DE60114151T2

DE60114151T2 - Extraktion von flavonoiden

Info

Publication number: DE60114151T2
Application number: DE60114151T
Authority: DE
Inventors: Robert Gerard Wallace; Gerald Willfrits BURONG
Original assignee: MAABAROT PROJECT LAUNCHING AND; MAABAROT PROJECT LAUNCHING AND MANAGEMENT Ltd
Current assignee: MAABAROT PROJECTS LAUNCHING AND MANAGEMENT LTD., M
Priority date: 2000-01-11
Filing date: 2001-01-11
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2021-01-12
Also published as: DE60114151D1; CA2396734A1; ATE307126T1; CA2396734C; EP1254131A1; EP1254131A4; NZ519931A; WO2001051482A1; CN1395573A; EP1254131B1; DK1254131T3; EP1254131B8; ES2251458T3; BR0107486A; JP2004500374A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren der Extraktion eines Flavonoid-Aglykons aus einem Ausgangsmaterial, das ein Flavonoid-Glykosid und/oder Konjugat davon enthält. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein effizientes Verfahren zur Herstellung von angereicherten Flavonoid-Aglykone-Extrakten aus Pflanzenmaterial unter Verwendung von wässrigen Lösungsmitteln bereit.
Technischer Hintergrund
Flavonoide sind eine Gruppe von Phytochemikalien mit breitgefächerten Anwendungen, einschließlich ihrer Verwendung als Therapeutika, als anti-mikrobielle Stoffe und als Antioxidantien. Sie können zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Reihe von medizinischen Störungen und Krankheiten eingesetzt werden, einschließlich degenerativer Krankheiten wie Herzkrankheiten, Alzheimer, Demenz und Krebserkrankungen, um einige aufzuzählen. Die Charakteristika und Eigenschaften der Flavonoide sind in der wissenschaftlichen Literatur ausführlich dokumentiert.
Die Nachfrage nach „natürlichen" Heilmitteln aus Phytochemikalien steigt und wird mit wachsendem Durchschnittsalter der Weltbevölkerung noch weiter ansteigen. Zudem findet innerhalb der jüngeren Bevölkerungsschichten eine Hinwendung zu natürlichen Alternativen zur Behandlung oder Vorbeugung von medizinischen Zuständen statt. Zusätzlich wird immer stärker gefordert, dass solche Mittel keine Reste organischer Lösungsmittel enthalten sollen, vor allem solche, die industriell synthetisiert werden, und dass Produkte so umweltfreundlich wie möglich hergestellt werden sollen. Die Gesellschaft legt zudem hohen Wert auf die Verwendung biologisch abbaubarer Materialien sowie auf die Anwendung von möglichst umweltfreundlichen Verfahren.
Die Flavonoide sind eine Untergruppe der Pflanzenpolyphenole, wobei die Dreiringstrukturen aus einem Grundgerüst aus fünfzehn Kohlenstoffatomen bestehen. Pflanzen-Flavonoid-Aglykone (das heißt, Flavonoide ohne angehängte Zucker) treten in einer Vielzahl von Strukturformen auf. Alle enthalten jedoch fünfzehn Kohlenstoffatome als Grundgerüst und diese sind in einer C₆-C₃-C₆-Konfiguration angeordnet, das heißt, zwei aromatische Ringe, die über eine Einheit aus drei Kohlenstoffatomen verknüpft sind, die entweder einen dritten Ring bildet oder nicht.
Die wichtige Rolle von Flavonoiden in Ernährung und Medizin wird mehr und mehr erkannt. Es sind die Flavonoide in Rotwein, grünem Tee, nativem Olivenöl, Sojaprodukten, Früchten und Gemüse, verschiedenen traditionellen medizinischen Kräutertees und Tinkturen, die zumindest teilweise für die aus ihrem Verzehr erlangten Vorteile verantwortlich sind.
Eine Gruppe der Flavonoide, deren Wert bekannt ist, ist die der Isoflavone. Die Isoflavone haben eine charakteristische Struktur und bilden eine bestimmte Gruppe von Isomeren der Flavonoide. Das Interesse an den Isoflavonen war beträchtlich, da man vermutete, dass sie derjenige Faktor der traditionellen orientalischen Ernährungsweise sind, der für das geringere Auftreten von Brust- und Prostatakrebs in einigen Bevölkerungsgruppen Ostasiens verantwortlich ist.
Obwohl die Isoflavone auch in anderen Pflanzenfamilien auftreten, werden sie am stärksten mit den Hülsenfrüchten assoziiert, vor allem mit der Papilionoideae-Unterfamilie der Leguminosae, die viele bekannte Futterpflanzen wie Klee, Hülsenbohnen, Sojabohnen und Erbsen einschließt, sowie Strauchpflanzen wie Stechginster und Ginster.
Zusätzlich zu der für Mensch und Tier gesundheitsfördernden Wirkung der Isoflavone, wurde kürzlich ihre Anwendung in der Tierfutterindustrie gezeigt. Bei Schweinen, denen mit dem Futter Isoflavone verabreicht wurden, wiesen im Durchschnitt erhöhte tägliche Gewichtszunahmen auf, verbrauchten aber nicht mehr Futter. Die Schweine wiesen auch einen prozentual höheren Anteil an Skelettmuskeln und eine höher geschätzte Zunahme an Muskelmasse pro Tag auf.
Unter idealen Bedingungen wäre die Ernährung jedes Einzelnen so ausgewogen, dass mit der sorgfältigen Auswahl von Nahrungsmitteln, Mahlzeiten und Getränken ausreichende Mengen dieser Stoffe aufgenommen würden, in der Realität ist dies jedoch vor allem für Stadtmenschen häufig nicht möglich. Aus diesem Grund besteht ein Bedarf an und eine Nachfrage nach Präparaten, die reich an Flavonoiden sind, die bequem und effektiv als Nahrungsergänzungsmittel oder als Therapeutika verwendet werden können.
Techniken aus dem Stand der Technik zur Extraktion von Flavonoiden weisen im Allgemeinen einen oder mehrere der folgenden Nachteile auf: (i) sie schließen die Verwendung giftiger Reagenzien ein; (ii) sie erfordern übermäßige Mehrtachextraktionen; (iii) sie schließen die Extraktion des Flavonoids in seiner glykosylierten Form (Flavonoid-Glykosoid) ein; (iv) sie sind viel zu zeitaufwendig und (v) sie schließen die Verwendung erheblicher Mengen entzündlicher organischer Lösungsmittel ein.
Die vorliegende Erfindung sucht die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden und ein einfaches und leicht durchführbares Verfahren zur Isolierung von Flavonoiden bei relativ hohen Ausbeuten verglichen mit den Verfahren des Standes der Technik bereitzustellen.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines angereicherten Flavonoid-Aglykon-Extrakts aus einem Ausgangsmaterial bereit, das ein geeignetes Flavonoid-Glykosid und/oder ein Konjugat davon enthält, das die folgenden Schritte umfasst:

(i) enzymatisches Umwandeln des Flavonoid-Glykosids oder Konjugats davon in das Flavonoid-Aglykon;
(ii) Einstellen des pH-Werts, um das Flavonoid-Aglykon löslich zu machen, und Entfernen der unlöslichen Fraktion; und
(iii) Einstellen des pH-Werts, um das lösliche Flavonoid-Aglykon relativ unlöslich zu machen, und Bilden eines Extrakts, der dasselbe enthält.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Flavonoid" jedes Pflanzenpolyphenol mit folgender allgemeiner Strukturformel:
oder Dimere, Trimere oder Polymere davon.
Bestimmte Flavonoide für die Zwecke der vorliegenden Erfindung schließen ein: Chalcone, Dihydrochalone, Aurone, Flavanone, Flavone, Neoflavonoide, Catechine, Flavonole, Dihydroflavonole, Proanthocyanidine, Flavane, Flavan-3-ole und Biflavonoide, ihre verschieden methoxylierten und anders modifizierten Formen wie etwa Konjugate, wie etwa Acyl-Konjugate, insbesondere einschließlich Acacetin, Apigenin, Baicalein, Chrysin, Chrysoeriol, Datiscetin, Dihydrobinetin, Dihydrokämpferol, Diosmetin, Catechin, Epicatechin, Eriodictyol, Fisetin, Fustin, Galangin, Hesperetin, Isorhamnetin, Kämpferol, Luteolin/Digitoflavon, Morin, Myricetin, Naringenin, Oroxylin A, Ponciretin, Quercetagetin, Quercetin, Robinetin, Scutellarein, die Silymaringruppe, Silybin, Silidianin, Silicristin, Helmkraut-Flavon II, Tangeretin, Wogonin und Isoflavone wie Genistein, Daidzein, Formononetin, Biochanin A, Baptenin und Pratensein, mit folgender allgemeiner Strukturformel:
Das Ausgangmaterial kann variiert werden und umfasst bevorzugt Pflanzenmaterial wie eine Pflanze oder einen Teil oder ein Präparat davon, das ein Flavonoid-Glykosid und/oder ein Konjugat davon enthält. Insbesondere schließt Pflanzenmaterial das folgende ein: Blätter, Kronenblätter, Kelchblätter, Blüten, Blattstiele, Austriebe, Wurzeln, Strünke, Samen, Hülsen, Knollen, Rinde, Kambium, Gehölz, Gallen, Früchte, Gemüse, Kräuter, Bakterien, Algen, Farne, Saft, Harze, Häute wie zum Beispiel Trauben-, Apfel-, Zwiebel- und Avocadohäute, Schalen einschließlich Zitrusschalen, Fruchtschalen, Pulpe wie etwa des Apfels, Weintrester, Getreidespelzen, Stroh, Heu, Ölsamenkuchen aus Oliven, Raps oder Canola und andere Ölfruchtextrakte. Das Ausgangsmaterial kann auch aus gentechnisch veränderten (gentechnisch manipulierten) Organismen wie veränderte Bakterien, Algen oder Pilze und GM-Pflanzen und ihren Teilen und Produkten sein.
Eine bestimmte Gruppe für das Ausgangsmaterial sind eingeweichte und keimende Samen und gesprossene Samen wie etwa Samen von Hülsenfrüchtlern. Samen von Hülsenfrüchtlern, außer Sojabohnen, enthalten im trockenen Samen im Wesentlichen keine Isoflavonoide, aber es wurde herausgefunden, dass bestimmte Anteile von Isoflavonen entstehen, wenn sie eingeweicht sind und sich zu Sprossen entwickeln, und dass der Isoflavon-Anteil im Extrakt und die Ausbeute auf der Basis des Gewichts der trockenen Samen deutlich ansteigt. Dieser Anstieg kann mindestens bis zu der Stufe andauern, in der der Blatttrieb erscheint und die ersten Blätter sich öffnen.
Des weiteren können die Samenentwicklung und Flavonoid-Synthese durch die Temperatur beeinflusst werden und vorzugsweise die Samenentwicklung und somit die Erzeugung von Isoflavonen ereignet sich bei etwa 23 bis 28°C. Allgemein lässt sich sagen, dass die Ausbeuten aufgrund der weit erkannten Auswirkung der Temperatur auf die Keimbildung bei jüngeren Samen bei höheren Temperaturen höher sein werden (bis zu einer Obergrenze) und die Ausbeuten bei den gleichaltrigen Samen bei niedrigeren Temperaturen sinken.
Der Patentanmelder hat außerdem herausgefunden, dass Sojabohnen durch Vorkeimen als Ausgangsmaterial verwendet werden können, um ein ausreichend angereichertes Flavonoid-Produkt herzustellen. Hierbei enthalten Sojabohnen signifikante Anteile an Isoflavonoid-Glykosiden im trockenen Samen. Dennoch können das Einweichen und die Keimbildung durchgeführt werden, damit sich die Enzyme bilden, die für die Umwandlung der Glykoside in Aglykone notwendig sind. Hierbei werden die Sojabohnen bevorzugt mindestens einen Tag lang ungefähr bei Raumtemperatur (25°C) eingeweicht, um endogene Enzyme zu aktivieren, und so den Isoflavonoid-Anteil in dem gemäß der Erfindung erhaltenen Extrakt zu erhöhen. Die höheren Enzymanteile, die für die Herstellung der Aglycone notwendig sind, können mit der Entwicklung der Wurzel unter der Samenschale zusammenfallen. Die Entstehung der besseren Isoflavonoid-Anteile in den Extrakten und Ausbeute pro Samen sind wiederum temperaturabhängig.
Die Extraktion aus solchen Samen und Sprossen kann das ergeben, was als (Iso)flavonoid-angereicherte Proteinextrakte mit 50 bis 60%igem oder höherem Proteingehalt beschrieben werden kann. Diese angereicherten Proteinkonzentrate können in (Iso)flavonoid-Protein-Isolate umgewandelt werden, indem wasserlösliche Kohlenhydrate etc. herausgewaschen werden, um den Proteinanteil zu erhöhen. Die Ausbeute kann außerdem verbessert werden, indem die keimenden Samen und Sprossen feiner zerkleinert werden, vor allem wenn es sich um besonders robustes Ausgangsmaterial handelt.
Pflanzen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung schließen sämtliche Pflanzen ein, die ein Flavonoid-Glykosid und/oder Konjugat davon enthalten, besonders bevorzugte Pflanzen sind jedoch Hülsenfrüchtler wie Soja, Kichererbsen (Cicer spp wie etwa Cicer arietinum), weißer Honigklee (Meliotus alba), Luzerne oder Alfalfa (Medicago sativa) oder Trifolium-Species. Es wird verstanden, dass eine Materialkombination aus verschiedenen Pflanzen das Ausgangsmaterial darstellen kann.
Bevorzugt ist die Umwandlung des Flavonoid-Glykosids und/oder Konjugats davon vollständig. Dennoch ist es wahrscheinlicher und praktischer, dass ein Teil des Flavonoid-Glykosids und/oder Konjugats davon im Ausgangsmaterial nicht in Flavonoid-Aglycone umgewandelt wird. Je höher der Grad der Umwandlung, desto mehr Flavonoid-Aglycone werden aus dem Extraktionsverfahren gewonnen. In jedem Fall wird der in dem Verfahren der Erfindung erreichte Umwandlungsgrad von den Verfahrensparametern bestimmt, einschließlich der erforderlichen Produktionsmenge des Verfahrens.
Die zur Umwandlung des Flavonoid-Glykosids verwendeten Enzyme können variiert werden und schließen Enzyme mit der Fähigkeit ein, Glykosidbindungen zu hydrolysieren, wie etwa ein Enzym aus der Gruppe, die folgendes umfasst: Glykosidasen, β-Glykosidasen, β-Galactosidase, β-Glucuronidase, Pectinasen, Hesperidinase, Anthocyanase, Rhamnodiastase, Naringinase oder Takadiastase.
Weitere Enzyme schließen solche ein, die die Bindung in den Flavonoid-Glykosid-Konjugaten zwischen dem Glukose(Zucker)-Rest und dem konjugierten Rest (z.B. eine Acylgruppe) hydrolysieren können, wie zum Beispiel die Isoflavon-7-0-Glykosid-6''-Malonat-Malonylesterase oder entsprechende Enzyme, die in geeigneten Pflanzen vorkommen.
Solche Enzyme können käuflich erworben werden oder aus Fachleuten ersichtlichen Quellen gewonnen werden, zum Beispiel aus Tieren, wie etwa aus der Schweineleber, aus Pflanzen, wie etwa aus Trifolium spp, Cicer spp, Helianthus spp, Melilotus spp, Medicago spp, Camellia (Thea) sinensis, Prunus spp, (z.B. P. amygdalus, P. communis, P. avium, P. armeniaca), Rhamnus frangula und Rhamnus utilis, aus Pilzen wie etwa Aspergillus spp einschließlich Aspergillus niger oder Apergillus oryzae, Saccharopolyspora erythraea, Robinia pseudoacacia L und Rhizobium spp, aus Bakterien wie etwa Leuconostoc oenos, Pediococcus cerevisiae und Lactobacillus plantarum oder aus Darmbakterien wie Bacteriodes spp und aus Hefepilzen wie Saccharomyces cerevisiae, Hansenula anomala, Kloeckera apiculata und Candida pulcherimma.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung von gentechnisch manipulierten Enzymen, wie sie aus gentechnisch veränderten (gentechnisch manipulierten) Organismen gewonnen werden. Hierbei könnten durch gentechnische Veränderung Pflanzen oder Mikroorganismen verwendet werden, die anderenfalls keine ausreichenden Mengen von Enzymen oder Enzyme mit nicht ausreichender Aktivität produzieren würden. Des weiteren kann die Gentechnik auch angewendet werden, um die Eigenschaften der Enzyme, wie etwa ihre Aktivität, zu verbessern. Alle derartigen gentechnisch manipulierten Erzeugnisse können im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Je nach vorherrschenden Bedingungen kann die enzymatische Umwandlung des Flavonoid-Glykosids oder Konjugats davon in das Flavonoid-Aglykon die Verwendung einer Vielzahl von Enzymen einschließen, die gleichzeitig oder sequentiell verwendet werden können, damit die notwendige Umwandlung erfolgt. Ein Fachmann ist in der Lage, die Art der enzymatischen Umwandlung mindestens abhängig von den Erfordernissen des Verfahrens und dem Ausgangsmaterial festzustellen.
In einigen Fällen kann die Umwandlung des Flavonoid-Glykosids und/oder Konjugats davon in das Flavonoid-Aglykon eine Behandlung mit einer Vielzahl von Enzymen erfordern, die entweder sequentiell oder gleichzeitig angewendet werden. Hierbei kann es nötig sein, dass das Flavonoid-Glykosid und/oder Konjugat davon zunächst in eine Zwischenform einer Verbindung oder von Verbindungen umgewandelt wird, bevor es in das Flavonoid-Aglykon umgewandelt wird. Das Erfordernis für die Umwandlung in ein Zwischenprodukt und die verwendeten bestimmten Enzyme werden einem Fachmann ersichtlich sein. Beispielsweise muss Narangin (ein Glykosid) zunächst mit Hilfe von alpha-Rhamnosidase in Prunin (Glykosid- Zwischenprodukt) umgewandelt werden, bevor es durch die Hydrolyse der Glukosereste mit Hilfe einer β-Glukosidase in seine Flavonoid-Aglykon-Form Naringinin umgewandelt wird.
Das Flavonoid-Glykosid kann auch vorbehandelt werden, um eine oder mehrere Zuckerreste oder Teile davon zu entfernen, bevor die enzymatische Umwandlung in das Flavonoid-Aglykon erfolgt. Hierbei kann das Flavonoid-Glykosid dahingehend behandelt werden, einige der Zuckerreste oder Teile davon wie Saccharideinheiten zu hydrolysieren, um ein teilweise umgewandeltes Flavonoid-Glykosid zu ergeben. Dabei können ein oder mehrere Zuckerreste durch Hydrolyse aus dem Flavonoid-Glykosid unter Verwendung von starken Säuren entfernt werden, die mindestens einen Zuckerrest an dem Flavonoid-Glykosid zurücklassen.
Es ist möglich, dass andere Variablen eingestellt werden müssen, um die höchstmögliche Ausbeute aus einem gegebenen Extraktionsverfahren und insbesondere aus der enzymatischen Umwandlung zu erhalten. Die Steuerung dieser Variablen und die bestimmte Kombinierung der Bedingungen, die zur bestmöglichen Umwandlung führen, ist einem Fachmann leicht ersichtlich. Derartige Variablen schließen die Temperatur, den Feuchtigkeitsgehalt und das Hinzufügen weiterer gelöster Stoffe oder enzymstabilisierender Mittel ein.
Besteht das Ausgangsmaterial aus Pflanzenmaterial mit einer relativ intakten Zellstruktur, in welcher das Flavonoid-Glykosid und/oder Konjugat davon sowie das Enzym enthalten sind, dann ist das Flavonoid-Glykosid und/oder Konjugat davon im Allgemeinen im Zellinneren von dem Enzym getrennt, das geeignet ist, es in das Flavonoid-Aglykon umzuwandeln. In diesem Fall können das Enzym und das Flavonoid-Glykosid und/oder Konjugat davon in Kontakt gebracht werden, indem mindestens die zelluläre Struktur des Pflanzenmaterials zerstört wird.
Somit stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines angereicherten Flavonoid-Aglykon-Extrakts aus Pflanzenmaterial bereit, das ein Flavonoid-Glykosid und/oder Konjugat davon enthält und das die folgenden Schritte umfasst:

(i) Zerstören der zellulären Struktur des Pflanzenmaterials, um das darin enthaltene Flavonoid-Glykosid oder Konjugat davon mit zumindest einem darin enthaltenen Enzym in Kontakt zu bringen, das geeignet ist, das Flavonoid-Glykosid oder Konjugat davon in ein Flavonoid-Aglykon umzuwandeln, und somit das Umwandeln des Flavonoid-Glykosids oder Konjugats davon in das Flavonoid-Aglykon;
(ii) Einstellen des pH-Wertes, um das Flavonoid-Aglykon löslich zu machen, und Abtrennen der unlöslichen Fraktion; und
(iii) Einstellen des pH-Wertes, um das Flavonoid-Aglykon relativ unlöslich zu machen, und Isolieren des Flavonoid-Aglykons.

Behandlungen, die die zelluläre Struktur mindestens zerstören, schließen Behandlungen zum Aufbrechen der Zellen ein. Hierfür gibt es viele Möglichkeiten, die einem Fachmann bekannt sind, einschließlich Behandlungen wie Mahlen, Zerkleinern, Zerstoßen oder Walzen, Gefrieren und Auftauen, Enzymbehandlungen wie etwa Hemizellulasen oder Zellulasen, Ultraschalltechnik, Trocknen, Behandlung mit ultravioletter Strahlung, Verwendung von Druckminderung oder -erhöhung, einschließlich Extrusion und Druckanwendungen auf abgedichtete Chargen, mikrobielle Verdauung oder Silierung, Behandlung mit oxidierenden und anderen Chemikalien, Reinigungsmittelbehandlungen oder eine beliebige Kombination aus den vorhergehenden.
Nach dem Zerstören der zellulären Struktur sollte jeglicher in diesem Schritt hinzugefügte Stoff, der den Rest des Verfahrens behindern würde, aus der Reaktionsmischung entfernt werden, bevor das Verfahren fortgesetzt wird.
Zudem können gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte Extrakte zusätzlich behandelt werden, um die Konzentration der interessierenden Flavonoide noch zu erhöhen. Hierfür können zusätzliche Reinigungsverfahren durchgeführt werden, wie z.B. Auswaschen mit Alkohol. Hier wurde herausgefunden, dass durch Aussetzen der Extrakte der vorliegenden Erfindung gegenüber einem Auswaschen mit Alkohol (z.B. Methanol, Ethanol oder wässrigem Ethanol) und Verdampfung des Lösungsmittels eine signifikante Erhöhung der Flavonoid-Aglycon-Konzentration um etwa das 2–6-Fache erreicht werden kann.
Wie oben angegeben, kann das Ausgangmaterial sowohl das Enzym als auch das Flavonoid-Glykosid und/oder Konjugat davon enthalten. Das Ausgangsmaterial kann jedoch das Flavonoid-Glykosid und/oder Konjugat davon mit einer unzureichenden Enzymmenge oder sogar ohne Enzym für die Durchführung der notwendigen Umwandlung umfassen. In solchen Fällen kann das Verfahren der Erfindung auch die Zugabe eines Enzyms umfassen, das für die Umwandlung des Flavonoid-Glykosids und/oder Konjugats davon in das Flavonoid-Aglykon geeignet ist.
Somit stellt die vorliegenden Erfindung auch ein Verfahren der Extraktion eines Flavonoid-Aglykons aus einem Ausgangsmaterial bereit, das ein Flavonoid-Glykosid und/oder Konjugat davon enthält und das die folgenden Schritte umfasst:

(i) Umwandeln des Flavonoid-Glykosids und/oder Konjugats davon in das Flavonoid-Aglykon durch Hinzugeben eines Enzyms zu dem Ausgangsmaterial, das für die Umwandlung des Flavonoid-Glykosids und/oder Konjugats davon in das Flavonoid-Aglykon geeignet ist;
(ii) Einstellen des pH-Werts, um das Flavonoid-Aglykon löslich zu machen, und Abtrennen der unlöslichen Fraktion; und
(iii) Einstellen des pH-Werts, um das Flavonoid-Aglykon relativ unlöslich zu machen, und Isolieren des Flavonoid-Aglykons aus der Lösung.

Nach der Herstellung des Flavonoid-Aglykons kann es notwendig sein, dieses vor Polymerisation oder einer anderen ungewollten Modifikation zu schützen. Es kann zum Beispiel notwendig sein, dass die Aktivität der Polyphenol-Oxidase beschränkt oder beseitigt wird, um eine Polymerisation des Flavonoid-Aglykons zu verhindern. Dies kann mit physikalischen Mitteln, wie z.B. Wärme, oder mit chemischen Mitteln, wie z.B. Schwefeldioxid, Natriummetabisulfit, Blausäure, Kohlenmonoxid, ein oder mehrere proteinverdauende Enzyme; und/oder durch Anwendung von Verfahren, die Sauerstoff ausschließen, z.B. indem man eine Kohlendioxid- oder Stickstoffatmosphäre bereitstellt oder durch Vakuumsaugen erreicht werden. Bei letztere Ansatz wird der Ausschluss von Sauerstoff solange fortgeführt, bis die Polyphenoloxidase-Aktivität herkömmlich dauerhaft beseitigt ist oder alternativ, bis das Flavonoid-Aglykon von der Flüssigkeit oder den Feststoffen abgetrennt wurde, die die Polyphenoloxidase-Enzyme enthält.
Der pH-Wert wird eingestellt, um das Flavonoid-Aglykon löslich zu machen. So kann der pH-Wert auf ungefähr mindestens 8,5 und bevorzugter auf mindestens 9,6; 11 oder 12 oder alternativ auf ungefähr 9,6–12 eingestellt werden. Jedoch variiert das bestimmte Niveau der benötigten pH-Werteinstellung in Abhängigkeit von mindestens dem bestimmten Flavonoid-Aglykon, das extrahiert wird.
Die Effizienz des Effekts der alkalischen Extraktion im Verfahren der vorliegenden Erfindung ist überraschend, da die Ausbeute der Extraktion steigt, wenn der pH-Wert über den pH-Wert hinaus angehoben wird, an dem eine gewissermaßen 100%-ige (99,9%-ige) Ionisierung der Isoflavonoide stattfindet (wenn pH = pKa + 3 pH-Einheiten oder ca. 10,2 beträgt), wobei bei diesem pH-Wert die Isoflavonoid-Aglykone vollständig wasserlöslich sind. Die Extraktion steigt sogar noch bei pH-Werten weiter an, die erwartungsgemäß einen Zerfall der Isoflavone bei einem pH-Wert von 12–12,5 verursachen.
Zudem wäre bei einer Erhöhung des pH-Werts über den pH-Wert der vollständigen Ionisierung (pKa + 3) keine erhöhte Ausbeute zu erwarten, sondern eher eine niedrigere Ausbeute aufgrund von gesteigerten Geschwindigkeiten der basenkatalysierten Oxidation. Es wurde herausgefunden, dass Genistein und Biochanin A pKa-Werte von ungefähr 7,2 haben. Dies würde parallel zu dem beobachteten Effekt der Veränderung des pH-Werts des Säureniederschlags sein, wobei keine Veränderung der Ausbeute stattfindet, wenn man die Protonenkonzentration um das Tausendfache variiert, wenn die Genistein und Biochanin A Isoflavonoid-Aglykone vollständig ungeladen (99+%) sind.
Die Einstellung des pH-Wertes, um das Flavonoid-Aglykon löslich zu machen, kann auf jede einem Fachmann bekannte Art erfolgen, einschließlich durch das Hinzufügen einer Base wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid, andere Alkalimetall- und Erdalkalimetallhydroxide oder Natriumacetat, die in einer flüssigen oder festen Form sein kann, oder Ammoniakgas. Der pH-Wert wird verändert, um sicherzustellen, dass ein ausreichender Anteil des Flavonoid-Aglykons gelöst wird. Unlösliches Pflanzenmaterial kann weiter behandelt werden, um eine vollständigere Extraktion des Flavonoid-Aglykons in die flüssige Phase zu erreichen. Derartige weitere Behandlungen schließen Waschen, Spülen und Perkolieren des unlöslichen Pflanzenmaterials ein.
Wenn das Flavonoid-Aglykon ausreichend gelöst ist, kann die unlösliche Fraktion durch ein beliebiges oder eine Kombination von Routineverfahren zum Trennen von löslichen und unlöslichen Fraktionen entfernt werden, die einem Fachmann bekannt sind. Derartige Verfahren schließen folgendes ein: Absetzenlassen, Filtrieren und Zentrifugieren. Zu beachten gilt, dass für die Zwecke der vorliegenden Erfindung der Ausdruck „Abtrennen der unlöslichen Fraktion" und offensichtliche Varianten davon das Entfernen eines Teils der unlöslichen Fraktion und insbesondere das Entfernen des größten Teils der unlöslichen Fraktion umfasst, was durch Zentrifugieren oder andere leicht ersichtliche Mittel geschehen kann.
Bevorzugt wird das alkalische Extrahieren unter minimaler Belüftung des Reaktionsvolumens durchgeführt, um einen Zerfall der Flavonoide zu verhindern. Hierbei wurde überraschenderweise festgestellt, dass das Minimieren der Belüftung des Reaktionsvolumens während des alkalischen Extrahierens die Ausbeute signifikant erhöht. Das Minimieren der Belüftung während des alkalischen Extrahierens kann auf verschiedenste Arten erfolgen, einschließlich (jedoch nicht ausschließlich) die folgenden: Vermeiden des Schüttelns der Probe, des Spritzens, des heftigen Rührens, sowie anderer Vermischung von Luft mit der flüssigen Probe. Alternativ kann die Belüftung vermieden werden, indem das alkalische Extrahieren in einer sauerstoffreduzierten oder sauerstofffreien Atmosphäre stattfindet, wie in einer Stickstoff- oder Argonatmosphäre, oder sauerstoffabsorbierende Stoffen können in die alkalische Lösung gegeben werden.
Danach wird der pH-Wert eingestellt, um das Flavonoid-Aglykon unlöslich zu machen. So kann der pH-Wert auf ungefähr 2 oder 3, oder 2–6 oder bevorzugter etwa 3–5,6 wie etwa 3,5; 3,6; 5,3 oder 5,6 eingestellt werden. Das erforderliche bestimmte Niveau der pH-Wert-Einstellung variiert abhängig von mindestens dem bestimmten Flavonoid-Aglykon, das extrahiert wird. Der optimale pH-Wert für diese Verfahrensstufe kann leicht von einem Fachmann bestimmt werden, der empirische Untersuchungen zur Bestimmung des optimalen pH-Werts für ein gegebenes Flavonoid-Aglykon durchführen kann.
Das Einstellen des pH-Wertes, um das Flavonoid-Aglykon unlöslich zu machen, kann auf jede denkbare, einem Fachmann bekannte Art und Weise erfolgen, einschließlich des Hinzugebens einer Säure wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Milchsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Essigsäure, oder Propionsäure, die in einer flüssigen, festen oder gasförmigen Form sein kann. Der pH-Wert wird verändert, um sicherzustellen, dass ein ausreichender Teil des Flavonoid-Aglykons unlöslich gemacht wird. Bei Bedarf kann die Einstellung des pH-Werts unter Schütteln erfolgen, um sicherzustellen, dass sich die Reaktanten vollständig mischen und im besten Falle eine vollständige Azidifizierung der Flavonoid-Aglykone stattfindet. Die lösliche Fraktion kann weiter bearbeitet werden, um einen noch vollständigeren Übergang des Flavonoid-Aglykons in die unlösliche Phase zu erhalten.
Wenn das Flavonoid-Aglykon als eine Suspension oder ein Niederschlag ausreichend getrennt ist, dann kann die unlösliche Fraktion durch ein beliebiges oder eine Kombination von Routineverfahren entfernt werden, die einem Fachmann zum Trennen von löslichen und unlöslichen Fraktionen bekannt sind. Derartige Verfahren schließen folgendes ein: Absetzenlassen, Filtrieren, Kristallisation, Co-Kristallisation und Zentrifugieren. Zur Unterstützung der Trennung kann auch Salz hinzugefügt werden und die Reaktionsmischung kann je nach Bedarf durch Abdampfen oder teilweises Gefrieren konzentriert werden. Das Trennen kann auch durch Herabsetzen der Temperatur oder Kühlen des Reaktionsvolumens unterstützt werden.
Das Trennen kann auch durch andere herkömmliche Techniken wie die Verwendung organischer Lösungsmittel, selektiver Membranfiltration und Chromatographie einschließlich Dünnschichtchromatographie, Flüssigchromatographie und Hochdruckflüssigchromatographie erreicht werden. Angesäuerte wässrige oder wässrige organische Niederschläge der Reaktionsmischung können ferner gereinigt oder konzentriert werden, indem man sie auf Aktivkohle absorbiert.
Eine weitere Möglichkeit der Reinigung wäre es, den Niederschlag aus dem Schritt der Säureextraktion in einem geeigneten Lösungsmittel zu lösen und die Lösung dann so zu modifizieren, dass eine oder mehrere der Nichttlavonoid-Komponenten unlöslich werden und ausfallen. Ein geeignetes Verfahren dafür wäre das Auflösen des Niederschlages in Ethanol mit anschließendem Modifizieren durch Hinzufügen von Aceton, wobei erwartet würde, dass sämtliche mitgelöste Zucker, Saponine und Proteine mehr oder weniger ausgefällt werden. Die verbleibende Lösung kann verdampft und der konzentrierte Extrakt wiedergewonnen werden oder die Lösung können weiter verarbeitet werden.
Eine mögliche Komplikation bei der Verwendung von Pflanzenmaterial als das Ausgangsmaterial für die Extraktion ist das Mitfällung von nicht erwünschten Pflanzenproteinen während des Extrahierens. Hierbei ist es möglich, dass die verschiedenen Bedingungen, die zur Abtrennung des Flavonoid-Aglykons während des Extrahierens verändert wurden, dieses nicht adäquat von anderen Pflanzenproteinen trennen. Dies kann durch zusätzliche Behandlungsschritte erfolgen, die am Ausgangsmaterial oder im Laufe des Extraktionsverfahrens angewendet wurden, um die mit einer Mitfällung assoziierten Probleme wenigstens zu verringern.
Somit kann die vorliegende Erfindung noch zusätzlich eine Behandlung zur Modifizierung der unerwünschten Proteine umfassen, damit diese die Extraktion der Flavonoid-Aglykone in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht übermäßig störend beeinflussen. Derartige Behandlungen schließen diejenigen ein, die folgendes erzielen: (i) ein verringertes Niveau von unerwünschten Proteinen in der löslichen Phase nach dem Schritt der Alkalisierung und (ii) ein gesteigertes Niveau von unerwünschten Proteinen oder Proteinmaterial in der löslichen Phase nach dem Schritt der Azidifizierung.
Die Behandlungen können variiert werden und schließen solche ein, die dem Fachmann leicht ersichtlich sind. Behandlungen, die die vorliegende Erfindung umfasst, schließen folgende ein: Erwärmen, chemische Behandlung, z.B. mit Tannin oder Bentonit, Enzymbehandlung oder elektrisches Entladen des Ausgangs-Pflanzenmaterials vor der Einstellung des alkalischen pH-Wertes oder der Reaktionsmischung aus dem Schritt des alkalischen Extrahierens, um sicherzustellen, dass die unerwünschten Proteine in unlöslicher Form vorliegen und somit von dem interessierenden löslichen Flavonoid-Aglykon getrennt werden können. Ein weiterer Ansatz wäre es, die Reaktionsmischung nach dem Schritt des alkalischen Extrahierens durch eine Säule zu schicken, die mit einem proteinabsorbierenden Stoff gefüllt ist.
Alternativ kann die Reaktionsmischung nach dem sauren Schritt des Extrahierens auch mit einer Proteinase wie Pepsin oder Papain behandelt werden, welche die unerwünschten Proteine im sauren Medium zu löslichen Formen umwandelt. Zudem kann Größenausschlusschromatographie einschließlich Gelfiltration oder ein Größenausschlussmembranfilter mit ausreichend engen Poren verwendet werden, so dass Flavonoidmoleküle hindurchpassen, jedoch nicht die größeren Proteine. Auch andere biologische Mittel können angewendet werden, einschließlich Fermentation mit proteinverdauenden oder -absorbierenden Mikroben. Silierung des zerstoßenen Materials kann in dem Extraktionsprotokoll ebenfalls verwendet werden.
Wie bereits erwähnt, sorgt das Verfahren der vorliegenden Erfindung für relativ hohe Ausbeuten an Flavonoiden wie zum Beispiel Isoflavonoiden. Beispielsweise können die Ausbeuten etwa um mindestens 25% höher als äquivalent ablaufende Verfahren sein, bei denen jedoch organische Lösungsmittel für das Extrahieren verwendet werden, bevorzugter um mindestens 50% höher und noch bevorzugter um mindestens 67% höher sein als veröffentlichte Ausbeuten.
Beispiele
Soweit nicht anders angegeben: (i) wurde das durch Stoff gefilterte Filtrat aus den alkalischen Extraktionen in den nachfolgenden Beispielen zweimal mit einer Lösung gespült, deren pH-Wert den der für das Extrahieren benutzten Lösungen entsprach; (ii) wurden alle alkalischen Extraktionen in den nachfolgenden Beispielen unter minimaler Belüftung und gemäß der folgenden allgemeinen Vorgehensweise durchgeführt: (a) das Pflanzenmaterial wurde mit einer größeren Menge Wasser versetzt, für gewöhnlich mindestens zwei- bis viermal mehr (b) der Suspensionslösung wurden anfangs geringe Volumina konzentrierter Natriumhydroxidlösung hinzugegeben (ungefähr 5 M), (c) später, mit Erreichen des gewählten pH-Werts, wurde die Natriumhydroxidlösung tropfenweise hinzugegeben, (d) das Natriumhydroxid wurde effizient mit der Suspensionslösung (bei minimaler Belüftung) vermischt und es wurde ausreichend lange gewartet, um einen stabilen pH-Wert in der Mischung zu erreichen (d) nachdem der gewünschte pH-Wert schließlich erreicht worden war, wurde der Wert nach weiteren 2 bis 5 Minuten nochmals überprüft und der pH-Wert im Falle einer Abweichung des Wertes eingestellt; und (iii) sämtliche in den Beispielen genannten Flavonoid-Ausbeuten wurden durch Anwendung von Dünnschichtchromatographie oder durch UV-spektroskopische Verfahren bestimmt.
Beispiel 1A
Eine Probe von etwa 1 kg Blätter an (langen) Halmen von unterirdischem Klee (Trifolium subterraneum L.), im Winter 1999 im Südwesten von Westaustralien gewachsen, wurde Anfang Oktober geerntet, bei ca. 20°C einen Tag lang sowie zehn Tage lang bei 5°C gelagert. Die Blätter von etwa 0,5 kg dieses gelagerten Materials wurden abgeschnitten und in einer Plastiktüte aufbewahrt.
25 g der Kleeblätter wurden mit 50 g säuregewaschenem nassen weißen Sand gemischt und 3,5 Minuten lang in einem Mörser und PistiII gemahlen. Die gemahlene Mischung aus Blättern und Sand wurde für 10 Minuten in eine versiegelte Plastiktüte gegeben und 20 Minuten lang bei ungefähr 62°C hitzebehandelt.
Am folgenden Tag wurde das hitzebehandelte Material in ein Becherglas gegeben und es wurden 200 ml von entionisiertem Wasser hinzugefügt, während des Rührvorgangs wurde 5 M Natriumhydroxidlösung mit einer Tropfpipette hinzugefügt, um den pH-Wert der Suspension auf 9,6 zu erhöhen. Das grobzerkleinerte faserige Material wurde entfernt, indem die Suspension durch eine Dreifachschicht aus feiner Gaze gegeben wurde, das schlammige Material, das die Gaze passierte, wurde durch Zentrifugieren bei 2000 upm für 2 Minuten entfernt.
Der pH-Wert der abgetrennten Lösung wurde dann auf 5,3 eingestellt. Die Mischung mit einem pH-Wert von 5,3 wurde 48 Stunden lang auf einer Temperatur von etwa 1°C gehalten und dann durch teilweises Gefrieren der Lösung und darauffolgendes Entfernen des gebildeten Eises konzentriert, so dass das Endvolumen etwa 100 ml betrug, die übriggebliebenen Lösung und der Niederschlag wurden durch Filterpapier gefiltert.
Das Filterpapier und der zurückgehaltene Niederschlag wurden bei 40°C getrocknet und der Isoflavongehalt wurde in einer modifizierten, das heißt nicht gemahlenen Version, nach der Methode von C. M. Francis und A. J. Millington gemessen („Varietal variation in the isoflavone content of subterranean clover: its estimation by a microtechnique", C. M. Francis und A. J. Millington, Australian Journal of Agricultural Research, Band 16, Seiten 557–64, 1965).
Das Gewicht des auf dem Filterpapier zurückgebliebenen Materials wurde durch Messen des Gewichts von vier Filterpapieren, wodurch das Durchschnittsgewicht berechnet wurde, und durch Abziehen dieses Durchschnittsgewichts von dem gemessenen Gewicht des im Versuch verwendeten Filterpapiers und dessen zurückgehaltenem Material berechnet.
Ergebnisse
Gewicht des auf dem Filterpapier zurückgebliebenen Materials – 0,35 g. Isoflavongehalt in dem trockenen gefilterten Niederschlag war Genistein 26,1 g/100 g, Biochanin A 8,5 g/100 g, Formononetin 2,1 g/100 g, Daidzein wurde nicht nachgewiesen. Die berechnete Extraktion von Isoflavonen aus 25 g Kleeblättern betrug 0,128 g.
Beispiel 1B
Eine Probe von etwa 1 kg Blätter mit (langen) Halmen von unterirdischem Klee (Trifolium subterraneum L.) der Sorte Trikkala, im Winter 1999 im Südwesten von Westaustralien gewachsen, wurde Anfang Oktober geerntet, bei ca. 20°C einen Tag lang sowie zehn Tage lang bei 5°C gelagert.
Die Blätter von etwa 0,5 kg dieses gelagerten Materials wurden abgeschnitten und in einer Plastiktüte aufbewahrt. 25 g der Kleeblätter wurden mit 50 g säuregewaschenem nassen weißen Sand gemischt und 3,5 Minuten lang in einem Mörser und PistiII gemahlen. Die gemahlene Mischung aus Blättern und Sand wurde für 10 Minuten in eine versiegelte Plastiktüte gegeben und dann 20 Minuten lang bei ungefähr 62°C hitzebehandelt.
Am folgenden Tag wurde das hitzebehandelte Material in ein Becherglas gegeben und es wurden 200 ml von entionisiertem Wasser hinzugefügt, während des Rührvorgangs wurde 5 M Natriumhydroxidlösung mit einer Tropfpipette hinzugefügt, um den pH-Wert der Suspension auf 12,0 zu erhöhen. Das grobzerkleinerte faserige Material wurde entfernt, indem die Suspension durch eine Dreifachschicht aus feiner Gaze gegeben wurde.
Der pH-Wert der abgetrennten Lösung und Suspension wurde dann auf 5,6 eingestellt. Die Mischung mit einem pH-Wert von 5,6 wurde 48 Stunden lang auf etwa 1°C gehalten und dann durch teilweises Gefrieren der Lösung und Entfernen des gebildeten Eises konzentriert, so dass das Endvolumen etwa 100 ml betrug, die übriggebliebene Lösung und der Niederschlag wurden durch Filterpapier gefiltert. Das Filterpapier und der zurückgehaltene Niederschlag wurden bei 40°C getrocknet und der Isoflavongehalt wurde gemessen wie in Beispiel 1A beschrieben.
Das Gewicht des auf dem Filterpapier zurückgebliebenen Materials wurde durch Messen des Gewichts von vier Filterpapieren, wodurch das Durchschnittsgewicht berechnet wurde, und durch Abziehen dieses Durchschnittsgewichts von dem gemessenen Gewicht des im Versuch verwendeten Filterpapiers mit dessen zurückgehaltenem Material berechnet.
Ergebnisse
Gewicht des auf dem Filterpapier zurückgebliebenen Materials – 1,1 g. Isoflavongehalt in dem trockenen gefilterten Niederschlag war Genistein 7,3 g/100 g, Biochanin A 2,4 g/100 g, Formononetin 0,55 g/100 g, Daidzein wurde nicht nachgewiesen. Die berechnete Extraktion von Isoflavonen aus 25 g Kleeblättern betrug 0,113 g.
Beispiel 1C
Eine Probe von etwa 1 kg Blätter mit (langen) Halmen von unterirdischem Klee (Trifolium subterraneum L.) der Sorte Trikkala, im Winter 1999 im Südwesten von Westaustralien gewachsen, wurde Anfang Oktober geerntet, bei ca. 20°C einen Tag lang sowie zehn Tage lang bei 5°C gelagert. Die Blätter von etwa 0,5 kg dieses gelagerten Materials wurden abgeschnitten und in einer Plastiktüte aufbewahrt.
26 g der Kleeblätter wurden mit 52 g säuregewaschenem nassen weißen Sand gemischt und 3,5 Minuten lang in einem Mörser und PistiII gemahlen. Die gemahlene Mischung aus Blättern und Sand wurde für 10 Minuten in eine versiegelte Plastiktüte gegeben und wurde dann 20 Minuten lang bei ungefähr 62°C hitzebehandelt.
Am folgenden Tag wurde das hitzebehandelte Material in ein Becherglas gegeben und es wurden 200 ml von entionisiertem Wasser hinzugefügt, während des Rührvorgangs wurde 5 M Natriumhydroxidlösung mit einer Tropfpipette hinzugefügt, um den pH-Wert der Suspension auf 12,0 zu erhöhen. Das grobzerkleinerte faserige Material wurde entfernt, indem die Suspension durch eine Dreifachschicht aus feiner Gaze gegeben wurde. Der pH-Wert der abgetrennten Lösung und Suspension wurde dann auf 3,5 eingestellt. Die Mischung mit einem pH-Wert von 3,5 wurde 48 Stunden lang bei etwa 1°C gehalten und dann durch teilweises Gefrieren der Lösung und darauffolgendes Entfernen des gebildeten Eises konzentriert, so dass das Endvolumen etwa 100 ml betrug, die übriggebliebenen Lösung und der Niederschlag wurden durch Filterpapier gefiltert. Das Filterpapier und der zurückgehaltene Niederschlag wurden bei 40°C getrocknet und der Isoflavongehalt wurde gemessen wie in Beispiel 1A beschrieben.
Das Gewicht des auf dem Filterpapier zurückgebliebenen Materials wurde durch Messen des Gewichts von vier Filterpapieren, wodurch das Durchschnittsgewicht berechnet wurde, und durch Abziehen dieses Durchschnittsgewichts von dem gemessenen Gewicht des im Versuch verwendeten Filterpapiers und dessen zurückgehaltenem Material berechnet.
Ergebnisse
Gewicht des auf dem Filterpapier zurückgehaltenen Materials – 1,09 g. Isoflavongehalt in dem trockenen gefilterten Niederschlag war Genistein 11,1 g/100 g, Biochanin A 3,8 g/100 g, Formononetin 0,85 g/100 g, Daidzein wurde nicht nachgewiesen. Die berechnete Extraktion von Isoflavonen aus 26 g Kleeblättern betrug 0,171 g.
Im Gegensatz dazu waren die Ausbeuten unter Verwendung des gleichen Verfahrens und äquivalenten Ausgangsmaterials, aber mit einem zusätzlichen Filtrierungsschritt des Produkts des alkalischen Extrahierens durch gesintertes Glas folgende: Gewicht des auf dem Filterpapier zurückgehaltenen Materials – 0,415 g, Genistein 6,3/100 g, Biochanin A 1,25 g/100 g, Formononetin 0,40 g/100 g. Die berechnete Extraktion von Isoflavonen aus 26 g Kleeblättern betrug 0,033 g.
Beispiel 1D
Eine Probe von etwa 1 kg Blätter mit (langen) Halmen von unterirdischem Klee (Trifolium subterraneum L.) der Sorte Trikkala, im Winter 1999 im Südwesten von Westaustralien gewachsen, wurde Anfang Oktober geerntet, bei ca. 20°C einen Tag lang sowie zehn Tage lang bei 5°C gelagert. Die Blätter von etwa 0,5 kg dieses gelagerten Materials wurden abgeschnitten und in einer Plastiktüte aufbewahrt.
26 g der Kleeblätter wurden mit 52 g säuregewaschenem nassen weißen Sand gemischt und 3,5 Minuten lang in einem Mörser und PistiII gemahlen. Die gemahlene Mischung aus Blättern und Sand wurde für 10 Minuten in eine versiegelte Plastiktüte gegeben und wurde dann 20 Minuten lang bei ungefähr 62°C hitzebehandelt.
Am folgenden Tag wurde das hitzebehandelte Material in ein Becherglas gegeben und es wurden 150 ml von entionisiertem Wasser hinzugefügt, während des Rührvorgangs wurde 5 M Natriumhydroxidlösung mit einer Tropfpipette hinzugefügt, um den pH-Wert der Suspension auf 11,0 zu erhöhen. Das grobzerkleinerte faserige Material wurde entfernt, indem die Suspension durch eine Dreifachschicht aus feiner Gaze gegeben wurde. Einen Teil des Schlammes, der in den alkalischen Kleesuspensionen auftrat, ließ man absetzen und entfernte ihn, indem die Flüssigkeit mit dem zurückbleibenden suspendierten Material in ein anderes Becherglas abgegossen wurde.
Der pH-Wert der abgetrennten Lösung und Suspension wurde dann auf 3,6 eingestellt. Die Mischung mit einem pH-Wert von 3,6 wurde 48 Stunden lang bei etwa 1°C gehalten und dann durch teilweises Gefrieren der Lösung und darauffolgendes Entfernen des gebildeten Eises konzentriert, so dass das Endvolumen etwa 100 ml betrug, die übriggebliebene Lösung und der Niederschlag wurden durch Filterpapier gefiltert. Das Filterpapier und der zurückgehaltene Niederschlag wurden bei 40°C getrocknet und der Isoflavongehalt wurde gemessen wie in Beispiel 1A beschrieben.
Das Gewicht des auf dem Filterpapier zurückgehaltenen Materials wurde durch Messen des Gewichts von vier Filterpapieren, wodurch das Durchschnittsgewicht berechnet wurde, und durch Abziehen dieses Durchschnittsgewichts von dem gemessenen Gewicht des im Versuch verwendeten Filterpapiers und dessen zurückgehaltenem Material berechnet.
Ergebnisse
Gewicht des auf dem Filterpapier zurückgehaltenen Materials – 1,25 g. Isoflavongehalt in dem trockenen gefilterten Niederschlag war Genistein 15,5 g/100 g, Biochanin A 5,2 g/100 g, Formononetin 1,30 g/100 g, Daidzein wurde nicht nachgewiesen. Die berechnete Extraktion von Isoflavonen aus 26 g Kleeblättern betrug 0,125 g.
Das Verhältnis der Isoflavone in den Niederschlägen der Beispiele 1A bis 1D beträgt jeweils Genistein 10,10,10,10 zu Biochanin A 3,2; 3,3; 3,4; 3,4 zu Formononetin 0,8; 0,8; 0,8; 0,8; somit wird angezeigt, dass die Ionisierungsgleichgewichte wahrscheinlich sehr ähnlich sind und wahrscheinlich auf die phenolische OH-Gruppe in Position 7 zurückzuführen sind, die alle drei aufweisen.
Beispiel 1E
Blätter von unterirdischem Klee wurden von späten (nach dem Beginn der Blüte) auf dem Feld gewachsenen gemischten unterirdischen Kleepflanzen Trikkala und Larisa abgeschnitten, die bei etwa 5°C einen Monat lang gelagert worden waren. Die angelagerten Längen der Blattstiele waren 1 bis 1,5 cm lang.
Portionen von 10 g wurden etwa 70 Sekunden lang gemahlen, und nach fünf Minuten wurde Natriummetabisulfitlösung hinzugegeben, um das Material zu konservieren. Die Endkonzentration betrug 1,2% des Gewichts der Blätter. Das Pflanzenmaterial wurde gefroren gelagert bis zum Extrahieren, wo die einzelnen Proben mit Wasser vermischt und der pH-Wert auf den gewählten Wert eingestellt wurde, nach zwei Stunden wurden sie Stoff-gefiltert, der gefilterte Feststoff wurde zweimal gewaschen, die gefilterte Lösung auf den pH-Wert 2 eingestellt und über Nacht bei 20°C gelagert, bevor sie auf Papier Papier-gefiltert wurde und das gefilterte Material warm getrocknet wurde.
Ergebnisse
Die Ergebnisse werden in untenstehender Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

A – Menge der Isoflavone pro 100 g Blättermaterial
B – Isoflavongehalt im Niederschlag g/100 g

Beispiel 1F
Das gleiche Blättermaterial wie in Beispiel 1E wurde verarbeitet wie in Beispiel 1E, mit den zusätzlichen Schritten des Erhitzens bei 58 bis 64°C während 40 Minuten vor dem Extrahieren bei pH-Werten von 10 oder 12.
Ergebnisse
Die Ergebnisse werden in untenstehender Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

Beispiel 1G
Blätter von unterirdischem Klee wurden von am Boden gewachsenen späten Pflanzen von unterirdischem Klee der Sorte Trikkala abgeschnitten, die gerade zu blühen begonnen hatten. Das Verhältnis von Blättern zu Blattstielen betrug 77,5% zu 22,5%.
Vier Chargen von je 11 g Blättern wurden vorbereitet, jede Charge wurde mit etwa 4 g sauberem Quarzsand 90 Sekunden lang in einem Mörser und PistiII gemahlen, nach einem Zeitraum von ungefähr 3,5 Minuten wurde eine Natriummetabisulfitlösung (Endkonzentration 0,2% des Gewichts des Klees) hinzugegeben um das Material zu konservieren, die Chargen wurden in einzelne Plastiktüten verpackt und vierzig Minuten lang in einem heißen Wasserbad auf zwischen 58 und 63°C erhitzt.
Am folgenden Tag wurden die einzelnen Chargen zusammengegeben, es wurde entionisiertes Wasser (etwa 300 ml) hinzugegeben und bei pH-Wert 12 etwa 20 Minuten lang extrahiert, bevor grob durch Stoff gefiltert wurde, der gefilterte Feststoff wurde zweimal gewaschen und die alkalische Lösung in vier gleiche Portionen von 77,5 ml aufgeteilt, von denen jede 3,5 Minuten zentrifugiert wurde. Die einzelnen zentrifugierten Lösungen wurden jeweils auf die pH-Werte 2,0; 3,0; 4,0 und 5,0 eingestellt, bevor sie über Nacht gelagert und am nächsten Tag durch Papier gefiltert wurden. Das gefilterte Material wurde warm getrocknet.
Ergebnisse
Die Ergebnisse werden in untenstehender Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3

Beispiel 1H
Blätter von unterirdischem Klee wurden von späten (nach dem Beginn der Blüte) gemischten unterirdischen Kleepflanzen der Sorten Trikkala und Larisa abgeschnitten, die bei etwa 5°C drei Tage lang gelagert worden waren.
Portionen von 11 g wurden ungefähr 90 Sekunden lang gemahlen und nach 5 Minuten mit Wasser vermischt, der pH-Wert der Mischung wurde auf 10 eingestellt, nach verschieden langen Zeitspannen wurden sie durch Stoff gefiltert, der gefilterte Feststoff zweimal gewaschen, der pH-Wert der gefilterten Lösung auf 2 eingestellt und bei 20°C über Nacht gelagert, bevor sie auf Papier Papier-gefiltert wurden und das gefilterte Material warm getrocknet wurde.
Ergebnisse
Die Ergebnisse werden in untenstehender Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4

Beispiel 1I
Blätter von unterirdischem Klee wurden von späten (nach dem Beginn der Blüte) auf dem Feld gewachsenen gemischten unterirdischen Kleepflanzen der Sorten Trikkala und Larisa abgeschnitten, die bei etwa 5°C 16 Tage lang gelagert worden waren.
Portionen von 10 g wurden ungefähr 70 Sekunden lang gemahlen und nach 5 Minuten wurde Natriummetabisulfitlösung hinzugegeben, um das Material zu konservieren, wobei die Endkonzentration zwischen 0 und 2,0% des Gewichts der Blätter betrug. Das Pflanzenmaterial wurde vor dem Extrahieren 5 Tage lang bei Raumtemperatur gelagert, dann wurden die einzelnen Proben mit Wasser vermischt und der pH-Wert für einen Zeitraum von 1,5 Stunden auf 10 eingestellt, danach wurden sie durch Stoff gefiltert, der gefilterte Feststoff zweimal gewaschen, die gefilterte Lösung auf den pH-Wert 2 eingestellt und bei 20°C über Nacht gelagert, bevor sie auf Papier Papier-gefiltert wurden und das gefilterte Material warm getrocknet wurde.
Ergebnisse
Die Ergebnisse werden in untenstehender Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5

A – Menge der Isoflavone g/100 g Blättermaterial
B – Isoflavongehalt im Niederschlag g/100 g

Beispiel 1J
Blätter von unterirdischem Klee wurden von späten (nach dem Beginn der Blüte) auf dem Feld gewachsenen gemischten unterirdischen Kleepflanzen der Sorten Trikkala und Larisa abgeschnitten, die bei etwa 5°C 25 Tage lang gelagert worden waren.
Portionen von 16 g wurden ungefähr 90 Sekunden lang gemahlen und nach 5 Minuten wurde Natriummetabisulfitlösung hinzugegeben, um das Material zu konservieren, wobei die Endkonzentration 0,2 oder 1,2% des Gewichts der Blätter betrug. Das Material wurde 40 Minuten lang bei 59 bis 64°C erhitzt. Die Probe wurde mit Wasser vermischt und der pH-Wert für einen Zeitraum von 1,5 Stunden auf 12 eingestellt, danach wurden sie durch Stoff gefiltert, der gefilterte Feststoff zweimal gewaschen, die gefilterte Lösung zentrifugiert und auf den pH-Wert 2 eingestellt und bei 20°C über Nacht gelagert, bevor sie auf Papier Papier-gefiltert wurden und das gefilterte Material warm getrocknet wurde.
Ergebnisse
Aus 16 g Blätter, die mit 0,2% Natriummetabisulfit konserviert worden waren, wurde 0,502 g trockener Niederschlag mit einem Isoflavongehalt von etwa 24,3 g/100 g, oder etwa 0,76 g/100 g Blättermaterial, oder 4,1% auf Trockengewichtsbasis gewonnen.
Aus 16 g Blätter, die mit 1,2% Natriummetabisulfit konserviert worden waren, wurde 0,710 g trockener Niederschlag mit einem Isoflavongehalt von etwa 24,0 g/100 g, oder etwa 1,07 g/100 g Blättermaterial, oder 5,66% auf Trockengewichtsbasis gewonnen.
Beispiel 1K
Blätter von unterirdischem Klee wurden von späten (nach dem Beginn der Blüte) auf dem Feld gewachsenen gemischten unterirdischen Kleepflanzen der Sorten Trikkala und Larisa abgeschnitten, die bei etwa 5°C 25 Tage lang gelagert worden waren.
Eine Portion von 16 g wurde ungefähr 90 Sekunden lang gemahlen und nach 5 Minuten wurde Natriummetabisulfitlösung hinzugegeben, um das Material zu konservieren, wobei die Endkonzentration 1,2% des Gewichts der Blätter betrug. Die Probe wurde mit Wasser vermischt und der pH-Wert für 1,5 Stunden auf 10 eingestellt, danach wurden sie durch Stoff gefiltert, der gefilterte Feststoff zweimal gewaschen, die gefilterte Lösung auf den pH-Wert 2 eingestellt und bei 20°C über Nacht gelagert, bevor sie auf Papier Papier-gefiltert wurden und das gefilterte Material warm getrocknet wurde.
Ergebnisse
Aus 16 g Blätter, die bei einem pH-Wert von 10 extrahiert wurden, wurde 1,10 g trockener Niederschlag mit einem Isoflavongehalt von etwa 12,6 g/100 g, oder etwa 0,86 g/100 g Blättermaterial, oder 4,57% auf Trockengewichtsbasis gewonnen.
Beispiel 2A

(1) Samen der italienischen Weißen Bitterlupine (Lupinus albus) wurden einen Tag lang in Leitungswasser eingeweicht, wobei das Wasser zweimal ausgetauscht wurde. Man ließ die Lupinen bei einer Raumtemperatur von ungefähr 25°C sprießen und am zehnten Tag, als die Wurzeln gut entwickelt waren und in dem Stadium, wo die ersten Blätter aus der Öffnung zwischen den beiden Hälften der Keimblätter hervorkamen, wurden Portionen von 56 g der gesprossenen Lupinen mit Sand in einem Mörser und PistiII gemahlen.
(2) Das gemahlenen Material aus (1) wurde während unterschiedlicher Zeitspannen (16 Minuten bis fünf Stunden – siehe unten) stehen gelassen, um die Hydrolyse der vorhandenen Genistein-Glykoside zu erlauben.
(3) Das hydrolysierte gemahlene Material wurde mit ungefähr 300 ml Wasser zu einer Suspensionslösung vermischt und der pH-Wert auf 12,0 eingestellt und auf einem pH-Wert zwischen 11,9 und 12,0 bei 30°C über einen bestimmten Zeitraum hinweg gehalten (siehe unten).
(4) Die Mischung aus (3) wurde durch Stoff gefiltert und bei ungefähr 600–100 upm fünf Minuten lang in einer Universalzentrifuge (Clements Modell B) zentrifugiert.
(5) Die gefilterte Lösung aus (4) wurde auf den pH-Wert 2,0 eingestellt und die angesäuerte Lösung wurde über Nacht stehen gelassen, damit der gebildete Niederschlag sich setzen konnte, danach wurde die Lösung gefiltert und getrocknet.

Ergebnisse
Die Ergebnisse werden in untenstehender Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6

A – mit Methylalkohol auswaschbarer Genisteingehalt

Bei den vereinten getrockneten Niederschlägen wurden 6% Feuchtigkeit, mit 59 Protein, 4,2% Asche und 17,8% mit Hexan extrahierbare Stoffe auf Trockengewichtsbasis gemessen.
Beispiel 2B
Samen von Lupinus albus wurden 24 Stunden lang eingeweicht und dann während verschieden langer Zeitspannen (23 Stunden, 4 Tage und 5 Tage) stehen gelassen, bevor sie gemahlen wurden, danach wurde 1–1,5 Stunde gewartet und schließlich die grobe Masse während 1,25 Stunden bei einem pH-Wert von 10,5 extrahiert. Die so erhaltenen Mischungen wurden durch Stoff gefiltert, um den Niederschlag zu entfernen, dann wurde auf pH-Wert 3,5 angesäuert und die Mischungen wurden gelagert, bevor sie durch Papier gefiltert wurden, um den Säureniederschlag zu isolieren.
Ergebnisse
Die Ergebnisse der Extraktion werden in untenstehender Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7

A – Menge an Genistein/Menge des trockenen Samenausgangsmaterials
B – Gehalt im Niederschlag g/100 g
C – Die Konzentration von Genistein in der Methanolauswaschung berechnet zu 6,4 g/100 g

Beispiel 2C
Samen der italienischen Weißen Lupine wurden vierundzwanzig Stunden lang mit zwei Luftpausen (air breaks) von jeweils einer Stunde (ungefähr nach 8 und nach 20 Stunden) eingeweicht und danach alle zwölf Stunden etwa eine Stunde lang für verschieden lange Zeitspannen (12 Stunden–9 Tage) eingeweicht. Die eingeweichten Samen wurden dann mit einer geringen Menge Sand in einem Mörser und PistiII etwa 10 Minuten lang gemahlen und in versiegelten Bechergläsern für verschieden lange Zeitspannen gelagert (65 Minuten–145 Minuten), bevor das Extrahieren bei einem pH-Wert von 10–12 durchgeführt wurde, dann wurde durch eine doppelte Schicht Stoff grob gefiltert, angesäuert (pH-Wert 2–3,5) und über Nacht gelagert, bevor durch Papier gefiltert wurde.
Ergebnisse
Die Ergebnisse werden in untenstehender Tabelle 8 gezeigt Tabelle 8

A – Genistein pro 100 g getrockneter Samen
B – Gehalt im Niederschlag g/100 g

Beispiel 2D
Schmalblättrige Blaue Lupinen (Lupinus angustofolius) der Sorte Gungurru mit einem Durchschnittsgewicht von 0,15 g wurden einen Tag lang in Leitungswasser eingeweicht, wobei das Wasser mehrmals ausgetauscht wurde, dann ließ man sie bei einer Raumtemperatur von ungefähr 25°C für verschieden lange Zeitspannen (4– 8 Tage) sprießen.
Alle Samen wurden mit einer geringen Menge Sand in einem Mörser und PistiII fünf Minuten lang gemahlen und für verschieden lange Zeitspannen (65–88 Minuten) in versiegelten Bechergläsern gelagert, bevor das Extrahieren bei einem pH-Wert von 12 60–90 Minuten lang durchgeführt wurde, dann wurden sie durch eine doppelte Schicht Stoff grob gefiltert, auf den pH-Wert 3,5 angesäuert und über Nacht gelagert, bevor sie durch Papier gefiltert wurden.
Ergebnisse
Die Ergebnisse werden in untenstehender Tabelle 9 gezeigt Tabelle 9

Beispiel 3A
Sojabohnensamen mit einem durchschnittlichen Trockengewicht von 0,16 g (0,15 g Ofen getrocknet) wurden 11 Stunden lang eingeweicht, eine Luftpause (air break) von 1 Stunde nach den ersten 7 Stunden nicht mitgerechnet. Nachdem sie abgetropft waren und 45 Minuten lang stehen gelassen worden waren, wurden die Samen zerdrückt und etwa 5 Minuten lang gut mit hinzugegebenem Sand mit einem Mörser und PistiII zerstoßen und dann in einem gegen Feuchtigkeitsverlust versiegelten Becherglas bei einer Raumtemperatur von ungefähr 25°C gelagert.
Nach 80 Minuten wurde die grobe Paste mit alkalischer Lösung ausgewaschen und der pH-Wert 2,5 Stunden lang auf 12 eingestellt, bevor gefiltert wurde, gefolgt von einer Einstellung des pH-Wertes der gefilterten Lösung auf 2,0. Die angesäuerte Lösung wurde über Nacht bei etwa 20°C zum Absetzen stehen gelassen, bevor durch Papier gefiltert und getrocknet wurde, abgewogene Portionen wurden dann mit Alkohol ausgewaschen und die Isoflavonlösungsanteile überprüft.
Ergebnisse
Aus 100 Samen wurden 7,27 g getrockneter Niederschlag gewonnen, etwa 0,15 g mit Methanol auswaschbare Isoflavone pro 100 g, annähernd 70 mg Isoflavone/100 g getrockneter Samen.
Beispiel 3B
Sojabohnensamen wurden 24 Stunden lang mit zwei Luftpausen (air breaks) von jeweils 1 Stunde (nach ungefähr 8 und 20 Stunden) eingeweicht und dann alle zwölf Stunden für ungefähr eine Stunde eingeweicht. Die Samen wurden mit einer geringen Menge an Sand 5–10 Minuten lang in einem Mörser und PistiII gemahlen und in versiegelten Bechergläsern für verschieden lange Zeitspannen gemahlen, bevor das Extrahieren mit alkalischer Lösung durchgeführt wurde, dann wurden sie durch eine doppelte Schicht Stoff gefiltert, angesäuert und über Nacht gelagert, bevor durch Papier gefiltert wurde.
Ergebnisse
24 Stunden lang eingeweichte Samen, die 5 Stunden lang stehen gelassen worden waren, bevor sie gemahlen und 80 Minuten stehen gelassen wurden, bei einem pH-Wert von 12 mit einer Lauge 2 Stunden lang extrahiert wurden und dann auf einen pH-Wert von 3,5 angesäuert wurden, erbrachten die folgende Ausbeute:
Aus 100 Samen wurden 7,387 g getrockneter Niederschlag von etwa 0,15 g Isoflavone pro 100 g, annähernd 73 mg/100 g getrockneter Samen gewonnen.
24 Stunden lang eingeweichte Samen, die danach 1,5 Tage stehen gelassen worden waren, waren in dem Stadium, in dem das erste Blatt unter der Samenschale sichtbar ist, die wenige mm lang ist. Die grobe Paste wurde nach dem Mahlen und nach 110 Minuten mit einer Lauge bei einem pH-Wert von 12 140 Minuten lang extrahiert, nach Filtrieren durch Stoff wurde das Filtrat in zwei gleichgroße Portionen aufgeteilt und auf den pH-Wert 3,5 bzw. 4,5 angesäuert. Die Ausbeuten waren wie folgt:
Bei einem pH-Wert von 3,5 wurden 4,30 g getrockneter Niederschlag, von etwa 0,20 g Isoflavonen pro 100 g gewonnen, annähernd 118 mg/100 g getrockneter Samen.
Bei einem pH-Wert von 4,5 wurden 4,84 g getrockneter Niederschlag, von etwa 0,23 g Isoflavonen pro 100 g gewonnen, annähernd 144 mg/100 g getrockneter Samen.
24 Stunden lang eingeweichte Samen, die danach 4 Tage lang stehen gelassen worden waren, waren in dem Stadium, in dem das Keimblatt gerade aus der Samenschale hervorkommt bis zu dem Punkt, wo das Keimblatt nach unten in Richtung der Wurzel geneigt ist und sich leicht öffnet. Die Samen wurden zerkleinert und etwa fünf Minuten lang gut mit hinzugegebenem Sand mit einem Mörser und PistiII zerstoßen und dann in einem gegen Feuchtigkeitsverlust versiegelten Becherglas bei einer Raumtemperatur von ungefähr 25°C gelagert, nach einem Zeitraum von 140 Minuten, wurde die grobe Paste dann mit alkalischer Lösung mit einem pH-Wert von 12 150 Minuten lang ausgewaschen bevor sie gefiltert wurde, gefolgt von einer Einstellung der gefilterten Lösung auf den pH-Wert 3,5. Die angesäuerte Lösung wurde über Nacht zum Absetzen bei ca. 20°C stehen gelassen, bevor sie durch Papier gefiltert und getrocknet wurde, abgewogene Portionen wurden dann mit Alkohol ausgewaschen, die Ausbeuten an Isoflavon sind unten beschrieben.
Aus 60 Samen wurden 6,17 g getrockneter Niederschlag von etwa 0,336 g Isoflavonen pro 100 g, annähernd 223 mg/100 g getrockneter Samen gewonnen. Die Konzentration in der Methanolauswaschung betrug 1,25 g/100 g.
Eine weitere Charge Sojasamen wurde zwei Stunden lang eingeweicht und dann eineinhalb Stunden lang stehen gelassen, bevor sie mit einer geringen Menge Sand in einem Mörser und PistiII zehn Minuten lang gemahlen wurde und danach in einem bedeckten Becherglas zwei Stunden lang gelagert wurde. Danach wurde das Extrahieren mit alkalischer Lösung bei einem pH-Wert von 12 zwei Stunden lang durchgeführt, daraufhin durch Stoff gefiltert und gewaschen, auf den pH-Wert 3,5 angesäuert und über Nacht gelagert, bevor durch Papier gefiltert und getrocknet wurde.
Aus 100 Samen wurden 5,88 g getrockneter Niederschlag von etwa 0,20 g Isoflavonen pro 100 g oder annähernd 80 mg/100 g getrockneter Samen gewonnen.
Beispiel 4
8 g Blätter von Pfefferminzpflanzen (Mentha piperita) wurden mit Sand sowie mit einer kleinen Menge Wasser in einem Mörser und PistiII für 1,5 Minuten gemahlen und die so hergestellte Blätterpaste wurde 13 Minuten lang stehen gelassen, um die Hydrolyse des vorhandenen Eriocitrins (Eriodyctyol-7-Rhaminosid-Glykosid) zu erlauben.
Die Blätterpaste wurde dann zu ungefähr 150 ml gemischter Suspensionslösung aufgegossen und der pH-Wert auf 12 eingestellt, und der pH-Wert wurde 90 Minuten lang zwischen 11,8 und 12,0 gehalten. Danach wurde die Mischung durch Stoff gefiltert, bevor der pH-Wert auf 2,0 eingestellt wurde. Die angesäuerte Lösung wurde über Nacht stehen gelassen, damit der gebildete Niederschlag sich vor dem Filtern mit Papier und dem Trocknen am folgenden Tag absetzen konnte.
Ergebnisse
Der getrocknete Niederschlag wog 0,372 g. Das mit Ethylalkohol auswaschbare Eriodictyol wurde auf ungefähr 2,5 g pro 100 g des getrockneten Niederschlags gemessen. Dies entspricht annähernd 118 mg pro 100 g Material von Pfefferminzblättern.
Beispiel 5
Käuflich erwerbbare eingeweichte Kichererbsen aus der Unterart Kabuli mit Wurzeln von ungefähr 2,5 cm Länge, aber ohne sichtbare obere Blatttriebe, wurden in einem Supermarkt gekauft und in einem Kühlschrank bei 5°C gelagert und zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Chargen eingeweicht, so dass sie sich weiter entwickeln konnten einschließlich bis zu dem Stadium vollständig gekeimter Samen. Diese wurden getestet, indem man die Samen nahm, sie zerkleinerte und ungefähr 10 Minuten lang gut mit hinzugefügtem Sand mit einem Mörser und PistiII zerstieß, dann wurden sie in gegen Feuchtigkeitsverlust versiegelten Bechergläsern bei Raumtemperatur von ungefähr 25 bis 28°C gelagert, nach einer Zeitspanne von mindestens 1,25–3 Stunden, wurde die grobe Paste mit alkalischer Lösung mit einem pH-Wert von 12 mindestens eine Stunde lang ausgewaschen, bevor sie gefiltert wurde, gefolgt von einer Einstellung des pH-Werts der gefilterten Lösung auf 3,5.
Die angesäuerte Lösung wurde über Nacht bei ungefähr 20°C stehen gelassen, damit sie sich setzen konnte, bevor sie durch Papier gefiltert und getrocknet wurde, abgewogene Portionen wurden dann mit Alkohol ausgewaschen und die Isoflavonlösungsanteile überprüft.
Ergebnisse
Im Kühlschrank gelagerte Probe mit keinem zusätzlichen Einweichen nach dem Kauf, Samen im Stadium ohne sichtbare Blatttriebe, aber mit Wurzeln bis zu 2,6 cm gemessen von der Stelle, wo die Wurzel aus dem Samen wächst, aus 60 Samen ergaben 9,15 g getrockneten Niederschlag von ungefähr 0,08 g Isoflavonen pro 100 g. Die Konzentration in der Methanolauswaschung betrug 0,6 g/100 g.
Samen im Stadium ohne sichtbare Blatttriebe, aber mit Wurzeln bis zu 4,4 cm, aus 60 Samen ergaben 8,94 g getrockneten Niederschlag von ungefähr 0,39 g Isoflavonen pro 100 g. Die Konzentration in der Methanolauswaschung betrug 3,0 g/100 g.
Samen im Stadium mit hervorkommenden bis bereits herausgekommenen Blatttrieben, aus 40 Samen wurden 6,17 g getrockneter Niederschlag von ungefähr 0,36 g Isoflavonen pro 100 g gewonnen. Die Konzentration in der Methanolauswaschung betrug 2,2 g/100 g.
Samen im Stadium, in dem die gesprossenen Keimblätter sich bereits mit einem großen Spalt dazwischen geteilt haben und die Sprosse bis zu 1,2 cm lang ist und mit Wurzeln bis zu oder länger als 5 cm aber mit keinen Nebenwurzeln an den Kichererbsenwurzeln, aus 67 Samen wurden 8,08 g getrockneter Niederschlag von ungefähr 0,41 g Isoflavonen pro 100 g gewonnen. Die Konzentration in der Methanolauswaschung betrug 2,4 g/100 g.
Samen im Stadium, in dem die Keimblätter komplett geöffnet sind und die Sprossen bis zu 2,5 cm lang sind und mit Wurzeln bis zu 6,7 cm mit Nebenwurzeln bis zu 1,4 cm Länge, aus 61 Samen wurden 8,41 g getrockneter Niederschlag von ungefähr 0,67 g Isoflavonen pro 100 g gewonnen.
Wenn Samen aus der Charge mit den Samen, die das Stadium der hervorkommenden bis bereits herausgekommenen Blatttriebe erreicht hatten, mit den zusätzlichen Schritten nach dem Zerdrücken und der Wartezeit 40 Minuten lang auf 60°C erhitzt wurden und nach dem Filtrieren und vor dem Schritt der Azidifizierung auf einen pH-Wert von 2,0 zentrifugiert wurden, wurde aus 50 Samen 2,61 g getrockneter Niederschlag von 0,75 g Isoflavonen pro 100 g gewonnen.
Bei den Beispielen gilt zu beachten, dass der Effekt der Extraktion bei alkalischem pH-Wert nicht auf die Hydroxidionen zurückzuführen sein kann, welche lediglich die negative Ladung auf den Pflanzenmaterialien erhöhen und somit die negativ geladenen ionisierten Isoflavonoid-Aglykone aufgrund der Abstoßung, die zwischen negativen Ionen herrscht, in Lösung zwingen. In diesem Fall würde das ledigliche Halten des Pflanzenmaterials auf einem erhöhten pH-Wert über längere Zeit dazu führen, dass höhere Mengen an Isoflavonoiden in Lösung gehen. Stattdessen ist die ausgewaschene Menge im Wesentlichen zeitunabhängig, wobei sich die Ausbeute wenig verändert, wenn die Auswaschungszeit bei einer Auswaschung an einem pH-Wert von 10 von 5 Minuten auf eine Stunde erhöht wird, aber sie reagiert schnell auf Änderungen des pH-Werts, Kleeblattmaterial, das bei einem pH-Wert von 9,5 extrahiert und Stoff-gefiltert wurde, mit nachfolgenden Waschen des Stoff-gefilterten Feststoffs mit einer Lösung mit einem pH-Wert von 12 statt 9,5, wobei dieser Vorgang wenige Minuten dauerte, wies eine um 27% erhöhte Extraktions-Ausbeute auf.
Es kann vermutet werden, dass das Erhöhen des pH-Werts nicht nur dazu führt, dass das Aglykon wasserlöslich wird, sondern es auch in die Lage versetzt, in Lösung zu gehen, entweder, indem dadurch die physikalische Natur des Pflanzenmaterials verändert wird – weniger physikalische Hindernisse durch das Auflösen vorhandener Strukturen, oder indem in gewisser Weise die chemische Umgebung verändert wird, vielleicht dadurch, dass Gleichgewichtszustände verändert werden, die Flavonoide in irgendeiner Bindung halten. Der spätere Mechanismus kann eine Erklärung für die Tatsache sein, dass beim alkalischen Extrahieren die Ausbeute höher als beim herkömmlichen Extrahieren mit organischen Lösungsmitteln ist.
Für die gesamte Spezifikation gilt, soweit nicht anders durch den Kontext vorgegeben, dass der Ausdruck „umfassen" oder Variationen davon, wie etwa „umfasst" oder „umfassend", als den Einschluss einer festgelegten ganzen Zahl oder einer Gruppe von ganzen Zahlen aber nicht den Ausschluss irgendeiner anderen ganzen Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen implizierend verstanden werden soll.

Claims

Ein Verfahren zur Herstellung eines angereicherten Flavonoid-Aglykon-Extrakts aus einem Ausgangsmaterial, das ein geeignetes Flavonoid-Glykosid und/oder Konjugat davon enthält, das die folgenden Schritte umfasst: (i) enzymatisches Umwandeln des Flavonoid-Glykosids oder Konjugats davon in das Flavonoid-Aglykon; (ii) Einstellen des pH-Wertes, um das Flavonoid-Aglykon löslich zu machen, und Entfernen der unlöslichen Fraktion; und (iii) Einstellen des pH-Wertes, um das lösliche Flavonoid-Aglykon relativ unlöslich zu machen, und Bilden eines Extrakts, der dasselbe enthält.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Flavonoid-Aglykon löslich gemacht wird, indem der pH-Wert auf ungefähr 8,5–12,5 eingestellt wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Flavonoid-Aglykon löslich gemacht wird, indem der pH-Wert auf ungefähr 9–12 eingestellt wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Flavonoid-Aglykon löslich gemacht wird, indem der pH-Wert auf ungefähr 11–12 eingestellt wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Flavonoid-Aglykon löslich gemacht wird, indem der pH-Wert auf mindestens ungefähr 8,5 eingestellt wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Flavonoid-Aglykon löslich gemacht wird, indem der pH-Wert auf mindestens ungefähr 9 eingestellt wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Flavonoid-Aglykon löslich gemacht wird, indem der pH-Wert auf mindestens ungefähr 9,6 eingestellt wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Flavonoid-Aglykon löslich gemacht wird, indem der pH-Wert auf ungefähr 11 oder 12 eingestellt wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Einstellung des pH-Wertes durch minimale Belüftung des Reaktionsvolumens erreicht wird, wodurch ein Zerfall der Flavonoide minimiert wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Einstellung des pH-Wertes durch die Zugabe einer Base erreicht wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Base Natriumhydroxid, Natriumacetat, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid oder Ammoniak ist.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die unlösliche Fraktion in Schritt (ii) durch eines oder durch eine Kombination aus mehreren des folgenden entfernt wird: Absetzenlassen, Filtrieren, und Zentrifugieren.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Flavonoid-Aglykon unlöslich gemacht wird, indem der pH-Wert auf ungefähr 2–6 eingestellt wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Flavonoid-Aglykon unlöslich gemacht wird, indem der pH-Wert auf ungefähr 2–5,6 eingestellt wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Flavonoid-Aglykon unlöslich gemacht wird, indem der pH-Wert auf ungefähr 2–3,5 eingestellt wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Flavonoid-Aglykon unlöslich gemacht wird, indem der pH-Wert auf ungefähr 2; 3,5; 3,6; 5,3 oder 5,6 eingestellt wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Einstellung des pH-Wertes in Schritt (iii) durch die Zugabe einer Säure erreicht wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die Säure Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Salpetersäure, Milchsäure, Weinsäure, Zitronensäure oder Propionsäure ist.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die unlösliche Fraktion in Schritt (iii) durch eines oder mehrere des folgenden getrennt wird: Absetzenlassen, Filtrieren, Kristallisation, Co-Kristallisation und Zentrifugieren.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei Schritt (iii) ferner mindestens eines des folgenden umfasst: Zugeben von Salz zur Unterstützung der Trennung, Konzentrieren der Reaktionsmischung durch Verdampfung oder teilweises Gefrieren; und/oder Reduzieren der Temperatur der Reaktionsmischung zur Verbesserung der Unterstützung der Trennung.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Flavonoid aus der Gruppe ausgewählt wird, die folgendes umfasst: Chalcone, Dihydrochalone, Aurone, Flavanone, Flavone, Neoflavonoide, Flavonole, Dihydroflavonole, Proanthocyanidine, Flavane, Flavan-3-ole und Biflavonoide, ihre verschieden methoxylierten und anders modifizierten Formen, Acacetin, Apigenin, Baicalein, Catechin, Chrysin, Chrysoeriol, Datiscetin, Dihydrobinetin, Dihydrokämpferol, Diosmetin, Catechin, Epicatechin, Eriodictyol, Fisetin, Fustin, Galangin, Hesperetin, Isorhamnetin, Kämpferol, Luteolin/Digitoflavon, Morin, Myricetin, Naringenin, Oroxylin A, Ponciretin, Quercetagetin, Quercetin, Robinetin, Scutellarein, die Silymaringruppe, Silybin, Silidianin, Silicristin, Helmkraut-Flavon II, Tangeretin, Wogonin und Isoflavone.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Flavonoid Genistein, Daidzein, Formononetin, Biochanin A, Baptenin oder Pratensein ist.
Ein Verfahren zur Herstellung eines angereicherten Flavonoid-Aglykon-Extrakts aus einer Pflanze oder einem Pflanzenmaterial, die/das ein geeignetes Flavonoid-Glykosid und/oder Konjugat davon enthält, das die folgenden Schritte umfasst: (i) enzymatisches Umwandeln des Flavonoid-Glykosids oder Konjugats davon in das Flavonoid-Aglykon; (ii) Einstellen des pH-Wertes, um das Flavonoid-Aglykon löslich zu machen, und Entfernen der unlöslichen Fraktion; und (iii) Einstellen des pH-Wertes, um das lösliche Flavonoid-Aglykon relativ unlöslich zu machen, und Bilden eines Extrakts, der dasselbe enthält.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei die Pflanze gentechnisch verändert ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 23 oder 24, wobei die Pflanze oder das Pflanzenmaterial davon aus der Gruppe ausgewählt wird, die folgendes umfasst: Blätter, Kronenblätter, Kelchblätter, Blüten, Blattstiele, Austriebe, Wurzeln, Strünke, Samen, Hülsen, Knollen, Rinde, Kambium, Gehölz, Gallen, Früchte, Gemüse, Kräuter, Farne, Saft, Harze, Häute, wie zum Beispiel Trauben-, Apfel, Zwiebel- und Avocadohäute, Schalen einschließlich Zitrusschalen, Fruchtschalen, Pulpe wie etwa des Apfels, Weintrester, Getreidespelzen, Stroh, Heu, Ölsamenkuchen aus Oliven, Raps oder Canola und andere Ölfruchtextrakte beinhaltet.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 bis 25, wobei die Pflanze ein Hülsenfrüchtler ist, wie etwa Soja, Kichererbsen (Cicer spp wie etwa Cicer arietinum), weißer Honigklee (Meliotus alba), Luzerne oder Alfalfa (Medicago sativa) oder Trifolium-Pflanzenarten.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 bis 26, wobei das Enzym eines oder mehrere Enzyme ist/sind, das/die aus der Gruppe ausgewählt wird, die folgendes umfasst: Glykosidasen, β-Glykosidasen, β-Galactosidase, β- Glucuronidase, Pectinasen, Hesperidinase, Anthocyanase, Rhamnodiastase, Naringinase und Takadiastase.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 bis 27, wobei das Enzym exogen ist und zu dem Flavonoid-Glykosid und/oder dessen Konjugat gegeben wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 bis 28, wobei eine Vielzahl von Enzymen auf eine sequentielle Art und Weise verwendet wird.
Ein Verfahren zur Herstellung eines angereicherten Flavonoid-Aglykon-Extrakts aus einem Pflanzenmaterial, das ein Flavonoid-Glykosid und/oder Konjugat davon enthält, das die folgenden Schritte umfasst: (i) Zerstören der zellulären Struktur des Pflanzenmaterials, um das darin enthaltene Flavonoid-Glykosid oder Konjugat davon mit zumindest einem darin enthaltenen Enzym in Kontakt zu bringen, das geeignet ist, das Flavonoid-Glykosid oder Konjugat davon in ein Flavonoid-Aglykon umzuwandeln, und somit das Umwandeln des Flavonoid-Glykosids oder Konjugats davon in das Flavonoid-Aglykon; (ii) Einstellen des pH-Wertes, um das Flavonoid-Aglykon löslich zu machen, und Abtrennen der unlöslichen Fraktion; und (iii) Einstellen des pH-Wertes, um das Flavonoid-Aglykon relativ unlöslich zu machen, und Isolieren des Flavonoid-Aglykons.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei die zelluläre Struktur durch folgendes zerstört wird: Mahlen, Zerkleinern, Zerstoßen oder Walzen, Gefrieren und Auftauen, Enzymbehandlungen wie etwa Hemizellulasen oder Zellulasen, Ultraschalltechnik, Trocknen, Behandlung mit ultraviolettem Licht, Verwendung von Druckminderung oder -erhöhung, einschließlich Extrusion als auch Druckanwendung auf abgedichtete Chargen, mikrobielle Verdauung oder Silierung, Behandlung mit oxidierenden und anderen Chemikalien, Reinigungsmittelbehandlungen oder eine beliebige Kombination aus den vorhergehenden.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 30 oder 31, wobei das Pflanzenmaterial Samen ist und vorbehandelt wurde, um darin die Erzeugung von Enzymen zu fördern, welche für die Umwandlung der Flavonoid-Glykoside und Konjugate davon in das Flavonoid-Aglycon notwendig sind.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 32, wobei die Vorbehandlung das Einweichen der Samen über einen Zeitraum umfasst, der für das Fördern der Herstellung der Enzyme ausreichenden ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 33, wobei die Samen ungefähr 10 Tage lang oder weniger eingeweicht werden.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 33, wobei die Samen ungefähr 0,5 bis 10 Tage lang eingeweicht werden.