KR101608506B1 - 쿠메스트롤 또는 쿠메스트린의 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 명세서는 키토산을 콩의 생육 기간 중 일정 시기까지 처리하는 쿠메스트롤의 생산방법 및 쿠메스트린의 생산방법에 대해 개시한다. 또한, 상기 생산방법에 의해 생산된 쿠메스트린에 효소 처리 또는 산 처리 등을 하여 쿠메스트롤을 생산하는 방법을 개시한다.
Description
본 발명은 쿠메스트롤 또는 쿠메스트린을 생산하는 방법에 관한 것이다.
갱년기 여성들을 위한 에스트로겐 요법에서 강력한 에스트로겐 효과를 갖고 있는 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol; DES) 등의 저렴한 합성 에스트로겐의 사용이 미국 FDA에 의해 전면 금지된 이후로 여성호르몬을 대체해 줄 수 있는 천연의 식물성 에스트로겐(phytoestrogen)에 관심이 모아지고 있다. 그러나 이러한 물질들은 천연에 극미량으로 존재하기 때문에 대량 확보가 매우 어려운 실정이다. 또한 과거 반세기에 걸쳐 이러한 물질들의 대량 합성 기술개발에 미온적이었기 때문에 두드러진 성과는 없었으며 비록 간헐적으로나마 합성법 개발에 대한 보고가 있기는 하지만 이 역시 실험실적 수준에 그치고 있기 때문에 현재까지 이렇다 할 만한 손쉬운 대량 제조방법이 전무한 상태이다. 쿠메스트롤(coumestrol)은 식물성 에스트로겐 중에서 현재까지 가장 강력한 것으로 알려져 있는 물질로서 주로 콩과(leguminosae), 국화과(compositae) 식물의 씨앗, 뿌리 그리고 잎에서 발견되는 물질로써 이소플라보노이드(isoflavonoid)의 일종으로 일반적으로는 쿠메스탄(coumestan) 계열 화합물로 분류되고 있다. 쿠메스트롤은 식물이 외상을 입었을 때 상처 부위에 짙은 농도로 분비되어 항산화, 항염 및 항독소 작용을 통해 항균, 항진균 및 항바이러스 작용을 하여 감염을 방지하는 역할을 하는 것이 알려지면서 주목을 받았던 물질이다(Darbarwar, M., et al., J. Sci. Ind. Res., 35, 297, 1982; Jeffrey, B. H., et al., Phytochemical Dictionary, Taylor & Francis, London, pp 418, 1933). 이러한 현상은 다양한 박테리아 및 곰팡이류, 바이러스 등의 감염이 쿠메스트롤을 포함한 다양한 방향족 화합물(aromatic compounds)의 합성을 유도하기 때문이다. 이러한 쿠메스트롤의 항생 작용의 근원은 항산화제로서의 화학적 기본 골격인 페놀성 구조를 보유하고 있어 프리 라디칼성(free radicals) 산화제의 유입을 억제하여 생체 내 과산화 화합물 생성을 저지하기 때문으로 알려지고 있다. 또한 다양한 천연 쿠메스탄 계열의 유도체들 중에서 오직 쿠메스트롤만이 에스트로겐 효과를 갖고 있는 것으로 알려지고 있다. 에스트로겐 효과에 대한 실험은 미숙한 쥐에게 경구 투여한 후 자궁의 무게 변화에 기초하여 평가되었다. 이러한 실험 결과에서 특기할 만한 사항으로 쿠메스트롤은 어린 암쥐에서는 효과적으로 에스트로겐 효과가 나타났지만 성숙한 숫컷 동물들에게는 활성을 나타내지 않았으며 독성이 전혀 없는 것으로 나타났다(Darbarwar, M., et al., J. Sci. Ind. Res., 35, 297, 1982). 그러나, 쿠메스트롤은 콩과 식물에 극미량으로 존재하므로 현재 상용되는 천연 쿠메스트롤은 고가로 시판되고 있다. 이러한 이유로 합성을 통해 쿠메스트롤을 얻으려는 연구가 간헐적으로 시도되어 왔으나 여러 개의 방향족 고리가 융합되어 있는 다소 복잡한 화학 구조 때문에 손쉬운 합성법 개발에 대한 접근법이 소개되지 않고 있으며, 비록 몇 가지의 합성법이 보고되고 있으나 각 합성법들은 아래에 설명하는 다양한 문제점을 내포하고 있어 상용화에 많은 어려움이 따르고 있다. 또한 최근에 화학적 합성법에 의해 생산한 성분 보다는 천연에서 생산한 성분이 안전성 측면에서 좋은 이미지를 가지고 있기 때문에 천연에서 대량으로 생산 할 수 있는 방법에 대해서도 진행 중에 있다.
Darbarwar, M., et al., J. Sci. Ind. Res., 35, 297, 1982
Jeffrey, B. H., et al., Phytochemical Dictionary, Taylor & Francis, London, pp 418, 1933
Darbarwar, M., et al., J. Sci. Ind. Res., 35, 297, 1982
일측면에서, 본 발명은 콩과 식물로부터 쿠메스트롤 또는 쿠메스트린(coumestrin)을 생산하는 방법을 제공하고자 한다. 다른 측면에서 본 발명은 쿠메스트린의 당 제거를 통한 다량의 쿠메스트롤의 생산방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면은 콩과 식물의 생육기간 동안 콩과 식물 또는 토양에 키토산을 처리하는 것을 포함하는 쿠메스트린(Coumestrin) 생산방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일측면은 키토산 처리를 콩과 식물의 뿌리에 처리하는 쿠메스트린 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 상기 키토산을 콩과 식물의 생육기간 중, VE시기부터 V4시기까지 중 어느 한 시기 이상의 기간동안 처리하는 쿠메스트린 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 저분자 수용성 키토산을 사용하는 쿠메스트린 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 키토산 처리를 4일 내지 6일 간격으로 하는 쿠메스트린 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 재배된 콩과 식물의 추출물을 제조하는 것을 더 포함하는 쿠메스트린 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 콩과 식물의 뿌리 부분의 추출물을 사용하는 쿠메스트린 생산방법을 제공한다.
본 발명의 일측면은 콩과 식물의 생육기간 동안 콩과 식물 또는 토양에 키토산을 처리하는 것을 포함하는 쿠메스트롤(Coumestrin) 생산방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일측면은 키토산 처리를 콩과 식물의 뿌리에 처리하는 쿠메스트롤 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 상기 키토산을 콩과 식물의 생육기간 중, VE시기부터 V4시기까지 중 어느 한 시기 이상의 기간동안 처리하는 쿠메스트롤 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 저분자 수용성 키토산을 사용하는 쿠메스트롤 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 키토산 처리를 4일 내지 6일 간격으로 하는 쿠메스트롤 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 재배된 콩과 식물의 추출물을 제조하는 것을 더 포함하는 쿠메스트롤 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 콩과 식물의 뿌리 부분의 추출물을 사용하는 쿠메스트롤 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 상기 방법으로 쿠메스트린 및 쿠메스트롤을 생산하는 것; 및 상기 쿠메스트린에 산, 염기, 효소 및 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 처리하여 쿠메스트린(Coumestrin)으로부터 당을 제거하는 것을 포함하는 쿠메스트롤 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 상기 산, 염기, 효소 및 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 처리는 쿠메스트린을 포함하는 콩과 식물의 추출물에 대해 처리하는, 쿠메스트롤 생산방법을 제공한다.
일측면에서, 본 발명에 따른 쿠메스트롤 또는 쿠메스트린의 생산방법은 콩과 식물을 사용한 것으로서, 생성되는 쿠메스트롤 또는 쿠메스트린의 함량을 높이므로 그로부터 다량의 쿠메스트롤을 높은 수율로 얻을 수 있게 한다. 이렇게 생산한 쿠메스트롤 또는 쿠메스트린은 약학, 식품 또는 화장품을 예로 들 수 있는 다양한 분야에 활용 가능하다.
도 1은 유도 인자 처리 및 생장 시기에 따른 콩과 식물의 뿌리 부분의 추출물 내의 쿠메스트롤 함량을 나타낸다.
도 2는 콩과 식물의 뿌리 부분의 추출물을 물에 녹인 후 베타 글루코시다아제를 이용하여 효소 반응을 진행한 후, 효소반응으로 생성된 침전물을 HPLC를 이용하여 분석한 것을 나타낸다.
도 3은 효소반응 전·후 콩과 식물의 뿌리 부분의 추출물 내 쿠메스트롤의 함량 비교를 나타낸다.
도 2는 콩과 식물의 뿌리 부분의 추출물을 물에 녹인 후 베타 글루코시다아제를 이용하여 효소 반응을 진행한 후, 효소반응으로 생성된 침전물을 HPLC를 이용하여 분석한 것을 나타낸다.
도 3은 효소반응 전·후 콩과 식물의 뿌리 부분의 추출물 내 쿠메스트롤의 함량 비교를 나타낸다.
쿠메스트롤(CMS, 3,9-dihydroxy-6H-benzofuro(3,2-c)(1)benzopyran-6-one C15H8O5, MW: 268.2)은 천연 에스트로겐인 에스트라디올(estradiol) 또는 스틸베스트롤(stilbestrol)과 구조적으로 유사한 쿠마린(coumarin) 유사 화합물로서, 하기 화학식 1과 같은 구조를 갖는다.
[화학식 1]
본 발명의 쿠메스트린은 하기 화학식 2로 나타낼 수 있다.
[화학식 2]
본 발명은 콩과 식물 파종 후 일정 재배 시기까지 콩과 식물 또는 주변 토양에 키토산을 처리하여 쿠메스트린을 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 콩과 식물 파종 후 일정 재배 시기까지 콩과 식물 또는 주변 토양에 키토산을 처리하여 쿠메스트롤을 생산하는 방법을 제공한다. 콩과 식물의 전체, 또는 종자, 잎, 줄기, 열매 등 일부분에 키토산을 처리할 수 있으며, 특히, 콩 뿌리 부분에 키토산을 처리하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일측면에서, 상기 콩과 식물은 쿠메스트린 및/또는 쿠메스트롤을 합성하는 콩과 식물이라면 특별한 제한없이 사용 가능하다. 예를 들어, 본 발명에서 사용될 수 있는 콩과 식물의 종류는, 장류 및 두부용, 나물용, 밥밑용 또는 풋콩용 품종일 수 있다. 장류 및 두부용 품종으로는, 대풍(大豊, 대한민국 품종명칭등록(이하, 생략) 출원공고번호 제2003-940호), 호장(湖醬, 출원공고번호 제2003-950호), 장원(壯元, 출원공고번호 제2002-76호), 대황(大潢, 출원공고번호 제2000-379호), 소담(출원공고번호 제1999-933호), 송학(松鶴, 출원공고번호 제1999-936호), 대원(大元, 대한민국 국가품종목록(이하, 생략) 등재번호 제01-0003-1997-38호), 진품(眞品, 등재번호 제01-0003-1997-26호), 단백(蛋白, 등재번호 제01-0003-1997-18호), 두유(豆油, 등재번호 제01-0003-1997-22호), 신팔달(新八達, 등재번호 제01-0003-1997-15호), 태광(太光, 등재번호 제01-0003-1997-12호), 만리(萬里, 등재번호 제01-0003-1997-11호), 장수(長壽, 등재번호 제01-0003-1997-9호), 무한(無限, 등재번호 제01-0003-1997-7호), 백운(白雲, 등재번호 제01-0003-1997-2호), 새알(등재번호 제10-0003-1997-3호), 황금(黃金, 등재번호 제01-0003-1997-1호) 및 장엽(長葉, 등재번호 제01-0003-1997-41호) 등이 있다. 나물용 품종으로는, 신화콩(출원공고번호 제2009-982호), 소원콩(출원공고번호 제2000-376호), 안평(安平, 출원공고번호 제2003-939호), 서남(西南, 출원공고번호 제2003-948호), 다채(多彩, 출원공고번호 제2003-930호), 소록(小綠), 소호(小湖, 출원공고번호 제2002-78호), 소명(疏明, 출원공고번호 제1999-932호), 다원(多元, 등재번호 제01-0003-1997-40호), 풍산(豊産, 등재번호 제01-0003-1997-34호)나물, 익산(益山, 등재번호 제01-0003-1997-29호)나물, 소백(小白, 등재번호 제01-2003-1997-31호)나물, 광안(光安, 등재번호 제01-0003-1997-19호), 단엽(短葉) 및 은하(銀河, 등재번호 제01-0003-1997-6호) 등이 있다. 밥밑용 품종으로는, 청자(靑磁, 출원공고번호 제2002-80호), 흑청(黑靑, 출원공고번호 제2000-381호), 갈미(褐味, 출원공고번호 제2000-380호), 선흑(鮮黑, 출원공고번호 제1999-934호), 검정콩(등재번호 제01-2003-1997-17호) 및 일품(一品)검정콩(등재번호 제01-0003-1997-42호) 등이 있다. 또한, 풋콩용 품종으로는, 다올(출원공고번호 제2003-931호), 신록(新綠, 출원공고번호 제2002-77호), 새올(출원공고번호 제1999-938호), 검정올(등재번호 제01-2003-1997-37호), 석양(夕凉)풋콩(등재번호 제01-0003-1997-25호), 화엄(華嚴)풋콩(등재번호 제01-0003-1997-21호) 및 큰올(등재번호 제01-2003-1997-14호) 등이 있다.
본 발명의 일측면에서, 키토산 처리는 콩과 식물의 생육기간 중 VE, VC, V1, V2, V3, 또는 V4 중 어느 한 시기 이상의 기간 동안 처리할 수 있다. 바람직하게는 VE 시기부터 V3시기까지, 더 바람직하게는 VE 시기부터 V4시기까지 처리할 수 있다. VE 시기는 생육단계 중 발아단계로서 자엽이 지상에 나타날 때를 의미하며, VC 시기는 자엽단계로서 초생엽이 전개 중인 때를 의미한다. V1 시기는 초생엽 단계로서 초생엽이 완전히 전개되었을 때를 의미하며, V2 시기는 제1복엽기로서 제1복엽이 완전히 전개되었을 때를 의미하며, V3 시기는 제2복엽기로서 제2복엽이 완전히 전개되었을 때를 의미한다. V4 시기는 제3복엽기로서 제3복엽이 완전히 전개되었을 때를 통상적으로 의미한다.
나아가, 키토산 처리는 콩과 식물 및/또는 토양 주변에 4일 내지 6일 간격으로 살포할 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 쿠메스트롤 또는 쿠메스트린의 생산방법에 사용하는 키토산은 저분자 수용성 키토산이 바람직하며, 분자량이 바람직하게는 20,000 이하, 15,000 이하, 10,000 이하, 또는 5,000 이하인 저분자 수용성 키토산일 수 있다. 저분자 수용성 키토산의 분자량은 바람직하게는 500 이상, 1,000 이상, 2,000 이상, 또는 5,000 이상일 수 있다. 키토산의 가장 중요한 특성은 저분자량을 가지면서 중성의 물에 가용성을 갖는 것이다. 키토산은 부분적으로 탈아세틸화된 키틴으로서, 무독성이다. 사용하는 키토산의 농도는 제한이 없으나, 바람직하게는 0.01% 이상, 더 바람직하게는 0.3% 이상이 적당하다. 키토산과 함께 사용하는 용매는 키토산이 잘 녹고 안전한 용매라면 제한되지 않으며, 바람직하게는 물(H2O)이 적당하다.
본 발명의 일측면에서, 쿠메스트린의 생산방법은 상기 방법으로 생산된 콩과 식물의 추출물을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 바람직하게는 콩 뿌리 부분의 추출물을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 쿠메스트롤의 생산방법은 상기 방법으로 생산된 콩과 식물의 추출물을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 바람직하게는 콩 뿌리 부분의 추출물을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일측면에서, 쿠메스트롤의 생산방법은 콩과 식물의 일정한 생육 기간 동안 콩과 식물 또는 토양에 키토산을 처리하여 쿠메스트린 및 쿠메스트롤을 생산하는 단계, 및 상기 생성된 쿠메스트린에 산, 염기, 효소, 및 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 처리하여 쿠메스트린으로부터 당을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 콩과 식물 또는 토양에 대해 키토산 처리를 함으로써, 쿠메스트린 및 쿠메스트롤을 동시에 생산할 수 있으며, 생성된 쿠메스트린으로부터 당을 제거하는 단계를 추가함으로써 쿠메스트린이 쿠메스트롤로 전환될 수 있어 생성되는 쿠메스트롤의 수율이 현저히 향상될 수 있다. 즉, 본 발명의 일측면에 의하면, 콩과 식물 또는 토양에 대해 키토산 처리만 하여 쿠메스트롤을 생산하는 경우에 비하여, 쿠메스트린에 대한 당 제거 단계를 추가함으로써 대량의 쿠메스트롤 생산이 가능하다.
상기 추출물의 추출방법은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되는 열수추출 방법, 고압추출 방법, 환류추출 방법, 초음파추출 방법 등을 사용할 수 있다.
구체적으로, 먼저, 콩과 식물로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 쿠메스트린을 함유하는 식물 추출물 제조하기 위하여 콩과 식물, 예컨대 콩과 식물의 뿌리에 약 1 내지 6 배, 바람직하게는 약 3배의 물 또는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기용매 또는 이들 유기용매와 물과의 혼합용매를 넣고, 상온에서 1 내지 5회 교반하면서 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 식물에 약 1 내지 8 배, 바람직하게는 약 4 배의 물 또는 상기 유기용매를 넣고, 1 내지 5회 환류 추출한 후, 10 내지 20 ℃에서 1 내지 3일간 침적시킨 후, 여과와 원심분리를 통하여 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 등을 이용하여 색소를 제거한 다음, 수층을 상기 유기용매를 사용하여 1 내지 5회 추출한 후, 수득한 유기용매층을 감압농축하여 상기 유기용매 엑기스를 얻은 다음, 이를 소량의 메탄올 등에 녹인 후, 대량의 에틸아세테이트 등을 추가하여 생성된 침전물을 건조시켜, 본 발명의 상기 쿠메스트린을 함유하는 콩과 식물 추출물을 수득할 수 있다.
그 다음 상기 배당체를 함유하는 추출물을 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해하여 쿠메스트롤을 제조한다.
이 때 산을 이용 시, 상기 추출물에 0.1N ∼2N 농도, 바람직하게는 1N 농도의 산 또는 산 및 알코올의 혼합용매(바람직하게 40~60% 에탄올 혼합용매)를 가한 후, 50 내지 100 ℃, 바람직하게는 80 ℃ 수욕조에서 0.5 내지 2시간 동안 가열 환류시켜 가수분해하여 반응액을 수득할 수 있다.
상기 산은 염산, 황산 및 질산으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 산, 또는 이들 산과 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매를 사용할 수 있다.
이 때 염기를 이용 시, 상기 추출물을 녹인 후, 0.1N ∼ 2N 농도, 바람직하게는 1N 농도의 염기 또는 염기 및 알코올의 혼합용매(바람직하게는 40~60% 부탄올 혼합용매)를 가해 50 내지 100 ℃, 바람직하게는 100 ℃ 수욕조에서 1 내지 12 시간 동안 가열 환류시켜 가수분해하여 반응액을 수득할 수 있다.
상기 염기는 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기, 또는 이들 염기와 에탄올, 메탄올, 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매를 사용할 수 있다.
이 때 효소를 이용시, 상기 추출물을 5 내지 20 배, 바람직하게는 약 10 배의 산성 완충용액에 용해시킨 다음, 효소를 첨가하여 약 35~40 ℃ 수욕 상에서 약 1 내지 60시간 동안 교반하면서, 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수(80∼100 ℃) 중에서 5 내지 15 분 동안 가열하여 가수분해 반응을 종료시키고 반응액을 수득할 수 있다.
상기 효소를 생산하는 미생물을 활용 시, 상기 추출물을 5 내지 10배, 바람직하게는 약 10배의 이온수에 용해시킨 후 110~130℃에서 30분간 멸균하여 25~35 ℃로 냉각한 후 미리 배양된 미생물을 액체량 대비 5∼10%로 접종하여 25~35℃에서 2 내지 5일 배양 시킨 후 5,000 내지 10,000 rpm으로 원심분리하여 회수한 침전물을 증류수로 수회 세척 후 원심분리하여 침전물로써 반응액을 수득할 수 있다.
상기 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물은 엑소(exo) 당 결합 분해 효소 또는 상기 엑소 당 결합 분해 효소를 생산하는 미생물을 사용하며, 상기 효소는 배당체에서 당 부분을 제거하여 쿠메스트롤을 분리할 수 있다.
상기와 같이 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해 한 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 알코올을 가하여 1 내지 5회 교반시킨 후, 침전된 염들을 여과를 통하여 제거하고, 여과된 여액을 감압농축하여 쿠메스트롤 조 생성물을 수득하고, 상기 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(예컨대, 클로로포름: 메탄올= 8:1 내)을 수득할 수 있다.
예컨대, 당의 제거는 하기 표 1과 같이 수행될 수 있다.
[표 1]
상기 쿠메스트린을 포함하는 물질에 산, 염기, 효소, 또는 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 처리하는 것은 콩과 식물의 추출물에 대해 처리할 수 있으며, 또한 콩과 식물의 추출물을 여과 또는 정제한 후에 처리하여 쿠메스트롤을 생산할 수도 있다.
이하, 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실험예 1] 콩과 식물의 생육 기간 중 유도 인자 처리
콩과 식물(대두(백태, Glycine Max.))의 생육 기간 중 초기(VE)시기부터 V4 시기까지 저분자 수용성 키토산 또는 누룩균(Aspergillus oryzae)을 토양 및 콩과 식물에 처리하여 재배하였다. 저분자 수용성 키토산은 물에 쉽게 용해되어 토양에 처리하기 용이하며 다른 유도 인자와 비교해서 식용이 가능한 성분으로 인체에 무해한 성분이다. 저분자 수용성 키토산은 ㈜ 영키팜에서 생산하는 수용성 키토산(YWCTS-100)을 구입하였다. 키토산 처리는 물에 0.3% 농도로 녹인 후 물조루를 이용하여 뿌리에 잘 접촉할 수 있게 콩 줄기 및 토양 위주로 5일 간격으로 살포하였다.
누룩균은 많은 연구를 통해 유도 효능이 뛰어나다고 알려진 균류로써 식품 발효균으로 사용되는 인체에 무해한 성분이다. 누룩균(Aspergillus oryzae) 건조균체는 ㈜ 메디오젠에서 구입하였다. 누룩균 처리는 콩에 처리하기 하루 전에, 설탕 10g을 1L의 물에 녹인 후, 누룩균(Aspergillus oryzae) 건조균체 10g을 잘 섞었다. 그 후, 진탕항온기에서 30도(℃)의 온도로 12시간 동안 배양하였다. 배양 후, 물조루를 이용하여 콩 줄기 및 콩 줄기 주변 토양에 잘 스며들도록 뿌려주었다. 누룩균(Aspergillus oryzae)의 처리는 5일 간격으로 하였다. 이 때, 대조군은 동량의 정제수를 뿌려주었다.
[실험예 2] 콩 뿌리 추출물의 제조
키토산과 누룩균을 각각 처리한 실험군과 아무것도 처리하지 않고 재배한 콩 뿌리를 생장 시기별 (VE~V4시기, 총 6시기)로 채취한 후 정제수로 세척하고 건조시킨 다음 세말화하였다. 상기 콩 뿌리 가루 100g을 70% 에탄올 수용액 1리터(L)에 넣고 실온에서 24시간 동안 추출한 후, 300 메쉬(mesh) 여과포로 여과하였다. 여과액을 냉각 콘덴서가 달린 증류 장치를 이용하여 50℃로 감압 농축하고 건조하여 콩 뿌리 추출물을 제조하였다.
[실험예 3] 콩 뿌리 추출물 내의 쿠메스트롤 함량 분석
상기 실험예 2에서 얻어진 각각의 생장 시기별 콩 뿌리 추출물에서 쿠메스트롤(coumestrol) 함량의 정량 분석을 위하여 HPLC를 이용하였다. 콩 뿌리 추출물 내의 쿠메스트롤 함량을 비교하기 위해, 기준 물질로 Indofine Chemical 사에서 구매한 쿠메스트롤을 사용하였다.
유도 인자 처리 및 생장 시기에 따른 콩 뿌리 추출물 내의 쿠메스트롤 함량은 도 1과 같다. 유도 인자 처리로 인하여 콩 뿌리 추출물 내 쿠메스트롤 함량은 유도 인자 처리를 하지 않은 대조군의 쿠메스트롤 함량에 비해서, 많이 증가하였다. 특히, 생육기간 중 V3 및 V4시기에 쿠메스트롤 함량이 급격히 증가하였다. V4시기까지 생성된 쿠메스트롤의 함량은, 무처리한 대조군의 쿠메스트롤 함량이 추출물 g당 1.6mg/g인 반면, 누룩균 처리시 2.6mg/g으로서 함량이 약 1.6배 증가하였고, 키토산 처리시 약 3.2mg/g으로 함량이 2배 정도 증가하였다.
[실험예 4] 쿠메스트린의 당 제거를 통한 쿠메스트롤 함량 증진
상기 실험예 1에서 진행한 키토산 처리 콩 뿌리에 쿠메스트롤의 배당체 형태인 쿠메스트린이 생성되었다는 것을 확인하였다. 키토산 처리 콩 뿌리 추출물에서 쿠메스트린의 당을 제거함으로써 추출물 내 쿠메스트롤 함량을 더욱 증가시킬 수 있다.
당을 제거할 수 있는 방법 중 베타 글루코시다아제를 이용하여 효소반응을 진행한 후 효소반응으로 생성된 침전물을 HPLC를 이용하여 분석해 보았다. 분석 결과 추출물 안의 쿠메스트린의 당이 제거되면서 도 2 와 같이 쿠메스트린이 쿠메스트롤로 전환되면서 쿠메스트롤 함량이 기존 콩 뿌리 추출물에 비해 월등히 증가된 것을 확인할 수 있었다. 즉, 쿠메스트린을 나타내는 수치 44.00 부근의 피크가 <콩 뿌리 추출물>의 HPLC에 비해서 <콩 뿌리 추출물 효소 반응 침전물>의 HPLC에서 조금 감소한 반면, 쿠메스트롤을 나타내는 수치 57.00 부근의 피크는 약 15배 정도 증가하였다.
효소반응 전·후 콩 뿌리 추출물 내 쿠메스트롤 함량 비교는 도 3과 같다. 효소반응을 통하여 키토산 처리 후 콩 뿌리 추출물 내 쿠메스트롤 함량이 약 3.5배 증가하였다.
Claims (9)
- 콩과 식물의 생육기간 동안 콩과 식물 또는 토양에 저분자 수용성 키토산을 4일 내지 6일 간격으로 처리하는 것을 포함하며, 상기 콩과 식물은 대두인, 쿠메스트린(Coumestrin) 또는 쿠메스트롤(Coumestrol) 생산방법.
- 제1항에 있어서,
상기 키토산 처리는 콩과 식물의 뿌리에 처리하는 쿠메스트린 또는 쿠메스트롤 생산방법. - 제1항에 있어서,
상기 키토산을 콩과 식물의 생육기간 중, VE시기부터 V4시기까지 중 어느 한 시기 이상의 기간동안 처리하는 쿠메스트린 또는 쿠메스트롤 생산방법. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 방법은 키토산이 처리된 상기 콩과 식물의 추출물을 제조하는 것을 더 포함하는 쿠메스트린 또는 쿠메스트롤 생산방법. - 제6항에 있어서,
상기 콩과 식물의 추출물은 뿌리 부분의 추출물인 쿠메스트린 또는 쿠메스트롤 생산방법. - 제1항 내지 제3항, 및 제6항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따라 쿠메스트린 및 쿠메스트롤을 생산하는 것; 및
상기 쿠메스트린에 산, 염기, 효소 및 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 처리하여 쿠메스트린으로부터 당을 제거하는 것을 더 포함하는 쿠메스트롤 생산방법. - 제8항에 있어서,
상기 산, 염기, 효소 및 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 처리는 쿠메스트린을 포함하는 콩과 식물의 추출물에 대해 처리하는, 쿠메스트롤 생산방법.
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