KR100465778B1

KR100465778B1 - 항산화성 플라보노이드를 함유하고 있는 고품질의홍화잎차 추출물의 제조방법

Info

Publication number: KR100465778B1
Application number: KR10-2002-0030363A
Authority: KR
Inventors: 최상원; 이준영
Original assignee: 우리홍화인영농조합법인; 최상원
Priority date: 2002-05-30
Filing date: 2002-05-30
Publication date: 2005-01-13
Also published as: KR20030092638A

Abstract

본 발명은 기능성 홍화잎차 추출물의 제조방법에 관한 것으로서, 5월 초순경에 수확한 생체 홍화잎을 정선·수세한 후 찌고 건조한 후 150∼180℃에서 1∼2분 동안 볶아서 만든 홍화잎차를 열수추출하여 제조된 홍화잎차 물추출물은 항산화성 플라보노이드를 함유하고 있어 암, 심장병, 고혈압 및 노화 등의 예방 및 치료에 탁월한 효과가 있다.

Description

항산화성 플라보노이드를 함유하고 있는 고품질의 홍화잎차 추출물의 제조방법 {Method for preparation of Safflower leaf tea containing antioxidative flavonoids}

본 발명은 암, 고혈압, 심장병, 및 노화의 예방 및 치료에 유용한 홍화잎차 물추출물의 제조방법과 이 방법에 의해 제조된 홍화잎차 물추출물의 관한 것이다. 더욱 상세하게는 5월 초순경에 수확한 생체 홍화잎을 정선·수세한 후 찌고 건조한 다음 다시 150∼180℃에서 1∼2분 동안 볶아서 만든 홍화잎차를 열수추출하여 제조된 홍화잎차 물추출물을 제조하는 방법과 이 방법에 의해 제조된 홍화잎차 물추출물의 항산화성 플라보노이드에 관한 것이다.

최근 급격한 산업사회의 발전에 따른 환경오염의 가속화와 더불어 식생활 패턴의 서구화로의 변모로 육류 소비가 크게 증가하면서 암을 비롯한 심장병, 고혈압, 동맥경화증, 당뇨병 및 치매 등의 만성적인 퇴행성질환이 크게 증가하고 있다. 따라서 현재 이러한 만성적인 질환을 예방할 수 있는 천연물 유래의 새로운 생리활성물질을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 생체의 방어기구를 향상시켜 질병을 방지 및 회복시키거나, 면역기능 향상 및 노화 억제 등의 생체조절기능을 갖고 있는 천연 항산화물질에 대한 관심이 크게 고조되고 있다.

항산화물질은 불포화지방산의 자동산화과정에서 생성되는 활성카르보닐화합물 유래의 라디컬종(ROO·, RO·및 ROOH)을 포착 및 제거하여 지방을 함유한 식품의 산패를 억제해 줄 뿐 아니라 생체 내에서 생성되는 활성산소 라디컬(¹O₂, O^- ₂, H₂O₂, ·OH)에 의한 지질과산화반응을 억제하여 암, 동맥경화증, 염증, 면역저하 및 노화를 예방해주는 생리활성물질로써 크게 각광을 받고 있다(Halliwell and Gutteridge, Lipid peroxidation. In: Free Radicala in BIology and Medicine. 2nd ed., Clarendon Press, Oxford, 1988; Emerit and Lippman, Free radicals and lipid peroxidation in cell pathology, pp. 177-18, Vol. 1, CRC Press, Boca Raton, USA, 1990).

지금까지 여러 식물로부터 수많은 천연 항산화물질이 개발되어져 왔으며, 그 대표적인 소재로서는 곡류, 두류, 과채류, 향신료, 및 생약 등의 식물과 더불어 조류, 미생물 대사물, 동물식품, 발효식품, 단백질 가수분해물, 아미노카보닐 반응생성물 등을 들 수 있다(Larson,Phytochemistry27: 969-978, 1988; Nakatani,Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi37: 569-576, 1990). 그리고 대표적인 항산화물질로서는 플라보노이드, 탄닌, 안토시아닌, 프로시아니딘(procyanidin) 및 페놀산과 같은 폴리페놀화합물과, 여러 비타민류(β-carotene, α-tocopherol 및 L-ascorbic acid), 함황화합물(L-cysteine, glutathione 및 carnosin 등), 질소배당체(capsacine, tyramine, serotonins), 리그난 및 그 유도체(sesamol, sesamolin, rosmarinic acid 및 silymarin 등), 테르페노이드 및 그 유도체 (carnosol, rosmanol, γ-oryzanol 등) 등이 잘 알려져 있다(Larson,Phytochemistry27: 969-978, 1988; Nakatani,Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi37: 569-576, 1990). 특히, 이들 천연 항산화물질 중 최근 항암, 항혈전, 항염증 및 항산화성 기능성 신소재로써 가장 각광을 받고 있는 것이 바로 플라보노이드 화합물이다.

플라보노이드는 식물계에 널리 분포하는 폴리페놀화합물의 일종인 천연색소로서 감마-피론(γ-pyrone) 구조[C₆(benzene A ring)-C₃-C₆(benzene B ring]를 갖고 있으며, 특히 식물의 잎, 개화조직 및 화분 등에 많이 존재한다. 자연에 존재하는 플라보노이드는 보통 글리코사이드(glycosides)로 존재하나, 아글리콘(aglycones) 및 메틸화된 유도체 등으로도 널리 분포되어 있다(Harborne J.B. The flavonoids, Academic Press, 1990).

플라보노이드는 항염증, 항알레르기 및 항산화 작용 등 여러 가지 생리적·약리적 작용을 지니고 있으며(Havesteen B.,Biochem. Pharmacol., 32: 1141-1148, 1983; Fukuzawa and Takaishi,J. Act. Oxy. Free Rad., 1: 55-69, 1990), 특히 최근 플라보노이드를 많이 함유한 여러 과채류의 섭취는 만성적인 암 및 심장병의 발병을 낮춰주는 사실이 밝혀지고 있다(Yoshida M. et al.,FEBS Letter260: 10-13, 1990; Hertog et al.,J. Agric Food Chem., 40: 2379-2383, 1992a; Verma A.K. et al.,Cancer Res., 48: 5754-5758, 1998). 또한, 플라보노이드는 종양 발생과 깊은 연관이 있는 프로스타글라딘 신테이즈(prostaglandin synthase), 리포옥시제나제(lipoxygenase) 및 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase)와 같은 효소 저해제로써(Bauman et al.,Prostaglandin20: 627-639, 1980; Yoshimoto et al.,Biochem. Biphys. Res. Commun., 116: 612-618, 1983; Moroney et al.,J. Pharmacol. Phamacodyn., 278: 4-12, 1988; Laughton et al.,Biochem. Pharmacol., 42: 1673-1681, 1991) 뿐만 아니라 항노화성 물질인 L-아스코르브산(L-ascorbic acid)을 재생하거나, 아울러 무독화 효소에 속하는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase)와 같은 효소를 유도하는 것으로 보고되고 있다 (Smith and Yang, Effect of Food Phytochemicals on Xenobiotic Metabolism and Tumorigenesis, ACS, 1994). 이러한 이유 때문에 현재 식물로부터 새로운 항산화성 플라보노이드 화합물을 찾으려는 연구가 활발히 이루어지고 있다.

한편, 여러 식물에는 다양한 종류의 플라보노이드가 존재하며, 감마피론 골격에 케톤기 및 이중결합의 유무, 그리고 벤젠 치환체의 결합위치에 따라 플라본, 플라바논, 플라보놀, 플라바노놀 및 이소플라본으로 나눠진다(Harborne, B. The flavonoids, Chapman & Hall, 1992). 이들 플라보노이드의 종류 및 함량은 품종,성숙시기, 재배환경 및 가공방법에 따라 상당히 차이가 있다(Hertog et al.,J. Agric Food Chem., 40: 2379-2383, 1992a; Sukrason and Yeoman,Phytochem., 32: 839-844, 1993; Lee et al.,J. Food Sci., 60: 473-476, 1995). 지금까지 알려진 대표적인 플라보노이드 함유 식물에는 양파, 케일, 콩, 포도, 토마토 및 고추 등의 여러 과채류와 녹차, 두충, 뽕, 쑥, 은행, 및 감등의 여러 식물잎 그리고 괴화, 갈화 및 금은화 등의 식물의 꽃 등 들 수 있다(Larson, Phytochem., 27: 969-978, 1988; Nakatani,Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi37: 569-576, 1990). 이들에 함유되어 있는 플라보노이드는 캄페롤 및 퀘세틴 등의 플라보놀과 아피게닌 및 루테오린 등의 플라본이 대부분 차지하고 있으며, 자연계에서는 이들 아글리콘의 탄소 3번 또는 7번 위치나 탄소 3'번 또는 4'번 위치의 하이드록시기에 당이 결합된 배당체로 존재한다(Williams and Harborne, The flavonoids, Chapman & Hall, London, 1994). 이러한 플라보노이드는 a아글리콘의 종류 및 당의 결합위치에 따라 항암성, 항염증, 항혈전 및 항산화성 생리활성이 상당히 다른 것으로 보고되고 있다(Williams and Harborne, The flavonoids, Chapman & Hall, London, 1994).

생체내 생성되는 여러 가지 활성산소종 중 하이드록시라디컬(·OH; hydroxyl radical)은 매우 반응성이 강한 무차별의 활성산소로써 단백질, DNA 및 스테로이드성 화합물들을 산화시킬 뿐만 아니라 세포막을 구성하는 불포화지방의 과산화를 초래하여 세포의 고유의 성질 및 기능을 손상시킨다(Niki,J. Act. Oxyg. Free Rad., 1: 38-46, 1990). 이러한 하이드록시라디컬은 세포내에서 파고사이토시스(phagocytosis) 과정에서, 프로스타글라딘(prostaglandin) 생합성과정 중 특히 PGG₂에서 PGH₂로 전환될 때, 항생제와 같은 안티네오플라스틱(antineoplastic) 물질에 의해, 이온화방사선 및 지질과산화물질의 분해과정 중에서 생성된다(Niki,J. Act. Oxyg. Free Rad., 1: 38-46, 1990). 그러나 일반적으로 생체 내에서 하이드록시라디컬은 펜톤(Fenton) 반응(H₂O₂+ Fe²⁺→·OH + OH^-+ Fe³⁺)에 의해 주로 생성되는 것으로 알려져 있다(Niki,J. Act. Oxyg. Free Rad., 1: 38-46, 1990).

한편, 하이드록시라디컬은 세포 내에서 1차 독성물질이나 2차 독성물질로서 작용하며, 배양 간세포에 치명적인 손상을 준다(Halliwell and Gutteridge, Free radicals in Biology and Medicine, pp. 279-313, Clarendon Press, UK, 1985; Punchard and Kelly, Free Radicals, pp. 1-8, Oxford University Press, USA, 1996). 그리고 알록산(alloxan)의 세포독성을 야기시키거나 DNA나 주변에서 생성된 하이드록시라디컬은 DNA의 염기배열을 절단하여 결국 발암, 돌연변이 및 세포독성과 같은 여러 가지 심각한 생물적인 악영향을 미친다(Pryor, Free Radical Biology: Xenobiotics, cancer, and aging, Ann N.Y. Acad. Sci., USA, 393: 1-22, 1982; Yoshikawa et al.,J. Act. oxy. Free Rad., 1: 83-101, 1990). 따라서 하이드록시라디컬 포착제로써 작용할 수 있는 항산화물질은 암, 심장병, 및 동맥경화증 등의 여러 가지 만성적인 질병을 예방할 수 있는 치료제로 개발할 수 있다.

현재 이러한 하이드록시 라디컬 포착제의 검색방법으로서 펜톤(Fenton) 반응에 의해 유도되는 2-데옥시리보스(2-deoxyribose) 분해반응(Halliwell et al.,Anal. Biochem., 165: 215-219, 1987) 및 데옥시구아노신(deoxyguanosine) 산화반응(kasai and Nishimura,Nucleic Acids Res., 12: 2137-2145, 1984), 그리고 쥐 간 마이크로좀 지질과산화 반응 등을 이용한 여러 인비트로(in vitro)모델시스템(Ratty and Das,Biocehm. Med. Meta. Biol., 39: 69-79,1988; Galvez et al.,Phamacology51: 127-133, 1995; Yokozawa et al.,J. Food Sci. Nutr., 4: 92-96, 1999)이 널리 사용되고 있다. 그런데 이들 중 특히 쥐 간 마이크로좀(microsome) 지질과산화 모델시스템이 다른 에세이(assay) 방법 보다 생체의 지질과산화 모델시스템에 가장 가까운 검색방법이기에 현재 가장 널리 이용되고 있다. 지금까지 여러 식물추출물로부터 하이드록시 라디컬 포착활성을 지니고 있는 항산화물질이 개발되어져 왔으며, 특히 식이성 식물에 함유되어 있는 플라보노이드 화합물이 하이드록시 라디컬 포착제로써, 하이드록시 라디컬에 의해 유도되는 지질과산화반응을 억제하여 여러 가지 병리적인 질병을 예방하는 것으로 보고되고 있다(Husain et al.,Phytochem., 26, 2489-2491, 1987; Puppo,Phytochem., 31, 85-88, 1992). 따라서 식물로부터 하이드록시 라디컬 포착활성을 갖는 새로운 플라보노이드의 검색에 관한 연구가 필요하다.

최근 플라보노이드를 함유한 식물의 잎을 이용한 기능성 차 및 음료뿐만 아니라 여러 기능성 건강보조식품의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 그 대표적인 식물잎에는 녹차잎을 비롯하여 두충잎, 은행잎, 뽕잎, 감잎, 인삼잎 및 헛개나무잎 등이 있다(노완섭 및 허석현, 건강보조식품과 기능성 식품, 효일문화사, 1999). 이들 식물잎에는 항고혈압, 항혈전, 항염증 및 항산화작용이 우수한 카테친(catechin) 및 그 유도체, 쿼세틴(quercetin)과 캄페롤(kaempferol)의 배당체, 아피제닌(apigenin)과 루테올린(luteolin) 배당체, 플라본(flavone) 및 그 배당체 등의 여러 플라보노이드(flavonoid) 화합물이 함유되어 있다(Harborne and Mabry, The Flavonoids, Chapman and Hall, New York, 1982). 이와 같이 플라보노이드를 다량 함유하고 있는 식물잎은 여러 만성적인 질병을 예방할 수 있는 기능성 식품, 화장품 및 의약품의 신소재로써 각광을 받을 수 있기 때문에 플라보노이드를 함유한 새로운 식물을 찾는 노력이 필요하다.

홍화(紅花, 영명: Safflower, 생약명:Carthamus tinctoriusL.)는 국화과 (Compositae)에 속하는 일년생 초목으로서 원산지는 아프카니스탄의 산악지대 또는 에티오피아이다 (이창복, 대한식물도감, 1980). 홍화꽃은 수용성의 황색색소(carthamin)와 불용성의 적색색소(safflomin)를 함유하고 예로부터 염료로 널리 사용되어 왔으며 (육창수, 한국본초학, 1981), 아울러 한방에서 어혈, 통경 및 고지혈증 치료제로서 홍화탕, 활혈통경탕 등의 처방제로 널리 이용되어 왔다 (본초학, 이상인, 1980). 그리고 홍화씨는 한국, 중국 및 일본 등지에서 진정 및 보혈 등의 약용으로 사용되어 왔으며 (생약학, 한대석, 1995), 아울러 항혈전 및 항고혈압성 물질인 리놀레산(linoleic acid)을 다량 함유하고 있어 미국 및 인도에서는 식용유 생산용으로 재배되고 있다 (박인규, 김봉제, 동의보감, 1989; Khan, A. R., Thesis, 18: 81-87, 1929; 안덕균, 육창수, 현대본초학, 1975).

한편, 최근 홍화씨가 골다공증, 골절과 같은 골질환 치료에 뛰어난 효과가있음이 과학적으로 증명되고 있으며 (김준환 등,한국식품영양과학지, 27: 698-704, 1998; 정 등,약학회지, 43: 526-534, 1999; 서 등,한국영양학회지, 33: 411-420, 2000; 최상원 등, 특허출원번호 3048, 2000; 이원정 등, 특허출원번호 0017617, 2000), 아울러 홍화씨 분말 및 홍화유박의 투여가 고지방-고콜레스테롤 섭취 흰쥐의 지질대사 개선 효과가 있음이 밝혀지면서(김준환 등, 한국식품영양과학지, 28: 625-631, 1999; 조성희 등, 한국식품영양과학지, 30: 112-118, 2001) 홍화씨를 이용한 기능성 건강보조식품의 개발이 활발히 이루어지고 있다(김준한 등, 한국농산물저장유통학회지, 7: 80-83, 2000; 김준한 등, 한국농산물저장유통학회지, 7: 171-176, 2000). 또한, 홍화씨 기름을 짜고 부산물로 얻어지는 홍화유박(oil cake)은 단백질 및 식이성 섬유소의 급원으로서 중요할 뿐 아니라 특히, 세로토닌, 리그난 및 플라보노이드와 같은 항산화성 페놀화합물을 함유하고 있어(Sakamura et al.,Agric. Biol. Chem., 44: 2951-2954, 1980; Zhang et al.,Chem. Pharm. Bull., 44: 874-876, 1996; Zhang et al.,Chem. Pharm. Bull. 45: 1910-1914, 1997; Choi et al.,J.Food Sci. & Nutr., 4: 25-29, 1999) 기능성 식품 및 의약품의 신소재로써 주목을 받고 있다.

홍화씨의 페놀성분 중 세로토닌 성분은 뇌에서 메신저(messenger), 장에서 호르몬 및 연골아세포에서 세포성장인자로써 작용할 뿐 아니라(Watanabe,J. Agric. Food Chem., 47: 4501-4505, 1999; Takii et al.,J. Biochem., 125: 910-915, 1999), 항염증(Kawashima et al.,J. Interferon Cytokine Res., 18: 423-428, 1998) 및 골다공증 치료 효과(최상원 등 특허출원번호 00-0003048, 2000)가있는 생리활성성분으로서 크게 주목을 받고 있다. 또한, 리그난 성분(마타이레시놀)은 피토에스트로겐(phytoestrogen) 화합물로써(Adlercreutz, BailliersClin. Endocrinol. Metab.12(4): 605-623, 1998), 호르몬 의존성의 유방암, 전립선암 및 대장암을 예방해(Dwyeret al., J. Am. Diet. Assoc.,94: 739-743, 1994; Tang and Adams,J. Endocrinol., 85: 291-297, 1980; Aldercreutzet al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 44: 147-153, 1993) 줄 뿐 아니라 골 형성 및 분화를 촉진하며, 아울러 골결절 내의 칼슘 침착를 강화함으로서 폐경기 이후 여성에게 많이 발생하는 골다공증을 예방 및 치료하는 물질로 최근 밝혀지고 있다(최상원 등, 특허출원번호, 00-0003048, 2000; 이원정 등, 특허출원번호 00-0017617, 2000). 그리고 플라보노이드 화합물인 루테올린(luteolin) 및 아카세틴(acacetin)은 항암, 항염증 및 항산화작용을 지니고 있어 암 뿐만 아니라 염증 및 고혈압 치료에 유용하다(Roh et al.,Food Sci. Biotechnol., 8: 88-92, 1999; Choi et al.,J.Food Sci. & Nutr., 4: 25-29, 1999; 김 등,한국식품영양과학지, 29: 1127-1132, 2000; 최상원 등 특허출원 00-0318, 2000). 그리고 홍화꽃에는 항혈전 성분인 색소 성분 뿐만 아니라 항암성 플라보노이드 성분을 함유하고 있음이 밝혀지고 있다(Baek et al.,Agr. Chem. and Biotechnol. 41: 197-201,1998). 이와 같이 지금까지 홍화씨 및 홍화꽃으로부터 여러 가지 생리활성물질의 분리 및 그들의 생리적·약리적 작용에 관한 연구가 많이 수행되어져 온 반면, 홍화잎으로부터 새로운 생리활성물질의 검색 및 그를 이용한 고품질의 기능성 차의 개발에 관한 연구는 거의 없는 실정이다.

이에 본 발명자들은 생체 홍화잎을 이용한 고품질의 홍화잎 차를 제조하는방법을 개발하였으며, 나아가 홍화잎차의 물추출물에 함유된 페놀 및 플라보노이드 함량을 조사하고 아울러 그들 추출물의 항산화활성을 DPPH 라디컬 및 펜톤(Fenton) 반응에 의해 유도되는 쥐 간 마이크로좀 지질과산화 반응을 이용한 인비트로 에세이(in vitroassay) 방법을 이용하여 측정한 바 홍화잎차의 물추출물 및 이에 함유되어 있는 플라보노이드는 디피피에이치 라디컬 및 하이드록시 라디컬에 의해 유도되는 생체의 지질과산화반응을 크게 억제하는 강한 항산화작용이 있음을 밝혀내었다.

본 발명의 목적은 홍화잎차와 홍화잎차 물추출물을 제조하는 방법을 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 홍화잎차 물추출물을 제조함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 암, 심장병, 고혈압, 노화의 예방 및 치료에 효과가 탁월한 플라보노이드를 함유한 천연 항산화제 조성물을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 홍화잎차 제조용 홍화잎을 선정하고 3가지 제조방법으로 홍화잎차를 제조하고 그 각각의 홍화잎차 물추출물을 제조한 후 홍화잎차 물추출물의 수용성 페놀 및 플라보노이드 정량을 하고, DPPH 라디컬 포착활성 및 쥐 간 마이크로좀 지질과산화 억제작용을 측정함으로서 홍화잎차 물추출물의 항산화활성을 확인하고, 그 중에서도 볶은 홍화잎차 물추출물의 항산화활성이 가장 뛰어남을 확인함으로서 달성하였다.

도 1은 홍화잎으로부터 분리된 플라보노이드 화합물의 HPLC 스펙트럼 결과를 나타낸 그림이다.

본 발명은 각 시기별로 채취한 홍화잎의 플라보노이드 함량을 측정함으로서 홍화잎차 제조용 최적 홍화잎을 선정하는 단계; 찐 홍화잎차, 건조 홍화잎차, 볶은 홍화잎차를 제조하고 이들 각각의 홍화잎차 물추출물을 제조하는 단계; 상기 제조된 3가지 홍화잎차 물추출물의 수용성 페놀 함량과 플라보노이드 함량을 측정하고, 아울러 볶은 정도에 따른 홍화잎차 물추출물의 플라보노이드 함량 변화를 측정하는 단계; 상기 제조된 3가지 홍화잎차 물추출물의 DPPH 라디컬 포착활성을 측정하는 단계; 상기 제조된 3가지 홍화잎차 물추출물의 쥐간 마이크로좀 지질과산화 저해활성을 측정하는 단계; 상기 제조된 홍화잎차 물추출물에 함유되어 있는 플라보노이드의 쥐간 마이크로좀 지질과산화 저해활성을 측정하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

홍화잎차 제조용 최적 홍화잎을 선정하기 위하여 경북 의성 농가에서 노지 재배한 홍화잎을 2001년 4월 중순부터 7월 초순까지 성숙 시기별로 채취하고 생리활성물질의 지표가 되는 플라보노이드 함량을 측정한다. 그 결과 홍화잎으로부터 한가지 신물질 플라보노이드를 포함한 8가지의 플라보노이드 화합물을 분리하였으며, 그 함량은홍화잎의 성장 초기에 크게 증가하여 5월 초순경(5/4∼5/11)에 최대치에 도달한 후 그 이후 감소하는 경향을 나타내고, 특히 6월 초순경부터 각 플라보노이드 화합물별로 그 함량의 변화가 다소 심한 경향을 나타낸다. 따라서 홍화잎의 플라보노이드 함량은 성장초기 즉, 5월 초순경에 가장 많이 함유되어 있음을 알 수 있다.

홍화잎차 제조를 위해 5월초에 홍화잎을 수확하고 줄기를 제거하여 정선된 잎을 흐르는 물에 수세한 후 탈수시킨다. 그 다음, 홍화잎을 찜통에서 약 30초간 쪄서 식히고 이를 한번 더 반복한 후 80℃ 강제순환식 열풍건조기에서 건조시켜(수분함량 5∼7%) 찐 홍화잎차를 제조한다(steamed and then hot-air dried safflower leaf tea; SHTSLT). 건조 홍화잎차(dried in the shade, steamed and then hot-air dried safflower leaf tea; DHTSLT)는 생엽을 그늘에서 말린 후 찜통에서 찌는 과정을 2회 반복한 후 열풍건조시켜 제조한다. 볶은 홍화잎차(roasted and then hot-air dried safflower leaf tea; RHTSLT)는 노구솥이 뜨거운 상태에서(150∼180℃) 홍화잎을 쌓아서 볶은 다음 열풍건조시켜 제조한다. 또한, 홍화잎차 물추출물을 제조하기 위해 상기 3가지 방법으로 제조한 각 차엽을 유발에서 마쇄·분리하고, 각 분말차엽에 비등수를 가하여 열탕 속에서 가온 침출시킨 후 실온으로 냉각한 다음 여과하여 제조하였다.

홍화잎차 물추출물의 수용성페놀의 정량은 스와인과 힐즈(Swain & Hills) 방법 (J. Sci. Food Agric., 10: 63-68, 1959)에 따라 실시한다. 그리고 홍화잎차 물추출물의 플라보노이드 함량은 최 등의 방법(Arch. Pharm. Res., 2002, 6월호 게재 예정)에 따라 HPLC로 측정한다. 일반적으로 식물잎에 함유되어 있는 페놀화합물은 천연 항산화성분일 뿐만 아니라 차맛의 주체가 되는 색과 향을 생성하는 데 깊이 관여하는 성분이다. 그러나 페놀성분이 지나치게 많아지면 차 맛의 깊은 감칠맛이 적어지고 떫은맛이 강하여 풍미가 떨어진다. 따라서 차의 제조에 있어 적당한 페놀성분이 용출되는 가공방법을 개발하는 것이 매우 중요하다. 상기의 수용성 페놀물질 정량의 결과는 볶은 홍화잎차 물추출물이 가장 높으며, 상기 제조된 볶은 홍화잎차 페놀의 양은 적당하며 차맛 또한 적당하는 것으로 판명된다. 한편, 홍화잎으로부터 8가지 플라보노이드를 분리 및 동정하였으며, 그 중 퀘세틴 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드는 신물질로 판명된다 (Arch. Pharm. Res., 2002, 6월호 게재 예정). 플라보노이드 함량은 8가지 플라보노이드 중 루테오린 7-글루코사이드 함량이 가장 많고, 그 다음으로 퀘세틴 7-글루코사이드 > 루테오린 > 아피게닌 6,8-디-C-글루코사이드 > 퀘세틴 > 루테오린 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드 > 퀘세틴 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드 > 아카세틴 7-글루쿠로나이드의 순서로 감소한다. 한편, 볶은 홍화잎차 물추출물은 건조 홍화잎차 보다 아피게닌 6,8-디-C-글루코사이드, 퀘세틴 7-글루코사이드 및 루테오린 7-글루코사이드 함량은 다소 감소하는 경향이나 그 외 4가지 플라보노이드 함량은 증가하는 경향이었으며, 특히 루테오린 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드 및 퀘세틴 7- (6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드 함량의 증가폭이 크게 나타난다. 반면, 찐 홍화잎차는 건조 홍화잎차보다 아피게닌 6,8-디-C-글루코사이드, 퀘세틴 7-글루코사이드 및 루테오린 7-글루코사이드 함량은 크게 감소하는 경향이나 그 외 4가지 플라보노이드 함량은 약간 증가하는 경향을 보인다.

또한, 볶은 정도에 따른 홍화잎차 물추출물의 플라보노이드 함량 변화를 측정한 결과, 볶는 시간을 증가시킴에 따라 모든 플라보노이드 함량이 증가하였으며, 특히 2분간 볶은 홍화잎에서 가장 높은 함량을 나타낸다. 그러나 3분간 볶은 홍화잎의 플라보노이드 함량은 2분 볶은 홍화잎보다 그 함량이 감소하는 경향을 나타낸다. 따라서 표 2에 나타낸 볶은 정도에 따른 홍화잎차 물추출물의 플라보노이드 함량의 변화로부터 홍화잎차 제조는 건조 홍화잎을 2분간 볶는 것이 가장 바람직하다는 것을 알 수 있다.

홍화잎 물추출물의 DPPH 라디컬 포착활성은 브로이즈(Blois)의 방법 (Nature, 4617: 1198-1200, 1958)을 변형하여 측정한다. 3가지 홍화잎차 물추출물의 DPPH 라디컬 포착활성을 측정한 결과, 볶은 홍화잎차 물추출물의 DPPH 라디컬 포착활성이 가장 강하고, 그 다음으로 찐 홍화잎차, 건조 홍화잎차의 순서로 감소한다. 일반적으로 -OH, -SH 및 -NH 핵을 지니고 있는 천연항산화물질은 DPPH 라디컬 포착활성이 강한 것으로 잘 알려져 있으므로 DPPH 라디컬 포착활성이 강한 볶은 홍화잎차 물추출물은 향후 항산화성 신소재로써 이용 가치가 높다고 생각된다.

홍화잎 물추출물 및 그로부터 분리된 8가지 플라보노이드의 항산화작용을 측정하기 위해 펜톤반응에 의해 생성된 하이드록시 라디컬에 의한 쥐 간 마이크로좀 지질과산화반응을 이용한 생체모델시스템을 사용한다. 쥐간으로부터 마이크로좀의 분리는 한나(Hanna) 등(Phamacol. Biochem. Behav., 39: 505-510, 1994)의 방법에 따라 수행한다. 또한, 시료의 쥐간 마이크로좀의 지질과산화 저해활성은 요코자와(Yokozawa) 등(J. Food Sci. Nutr., 4: 92-96, 1999)의 방법을 변형하여 측정한다. 3가지 다른 홍화잎차 물추출물의 쥐 간 마이크로좀 지질과산화 억제작용을 측정한 결과, 볶은 홍화잎차 물추출물의 지질과산화 억제율이 가장 강하며, 다음으로 찐 홍화잎차, 건조 홍화잎차의 순서로 감소한다. 한편, 홍화잎차로부터 분리된 8가지 플라보노이드 화합물은 하이드록시 라디컬 포착제로써 그로 인해 유도되는 지질과산화반응을 억제하였으며, 특히 그들 중 퀘세틴 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드 및 루테오린 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드이 가장 강한 항산화작용을 나타내었다. 따라서 볶은 홍화잎차 물추출물은 항산화성 플라보노이드 성분을 많이 함유하고 있을 뿐만 아니라, DPPH 라디컬 포착활성이 강하며, 아울러 생체 지질과산화 억제작용이 매우 높음을 알 수 있다. 따라서 볶은 홍화잎의 물추출물은 생체내 생성되는 하이드록시라디컬에 의해 일어나는 지질과산화반응을 억제함으로서 암 뿐만 아니라 심장병, 고혈압 및 노화를 예방할 수 있는 천연항산화 신소재로써 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 홍화잎차 제조용 홍화잎 선정

홍화잎차 제조용 최적 홍화잎을 선정하기 위하여 경북 의성 농가에서 노지 재배한 홍화잎을 2001년 4월 중순부터 7월 초순까지 성숙 시기별로 채취하고 생리활성물질의 지표가 되는 플라보노이드 함량을 측정하였다.

즉, 생체 홍화잎을 각 시기별로 채취한 다음 수세 및 건조한 홍화잎 2g에 증류수 100 mL를 가하여 열탕에서 1시간 동안 추출하고 여과한 후, 여기에 노르말-부탄올 300 mL를 가하여 분획한 다음, 이 부탄올 추출물을 농축하고 이것을 80% 메탄올 수용액 5 mL에 용해시켰다. 이를 2배 희석한 후 0.45μm membrane filter(Gelman Sci., USA)에 통과시키고 그 중에서 10μL를 취하여 HPLC에 주입하였다. 이 때 HPLC 조건은 다음과 같다; Column, YMC-Pack Pro C18 (4.6 ㎜ i.d. × 25 ㎝, 5㎛, YMC, Inc., USA); solvent A, 0.1% H₃PO4 in 20% MeOH; solvent B, 80% MeOH; 농도구배용출, solvent A→ solvent B for 40 min; flow rate, 1 mL/min; detection, 340 ㎚; inject vol., 10 ㎕; chart speed, 0.5 ㎝/min.

그 결과, 표 1에서 보는 바와 같이 홍화잎으로부터 8가지의 플라보노이드 화합물을 분리하였으며, 그 중 퀘세틴 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드는 신물질임을 확인하였다 (Arch. Pharm. Res., 2002, 6월호 게재 예정). 또한, 플라보노이드 함량은 홍화잎의 성장 초기에 크게 증가하여 5월 초순경(5/4∼5/11)에 최대치에 도달한 후 그 이후 감소하는 경향을 나타내었으며, 특히 6월 초순부터 각 플라보노이드 별로 그 함량의 변화가 다소 심한 경향을 나타내었다. 이와 같이 홍화잎의 플라보노이드 함량은 성장초기 즉, 5월 초순경에 가장 많이 함유되어 있음을 알 수 있었다.

홍화잎의 수확시기별 플라보노이드 함량 변화

수확시기	플라보노이드 (mg/kg, 건물중)
수확시기	1	2	3	4	5	6	7	8
4/28	71.94	84.64	183.38	10.23	5.54	14.33	136.67	35.56
5/04	88.30	108.12	224.20	34.23	7.56	126.56	147.67	23.44
5/11	94.65	120.44	122.50	28.5	19.78	114.88	112.56	17.67
5/18	109.78	36.78	44.26	16.7	12.45	130.33	98.67	15.56
5/25	96.27	14.96	97.46	13.2	10.34	25.68	50.67	12.43
6/01	90.23	43.5	110.23	10.36	9.45	23.65	31.87	17.83
6/08	89.82	75.76	145.12	8.85	11.48	29.20	23.65	12.45
6/15	112.30	38.24	88.68	6.65	8.45	18.48	22.56	10.34
6/22	84.04	46.58	68.66	7.45	7.49	20.88	22.05	8.95
6/29	103.47	54.78	120.50	10.34	3.65	44.66	61.29	13.22
7/07	59.26	49.76	152.62	5.64	2.67	11.49	32.75	10.34
모든 측정치는 3회 반복 측정한 후 평균값으로 나타내었다. 이때 표준편차는 생략함.모든 측정치간에 통계학적 유의성 (p<0.05)이 있음.1: 아피게닌 6,8-디-C-글루코사이드,2: 퀘세틴 7-글루코사이드,3: 루테오린 7-글루코사이드,4: 퀘세틴 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드,5:루테오린 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드,6: 퀘세틴,7: 루테오린,8: 아카세틴 7-글루쿠로나이드

실시예 2: 본 발명 홍화잎차 및 홍화잎차 물추출물의 제조

본 발명 홍화잎차를 제조하기 위하여 경북 의성 농가의 노지에서 재배한 홍화잎을 2001년 5월초에 수확하고 줄기를 제거하여 홍화잎을 얻었다. 찐 홍화잎차는 상기 정선된 홍화잎을 흐르는 물에 수세한 후 탈수시키고 홍화잎을 찜통에서 약 30초간 쪄서 식힌 후 이를 한번 더 반복하고 80℃ 강제순환식 열풍건조기에서 건조시켜(수분함량 5∼7%) 찐 홍화잎차를 제조하였다(steamed and then hot-air dried safflower leaf tea; SHTSLT). 건조 홍화잎차(dried in the shade, steamed and then hot-air dried safflower leaf tea; DHTSLT)는 생엽을 5일간 그늘에서 말린 후 찜통에서 30초간 찌는 과정을 2회 반복한 후 열풍건조시켜 제조하였다. 볶은 홍화잎차(roasted and then hot-air dried safflower leaf tea; RHTSLT)는 노구솥이뜨거운 상태에서(150∼180℃) 홍화잎을 1∼1.5 cm 높이로 쌓아서 1분간 볶은 다음 상기와 같은 조건에서 열풍건조시켜 제조하였다.

또한, 위의 3가지 방법으로 제조한 각 차엽을 유발에서 마쇄한 후 30 mesh의 표준체로 분리하여 분말차엽을 제조하고, 분말차엽 3.0 g을 200 mL 비이커에 취하고 비등수 100 mL를 가하여 80℃의 열탕 속에서 1시간 가온 침출 시킨 후 실온으로 냉각한 다음 와트만(Whatman)No. 2 여과지가 깔린 감압 여과장치에서 흡인 여과하여 홍화잎차의 물추출물을 제조하였다.

실시예 3: 본 발명 홍화잎차 물추출물의 수용성 페놀 및 플라보노이드의 정량

실험예 1 : 본 발명 홍화잎차 물추출물의 수용성 페놀 함량 측정

본 발명 제차공정을 달리한 3가지 홍화잎차 물추출물의 수용성 페놀물질의 정량은 스와인과 힐즈(Swain & Hills) 방법 (J. Sci. Food Agric., 10: 63-68, 1959)에 따라 다음과 같이 실시하였다. 시료 5 mL에 1.0 N 폴린 시오칼츄스(Folin-Ciocalteu's) 페놀용액과 포화 무수 Na₂CO₃용액 (75 g/L)을 각각 5 mL씩 넣어 격렬히 혼합하고 10분간 방치 후 765 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 별도로 몰식자산(gallic acid)를 사용하여 작성된 표준곡선으로부터 시료의 총 수용성 페놀물질 함량을 환산하였다.

상기 수용성 페놀 측정방법에 의해 제차공정을 달리한 3가지 홍화잎차 물추출물의 수용성 페놀 함량을 측정한 결과는 표 2와 같다. 즉, 3가지 홍화잎차 물추출물 중 볶은 홍화잎차 물추출물이 842 mg/100g으로 가장 높은 페놀 함량을 나타내었으며, 그 다음으로 찐 홍화잎차 물추출물이 786 mg/100g의 페놀 함량을 나타내었고, 건조 홍화잎차 물추출물이 627 mg/100g 으로 가장 낮은 페놀함량을 나타내었다.

일반적으로 식물잎의 페놀성분은 차의 색과 향미 생성에 깊이 관여할 뿐 아니라 천연 항산화 성분으로서 여러 가지 만성적인 질병의 예방에 중요한 역할을 한다. 특히 페놀성분의 종류 및 농도에 따라 엽차의 맛이 상당히 달라지는데, 페놀성분이 지나치게 많아지면 차 맛의 깊은 감칠맛이 적어지고 떫은맛이 강하여 풍미가 떨어진다. 따라서 차의 제조에 있어 적당한 페놀성분이 용출되는 가공방법을 개발하는 것이 매우 중요하다. 위에서 제조된 볶은 홍화잎차는 생잎 특유의 풀냄새가 거의 나지 않으며 페놀성분 또한 적당히 함유하고 있어 차맛이 양호한 것으로 판명되었다.

3가지 가공법으로 제조된 본 발명 홍화잎차 물추출물의 수용성 페놀의 함량

홍화잎차 물추출물	수용성 페놀 (mg/100g, 건조 홍화잎)
찐 차¹	786 ± 12.4
건조차²	627 ± 10.6
볶은차³	842 ± 14.3
¹찐 후 건조한 홍화잎차²음건한 후 쪄서 건조한 홍화잎차³볶은 후 건조한 홍화잎차모든 측정치는 3회 반복 측정한 후 평균값으로 나타내었다. (평균 ± 표준편차)모든 측정치간에 통계학적 유의성 (p<0.05)이 있음.

실험예 2 : 본 발명 홍화잎차 물추출물의 플라보노이드 함량 측정

본 발명 홍화잎차 물추출물의 플라보노이드 분리 및 정량은 상기 실시예 1과 동일하게 실시하였다. 제차공정을 달리한 3가지 홍화잎차 물추출물의 플라보노이드 함량을 측정한 결과는 표 3과 같다. 먼저 건조 홍화잎차의 물추출물에는 8가지 플라보노이드가 함유되어 있었으며, 그 중에서 루테오린 7-글루코사이드 함량이 가장 많았으며, 그 다음으로 퀘세틴 7-글루코사이드> 루테오린> 아피게닌 6,8-디-C-글루코사이드 > 퀘세틴 > 루테오린 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드 > 퀘세틴 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드 > 아카세틴 7-글루쿠로나이드의 순서로 감소하였다. 한편, 볶은 홍화잎차 물추출물은 건조 홍화잎차 보다 아피게닌 6,8-디-C-글루코사이드, 퀘세틴 7-글루코사이드 및 루테오린 7-글루코사이드 함량은 다소 감소하는 경향이었으나 그 외 4가지 플라보노이드 함량은 증가하는 경향이었으며, 특히 루테오린 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드 및 퀘세틴 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드 함량의 증가폭이 크게 나타났다. 반면, 찐 홍화잎차는 건조 홍화잎차보다 아피게닌 6,8-디-C-글루코사이드, 퀘세틴 7-글루코사이드 및 루테오린 7-글루코사이드 함량은 크게 감소하는 경향이었으나 그 외 4가지 플라보노이드 함량은 약간 증가하는 경향이었다.

3가지 가공법으로 제조된 본 발명 홍화잎차 물추출물의 플라보노이드의 함량

홍화잎차 물추출물	플라보노이드 (mg/kg, 건물중)
홍화잎차 물추출물	1	2	3	4	5	6	7	8
찐 차¹	141.90	243.51	590.49	67.44	75.45	64.18	401.23	31.27
건조차²	168.27	397.61	666.30	40.48	49.02	54.72	390.76	32.45
볶은차³	143.87	367.26	647.28	121.43	153.17	77.97	405.45	34.49
¹찐 후 건조한 홍화잎차.²음건한 후 쪄서 건조한 홍화잎차.³볶은 후 건조한 홍화잎차모든 측정치는 3회 반복 측정한 후 평균값으로 나타내었다. 이때 표준편차는 생략함.모든 측정치간에 통계학적 유의성 (p<0.05)이 있음.1: 아피게닌 6,8-디-C-글루코사이드,2: 퀘세틴 7-글루코사이드,3: 루테오린 7-글루코사이드,4: 퀘세틴 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드,5: 루테오린 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드,6: 퀘세틴,7: 루테오린,8: 아카세틴 7-글루쿠로나이드.

실험예 3 : 볶은 정도에 따른 본 발명 홍화잎차 물추출물의 플라보노이드 함량 변화

볶은 정도에 따른 본 발명 홍화잎차 물추출물의 플라보노이드 함량 변화를 알기 위해 노구솥이 뜨거운 상태에서(150∼180℃) 홍화잎을 1∼1.5 cm 높이로 쌓아서 각 시간대별로(30초, 1분, 2분 및 3분간) 볶은 다음 플라보노이드 함량을 측정하였다. 그 결과는 표 4와 같다.

즉, 볶는 시간을 증가시킴에 따라 모든 플라보노이드 함량이 증가하였으며, 특히 2분간 볶은 홍화잎에서 가장 높은 함량을 나타내었다. 그러나 3분간 볶은 홍화잎의 플라보노이드 함량은 2분 볶은 홍화잎보다 그 함량이 감소하는 경향을 나타내었다. 따라서 표 2에 나타낸 볶은 정도에 따른 홍화잎차 물추출물의 플라보노이드 함량의 변화로부터 홍화잎차 제조는 건조 홍화잎을 2분간 볶는 것이 가장 바람직하다는 것을 알 수 있었다.

볶은 정도에 따른 본 발명 홍화잎차 물추출물의 플라보노이드 함량 변화

볶는 정도	플라보노이드 (mg/100g, 건조 홍화잎)
볶는 정도	1	2	3	4	5	6	7	8
대조구(볶지않음)	168.27	397.61	666.30	40.48	49.02	54.72	390.76	32.45
30초 볶음	75.17	221.99	327.50	49.82	223.53	30.78	201.45	13.57
1분 볶음	90.40	230.73	404.87	146.55	336.45	48.05	267.45	28.10
2분 볶음	143.87	267.26	547.28	321.43	536.17	77.97	401.65	34.58
3분 볶음	87.41	165.59	411.52	313.89	427.57	64.02	310.86	30.64
모든 측정치는 3회 반복 측정한 후 평균값으로 나타내었다. 이때 표준편차는 생략함.모든 측정치간에 통계학적 유의성 (p<0.05)이 있음.1: 아피게닌 6,8-디-C-글루코사이드,2: 퀘세틴 7-글루코사이드,3: 루테오린 7-글루코사이드,4: 퀘세틴 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드,5: 루테오린 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드,6: 퀘세틴,7: 루테오린,8: 아카세틴 7-글루쿠로나이드.

실시예 4: 본 발명 홍화잎차 물추출물의 DPPH 라디컬 포착활성

위의 실시예 2에서 제조된 3가지 홍화잎차 물추출물의 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 포착활성은 브로이즈(Blois)의 방법(Nature181: 1199-1200, 1958)을 변형하여 다음과 같이 실시하였다. 홍화잎차 물추출물(최종농도 0.02 mg/mL) 4.0 mL에 0.2 mM의 DPPH를 함유한 메탄올용액 1.0 mL를 혼합한 후 격렬하게 볼텍스(vortex)하고 실온에서 10분간 반응시킨 다음 517 ㎚에서 흡광도를 측정하여 DPPH의 환원에 의한 흡광도의 감소를 측정하였다. 이 때 DPPH 라디칼 소거활성은 다음 식에 따라 계산하였다. 저해율(%) = A - A/B × 100, A :517 nm 에서의 시료 무첨가구(control)의 흡광도; B :517 nm에서의 시료 첨가구의 흡광도. 그리고 시료의 IC50(DPPH 라디컬을 50% 포착하는 시료의 농도)는 처리한 농도에 대한 저해율로부터 회귀분석에 따라 계산하여 나타내었다.

3가지 홍화잎차 물추출물의 DPPH 라디컬 포착활성을 측정한 결과는 표 5와 같다. 볶은 홍화잎차 물추출물의 DPPH 라디컬 포착활성(IC₅₀= 164.6 μg/mL)이 가장 강하였으며, 그 다음으로 찐 홍화잎차(IC₅₀= 198.1 μg/mL), 건조 홍화잎차(IC₅₀= 326.6 μg/mL) 순서로 감소하였다.

일반적으로 DPPH 라디컬 포착활성이 강한 녹차, 감잎차, 두충잎차 및 뽕잎차의 물추출물은 플라보노이드, 리그난 및 탄닌과 같은 페놀화합물을 다량 함유하고 있어 천연항산화성 소재로써 현재 기능성 음료 및 차로 널리 이용되고 있다(노완섭, 허석현, 건강보조식품과 기능성식품, 효일문화사, 1999). 따라서 DPPH 라디컬 포착활성이 강한 볶은 홍화잎차 물추출물은 향후 항산화성 신소재로써 기능성차의 개발 가치가 높다고 생각된다.

3가지 가공법으로 제조된 본 발명 홍화잎차 물추출물의 DPPH 라디컬 포착활성

홍화잎차 물추출물	DPPH 라디컬 포착활성 (IC₅₀, μg/mL)⁴
찐 차¹	198.1 ± 1.7
건조차²	326.6 ± 3.2
볶은차³	164.6 ± 1.4
¹찐 후 건조한 홍화잎차²음건한 후 쪄서 건조한 홍화잎차³볶은 후 건조한 홍화잎차⁴DPPH 라디컬 형성을 50% 억제할 수 있는 시료의 농도.모든 측정치는 3회 반복 측정한 후 평균값으로 나타내었다(평균 ± 표준편차).모든 측정치간에 통계학적 유의성 (p<0.05)이 있음.

실시예 5 : 본 발명 홍화잎차 물추출물의 항산화작용 측정

본 발명 홍화잎차 물추출물의 항산화 작용을 측정하기 위하여 펜톤반응에 의해 유도된 하이드록시 라디컬에 의한 쥐간의 마이크로좀(microsome) 지질과산화반응을 이용한 생체모델시스템을 사용하였다. 먼저 흰쥐의 간으로부터 마이크로좀의 분리는 한나(Hanna) 등(Phamacol. Biochem. Behav., 39: 505-510, 1994)의 방법에 따라 수행하였다. 즉, 스프라쿠 다우리(Spraque-Dawley)종 숫쥐(300±20g)을 마취시키고 복개하여 간 조직을 적출한 다음 잘게 자른 후 0.25 M 수크로즈(sucrose)용액으로 세척하여 4배 용량의 냉각된 균질용 용액(40 mM Tris-HCl, 250 mM Sucrose, 2 mM EDTA, 0.4 mM PMSF, pH 7.4)에 넣어 균질화 한 후 4℃, 15,000 ×g에서 10분간 원심분리하여 얻어진 상등액을 사용하였다. 이 상등액을 취하여 다시 4℃, 100,000×g에서 75분간 원심분리하여 얻은 펠렛(pellet)을 100,000 ×g에서 60분간 원심분리하여 소량의 펠렛를 얻었다. 이 펠렛을 차가운 완충용액(50 mM KH₂PO₄, 50 mM K₂HPO₄, 0.15 M KCl, 0.4 mM PMSF, pH 7.4)에 단백질 농도가 10mg protein/mL가 되도록 현탁시킨 후 다음 분석에 이용할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 이때 단백질량은 로우리(Lowry) 등의 방법(J. Biol. Chem., 193: 265-275, 1951)에 따라 측정하였으며, 표준물질로서 보빈 시럼 알부민(bovine serum albumin)를 이용하였다.

시료의 쥐간 마이크로좀의 지질과산화 억제활성 측정은 요코자와(Yokozawa) 등의 방법(J. Food Sci. Nutr., 4: 92-96, 1999)을 변형하여 다음과 같이 실시하였다. 0.5 mL의 마이크로좀 분획 (2mg/mL protein), 0.3 mL의 0.5% H₂O₂, 0.3 mL의 10 mM FeSO₄및 0.1 mL의 시료(최종농도 2.0∼50μg/mL)를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켜 지질과산화를 유도하였으며, 이때 생성된 티오바비투릭산 반응물질(thiobarbituric acid reacted substance)은 오까와(Ohkawa)등의 방법(Anal., Biochem., 95: 351-358, 1979)에 따라 측정하였다. 즉, 위의 반응액에 1.5 mL의 20% 아세트산/0.2M 염산(pH 3.4), 0.2 mL의 8.1% SDS 및 1.5 mL의 0.8% TBA/NaOH를 첨가하여 수욕상(100℃)에서 20분간 가열하여 발색시킨 후 탈지면으로 여과한 다음 냉각 후 535 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 시료를 넣지 않은 대조구(control)와 함께 측정하여 시료의 상대적인 지질과산화 억제율(%)을 다음 식에 따라 계산하였다. 억제율(%)=100-(A/B ×100), A: 532 nm에서 시료의 흡광도,B: 532 nm에서 대조구의 흡광도이다. 그리고 시료의 IC₅₀치(지질과산화를 50% 저해하는 시료의 농도)는 처리한 농도에 대한 저해율로부터 회귀분석에 따라 계산하여 나타내었다.

3가지 다른 홍화잎차 물추출물이 하이드록시 라디컬에 의한 쥐 간 마이크로좀 지질과산화 반응을 억제하는 작용의 측정결과는 표 6과 같다. 3가지 추출물 중 볶은 홍화잎차 물추출물의 지질과산화 억제율(IC₅₀= 45.6 mg/mL)이 가장 강하였으며, 그 다음으로 찐 홍화잎차(IC₅₀= 67.8 mg/mL), 건조 홍화잎차(IC₅₀= 89.2 mg/mL)의 순서로 감소하였다. 이와같이 볶은 홍화잎차 물추출물은 강한 하이드록시 라디컬 포착제로써, 하이드록시 라디컬로 인해 유발되는 여러 지질과산화반응을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다.

3가지 가공법으로 제조된 본 발명 홍화잎차 물추출물의 하이드록시 라디컬에의한 쥐간 마이크로좀 지질과산화 억제 효과

홍화잎차 물추출물	지질과산화 저해율(IC₅₀, mg/mL)⁴
찐 차¹	67.8 ± 1.3
건조차²	89.2 ± 2.1
볶은차³	45.6 ± 0.7
¹찐 후 건조한 홍화잎차.²음건한 후 쪄서 건조한 홍화잎차.³볶은 후 건조한 홍화잎차.⁴쥐 간 마이크로좀 지질과산화반응 50% 억제할 수 있는 시료의 농도.모든 측정치는 3회 반복 측정한 후 평균값으로 나타내었다(평균 ± 표준편차).모든 측정치간에 통계학적 유의성 (p<0.05)이 있음.

실시예 6 : 본 발명 홍화잎차로부터 분리된 플라보노이드의 항산화작용 측정

앞서 홍화잎차 물추출물로부터 분리된 8가지 플라보노이드의 항산화작용을 실시예 5와 동일하게 측정한 결과는 표 7과 같다. 8가지 플라보노이드 중 퀘세틴 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드(IC₅₀= 0.85 μM) 및 루테오린 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드(IC₅₀= 0.95 μM)는 천연 항산화제로 잘 알려진 토코페놀(IC₅₀= 0.98 μM)과 유사하게 강한 항산화활성을 나타내었으며, 아울러 루테오린(표 7의 플라보노이드1)과 퀘세틴(표 7의 플라보노이드 2) 및 그 배당체(표 7의 플라보노이드 3 과 5) 성분도 높은 항산화활성을 나타내었다. 반면, 아카세틴 7-글루코사이드(표 7의 플라보노이드 7) 및 아피게닌 6,8-디-C-글루코사이드(표 7의 플라보노이드 8)는 다소 낮은 항산화활성을 나타내었다. 이와 같이 홍화잎차 물추출물에는 하이드록시 라디컬 포착제로써 강한 항산화활성을 지니고 있는 퀘세틴 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드 및 루테오린 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드가 존재함을 알 수 있었다.

본 발명 홍화잎차 물추출물로부터 분리된 8가지 플라보노이드의 하이드록시 라디컬에 의한 쥐간 마이크로좀 지질과산화 억제 효과

플라보노이드	지질과산화 저해율(IC₅₀, μM)¹
1	1.23 ± 0.3
2	1.11 ± 0.2
3	2.87 ± 0.3
4	0.95 ± 0.2
5	2.66 ± 0.3
6	0.85 ± 0.2
7	5.64 ± 0.8
8	6.43 ± 0.6
α-Tocopherol	0.98 ± 0.1
¹쥐 간 마이크로좀 지질과산화반응을 50% 억제할 수 있는 시료의 농도.모든 측정치는 3회 반복 측정한 후 평균값으로 나타내었다(평균 ± 표준편차).모든 측정치간에 통계학적 유의성 (p<0.05)이 있음.1: 루테오린,2: 퀘세틴,3: 루테오린 7-글루코사이드,4: 루테오린 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드 ,5: 퀘세틴 7-글루코사이드,6: 퀘세틴 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드,7: 아카세틴 7-글루코사이드,8: 아피게닌 6,8-디-C-글루코사이드

이상의 결과로부터 볶은 홍화잎차 물추출물은 항산화성분인 페놀성분 및 플라보노이드 성분을 많이 함유하고 있음을 알 수 있었다. 따라서 항산화성 플라보노이드를 함유한 볶은 홍화잎의 물추출물은 암, 심장병, 고혈압 및 노화를 예방할 수 있는 천연 항산화 신소재로써 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명 볶은 홍화잎차 물추출물은 항산화성 페놀 및 플라보노이드 화합물을 다량 함유하고 있을 뿐만 아니라, DPPH 라디컬 포착활성이 강하며, 하이드록시 라디컬에 의해 유도되는 지질과산화반응을 억제하는 효과가 우수하였다. 특히 볶은 홍화잎차에는 항산화활성이 강한 플라보노이드 화합물, 즉 퀘세틴과 루테오린 그리고 퀘세틴 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드 및 루테오린 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드을 함유하고 있어 지질과산화반응에 의해 초래되는 암, 심장병, 고혈압 및 노화 등의 예방 및 치료에 유용한 기능성 식품 소재로서 유용한 발명인 것이다.

Claims

5월 초순경(5/4∼5/11)에 수확한 생체 홍화잎을 찌고 건조한 후 볶아서 다시 건조하여 홍화잎차를 제조하는 단계와 상기 단계에서 얻은 홍화잎차에 물을 가하여 열탕 추출한 후 냉각·방치 및 여과하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 홍화잎차 물추출물의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 볶음과정은 홍화잎을 150∼180℃에서 1∼2분 동안 수행함을 특징으로 하는 방법.
제 1항의 방법에 의해 제조된 홍화잎차 물추출물.
제 3항에 있어서, 홍화잎차 물추출물은 퀘세틴 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드와 루테오린 7-(6"-아세틸)-O-β-D-글루코사이드의 항산화성 플라보노이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 홍화잎차 물추출물.
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