KR100338654B1 - 페룰산에스테르 유도체, 3,9-디페룰릴쿠메스트롤 및 이를함유한 화장료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 3,9-디페룰릴쿠메스트롤(3,9-diferulylcoumestrol)을 함유하는 피부 화장료에 관한 것으로, 특히 페룰산에 쿠메스트롤을 결합시킨 화합물을 함유한 피부 화장료에 관한 것이다. 이는 피부에 대한 노화방지, 미백효과 및 육모효과가 상승되고 미용상의 이상현상개선에 유효한 효과적인 신규 피부 화장료이다.

Description

페룰산에스테르 유도체, 3,9-디페룰릴쿠메스트롤 및 이를 함유한 화장료 {Ferulic ester derivative, 3,9-diferulylcoumestrol and cosmetic product containing the same}

본 발명은 3,9-디페룰릴쿠메스트롤 및 상기 3,9-디페룰릴쿠메스트롤을 함유하는 피부 화장료에 관한 것으로, 특히 페룰산에 쿠메스트롤을 결합시킨 화합물을 함유하여 피부에 대한 노화방지, 미백효과 및 육모효과가 상승되고 미용상의 이상 현상 개선에 효과적인 신규 피부 화장료에 관한 것이다.

피부의 노화는 나이가 들어감에 따라 주름이나 늘어짐이 형성되는 현상이다.최근들어 피부 노화 현상에 대한 연구는 크게 피부 콜라겐 등의 결합 조직 매트릭스 형성과 파괴 메카니즘 연구 등의 조직학적 접근 방법과 산화적 스트레스의 노화에 미치는 영향과 같은 면역학적 접근방법으로 대별되고 있다. 먼저, 조직학적 측면에서 주름과 늘어짐의 원인은 진피의 콜라겐 섬유(교원섬유)나 엘라스틴(탄성섬유)의 변성에 기인한다[참조문헌: M. Oshima et al., Matrix, 13, 187 (1993); S. Harumiya et al., J. Biochem., 120, 745(1996)]. 여기에 피하조직과 근육조직의 지지력 저하가 가세해 주름은 더욱 증가하게 된다. 특히, 피부 진피의 콜라겐 섬유와 엘라스틴의 근본이 되는 물질이 콜라겐이라는 단백질인데, 이 단백질은 진피층의 섬유아세포에서 합성되어 콜라겐 섬유와 엘라스틴을 형성하게 된다. 섬유아세포의 세포막은 영양분의 통로와 세포외 물질들을 특이적으로 인식할 수 있는 신호 수용체 당단백질을 갖고 있다. 이 수용체는 이온 수송 통로와 연계되어 있으며, 외부물질이 섬유아세포 세포막의 수용체에 접근하면 신호가 세포내로 전달되어 핵내부까지 전달된다. 핵내에서는 콜라겐 단백질을 합성하라는 명령을 내리게 되고 평상시보다 많은 양의 콜라겐 단백질이 합성되어 핵 외부로 방출되고 이어서 세포내 각종 기관을 통해 성숙되면서 세포외로 방출된다. 방출된 단백질은 세포와 세포사이의 콜라겐 섬유나 엘라스틴의 기초가 되어 탄력있고 강한 지지력을 갖는 피부가 된다[참조문헌: A. Hayashi et al., Fragnance J., 2, 32(1992)]. 그러나, 진피층의 콜라겐 생합성은 연령의 증가와 자외선, 공해 등의 내외적인 스트레스들에 의해 급격히 저하되어 종국에는 주름 생성과 직결된다[참조문헌: M. Oshima et al., Matrix, 13, 187 (1993)].

면역학적 측면에서는, 인체 내외적인 산화적 스트레스가 세포의 파괴 및 콜라겐 등을 포함한 생체 결합조직들을 파괴하여 주름의 수와 깊이를 가중시키게 된다. 이 또한 연령증가에 따른 생체 항산화 물질의 생합성 능력의 저하로 인해 외적으로 유입 또는 신진대사과정 중 불가피하게 생성되는 활성 산소종과 같은 산화 물질들의 활성을 막아 주지 못하게 되어 주름의 가중을 촉진시킨다[참조문헌: L. H. Kligman et al., J. Invest. Dermatol. 93, 210 (1989); H. Tanaka et al., Arch. Dermatol. Res., 285, 352 (1993); M. D. Carbonare et al., J. Photochem. Photobiol. B. Biol, 14, 105(1992); T. Okada et al., Fragnance J., 11, 23(1993)]. 그러므로, 피부를 포함한 생체내 산화를 막아주기 위한 방법으로 인위적인 항산화제 섭취 혹은 도포가 필수적이다. 자연계에는 항산화 작용을 갖는 물질들이 무수히 많이 존재하고 있으며, 항산화 작용의 원리는 다음과 같이 설명되어질 수 있다. 세포막을 형성하는 지질은 자외선이나 공해물질 등의 외부 환경적인 요인과 정신적 스트레스 등의 내적 요인들에 의해 생성되는 과산화물이나 기타 활성 산소종들에 의해 쉽게 공격을 받아 과산화지질로 변성되어 자체적으로 라디칼 중합체를 형성하여 세포막이 파괴된다[참조문헌: T. Shibamoto et al., American Chem Soc 154(1994)]. 세포내 물질들을 보호하고 있는 세포막의 파괴는 세포의 괴사를 야기시켜 피부는 노화되게 된다. 이때 항산화 물질들은 세포막 지질이 산화되기 전에 대신 산화되어 지질의 산화를 막아준다. 지금까지 화장품에 이용되는 항산화물질은 토코페롤, 아스코르빈산과 각종 식물 추출물들이 이용되고 있다. 하지만, 이들은 자연환경하에서 매우 불안정하여 사용상 문제점이 있거나, 혹은 가시적 효과를 나타내기엔 다소 미흡하다는데 문제가 되어왔다.

현재까지 화장품에서 항노화 컨셉에 응용되는 기능성 물질의 대다수는 기술적 제한성 때문에 조직학적 개선 효과보다는 시험관내적인 항산화 효과 측정 결과와 임상 테스트 결과를 부합하여 그 효능 효과를 논하는 것이 전부인 것이 현실이다. 즉, 현재 화장품용으로 개발되고 있는 항노화 물질 또는 원료들은 오직 시험관내적인 면역학적 효과에 제품 컨셉의 포커스를 맞추고 있어 실질적인 주름의 개선 등의 효과를 보기가 쉽지 않다는 견해가 주류를 이루고 있다.

본 발명에서는 위와같은 노화의 지연 또는 주름 생성의 억제를 위해 조직학적 및 면역학적 효능 효과를 동시에 가지며, 화학적 불안정성이나 미미한 효과를 해결하는 방법으로 우수한 항산화력을 갖는 페룰산과 쿠메스트롤로부터 합성된 물질인 3,9-디페루릴쿠메스트롤을 발명하게 되었다.

실질적인 항노화 기능을 갖는 물질의 개발은 사실상 쉬운 일이 아니다. 상기에서 언급한 바와 같이 현재까지의 항노화 컨셉으로 출시된 원료와 제품들은 항산화 효과에만 촛점이 맞추어져 있어 원하는 효과를 나타내기엔 불가능한 실정이다. 이는 외부 혹은 내부적으로 유입, 생성되는 활성 산소종의 공격에 대해 단순히 방어적인 예방차원의 개념으로서 조직학적 측면에서 가시적이거나 실질적인 주름 개선등의 항노화 기능을 갖는다고 볼 수 없기 때문이다. 그러므로 항노화 기능을 갖기 위해서는 항산화를 통한 피부 노화 촉진을 지연시키는 면역기능 뿐만 아니라 동시에 피부 콜라겐 생성을 촉진시켜 피부 재생, 탄력과 주름 개선을 겸비한 원료 및이를 함유한 제품의 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 피부 노화 억제의 기본 방향으로 설정한 면역기능의 강화와 조직학적 피부 주름 개선을 동시에 만족시킬 수 있는 물질을 개발하고자 하였다. 이에 대해 우수한 항산화력을 갖는 것으로 잘 알려진 페룰산과 콜라겐 합성 촉진 효과가 뛰어난 것으로 알려진 쿠메스트롤을 선구물질로 하는 새로운 개념의 항노화 물질을 합성하게 되었다.

페룰산은 아위, 송진, 볏잎 등에 함유된 성분으로 항균, 항종양 효과 및 온화한 항산화 효과를 갖고 있는 것으로 알려져 있다[참조문헌: M.G. Smart et al., Aust. J. Plant Physiol. 6, 485 (1979)]. 또한, 혈전응고저해작용과 식품의 방부제로도 사용된다[참조문헌: T. Tsukiya et al., Jpn. Kokai 7518621(1975), C.A. 83, 7602v (1975)]. 페룰산은 1866년 호주의 H.Hlasiwetz와 그의 동료들이 식물의 레진에서 추출하여 명명하였다[참조문헌: H. Hlasiwetz et al., Ann. 138, 61 (1866)]. 산소 분자로부터 유래되는 활성 산소종들은 신진대사과정 중에 필수적으로 생성되며 인체내에 적정농도로 유지되어야 하며, 농도가 너무 낮을 때에는 대사가 원활하게 이루어지지 못하고, 너무 높을 때에는 각 기관 세포지질막 등의 생체 분자들의 과산화를 유발시킨다[참조문헌: A.M. Kligman et al.,J.Am. Acad. Dermatol., 15, 836 (1986); E. J. Van Scott et al., Cutis., 43, 222 (1989)]. 페룰산은 이와같이 산소분자로부터 유래되는 다양한 활성 산소종들에 대해서는 온화한 항산화력을 가지며, 철이온과 구리이온과 같은 산화성 전이금속들에 대한 강력한 항산화 효과를 나타내는 것으로 보고되어 있다[참조문헌: M.G. Smart et al.,Aust. J. Plant Physiol. 6, 485 (1979)]. 또한, 아마인유 등과 같은 천연 오일 등의 자동산화를 방지하는 데도 이용됨이 보고되어 있다. 그리고 페룰산은 일본과 다른 선진국들에서 화장품, 제약 및 식품에서 항산화제로서의 활성물질임이 증명되고 있다. 그러나, 페룰산은 단순한 항산화 기능만을 갖고 있기 때문에, 주된 용도는 전이금속이나 기타 유입된 활성 산소종에 의한 제품내에 함유된 다른 유효성분들의 산화를 막아주기 위한 첨가제로서 사용되고 있다[참조문헌: T. Tsukiya et al., Jpn. Kokai 7518621(1975), C.A. 83, 7602v (1975)].

쿠메스트롤은 주로 콩과 식물에서 발견되는 물질로서 온화한 항산화 효과를 갖고 있으며, 식물이 외부 상처를 입었을 때 항균, 항진균 및 항바이러스 작용을 하여 감염을 방지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다[참조문헌: Darbarwar, M., et al., J. Sci. Ind. Res., 35, 297(1982); Jeffrey, B. H., et al., Phytochemical Dictionary, Taylor Francis, London, pp 418 (1933)]. 또한 그 정확한 메카니즘은 알려져 있지 않지만, 피부 및 장기 조직의 콜라겐 등의 결합조직 생성을 촉진시키는 것으로 알려져 있어 조직학적 측면에서 노화 혹은 주름 생성 억제 효과가 있는 것으로 추정된다[참조문헌: Bickoff, E. M., et al., J. Anim. Sci., 19, 4(1960)]. 그러나, 검은콩 등에 함유되어 있는 쿠메스트롤의 함량은 극히 미량이기 때문에 단순 추출을 이용한 원료 제조는 쿠메스트롤의 함량 조절의 신뢰성이 많이 떨어지고 원하는 효과를 얻기에는 충분하지 못하여 대량 합성 방법을 통해 쿠메스트롤을 제조한 후, 페룰산과 같이 우수한 항산화 효과를 갖는 물질과 결합시켜 화장품에서 실질적으로 노화 억제와 피부 탄력 및 개선의 상승 효과와 더불어 미백 작용이 기대되는 물질을 개발하는 데 목적이 있다.

쿠메스트롤의 합성 방법은 지금까지 세가지 정도가 알려져 있지만 합성이 보편화되지 않은 물질로서, 이 중 한 가지 방법을 택하여 합성을 시도하였다[참조문헌: E. M. Bickoff, et al., J. Am. Chem. Soc., 80, 4381(1958)]. 선택된 합성 방법은 총 7 단계의 합성 루트를 거치는 전합성(total synthesis) 과정이다. 본 발명에서는 합성된 쿠메스트롤과 페룰산을 결합시킴으로써, 강력한 항산화 작용을 가지면서 피부 결합조직 부활을 촉진시켜 피부 노화 방지 작용과 피부 미백 작용을 갖는 물질을 제조하는데 있다.

도 1은 본 발명의 3,9-디페룰릴쿠메스트롤의 합성 방법 및 화학 구조를 나타내는 도면.

도 2는 본 발명의 3,9-디페룰릴쿠메스트롤 도포군과 대조군의 헤어리스 (hairless) 마우스 피부의 콜라겐 증가에 대한 조직학적 검사 결과를 나타내는 도면(A: 세포질, B: 콜라겐(블루), C: 핵, D: 피지선, E: 한선, F: 지방, G: 신경층).

(1) 쿠메스트롤의 합성

합성된 물질의 물리, 화학적 성질을 확인하기 위해, 녹는점은 Mel-Temp II(laboratory devicies, USA)를 사용하였으며, 보정되지 않았다. 합성된 중간체 및 최종 화합물의 구조 확인에 사용된¹H-NMR 스펙트럼은 히타치(Hitachi) CW-60 MHz와 배리언(Varian) FT-500MHz¹H-NMR 분광계,¹³C-NMR은 배리언 FT-500MHz¹³C-NMR 분광계, IR 스펙트럼은 자스코(Jasco) FT-IR-5300 분광계, UV-VIS 스펙트럼은 배리언 캐리(carry) UV-VIS 분광 광도계를 사용하였다. 화학적 이동은 내부 표준물질인 TMS(테트라메틸실란)을 기준으로 하여 δ- unit로 표시했고, 데이터는 다음과 같이 기록하였다. 화학적 이동 (적분세기, 다중도, 커플링 상수(Hz)).

쿠메스트롤 합성의 1 단계로 2,4-디메톡시벤잘로다닌(dimethoxybenzal-rhodanine)의 합성을 위해, 2,4-디메톡시벤즈알데히드 50g, 로다닌 40g과 아세트산나트륨 150g을 아세트산 200mL에 녹인 후, 약 130^oC에서 30분간 가열하였다. 생성물은 거의 불용성으로 플라스크안에서 급속히 고체가 되었다. 반응 혼합물을 냉각시키고 200mL의 증류수를 가해 아세트산나트륨과 아세트산을 추출해 낸 후, 고체 생성물을 여과하면서 과량의 증류수로 아세트산 냄새가 거의 제거될 때까지 세척하였다. 잔존하는 불순물들은 약 250mL의 뜨거운 에탄올로 추출, 제거하여 미세한 노란색 침상 생성물을 얻었다.

2 단계로 2,4-디메톡시페닐티오피루브산의 합성을 위해 1 단계에서 만들어진 2,4-디메톡시벤잘로다닌 20g을 15% 수산화나트륨 수용액 80mL와 14% 황화나트륨 20mL의 혼합액에 부유시킨 다음, 고체가 완전히 녹을 때까지 질소 분위기하에 교반하면서 100^oC로 가열하였다(약 10분간). 혼합물을 얼음 중탕에서 냉각시킨 후, 35% 염산으로 pH 2-4로 맞춰 침전물을 얻었다. 침전물을 여과하면서 증류수로 충분히 세척한 후, 200mL의 에틸아세테이트로 추출하였다. 물층을 제거한 후, 에틸아세테이트층을 완전농축하여 진한 오렌지색의 고체를 얻었다. 그 고체를 톨루엔으로 재결정하여 오렌지색 침상 결정을 얻었다.

3 단계로 2,4-디메톡시페닐피루브산옥심의 합성을 위해, 메톡시화나트륨 18.79g을 무수 메탄올에 녹인 후, 히드록실아민히드로클로라이드 농축 수용액을 가해 5분간 교반시켜 히드록실아민을 얻었다. 히드록실아민 용액을 여과한 후, 2,4-디메톡시페닐티오피루브산 24g에 가한 후, 황화수소 기체가 더 이상 방출되지 않을때까지 환류 가열하였다(약 1시간). 반응 혼합물을 냉각시키고 감압하에서 메탄올을 제거하였다. 그런 후, 과량의 5% 수산화나트륨 수용액으로 추출하여 미량의 불순물들을 침전시켜 여과하였다. 이 수용액에 200mL의 에틸아세테이트를 가하여 불순물들을 추출, 제거한 후, 35% HCl 수용액으로 pH 2.0으로 맞춰 고체 생성물을 석출시켰다. 석출된 고체를 200mL의 에틸아세테이트로 추출하여 잔존 수분을 제거하고, 에틸아세테이트는 다시 진공농축하여 제거하였다. 최종적으로 진공건조하여 백색의 미세한 침상 결정을 얻었다.

4 단계로 2,4-디메톡시페닐아세토니트릴의 합성을 위해, 상기 건조된 옥심 10g을 아세트산 무수물 6mL와 함께 수욕조에서 100^oC로 가열하였다. 2-3분 동안의 매우 격렬한 발열 반응이 끝난 후, 약 50 mL의 증류수를 가해 격렬하게 흔들면, 처음엔 오일상이었다가 곧 고체로 변했다. 묽은 NaHCO₃수용액으로 세척한 후, 2-프로판올로 재결정하여 미색의 굵은 침상 결정을 얻었다.

5 단계로 α-(2,4-디메톡시페닐)-2,4-디히드록시아세토페논의 합성을 위해, 2,4-디메톡시페닐아세토니트릴 4.4g과 레소르시놀 8g을 50mL의 무수 에테르에 녹인 후, 약 2시간 가량 HCl 기체로 포화시켜 5일간 0^oC에 보관하였다. 에테르 용매에 침전되어있는 케티민 염 침전물을 여과하여 증류수에 투입 후, 100^oC에서 투명한 판상 침전이 생성될 때까지 가열하였다(약 1시간). 침전물을 여과하여 블루 실리카로 채워진 데시케이터에서 진공 건조시켰다.

6 단계로 3-(2,4-디메톡시페닐)-4,7-디히드록시쿠마린의 합성을 위해, α-(2,4-디메톡시페닐)-2,4-디히드록시아세토페논 6.69g과 메틸클로로포르메이트 4.1mL를 17g 이상의 K₂CO₃를 함유한 무수 아세톤 150mL에서 4시간 동안 환류 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 증류수 300mL로 묽힌 후 35% HCl로 산성화시켰다. 생성된 침전물을 여과한 후, 여액을 진공증발하여 아세톤을 제거하고 여액 중에 잔존하는 침전물을 여과하였다. 침전물을 메탄올 100mL에 녹인 후, 약간의 알리자린 옐로를 가한 다음, 질소분위기에서 가열하면서 20% 수산화칼륨의 메탄올 용액을 지시약의 색이 진한 오렌지색으로 될 때까지 천천히 가했다. 그런 후, 10분간 더 가열하였다. 냉각된 반응 혼합물에 200mL의 증류수를 가한 후, 35% 염산으로 산성화시켜 침전물을 얻었다. 침전물을 무수 에탄올에서 재결정하여 백색 파우더를 얻었다. 마지막 단계로 쿠메스트롤의 합성을 위해 6 단계에서 얻은 쿠마린 1.00g과 아닐린히드로클로라이드 2g을 질소분위기에서 210~220^oC로 4시간 동안 가열하였다. 냉각된 반응 혼합물을 증류수로 세척하여 아닐린히드로클로라이드를 제거한 후, 약간의 에틸아세테이트와 아세톤으로 진홍색 불순물을 제거하였다. 어느 정도 정제가 된 후, 아세톤과 메탄올의 혼합 용액에 녹여 150mg의 활성탄과 함께 10분간 가열하였다. 뜨거운 상태에서 셀라이트 충전 필터로 활성탄을 걸러낸 후, 진공농축하여 약 20mL정도의 용매를 남겨 상온 방치를 하여 침전물을 얻어 여과하였다. 여과된 쿠메스트롤은 진공 데시케이터에서 완전건조시켰다. 각 단계에서 합성된 물질 확인과 순도 확인을 위해 녹는점과 각종 스펙트럼 데이터를 분석하여 문헌값과 대조하였다.

1 단계 합성물질인 2,4-디메톡시벤잘로다닌은 녹는점이 270-273^oC (문헌값 275^oC)이었고, 수득률은 90%이었다.

2 단계의 2,4-디메톡시페닐티오피루브산의 수득률은 86%이었으며, 녹는점은 166-168^oC (문헌값 168-170^oC)이었다.

3 단계 합성물질인 2,4-디메톡시페닐피루브산옥심의 수득률은 91%였으며, 녹는점은 149^oC (문헌값 149^oC) 이었다. FT-IR(KBr) 스펙트럼에서는 3232, 3077, 2961, 1697, 1616, 1588, 1509, 1467, 1422, 1210 cm^-1에서 피크가 나타났으며,¹H-NMR(DMSO-d₆, 60MHz)에서는 6.89(1H,m), 6.50(2H,m), 3.80(3H,s), 3.75(3H,s), 3.70(2H,s) ppm에서 피크가 확인되었다.

4 단계 합성물질인 2,4-디메톡시페닐아세토니트릴의 수득률은 거의 정량적이었으며, R_f값은 0.70(헥산:에틸아세테이트=1:1)이었고, 녹는점은 76^oC (문헌값 76^oC)이었다. FT-IR(KBr) 스펙트럼의 피크는 2952, 2848, 2244, 1620, 1509, 1413, 1267, 1217, 1044 cm^-1에서 나타났으며,¹H-NMR(CDCl₃,60MHz)에서는 7.24(1H,d, 9.6Hz), 6.50(2H,m), 3.85(3H,s), 3.81(3H,s), 3.60(2H,s) ppm에서 피크가 확인되었다.

5 단계 합성물질인 α-(2,4-디메톡시페닐)-2,4-디히드록시아세토페논의 수득률은 35%이었고, R_f값은 0.36(헥산:에틸아세테이트=1:1)이었고, 녹는점이 155℃ (문헌값 156℃)이었다. FT-IR(KBr) 스펙트럼의 피크는 3261, 3006, 2951, 1634, 1507, 1235, 1154, 1134 cm^-1에서 나타났고,¹H-NMR(CDCl₃, 60MHz)은 7.78(1H,m), 7.03(1H,m), 6.4(4H,m), 4.10(2H,s), 3.75(6H,d) ppm에서 피크가 나타났다.

6 단계 합성물질인 3-(2,4-디메톡시페닐)-4,7-디히드록시쿠마린의 수득률은 87%이었으며, 녹는점은 260-263℃ (문헌값 263-264℃)이었고, R_f값은 0.30(헥산:에틸아세테이트=1:1)이었다. FT-IR(KBr) 측정시 3343, 3121, 2968, 2941, 2851, 1689, 1622, 1514, 1277 cm^-1에서 피크가 나타났으며,¹H-NMR(DMSO-d₆, 60MHz)의 분석결과는 7.78(1H,m), 7.15(1H,m), 7.70(4H,m), 3.82(3H,s), 3.75(3H,s) ppm에서 피크가 확인되었다.

마지막 단계인 쿠메스트롤의 수득률은 70%였으며, 녹는점은 382-3℃ (문헌값 385℃)이었고, R_f값은 0.54(헥산:에틸아세테이트=1:1)이었다. FT-IR(KBr) 측정시 3377, 1705, 1631, 1499, 1264, 1092, 1014 cm^-1에서 흡수피크가 나타났다.¹H-NMR(DMSO-d₆, 500MHz)분석의 경우는 7.80(1H,d, 8.42Hz), 7.66(1H,d, 8.42Hz), 7.15(1H,d, 2.20Hz), 6.91(3H,m) ppm에서 각 피크가 확인되었다.¹³C-NMR(DMSO-d₆,100MHz)의 경우는 165.23, 163.45, 162.75, 161.57, 159.90, 158.60, 126.64, 124.57, 118.55, 117.82, 117.74, 108.10, 107.05, 105.99, 102.66 ppm에서 흡수를 나타내어 합성이 잘 된 것을 확인하였다. 총 7 단계의 합성 과정 중 제 5단계는 수득률이 매우 낮았다. 이에 대해서는 문헌상에서도 저조한 수득률이 보고되어 있다. 그래서 2 배 이상의 반응시간을 주었으며, 반응온도를 올렸다. 그러나 더 이상의 성과는 없었다. 이 반응은 반응속도론적인 면과 평형에 있어서 잘 진행이 안되는 것으로 판단된다. 전체적으로 총 수득률은 약 15% 내외로 나타났다.

실시예 1: 페룰산에스테르 유도체, 3,9-디페룰릴쿠메스트롤의 합성

페룰산과 쿠메스트롤의 에스테르 결합을 통한 새로운 합성물질, 3,9-디페룰릴쿠메스트롤의 발명을 위해 페룰산은 시그마(Sigma)사로부터 구입하여 사용하였으며, 쿠메스트롤은 상기한 바와 같이 합성하여 사용하였다. 합성물질의 물리적 성질을 확인하기 위한 방법으로, 녹는점은 Mel-Temp II (laboratory devicies, USA)를 사용하였으며, 보정되지 않았다. 합성된 최종 화합물의 구조 확인에 사용된¹H-NMR 스펙트럼은 브루커(Bruker) FT-300MHz¹H-NMR 분광계,¹³C-NMR은 브루커 FT-75MHz¹³C-NMR 분광계, IR 스펙트럼은 자스코 FT-IR 5300 분광계, 그리고 UV-VIS 스펙트럼은 배리언 캐리 UV-VIS 분광 광도계를 사용하였다. 화학적 이동은 내부 표준물질인 TMS(테트라메틸실란)을 기준으로 하여 δ- unit로 표시했고, 데이터는 다음과 같이 기록하였다. 화학적 이동(적분세기, 다중도, 커플링 상수(Hz)).

합성방법의 상세한 내용은 다음과 같다. 기체 흡수관을 연결한 콘덴서를 100mL 2구 둥근 플라스크에 부착한 후, 페룰산 152 mg를 넣고 THF 5mL을 가해 완전히 녹였다. 그런 후, 티오닐클로라이드 110 mg을 천천히 가한 다음 수욕조에서 가열, 교반하였다. 30분 간격으로 소량의 시료를 채취하여 메탄올과 함께 1 분간 가열한 후, TLC를 검사하여 미반응물의 유무를 확인함으로써 반응의 종료시점을 결정하였다(약 1시간). 반응 종료 후, THF를 진공건조시키고 쿠메스트롤 100 mg과 DMSO 15 mL를 넣어 상온에서 완전용해하였다. 그런 후, 가열 교반하면서 매 1시간 간격으로 TLC 검사를 통해 반응 진행 정도를 확인하였다. 반응 종료 후, 상온에서 냉각된 반응물에 5% 중탄산나트륨 수용액 20 mL를 가해 10 분간 교반한 후, 여과하여 불용성 고체들을 제거하였다. 여과액은 5% 묽은 염산을 적가하여 pH 6-7이 되도록 하여 최종 산물을 석출시켰다. 석출된 생성물을 여과한 후, 증류수로 수 차례 세척하여 산과 염기를 제거하고 실리카 겔을 담은 진공 데시케이터에서 1일간 진공건조하여 갈색의 화합물을 얻었다(도 1 참조).

녹는점은 400℃ 이상이었으며, FT-IR(KBr) 측정시 3423, 2943, 1728, 1633, 1597, 1508, 1417, 1499, 1257, 1118, 1030 cm^-1에서 흡수피크가 나타났다.¹H-NMR(DMSO-d₆, 300MHz)분석의 경우는 7.91(1H,d), 7.86(1H,d), 7.77(1H,m), 7.72-7.68(2H,m), 7.58-7.44(3H,m), 7.29-7.27(4H,m), 7.02-6.97(2H,m), 6.84-6.64(2H,m), 3.87(3H,s), 3.85(3H,s) ppm에서 각 피크가 확인되었다.

¹³C-NMR(DMSO-d₆, 100MHz)의 경우는 165.20, 163.38, 162.55, 161.02, 159.10, 158.24, 156.24, 152.20, 150.82, 149.80, 148.48, 146.19, 145.27,134.06, 129.47, 127.21, 126.71, 125.80, 125.55, 124.60, 122.58, 118.01, 117.66, 117.58, 115.99, 115.56, 114.16, 111.12, 110.45, 107.84, 107.38, 106.12, 102.56, 100.94, 98.45, 56.20, 55.98 ppm에서 흡수피크가 나타났으며, 이러한 데이터들의 분석을 통해 고순도의 화합물이 합성된 것을 확인하였다.

실시예 2: 페룰산에스테르 유도체, 3,9-디페룰릴쿠메스트롤의 미백 및 항산화 활성 측정

합성한 3,9-디페룰릴쿠메스트롤을 1,3-부틸렌글리콜에 0.1%(wt/wt)가 되도록 녹여 0.1%(wt/wt) 용액을 제조하였다. 그리고, 각 0.1%의 비타민 C, 비타민 E, 코지산(kojic acid) 그리고 알부틴을 비교 샘플로 하여 티로시나제 억제 효과와 NBT법을 이용하여 미백과 항산화 활성을 측정하였다.

본 발명에서 미백효과를 측정하기 위해, l-티로신 용액은 0.2mg/ml 농도로 100ml 준비하고, 티로시나제 용액은 680 units/ml 농도로 5ml 준비(3,400units/mg을 5배 희석)하여 사용하였다. 공시험 용액은 티로신 1ml + 인산완충용액 1ml + 증류수(DW) 1ml로 하였으며, 실험과정은 다음과 같다.

① A, B, C를 넣고 37℃에서 30분간 유지,

② D를 넣고 정확히 30분간 유지,

③ 10분 ±10초 내로 꺼내서 얼음물로 구성된 냉동조건에서 반응 종결,

④ 동일 조건으로 희석시킨 비교 샘플들의 흡광도를 조사할 때 비교 실험군의 흡광도를 먼저 조사하고 공시험군을 그 뒤에 실험한다(475nm에서 측정).

티로시나제 활성 억제효과(%) 계산법은 다음과 같고, 그 결과는 표와 같다.

티로시나제 활성 억제효과(%) : [ 1-(E-B/C)] X 100

(B: 공시험군, C: 대조군, E: 실험군)

그 결과는 표 2와 같이 3,9-디페룰릴쿠메스트롤은 0.1% 농도에서 같은 농도의 코지산에 비해서는 작았지만, 비타민 C나 알부틴 보다 월등한 티로시나제 억제효과를 나타냈다. 이러한 결과는 3,9-디페루릴쿠메스트롤의 미백 물질로의 응용 가능성을 보여주고 있다.

본 발명에서 항산화 효과를 측정하기 위해, 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성하는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가한다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시킨다. 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitroblue tetrazolium; NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성하는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정한다.

사용한 시약으로서는

1) 0.05M(50mM) Na₂CO₃완충액(MW=105.99): 탄산나트륨(화광순약) 5.25g(50mM)을 정제수에 용해한 용액과 50mM NaHCO₃(MW=84.01) 용액을 혼합하여 pH 10.2로 한다.

2) 3mM 크산틴 용액: 크산틴(半井化學, MW=152.11) 45.6mg을 물에 용해하여 10ml로 한다.

3) 3mM EDTA 용액: 에틸렌디아민사초산나트륨(同仁化學, MW=60.1)을 증류수에 용해하여 3mM로 한다.

4) 0.15% BSA 용액: BSA(Fraction V, powder, Sigma) 15mg을 증류수에 용해하여 10ml로 한다.

5) 0.75mM NBT 용액: 니트로블루테트라졸리움(MW=817.65, 東京化學) 61.32mg을 증류수에 용해하여 100ml로 한다.

6) 크산틴 옥시다제 용액: 크산틴 옥시다제(Boehringer)를 증류수로 약 100배로 희석하고 측정조작에서 공시험의 흡광도가 0.2-0.23의 범위에 들도록 한다.

다시 말해, 흡광도의 변화가 A560=0.3/20분이 되게 정제수로 희석한다.

7) 6mM CuCl₂용액: 염화구리(CuCl₂-2H₂O, MW=134.45) 102.29mg을 증류수에 용해하여 100ml로 한다.

측정방법으로서,

1. 0.05M Na₂CO₃---2.4ml

2. 3mM 크산틴 용액 --- 0.1ml

3. 3mM EDTA 용액 --- 0.1ml

4. BSA 용액 --- 0.1ml

5. 0.72mM NBT 용액 --- 0.1ml

6. 크산틴 옥시다제 용액 --- 0.1ml

7. 6mM CuCl₂용액 --- 0.1ml

① 바이엘병에 1, 2, 3, 4, 5를 가하고 여기에 시료용액 0.1ml을 첨가하여 25℃에서 10분간 방치한다.

② 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다.

③ 그 후에 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

④ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

⑤ 역시, 시료용액의 공시험값은 6 대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과의 결과 산출은 아래와 같으며, 그 결과는 하기 표 3과 같다.

억제율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100

St: 시료용액의 효소반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt: 공시험용액의 효소반응후의 560nm에서의 흡광도

So: 시료용액의 효소무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

Bo: 공시험용액의 효소무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

그 결과는 표 3과 같이 항산화제로 많이 이용되고 있는 토코페롤에 필적하는 항산화력을 갖고 있음이 확인되었다. 그러나, 강력한 산화제로 알려져 있는 비타민 C는 효과 측정과정에서 첨가되는 시약과 반응할 정도로 항산화력이 커서 최종 효과 측정이 힘들었다.

실시예 3: 3,9-디페룰릴쿠메스트롤의 세포 독성 및 활성효과

실험용 세포는 사람 유래의 섬유아세포(ATCC, Hs68)로 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지로 배양하였으며, 5% CO₂, 100% 습도 조건으로 37℃ 배양기에서 배양하였다. 1x10⁵Cells/mL의 세포를 96개의 플레이트에 시딩(seeding)한 후 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 여기에 0.2m 필터로 제균한 실험 시료를 각각의 농도로 투여하고 24시간 동안 37℃에서 추가 배양했다. 그리고, MTT시약을 첨가하고 4시간 동안 37℃에서 배양한 후, 배양액을 제거하였다. 여기에 1N NaOH 이소프로판올 용액을 첨가한 후, 20분간 교반하여 565nm에서 흡광도를 측정하였다. 그런 후, 시료를 처리하지 않은 세포(생존율 100%)와 비교하여 세포의 사멸 농도를 결정하였다.

50 μM 농도의 3,9-디페룰릴쿠메스트롤의 1,3-부틸렌글리콜 용액을 단계별로 희석시켜 가며 세포독성을 나타내지 않는 농도를 찾았다. 그 결과, 표 4과 같이 최대 78 μM (0.0048%)에서 세포독성을 일으키지 않았다. LD₅₀에서 세포활성은 20%로 나타나 양호한 효과를 보였다.

실시예 4: 3,9-디페룰릴쿠메스트롤의 콜라겐 생성 촉진 효과(콜라겐 증식 촉진 효과에 대한 피부 조직 검사)

합성된 3,9-디페룰릴쿠메스트롤의 콜라겐 생성 촉진 효과를 확인하기 위해, 8주령의 헤어리스 마우스 암컷 10마리를 구입해, 먼저 8주령의 2마리로부터 피부를 적출하여 그 중 가장자리와 중간부분으로부터 8주령의 피부 상태에 대한 표준 염색 샘플을 만들어 콜라겐 증식 정도를 관찰하였다. 나머지 8마리는 각각 4마리씩 도포군과 대조군으로 하였다. 동일한 실험 환경에서 머리와 복부를 제외한 전신에 3,9-디페룰릴쿠메스트롤 0.1%(wt/wt) 1,3-BG 용액과 순수 1,3-BG 원액을 각각 도포군과 대조군에 15일간, 30일간 도포하였다. 먼저, 도포 15일이 경과된 도포군과 대조군각 2마리씩 피부를 적출하여 가장자리와 중간부분으로부터 염색 샘플을 얻었다. 30일이 경과된 나머지 도포군과 대조군으로부터 위와 동일한 방법으로 피부 염색 샘플을 얻었다. 각각 얻어진 10개의 피부 염색 샘플들에 대해 8주령의 피부상태를 기준으로 하여 대조군과 도포군의 콜라겐 증식 촉진 효과에 대한 비교 판정하였다. 2주 경과 후, 초기의 8주령 대조군과 1,3-부틸렌글리콜 도포 대조군에 비해 3,9-디페룰릴쿠메스트롤 도포군에서 콜라겐의 합성과 증식이 나타났다. 또한, 30일 경과 후에도 3,9-디페룰릴쿠메스트롤 도포군에서는 진피층의 콜라겐 증식이 증가하여 조직의 조밀도가 높아지는 경향을 나타냈다. 이러한 결과들로부터 3,9-디페룰릴쿠메스트롤의 뛰어난 콜라겐 합성 및 증식 촉진 효과가 있음이 실험적으로 확인되었다(도 2 참조).

실시예 5, 6, 7:

본 실시예에서는 실시예 1에 의해 합성한 3,9-디페룰릴쿠메스트롤을 함유한 화장료의 임상비교실험을 행하였다. 비교실험에 사용된 화장료는 크림으로, 조성은 표 4에 나타내었다. 우선 표 5에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃로 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후, 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 5-7, 비교예)을 조제한다. 표 5의 각 크림을 피검자(20세 - 35세의 여성) 5명의 얼굴 오른쪽에 1일 2회 연속 1개월간 도포하였다. 실험완료 후, 얼굴 좌우 양편의 도포부위 피부를 영상분석기로 얼굴색을 비교하여 가장 어두운색을 5, 중간색을 3, 가장 환한 색을 1로 정하고 그 중간정도를 어림잡아 평가하였다. 표 6은 실시예 5의 조성으로 된 크림을 사용한 피검자의 안면 피부색을비교예의 조성으로 된 크림을 사용한 피검자의 안면 사용부위와 비교한 것이다. 표 6에서와 같이 3,9-디페룰릴쿠메스트롤을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면에서 피부색개선효과가 나타난 것을 알 수 있다.

이하에 그 외의 실시예를 나타내었다. 즉, 상기한 바와 같이 피부개선에 우수한 효과를 나타내었으며 피부미용효과를 나타내었다.

실시예 8

95% 에탄올 8g에 폴리피롤리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합, 용해한다. 실시예 1의 3,9-디페룰릴쿠메스트롤 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻는다.

실시예 9

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이트 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합용해하고, 실시예 1의 3,9-디페룰릴쿠메스트롤 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 가열용해시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수/유중계형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻는다.

실시예 10

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E 아세테이트 0.2g, 감초산나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1의 3,9-디페룰릴쿠메스트롤 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부질 개선의 효과가 있는 미용액을 얻는다.

본 발명에 의한 3,9-디페룰릴쿠메스트롤은 피부 미백 효과 및 항산화 효과가 탁월하며 안전성면에서도 매우 우수하다. 또한, 상술한 3,9-디페룰릴쿠메스트롤은 각종 기능성 피부 화장료에 적용이 가능하다.

Claims (3)

1. 페룰산과 쿠메스트롤의 에스테르 결합에 의해 합성된 3,9-디페룰릴쿠메스트롤.
2. 제1항의 3,9-디페룰릴쿠메스트롤을 함유하는 피부 화장료.
3. 제2항에 있어서, 3,9-디페룰릴쿠메스트롤 0.01 - 10중량%을 함유하는 피부 화장료.