으며, 이 중 DO-CH, DO-25CM은 최종농도 10μg/ml에서 50% 이상의 저해율을 보였다. 이들 두 분획에 대한 췌장 지방분해효소 50% 저해농도를 측정한 결과, DO-CH은 9.6μg/ml, DO-25CM은 4.6μg/ml을 나타냈다. 결과적으로 DO-B는 10μg/ml의 비교적 저농도에서도 유의성 있는 활성을 나타냈으며, 그 하위분획들은 이에 비해 활성이 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.

최종농도 10μg/ml에서 둥근마 부탄올 가용 분획물 또는 하위 분획물의 췌장 지방분해효소 저해 활성
실험군	췌장 지방분해효소 활성 저해율(%)
DO-B	35.3 ± 1.0^***
DO-CH	59.6 ± 1.0^***
DO-50CM	43.4 ± 1.5^***
DO-25CM	69.7 ± 1.7^***
DO-12.5CM	43.3 ± 0.5^***
DO-6.25CM	31.8 ± 1.9^***
DO-3CM	42.2 ± 0.1^***
DO-1CM	44.4 ± 0.8^***
올리스타트(양성대조군)	98.3 ± 0.3^***
각 군당 3개 시료에 대한 평균 ± 표준오차 값으로 나타내었으며, 유의성평가는 각 실험군을 ONE WAY ANOVA Test를 실시하여 구하였으며 P<0.05, P<0.01 및 **P<0.001로 표시하였다.

둥근마 부탄올 가용 분획물 또는 그 활성 하위분획물^a의 췌장 지방분해효소 50% 저해농도
실험군	50 % 저해 활성 농도(IC₅₀)(μg/ml)^b
DO-B	20.0 ± 1.0
DO-CH	9.6 ± 0.8
DO-25CM	4.6 ± 0.3
올리스타트(양성대조군)	0.2 ± 0.0
^a최종농도 10μg/ml에서 50% 이상의 활성을 나타내는 분획을 활성분획으로 정하였다. ^b각 군당 3개 시료에 대한 평균 ± 표준오차 값으로 나타내었다.

하기에 본 발명의 둥근마 조추출물 또는 분획물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

DO-B 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

DO-CH 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

DO-50CM 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

DO-25CM 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na2HPO4,12H2O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

DO-12.5CM 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

DO-6.25CM 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

DO-3CM 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]

[과제고유번호]

PF06102-00

[부처명]

교육과학기술부

[연구사업명]

자생식물이용기술개발사업

[연구과제명]

마 무병종우 대량생산 및 보급체계 확립과 둥근마 유용성분을 이용한 제품화 연구

[주관기관]

동양물산기업(주) 중앙기술연구소

[연구기간]

2008년 04월 01일 ~ 2009년 03월 31일

도 1은 8주간 고지방 식이를 한 흰 쥐에 대한 둥근마 분획 섭취가 체중변화에 미치는 영향을 나타낸 도이다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

Claims

둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)를 생장점 배양 및 바이러스 검정을 거쳐 대량 증식된 우량 경삽묘를 얻고; 삽목법에 의해 우량 경삽묘를 정식하여 순화 또는 페트리 디쉬 내에서 소구를 생산하며; 정식된 경삽묘에 양액을 공급하여 지상부를 생육시킨 후; 씨마(종우)를 생산하는 단계를 통하여 무병종우를 대량생산하는 조직배양 기술을 이용한 공정을 통하여 얻어진 종우를 재배하여 생산된 둥근마 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 치료용 약학 조성물.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 주정, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 조추출물을 포함하는 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 분획물은 제 4항의 조추출물을 물 및 부탄올 용매로 분획공정을 수행하여 수득된 부탄올 가용 분획물 및 이 분획물을 헥산, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드 및 에틸아세테이트 등의 비극성용매로 상호 혼합된 비극성용매 혼합용매 또는 상기 비극성 용매 및 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 알콜 용매와의 혼합용매로부터 선택되어진 용매에 가용한 분획물을 포함하는 약학 조성물.
삭제
둥근마(Dioscorea opposita Thunb.)를 생장점 배양 및 바이러스 검정을 거쳐 대량 증식된 우량 경삽묘를 얻고; 삽목법에 의해 우량 경삽묘를 정식하여 순화 또는 페트리 디쉬 내에서 소구를 생산하며; 정식된 경삽묘에 양액을 공급하여 지상부를 생육시킨 후; 씨마(종우)를 생산하는 단계를 통하여 무병종우를 대량생산하는 조직배양 기술을 이용한 공정을 통하여 얻어진 종우를 재배하여 생산된 둥근마 조추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만증의 예방 및 개선용 건강기능식품.
삭제