CN102803501B - 用于制备香豆雌酚的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于制备香豆雌酚的方法，其包括使豆发芽的步骤和使豆发酵的步骤，此外本发明涉及用该方法制备的香豆雌酚。

Description

用于制备香豆雌酚的方法
技术领域
本发明涉及用于制备香豆雌酚（coumestrol）的方法及用该方法制备的香豆雌酚。
背景技术
豆具有很高的营养价值，而且其包含各种生理活性和功能性的物质。尤其，由于豆中含有的植物雌激素（phytoestrogens）与人体的哺乳动物雌激素在结构上相似，它们对防治慢性疾病如激素失调有效。所述植物雌激素通常包括异黄酮（isoflavone）、香豆雌酚（coumestrol）和木脂素（lignan）。
发明内容
技术问题
本发明在于提供用于制备香豆雌酚的方法及用该方法制备的香豆雌酚。
技术方案
在一个总的方面，本发明提供用于制备香豆雌酚的方法，包括：豆的发芽；和豆的发酵。
在另一个总的方面，本发明提供用上述方法制备的香豆雌酚。
有益效果
本发明公开的用于制备香豆雌酚的方法通过提高豆中的香豆雌酚的含量将以高产率获得大量的香豆雌酚。通过所述方法可以制备大量高价的香豆雌酚。所制备的香豆雌酚可以有效地应用于药物、食品或化妆品领域。
附图说明
图1展示了在30℃的自动浇水装置内从发芽的豆中提取的香豆雌酚的含量（mg/kg，干重）；
图2展示了与黑曲霉接触后从发芽的豆中提取的香豆雌酚的含量（mg/kg，干重）；
图3展示了将黑曲霉接触后从30℃的液体培养基（马铃薯葡萄糖肉汤）内进行发芽的豆中提取的香豆雌酚的含量（mg/kg，干重）；
图4展示了将酱油曲霉接种后从30℃的液体培养基（马铃薯葡萄糖肉汤）内进行发芽的豆中提取的香豆雌酚的含量（mg/kg，干重）；
图5展示了将双歧杆菌接种后从30℃的液体培养基（马铃薯葡萄糖肉汤）内进行发芽的豆中提取的香豆雌酚的含量（mg/kg，干重）；
图6展示了不同种类的豆中香豆雌酚的含量；
图7展示了根据培养基的添加剂的香豆雌酚的含量；
图8展示了根据菌类浓度的香豆雌酚的含量；和
图9展示了最佳条件下的香豆雌酚的含量。
具体实施方式
香豆雌酚 (CMS; 3,9- 二羟基 -6H- 苯并呋喃 (3,2-c)(1) 苯并呋喃 -6- 酮， C15H8O5, 分子量 : 268.2)为香豆素类化合物，其结构与作为天然雌激素的雌二醇（estradiol）或己烯雌酚（stilbestrol）类似。它具有化学式1的结构：
【化学式1】
由于香豆雌酚的雌激素活性比已知具有雌激素活性的异黄酮高30-100倍，它对缓解子宫癌、骨髓癌、乳腺癌、脑癌或更年期障碍的症状有效。所述香豆雌酚的雌激素活性被认为要归功于其结构。
已知在豆或属豆科的其他植物中会少量存在香豆雌酚。因此，能有效地制备所述实用但在豆中只存有微量的香豆雌酚是有必要的。
下面将更为详细地描述本发明。
一方面，本发明提供用于制备香豆雌酚的方法，包括：使豆发芽的发芽过程；和使豆发酵的发酵过程。
在本发明的一方面，所述豆可以为能够合成香豆雌酚的属豆科（Fabaceae）的任何植物。例如，本发明使用的豆可以包括用于豆瓣酱、豆腐、豆芽、豆米混合物或未成熟的豆。用于豆瓣酱或豆腐的豆的品种包括大丰、湖酱、状元、大黄、小胆、松鹤、大元、真品、蛋白、豆油、新八达、太光、万里、长寿、无限、白云、鸟卵、黄金和长叶。用于豆芽的品种包括神话、小圆、安平、西南、多彩、小绿、小湖、疏明、多元、丰产豆芽、益山豆芽、小白豆芽、光安、短叶和银河。用于豆米混合物的豆的品种包括青磁、黑青、褐叶、鲜黑、黑豆和一品黑豆。此外，用于未熟豆的品种包括多兀、新绿、新乙、黑乙、夕凉未熟豆、华严未熟豆和大乙。
在本发明的另一方面，所述豆可以为能够发芽且对疾病和害虫的侵害有抵抗力的品种。例如，所述品种包括神话豆、小圆豆、安平、西南、多彩、小绿、小湖、疏明、大元、丰产豆芽、益山豆芽、小白豆芽、光安、短叶及银河。
本发明公开的用于制备香豆雌酚的方法包括使豆发芽的发芽过程。可以通过将豆至少部分地接触氧气或空气来实施所述发芽过程。
本发明公开的用于制备香豆雌酚的方法也包括使豆发酵的发酵过程。已知香豆雌酚是由属豆科的植物合成的植保素（phytoalexin），其能够保护植物免受来自真菌或其他病原微生物的侵害。因此，当豆与微生物如真菌、酵母菌或乳酸菌进行接触时，该微生物作为香豆雌酚生物合成诱导子可以增加豆中香豆雌酚的含量。在本发明的另一方面，通过将豆至少部分地接触微生物来实施发酵过程时，可以增加豆中香豆雌酚的含量。在本发明的另一方面，可以通过将豆与微生物进行1-10次的接种来实施所述发酵过程，具体为1-5次，优选为1-3次。通过该过程，可以使微生物更好地与所述豆进行接触。
根据本发明的一方面公开的用于制备香豆雌酚的方法，所述发芽过程和发酵过程可以同时或先后进行。在本发明的另一方面，当同时进行所述发芽和发酵过程时，所述豆在已与微生物接触的状态下与氧气或空气进行接触。具体地，将所述豆浸泡于含有微生物的培养基内时，可以使之与氧气或空气进行接触。
在本发明的另一方面，所述微生物可以为能够作为香豆雌酚合成诱导子的任何微生物。在本发明的另一方面，所述微生物可以为真菌、酵母菌或乳酸菌。具体地，所述菌类可以为曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）或红曲霉属（Monascus）。更为具体地，所述微生物可以为选自黑曲霉（Aspergillus niger）、酱油曲霉（Aspergillus sojae）、米曲霉（Aspergillus oryzae）和双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）中的任何一种微生物。上述微生物适合用于提高豆中香豆雌酚的产量。
在本发明的一方面，通过将微生物孢子的悬浮液涂抹于豆的子叶表面使所述微生物与所述豆进行接触。在本发明的另一方面，通过将所述微生物的粉末加入于含有豆的培养基内使所述微生物与所述豆进行接触。在本发明的另一方面，可以与占所述培养基总重量的0.05-2wt%的微生物进行接触，具体为0.75-2wt%，优选为1.0-2.0wt%。
在本发明的一方面，只要能持续地完成所述发芽和发酵，对所述发芽和发酵过程中至少一个过程的条件没有特别的限制。以下为所述发芽或发酵过程的示例性条件。
在本发明的一方面，可以在反应器内进行所述发芽和发酵过程中至少一个过程。在本发明的另一方面，可以在装有占所述反应器总容量的20-80vol%的培养基的反应器内进行所述过程，具体为40-60vol%，优选为45-55vol%。
在本发明的一方面，只要能有效地完成所述发芽和发酵过程，对所述培养基没有特别的限制。具体地，可以使用液体营养培养基，优选为马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）。在本发明的另一方面，所述培养基可以含有占所述培养基总重量的0.001-10wt%的糖类，具体为0.1-5wt%，优选为0.5-2wt%。所述糖类包括常见的单糖类（monosaccharides），二糖类（disaccharides）或多糖类（polysaccharides），具体为其包括蔗糖（sucrose）、葡萄糖（glucose）或SRT。
在本发明的一方面，可以通过在反应器中加入占所述反应器总容量的1-50vol%的豆来进行所述过程，具体为5-20vol%，优选为6-12vol%。在此过程中，可以将部分的豆浸泡于所述培养基内，而其他的豆则无需浸泡。当未浸泡于培养基内的豆完全地暴露于空气中时，与发酵豆接触的微生物可能会在浇水时被冲洗掉。反之，将所述豆完全地浸泡于培养基内时，可能会使之发霉。
在本发明的一方面，在供应充足的氧气或空气下进行所述过程。例如，在5000mL的反应器内进行所述过程时，可以以2,500vvm/m的速率供应氧气或空气。而且，在3L的反应器内进行所述过程时，可以以15,000vvm/m的速率供应氧气或空气。供应充足的氧气或空气可使发芽能够有效地进行。
在本发明的一方面，所述过程可以在20-35ºC下进行，优选为20-30ºC。在本发明的另一方面，所述过程可以在暗处进行。在本发明的另一方面，所述过程可以进行2-10天。例如，先将所述发芽过程进行2天，然后将该过程与发酵过程同时进行6-8天。
在上述条件下进行所述发芽过程和发酵过程时，豆中的香豆雌酚的含量将会有效地增加。
本发明的一方面公开的用于制备香豆雌酚的方法进一步包括，在所述发芽过程之前，通过使用灭菌水、乙醇和次氯酸钠中至少一种的灭菌剂对所述豆进行灭菌的过程，优选地使用灭菌水。
本发明的一方面公开的用于制备香豆雌酚的方法进一步包括，在所述发芽和发酵过程之后，从所述发芽且发酵的豆中提取香豆雌酚的过程。所述提取可以选用本领域的技术人员所熟知的方法，具体地使用醇类进行提取，优选地使用乙醇进行提取。
在另一方面，本发明提供通过所述用于制备香豆雌酚的方法制备的香豆雌酚。所述香豆雌酚可以有效地应用于药物、食品或化妆品领域。在另一方面，本发明提供含有作为有效成分的香豆雌酚的药物、食品或化妆品组合物。
现将通过实施例详细地描述本发明的特征及其效果。下列实施例仅用作说明为目的，不用于限制本发明的范围。
[实施例1-6] 豆的发芽和发酵
使用用于豆芽的豆，大豆（Glycine max (L.) Merrill） [两种品种；品种1（以下均称“品种1”）和品种2（以下均称“品种2”）]。待发芽后，使所述豆与微生物进行接触，并且分析其是否增加香豆雌酚的产量。这里使用的微生物为黑曲霉（KCCM 11240，韩国微生物保藏中心）、酱油曲霉（KCCM 60354，韩国微生物保藏中心，无毒性，食用级别）和属乳酸菌的双歧杆菌 (KCCM 11207, 韩国微生物保藏中心)。以下为具体的实验条件。
<发芽条件>
所述豆在温度为33ºC、湿度为55%的暗处进行发芽。共三组，每组各测试2次。使用计时器每隔4小时对其进行3分钟的自动浇水。可以使用设计好的自动浇水装置，从而水可以通过其网状底部排出。
<微生物的制备>
1.真菌的制备（黑曲霉和酱油曲霉）
将所述微生物接种于一盘培养基（马铃薯葡萄糖琼脂，DifcoTM，BD Diagnostics, Sparks, MD, 美国）内后，在37℃下培养所述微生物2周，从而使孢子充分地形成。通过用灭菌的刮铲在水中均匀地铺展所述孢子。然后，使用血球计数器测量其浓度后，通过稀释制备孢子悬浮液并使其稀释至106个/mL;
2. 乳酸菌（双歧杆菌）的制备
在一盘培养基（强化的梭状芽胞杆菌培养基，Oxoid Ltd，汉普郡, 英国）内接种所述微生物后，注射氮气并进行密封处理，而后在37℃下培养所述微生物1周。
<使用微生物的发芽和发酵>
以下为用于各个实施例的发芽条件和微生物处理。
表 1
实施例 处理条件
实施例 1 在自动浇水装置中，在没有接种微生物的状态下，使所述豆发芽8天（参见图1）。
实施例 2 在自动浇水装置中，将100μL的孢子悬浮液接种于发芽2周的豆的幼苗上并经4小时后再接种一次。等到接种黑曲霉后，在自动浇水装置中将所述豆进一步进行发芽2、4和6天（参见图2）。
实施例 3 将100μL的孢子悬浮液（106个/mL，黑曲霉）与4颗经表面灭菌处理的已发芽的豆一同放入装有1μL液体培养基（马铃薯葡萄糖琼脂，DifcoTM，BD Diagnostics, Sparks, MD, 美国）的玻璃瓶子(Ø30mm x h75mm)内。然后，在30ºC下使所述豆进一步进行发芽2、4和6天（参见图3）。
实施例 4 除所述已发芽的豆与酱油曲霉一同培养之外，该实验与实施例3在同等条件下进行（参见图4）。
实施例 5 除所述已发芽的豆与双歧杆菌一同培养之外，该实验与实施例3在同等条件下进行（参见图5）。
实施例 6 将4颗经表面灭菌处理的已发芽的豆完全地浸泡于装有5mL的液体培养基（马铃薯葡萄糖琼脂，DifcoTM，BD Diagnostics, Sparks, MD, 美国）的玻璃瓶(Ø30mm x h75mm)内。加入100μL的孢子悬浮液（106个/mL）后，在30ºC下使所述豆进一步进行发芽2、4和6天。
<香豆雌酚含量的分析>
将乙醇加入到所述已发芽的豆中，使其最终浓度达到80%。待均化后，提取并分析香豆雌酚。
- 色谱柱: NOVA-PAK RP18 5μm (3.9 x 150 mm)
- 柱温: 27ºC
- 探测器: UVD (260nm)
- 溶剂: 1% 的乙酸溶液 (乙腈-梯度级)
<实验结果>
[ 实施例 1]
在实施例1中，使未接种微生物的豆进行发芽。如图1所示，香豆雌酚的含量极少。
[实施例2]
如图2所示，将所述豆进行发芽并接种微生物时，香豆雌酚的产量高于实施例1的产量。
然而，由于所述微生物被接种于所述幼苗上，已接种的微生物未能有效地起到香豆雌酚生物合成诱导子的作用。其原因可能是已接种的微生物不能充分地进行生长，反而被每隔4小时进行的浇水清除。事实上，在生长8周的豆上没有观察到所述微生物的生长。
通过上述实施例，可以确定所述微生物可以成为豆的有效的香豆雌酚生物合成诱导子。
[实施例3]
如图3所示，将发芽2天的豆与黑曲霉一同进行培养时，香豆雌酚的产量将得到明显的提高，其中品种1的香豆雌酚的产量到第6天能达到约干重170mg/kg且品种2的香豆雌酚的产量到第8天能达到约干重82.4mg/kg。这将比实施例1相对增长约13倍，在所述实施例1中未接种微生物的豆将在自动浇水装置中生长[干重12.80mg/kg (品种1)和干重5.85mg/kg (品种2)]。通过上述实施例，可以确定豆中香豆雌酚的产量会因接种黑曲霉而增加。
[实施例4]
如图4所示，将发芽2天的的豆与酱油曲霉一起培养时，品种1的香豆雌酚的产量为干重72.04mg/kg且品种2的香豆雌酚的产量为干重81.63mg/kg。所述香豆雌酚的产量明显地高于实施例1，但相对低于同黑曲霉一起培养的豆的香豆雌酚的产量。通过上述实施例，可以确定豆中香豆雌酚的产量将取决于使用的微生物的种类。
[实施例5]
如图5所示，将所述豆与属乳酸菌的双歧杆菌一同培养4天时，品种1的香豆雌酚的产量为干重82.85mg/kg且品种2的香豆雌酚的产量为干重45.1mg/kg。
[实施例6]
在上述实验条件下，由于所述豆完全地浸泡于所述培养基内，使其未能完成发芽。紧接着使用微生物进行处理后，所述豆开始腐烂且没有检测到任何香豆雌酚。
[实施例7] 规模化生产
1. 方法
通过使用大容量的生物反应器在各种条件下生产香豆雌酚。在接种微生物之前，在121℃下通过使用高压灭菌器对所有设备进行灭菌处理。所述豆使用丰产豆芽或小圆豆。使用选自灭菌水、乙醇和次氯酸钠中至少一种的灭菌液对所述豆的幼苗通过清洗2次来进行灭菌处理。将制备占所述反应器容量的20-80vol%的培养基，该培养基含有以下各项的至少其中之一：1%的蔗糖、1%的葡萄糖和1%的SRT。其中加入占所述反应器容量的3-12vol%的所述豆的幼苗。所述豆在装有所述培养基的反应器内进行发芽，而且所述豆是在20-30ºC的明处或暗处且在15000vvm/m的空气供应下进行发芽。
当第二天所述豆开始发芽时，在所述培养基中加入占所述培养基总重量的0-1.25wt%的微生物（1×109CFU/g的米曲霉；从Mediogen获得）且将其培养至第八天。
待培养结束后，从所述豆和培养基中提取香豆雌酚并对其进行分析，该分析方法等同于实施例1-6中使用方法。
2. 结果
（1）根据豆的品种的结果
图6展示了根据豆的品种的香豆雌酚的含量。如图6所示，从丰产豆芽中产生约33.8μg/g的香豆雌酚，并且从小圆豆中产生196μg/g的香豆雌酚。考虑到豆本身会产生5μg/g或更少的香豆雌酚，从而得知本发明能使香豆雌酚的产量大幅度提高。
（2）根据培养基中添加剂的结果
图7展示了根据培养基中添加剂而呈现的香豆雌酚的含量，所述培养基含有以下各项中的至少一项：1%的蔗糖、1%的葡萄糖和1%的SRT。如图7所示，当加入所述添加剂时，比未处理组产生更多的香豆雌酚。特别地，当所述培养基包含1%的蔗糖时，香豆雌酚的产量最多。这是由于所述添加剂能够维持微生物的生长，从而使所述微生物起到香豆雌酚生物合成诱导子的作用。
（3）根据微生物浓度的结果
图8展示根据微生物浓度的香豆雌酚的含量，该微生物起到香豆雌酚生物合成诱导子的作用。如图8所示，当所述微生物的浓度提高一定程度时，随着浓度的增加会产生更多的香豆雌酚。特别地，当所述微生物的浓度为1.25wt%时，香豆雌酚的产量比未处理组多出约11倍。此外，当所述微生物的浓度为2wt%或更高时，将不会进行发芽，却仅进行发酵。
（4）最佳条件
将上述描述的条件组合在一起并比较所述香豆雌酚的含量。最佳条件为如下所述。
表 2
最佳条件
豆的种类 小圆豆
灭菌剂 灭菌水
豆的量 占反应器容量的10vol%
培养基的量 占反应器容量的50vol%
培养基的添加剂 1%的蔗糖
温度 25ºC
亮度 暗
空气的供应 最大值(用于3L反应器，15,000vvm/m)
图9展示在最佳条件下生产的香豆雌酚的量。如图9所示，在该最佳条件下，将会产生多于8倍的香豆雌酚。
通过上述实施例，可以确定通过使用微生物使豆发芽和发酵来提高豆中香豆雌酚的含量。进一步，可以确定所述香豆雌酚在最佳的发芽和发酵条件下能以商业化规模进行生产。

Claims (8)

1.用于制备香豆雌酚的方法，包括：
将豆与氧气或空气至少部分地接触，以使豆发芽；和
使豆与微生物至少部分地接触，以将豆发酵；
其中，所述微生物为选自曲霉属微生物和双歧杆菌中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的用于制备香豆雌酚的方法，其特征在于，所述将豆与氧气或空气至少部分地接触的过程和所述使豆与微生物至少部分地接触的过程同时或先后进行。
3.根据权利要求2所述的用于制备香豆雌酚的方法，其特征在于，当所述将豆与氧气或空气至少部分地接触的过程和所述使豆与微生物至少部分地接触的过程同时进行时，所述豆在已与微生物接触的状态下与氧气或空气进行接触。
4.根据权利要求3所述的用于制备香豆雌酚的方法，其特征在于，所述豆在被浸泡于含有微生物的培养基内时与氧气或空气接触。
5.根据权利要求1所述的用于制备香豆雌酚的方法，其特征在于，所述微生物为选自黑曲霉、酱油曲霉、米曲霉和双歧杆菌中的至少一种微生物。
6.根据权利要求1所述的用于制备香豆雌酚的方法，其特征在于，所述将豆与氧气或空气至少部分地接触的过程和所述使豆与微生物至少部分地接触的过程中的至少一个过程在装有占反应器总容量的20-80vol%的培养基的反应器内进行， 且所述豆占所述反应器总容量的1-50vol%。
7.根据权利要求6所述的用于制备香豆雌酚的方法，其特征在于，所述培养基含有占所述培养基总重量的0.001-10wt%的糖类。
8.根据权利要求1所述的用于制备香豆雌酚的方法，其特征在于，所述将豆与氧气或空气至少部分地接触的过程和所述使豆与微生物至少部分地接触的过程中的至少一个过程是在20-35ºC、在黑暗中进行2-10天。
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