CN108272839A

CN108272839A - 一种杨梅总黄酮、其制备方法和应用以及eNOS激动剂

Info

Publication number: CN108272839A
Application number: CN201810257399.XA
Authority: CN
Inventors: 丁虹; 李建; 李晓斐; 杜思达
Original assignee: WUHAN WORDNER UNITED PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: WUHAN WORDNER UNITED PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2018-03-26
Filing date: 2018-03-26
Publication date: 2018-07-13

Abstract

本发明涉及药品与保健品领域，提供了一种杨梅总黄酮、其制备方法和应用以及eNOS激动剂。该杨梅总黄酮具有上调eNOS表达和增加eNOS活性的作用，将杨梅总黄酮作为eNOS激动剂，将其应用于制备eNOS介导疾病的药物中，能够有效治疗内皮障碍引发的疾病。该杨梅总黄酮的制备方法包括取杨梅100‑150重量份，粉碎，加入500‑1200重量份的提取溶剂提取1‑3次，每次提取60‑120min，将多次获得的提取液过滤合并，浓缩，其中，提取溶剂包括乙醇和/或乙酸乙酯。该制备方法简单，获得的杨梅总黄酮的含量高，纯度高，最终产品安全可靠，而包含有杨梅总黄酮的eNOS激动剂，能够有效治疗内皮障碍引发的疾病。

Description

一种杨梅总黄酮、其制备方法和应用以及eNOS激动剂

技术领域

本发明涉及药品与保健品领域，具体而言，涉及一种杨梅总黄酮、其制备方法和应用以及eNOS激动剂。

背景技术

一氧化氮(nitric oxide，NO)是一种具有较高自由基活性的第二信使分子，其在血管张力的维持和血压的稳定调节中起着重要作用。研究表明，NO主要通过非酶生性和酶生性两种方式产生，前者主要通过硝酸甘油、硝普钠等供体产生，后者必须有酶的参与，主要依赖于一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)产生。由于NO在体内极不稳定，因此，对NOS的研究将大大促进NO相关功能的研究。NOS是一种同工酶，主要分为3种亚型，即主要存在于内皮细胞中的内皮型NOS(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、神经细胞中的神经型NOS(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)，以及主要存在于巨噬细胞、胶质细胞中的诱导型NOS(inducible nitric oxide synthase，iNOS)。eNOS是一种特异的氧化L-精氨酸生成L-瓜氨酸和一氧化氮(NO)的酶。该酶是由一个二聚体结构组成，两个相同亚基组成的二聚体化是其表达活性所必须的条件。每个亚基又分为两个结构区，C-端为还原区，序列与细胞色素酶p450同源，含有与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及钙调蛋白(CaM)相结合的位点；N-端为氧化区，含有血红素、四氢生物喋呤(BH₄)、L-精氨酸等结合位点。两结构区彼此独立折叠和行使功能。细胞内一氧化氮合酶(NOS)可由一些物质如：乙酰胆碱、缓激肽等通过升高胞质内钙离子浓度继而激活钙调蛋白而活化。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是心血管系统内皮功能舒张的一种重要调节因子，大量研究表明，血管内皮来源的一氧化氮(NO)的产生，能够通过快速穿越生物膜进入血管平滑肌中并激活细胞内的鸟苷酸环化酶，这种激活可以迅速使血管平滑肌内的环磷酸鸟苷(cGMP)释放增加，导致平滑肌的松弛，对调控机体高血压等心血管疾病有重要的影响作用。在血管内皮中的eNOS是影响血管中NO释放的主要调控蛋白，使用具有激活eNOS能力的干预手段对组织血管eNOS下调对终末器官的损伤具有保护作用，对内皮功能障碍引起的各类疾病如动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)、血管再狭窄、高血压、冠心病及脑血管疾病有保护作用。

内皮功能障碍通常出现在吸烟人群、糖尿病、糖尿病肾病、高血压、血脂异常和代谢综合征患者中。eNOS产生的NO的主要作用是调节血管张力和血流分布，尤其对心脑血管的调节可直接影响心脑血管疾病的发生发展。此外，NO还可通过抑制血管平滑肌细胞增殖和血小板黏附，防止血栓相关疾病的发生。利用基因敲除小鼠模型，发现若敲除eNOS基因将导致小鼠全身血管内皮功能障碍，血管舒张效应明显减弱，出现严重的高血压疾病。因此，eNOS/NO信号通路与内皮功能障碍相关疾病的发生发展密切相关。研究发现，内皮依赖性的血管舒张功能降低与NO的减少密切相关，主要由3种情况所致，eNOS表达的减少导致NO产量下降，eNOS活性降低导致NO产量下降或NO与O^－2反应引起NO降解增加。其中eNOS表达减少的可能机制包括eNOS mRNA和其蛋白表达水平的减少，eNOS活性下降与血管中eNOS内源性即竞争抑制剂不对称－二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)和辅酶因子(包括NADPH、BH4)有关。这几种导致内皮功能障碍的机制并不相互排斥，还可能同时发生，其共同的特征是NO的生物学活性减弱，因此降低了对血管系统的保护。所以寻找有效的eNOS激动剂对治疗内皮障碍引发的疾病具有重要意义。

发明内容

本发明的目的，例如包括提供一种杨梅总黄酮在制药领域的新用途，即杨梅总黄酮在制备治疗或预防eNOS介导疾病的药物中的应用。

本发明的目的还包括提供一种上述杨梅总黄酮的制备方法，获得杨梅总黄酮的含量高，提取率大，纯度高，最终产品安全可靠。

本发明的目的还包括提供一种由上述杨梅总黄酮的制备方法制备而成的杨梅总黄酮，其纯度高，最终产品安全可靠。

本发明的目的还包括提供一种eNOS激动剂，其以杨梅总黄酮作为eNOS激动剂，能够有效治疗内皮障碍引发的疾病。

为实现上述至少一个目的，本发明的实施例采用以下技术方案：

杨梅总黄酮在制备治疗或预防eNOS介导疾病的药物中的应用。

杨梅总黄酮在制备上调eNOS表达的药物中的应用。

杨梅总黄酮在制备增加eNOS活性的药物中的应用。

杨梅总黄酮在制备治疗或预防血管内皮障碍疾病的药物中的应用，血管内皮障碍疾病包括高血压、动脉粥样硬化和糖尿病肾病中的一种或多种。

一种杨梅总黄酮的制备方法，其包括取杨梅100-150重量份，粉碎，加入500-1200重量份的提取溶剂提取1-3次，每次提取60-120min，将多次获得的提取液过滤合并，浓缩，其中，提取溶剂包括乙醇和/或乙酸乙酯。

可选地，在本发明的优选实施例中，在将上述杨梅粉碎后，在加入提取溶液之前，还包括：向杨梅中加入水300-400重量份、纤维素酶0.5-0.6重量份和果胶酶1-1.2重量份进行酶解，酶解温度为40～60℃，酶解时间为100～120min，酶解完成后加热至80-100℃进行灭酶，得到酶解液；向酶解液中加入pH值为4-5的无机酸，接着以2-5℃/min的降温速度降温至50-60℃，反应1-2h，得到酸洗液；将酸洗液离心，取上清液，向上清液中加入提取溶剂。

可选地，在本发明的优选实施例中，再向上清液中加入提取溶剂之前，还包括对上清液进行超声波-微波复合提取，超声波-微波复合提取包括：依次进行的第一次超声波-微波复合提取和第二次超声波-微波复合提取，其中，第一次超声波-微波复合提取的超声波的提取时间为1～3min，微波的提取时间为1～2min，微波的辐射功率为500～600W；第二次超声波-微波复合提取的超声波的提取时间为0.5～1.5min，微波的提取时间为0.5～1.5min，微波的辐射功率为700～900W。

一种杨梅总黄酮，其是由上述杨梅总黄酮的制备方法制备而成，优选地，杨梅总黄酮中黄酮含量为10-95％v/v，优选为40-95％v/v，更优选为60-90％v/v。

一种eNOS激动剂，其原料包括上述杨梅总黄酮。

可选地，在本发明的优选实施例中，原料仅包括杨梅总黄酮一种组分或者还包括用于制备口服制剂或注射剂的辅料。

本发明实施例的有益效果例如包括：

本实施例提供的杨梅总黄酮在制药领域的新用途，该杨梅总黄酮具有上调eNOS的表达的作用，同时还具有增加eNOS活性的作用，将杨梅总黄酮作为eNOS激动剂，能够有效治疗内皮障碍引发的疾病，如高血压、动脉粥样硬化、糖尿病肾病，将其应用于制备eNOS介导疾病的药物中。该产品能够有效治疗内皮障碍引发的疾病，杨梅黄酮能够增加人脐静脉血管内皮细胞中eNOS的浓度，并且杨梅黄酮可以通过抑制内皮素的释放保护血管内皮细胞以及防止血压升高，进而增加血管内eNOS的表达，杨梅黄酮具有预防和保护糖尿病肾病的作用。本实施例提供的杨梅总黄酮制备方法，其制备工艺简单，获得的杨梅总黄酮的含量高，纯度高，最终产品安全可靠，将其应用于制备eNOS介导疾病的药物中，效果更佳，而包含有杨梅总黄酮的eNOS激动剂，能够有效治疗内皮障碍引发的疾病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的杨梅黄酮对HUVECs细胞内NO含量的影响的示意图；

图2为本发明实施例1提供的杨梅黄酮对HUVECs细胞内eNOS表达的影响的示意图，其中^##P<0.01，^#P<0.05vs Control组，^**P<0.01，^*P<0.05vs Ang II组；

图3为本发明实施例1提供的杨梅黄酮对高血压血管病理变化的影响的意图；

图4为本发明实施例1提供的杨梅黄酮对高血压大鼠血管eNOS蛋白表达的影响的示意图，其中^##P<0.01，^#P<0.05vs正常组，^**P<0.01，^*P<0.05vs模型组；

图5为本发明实施例1提供的杨梅黄酮对糖尿病肾脏eNOS表达的影响的示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种一种杨梅总黄酮、其制备方法和应用以及eNOS激动剂进行具体说明。

杨梅(Myica rubra Sieb et Zucc.)。系杨梅科(Mycicacae)杨梅属(Myrica L)杨梅属多年生常绿乔木.是南方良好的经济生态树种。近年来，人们越来越重视从天然产物中寻找强身祛病的保健品。以替代具有较多毒副作用的化学药品。杨梅为药食两用芳香植物在宋代(食疗本草>和明代(本草纲目)对杨梅的药用功效均有记载。杨梅具有抗肿瘤、抗过敏、神经保护、降血糖等作用，但是对于杨梅总黄酮的作用研究较少。

本实施例中，经发明人长期研究发现，杨梅总黄酮能够作为eNOS激动剂，该eNOS激动剂的原料可以仅包括单一的杨梅总黄酮，也可以利用杨梅总黄酮与其他辅料进行复配使用。

具体地，辅料为用于制备口服制剂或注射剂的辅料，是指除了活性成分以外包含有剂型中的物质，该辅料具体包括但不限于填充剂、润滑剂、分散剂、湿润剂、粘合剂、调节剂、增溶剂、抗氧化剂、抑菌剂、乳化剂和崩解剂等。粘合剂包括但不限于糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素及其衍生物、明胶浆、糖浆、淀粉浆或聚乙烯吡格烷酮等；填充剂包括但不限于乳糖、糖粉、水苏糖、甜菊糖甙、低聚糖、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、无机钙盐和甘氨酸等；润滑剂包括但不限于微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油和聚乙二醇等；崩解剂包括但不限于淀粉及其衍生物和微晶纤维素等；湿润剂包含亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和二丁基苯酸等；抑菌剂包括但不限于5-8％苯酚、0.3-0.5％甲酚和0.5-1％三氯叔丁醇等；调节剂包括但不限于盐酸、枸橼酸、氢氧化钾和枸橼酸钠及缓冲液等；乳化剂包括但不限于聚山梨酯-80、脂肪酸山梨坦、卵磷脂和豆磷脂等；增溶剂包括但不限于吐温-80、胆汁和甘油等。

除了辅料以外，本实施例提供的eNOS激动剂作为保健品或药品时，还可以包含辅助性成分，即具有一定的生理活性，但该成分的加入不会改变上述提取物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式，若将上述辅助性成分与本发明杨梅总黄酮配合使用，仍属于本发明保护范围。

经发明人研究发现，杨梅总黄酮具有上调eNOS的表达或增加eNOS活性的作用，因此将杨梅总黄酮应用于制备治疗或预防eNOS介导疾病的药物中。

具体来说，杨梅总黄酮在制备上调eNOS表达的药物中的应用。杨梅总黄酮在制备增加eNOS活性的药物中的应用。杨梅总黄酮在制备治疗或预防血管内皮障碍疾病的药物中的应用，所述血管内皮障碍疾病包括高血压、动脉粥样硬化、高血压肾病和糖尿病肾病中的一种或多种。

当内皮功能紊乱为血管内皮功能紊乱时，血管内皮不仅仅是一个被动性屏障，而且是一个非常复杂的内分泌“器官”，它通过主动分泌大量的血管活性物质，起着调节血管张力、防止血栓形成及循环血细胞粘附、抑制血管平滑肌增殖等保护作用，进而会导致产生高血压和动脉粥样硬化等疾病。

当内皮功能紊乱为肾小球内皮细胞紊乱时，肾小球内皮细胞长期在高糖、血管紧张素、血管内皮生长因子、活性氧、糖基化终末产物等物质的刺激下回造成结构和功能的改变，出现肾小球滤过率增加、蛋白尿最终导致肾功能不全，进而会导致产生高血压肾病与糖尿病肾病等疾病。

杨梅总黄酮中黄酮含量为10-95％v/v，优选为40-95％v/v，更优选为60-90％v/v。经发明人研究发现，杨梅总黄酮中含有上述含量的的黄酮时，其预防和治疗内皮功能紊乱造成的相关疾病的功效更佳。

杨梅总黄酮特征为，含有杨梅素、二氢杨梅素、3’,5’-二甲氧基杨梅素-3-O-(6’-O-乙酰基)-α-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、二氢槲皮素、山柰酚、木犀草素、鼠李素、儿茶素、表儿茶素、原花青素二聚体、原花青素三聚体、原花青素四聚体中的组合物。

本实施例中的杨梅总黄酮可以为于市面上采购，也可自主制备，本实施例中，优选采用以下制备方法制备，据此，此外，本发明实施例还提供了上述杨梅总黄酮的制备方法，具体包括以下步骤：

S1、粉碎。

取杨梅100-150重量份，粉碎。粉碎约至20-100目，优选为40-80目。本实施例中的杨梅可以为新鲜杨梅或者杨梅粉。粉碎后的杨梅更利于提取杨梅内的杨梅总黄酮。

S2、酶解反应。

向粉碎后的杨梅中加入0.5-0.6重量份纤维素酶和1-1.2重量份果胶酶进行酶解，酶解温度为40～60℃，酶解时间为100～120min，酶解完成后加热至80-100℃进行灭酶，得到酶解液。

纤维素酶和果胶酶能够使细胞壁的主要成分纤维素水解，从而破坏杨梅的细胞壁的结构，产生局部的坍塌、溶解、疏松，减少溶剂提取时来自细胞壁和细胞质的阻力，加快有效成分溶出细胞的速率，提高提取效率，缩短提取时间。

S3、酸洗除杂。

向酶解液中加入pH值为4-5的无机酸，接着以2-5℃/min的降温速度降温至50-60℃，反应1-2h，得到酸洗液；将酸洗液离心，取上清液。

树脂、油脂、色素等会被提取溶剂浸出的有机杂质在温度为50-60℃条件下能够与无机酸反应，进而生成不溶于水的物质，经离心后去除，经过酸洗除杂后，最后制得的杨梅黄酮的纯度相较于现有技术有较大的提高，并且产品的纯度高，得率高。

S4、超声波-微波复合提取。

对上清液进行超声波-微波复合提取，超声波-微波复合提取包括：依次进行的第一次超声波-微波复合提取和第二次超声波-微波复合提取，其中，第一次超声波-微波复合提取的超声波的提取时间为1～3min，微波的提取时间为1～2min，微波的辐射功率为500～600W；第二次超声波-微波复合提取的超声波的提取时间为0.5～1.5min，微波的提取时间为0.5～1.5min，微波的辐射功率为700～900W。

本实施例中，将超声波提取和微波提取复合提取，能够有效提高杨梅中杨梅总黄酮的提取率。因为先通过超声波的机械粉碎和空化效应等作用，可使物质分子运动的频率和速度增大，溶剂的穿透力增强，组织内部或胶体内的有效成分溶出速度和溶出数量得到提高，再辅以微波的生理、物理效应使极性分子随微波频率摆动并产生热量，使体系更加分散，有利于物质的溶出。超声波处理后的样品更适宜于微波发挥其功效，使原料内部温度在微波辐射下得以全面、快速、均匀升高，从而加快溶剂对杨梅总黄酮的提取过程，大大提高提取的效率。此复合提取法克服了传统方法的缺点，具有操作简便，经济、省时的优点，所以在相同的时间内大大提高了杨梅中杨梅总黄酮的浸出率。

通过进行两次超声波-微波复合提取步骤，且控制两次超声波-微波复合提取步骤的不同工艺参数，使杨梅内的杨梅黄酮充分溶解，在第一次超声波-微波复合提取时，第一次超声波的1～3min提取时间能够充分使物质分子运动频率和速度加大，第一乙醇的穿透力增强，便于杨梅总黄酮溶出，此外，进行1～2min的第一次微波提取，并且控制第一次微波的辐射功率为500～600W，快速提高溶剂的温度，进一步加快分子的运动频率和速度，从而加快溶剂对杨梅黄酮的提取过程。在第一次超声波-微波复合提取后，间隔1～2min，间隔的时间能够使溶剂的运动趋于平稳，同时降低溶剂的温度，然后再次进行第二次超声波-微波复合提取，有助于进一步加强杨梅总黄酮的浸出率，提高杨梅总黄酮的提取率，由于第一次超声波-微波复合提取后杨梅总黄酮大部分已被浸出，本实施例中通过缩短第二次超声波-微波复合提取的时间，从而进行辅助提取，加强杨梅总黄酮的提取率，同时增大第二次微波的辐射功率，使杨梅内部温度进一步进行提高，加快杨梅内分子的运动频率和速度，从而将第一次超声波-微波复合提取未破碎或未溶出的杨梅总黄酮进一步溶出。

S5、提取溶剂提取。

向粉碎后的杨梅中加入500-1200重量份的提取溶剂，提取1-3次，每次提取1-2h，将多次提取获得的提取液过滤合并，浓缩。本实施例中，提取溶剂包括乙醇和/或乙酸乙酯。提取溶剂通过浸泡能够充分将杨梅中的黄酮提取出来，提取效果佳，配合前序步骤的酶解。酸洗和超声波-微波复合提取，提取效果更佳，且提取纯度较高。

值得注意的是，本实施例提供的步骤S2、S3和S4均为可选步骤，也即是，在本发明的其他实施例中，杨梅总黄酮的制备方法可仅包含步骤S1和步骤S5。

以下结合实施例对本发明的杨梅总黄酮、其制备方法和应用以及eNOS激动剂进一步进行阐述。

实施例1

称取100g的杨梅干粉，加入的95％乙醇800ml提取2次，提取时间为2h，将提取液过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏，即得杨梅总黄酮。

实施例2

称取100g的杨梅干粉，加入的80％乙醇1000ml提取2次，提取时间为2h，将提取液过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏，即得杨梅总黄酮。

实施例3

称取100g的杨梅干粉，加入的95％乙酸乙酯800ml提取2次，提取时间为3h，将提取液过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏，即得杨梅总黄酮。

实施例4

称取100g的杨梅干粉，加入的50％乙酸乙酯1000ml提取1次，提取时间为3h，将提取液过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏，即得杨梅总黄酮。

实施例5

称取150g的杨梅干粉，加入300g的水、0.5g的纤维素酶和1g的果胶酶，置于40℃下酶解120min，接着加热至80℃进行灭酶，得到酶解液；向酶解液中加入pH值为5的无机酸，以5℃/min的降温速度降温至50℃，反应1h，得到酸洗液；将酸洗液离心，取上清液，向上清液中加入50％乙酸乙酯900ml提取2次，提取时间为2h，将提取液过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏，即得杨梅总黄酮。

实施例6

称取120g的杨梅干粉，加入400g的水、0.5g的纤维素酶和1g的果胶酶，置于60℃下酶解100min，接着加热至100℃进行灭酶，得到酶解液；向酶解液中加入pH值为4的无机酸，以2℃/min的降温速度降温至60℃，反应2h，得到酸洗液；将酸洗液离心，取上清液，将上清液置于超声波-微波条件下进行复合提取，进行的第一次超声波-微波复合提取和第二次超声波-微波复合提取，其中，第一次超声波-微波复合提取的超声波的提取时间为1min，微波的提取时间为1min，微波的辐射功率为600W；第二次超声波-微波复合提取的超声波的提取时间为0.5min，微波的提取时间为0.5min，微波的辐射功率为900W，复合提取完成后再加入70％乙酸乙酯1000ml提取1次，提取时间为1h，将提取液过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏，即得杨梅总黄酮。

实施例7

称取150g的杨梅干粉，加入350g的水、0.6g的纤维素酶和1.2g的果胶酶，置于50℃下酶解110min，接着加热至90℃进行灭酶，得到酶解液；向酶解液中加入pH值为4的无机酸，以3℃/min的降温速度降温至60℃，反应1h，得到酸洗液；将酸洗液离心，取上清液，将上清液置于超声波-微波条件下进行复合提取，进行的第一次超声波-微波复合提取和第二次超声波-微波复合提取，其中，第一次超声波-微波复合提取的超声波的提取时间为3min，微波的提取时间为2min，微波的辐射功率为600W；第二次超声波-微波复合提取的超声波的提取时间为1.5min，微波的提取时间为1.5min，微波的辐射功率为700W，复合提取完成后再加入70％乙酸乙酯500ml提取1次，提取时间为1h，将提取液过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏，即得杨梅总黄酮。

实施例8：eNOS激动剂片剂

原料：

活性成分：杨梅总黄酮100g

药用辅料：淀粉35g、糊精75g、硬脂酸镁2g、滑石粉6g以及70％乙醇12g。

制备方法：

1)取所述重量份的实施例1中的杨梅总黄酮浓缩成浸膏；

2)加入所述重量份的淀粉、糊精、硬脂酸镁、滑石粉以及70％乙醇，搅拌混合制软粒；

3)对软粒进行压片，每片含杨梅总黄酮100mg

实施例9：eNOS激动剂胶囊剂

原料：

活性成分：杨梅总黄酮120g；

药用辅料：淀粉40g、糊精80g、硬脂酸镁3g、滑石粉9g、70％乙醇20g。

制备方法：

1)取所述重量份的实施例1中的杨梅总黄酮浓缩成浸膏；

3)软粒进行灌装形成胶囊，每片含杨梅总黄酮100mg

实施例10：eNOS激动剂注射剂

原料：

活性成分：杨梅总黄酮100g

药用辅料：注射用水1000ml。

制备方法：将实施例1得到的杨梅总黄酮冷藏并去除杂质，加入所述重量份的注射用水，冷藏过夜，解冻，抽滤，滤液调节pH6，然后加入活性炭脱色，室温下静置后精滤，灌装，灭菌分装，每只含杨梅总黄酮200mg。

试验例

一、杨梅总黄酮中黄酮含量测定

使用实施例1中方法提取杨梅总黄酮，通过紫外分光光度计测定总黄酮含量。

1.实验材料

芦丁，上海阿拉丁试剂有限公司；

亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇均购自国药化学试剂有限公司；

2.实验方法

标准曲线的制备：取芦丁标准品储备液，稀释为0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.0625mg/ml和0.03125mg/ml的标准品溶液，待用；

样品溶液的制备：取0.1g浸膏，定容至100ml蒸馏水中，制成1mg/ml样品溶液；

将标准品与样品按表1的顺序加入实验体系中，按步骤进行测定：

表1.黄酮含量测定加样表

3.统计学处理

所有数据均采用Means±SEM表示，统计学分析均采用SPSS19.0软件进行，两组间比较均采用t检验，多组间比较采用one-way ANOVA分析。

4.实验结果

总黄酮含量测定的标准曲线为Y＝5.0849X+0.0182，相关系数：0.9957，测定杨梅总黄酮中黄酮含量为72.4±0.12％。

二、杨梅总黄酮通过激活eNOS保护血管紧张素造成的内皮细胞损伤

1.实验材料

1.1实验仪器与试剂

杨梅粉，陕西森弗天然制品有限公司；

NO测定荧光探针，江苏碧云天生物技术有限公司；

兔抗eNOS多克隆抗体，北京中山金桥生物有限公司；

血管紧张素II，武汉科瑞生物技术有限公司；

1.2实验细胞

人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)，上海基尔顿生物有限公司；

2.实验方法

2.2细胞培养

(1)培养基为DMEM高糖培养基，加入10％胎牛血清，含有青霉素100U/ml的链霉素100μg/ml；

(2)培养条件为5％的CO₂，37℃的恒温培养箱；

(3)每2～3天换液；

(4)细胞融合至80％传代及接板。

2.2杨梅黄酮对AngII诱导HUVECs细胞损伤的影响

1μmol/L的Ang II作为造模药物，药物分组为Control组、杨梅黄酮组(20μg/ml)、Ang II组、Ang II+杨梅黄酮组(20μg/ml)组。空白组加入不含Ang II的DMEM，造模组与给药处理组均加入1μmol/L的Ang II造模12h，L-NAME处理组提前用100uM的L-NAME处理2h，造模与给药同时进行。

(1)MTT法测定细胞活性

使用培养基将MTT配置为1mg/ml的溶液，在处理后吸出旧培养基弃掉，PBS清洗三遍，加入含有MTT培养，5％的CO₂，37℃的恒温培养箱培养4h，吸出培养基，加入DMSO溶解平衡10min，测定490nm处吸光度。

(2)NO含量测定

使用终浓度为5μmol/L的DAF-FM DA探针，加入后在37℃孵育15-30min,小心吸去孵育液后用PBS洗涤轻轻洗细胞3次。在相同条件下使用荧光显微镜观察并拍照记录。

(3)采用western blot方法测定eNOS蛋白表达含量

3.统计学处理

所有数据均采用Means±SEM表示，统计学分析均采用SPSS19.0软件进行，两组间比较均采用t检验，多组间比较采用one-way ANOVA分析。P<0.05为认为有显著性差异。

4.实验结果

4.1杨梅黄酮对AngII诱导HUVECs细胞损伤的影响

使用MTT法测定细胞活性，实验结果如表2所示，Control组吸光度为0.65±0.23、杨梅黄酮组(20μg/ml)吸光度为0.67±0.35、Ang II组吸光度为0.45±0.29、Ang II+杨梅黄酮组(20μg/ml)吸光度为0.62±0.51。结果表明单独使用杨梅黄酮对HUVECs细胞活性没有影响，而在AngII的刺激下，细胞活性下降(p<0.01)；杨梅黄酮可以逆转这一损伤。

表2.杨梅黄酮对AngII诱导HUVECs细胞损伤的影响(吸光度)

分组	吸光度
		Control	0.65±0.23
杨梅黄酮(20μg/ml)	0.67±0.35
		Ang II(1μM)	0.45±0.29^##
Ang II+杨梅黄酮	0.62±0.51**

注：其中^##P<0.01，^#P<0.05vs Control，^**P<0.01，^*P<0.05vs Ang II组

4.2杨梅黄酮对AngII诱导的HUVECs细胞内NO含量的影响

结果见图1所示，与Control组相比，单独使用杨梅黄酮(20μg/ml)，会增加HUVECs中NO的浓度。加入AngII组显著降低NO含量，杨梅黄酮(20μg/ml)可以逆转这一损伤。

4.3杨梅黄酮对对AngII诱导的HUVECs细胞内eNOS的影响

结果见图2所示，与Control组相比，单独使用杨梅黄酮(20μg/ml)，会增加HUVECs中eNOS的浓度。加入AngII组显著降低eNOS含量，杨梅黄酮(20μg/ml)可以逆转这一变化，如图2所示。

三、杨梅总黄酮通过激活eNOS调节高血压大鼠血管功能紊乱

1.实验材料

1.1实验仪器与试剂

三通道无创血压测定仪，成都泰盟仪器有限公司；

杨梅粉，陕西森弗天然制品有限公司；

硝苯地平，浙江泰利森药业有限公司；

NO含量测定试剂盒，南京建成生物技术有限公司；

BUN测定试剂盒，南京建成生物技术有限公司；

苏木素-伊红染色，碧云天生物有限公司；

兔抗eNOS多克隆抗体，北京中山金桥生物有限公司；

内皮素(ET-1)ELISA试剂盒，BioSwamp生物技术有限公司；

1.2实验动物

32只SD雄性大鼠，体重范围为200±20g，购于湖北省实验动物研究中心，许可证号为SCXK(鄂)2015-0018；

2.实验方法

2.动物实验

2.1动物分组与给药

SD雄性大鼠随机分为正常组，模型组，模型+杨梅醇提物(100mg/kg)预防组，模型+硝苯地平(10mg/kg)预防组；每组8只。造模组每天灌胃给予亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)60mg/kg，造模一个月后，血压高于150mmHg，为典型高血压模型。与造模同时进行预防给药，目的是模拟人类处于高血压临界期，我们的目标物质及目前的经典降压药能否阻止高血压的进程观察。

2.2血压测定

使用无创血压测定仪测定大鼠在造模2、4、6、8周时的血压。

2.3动物处理

实验第八周末血压测定结束后，大鼠禁食不禁水24h，以10％Chloral hydrate腹腔注射进行麻醉，麻醉剂量为3mL/kg。眼球取血，在4℃静置24h后离心取血清放入-80℃保存备用。处死大鼠后，打开腹腔与胸腔，分离胸主动脉，取部分4％多聚甲醛固定。

2.4血清内皮素(ET-1)含量测定

取血清，按照大鼠内皮素(ET-1)试剂盒说明书步骤测定血清内TM与PAI-1含量。

2.5血管病理观察

取固定胸主动脉组织，常规包埋，石蜡切片后进行HE染色。

HE染色步骤为：

(1)切片脱蜡至水；

(2)用苏木素染液覆盖染色10min，水洗；

(3)1％盐酸酒精分化数秒；

(4)碱性溶液返蓝，自来水冲洗数分钟；

(5)入伊红染液染1-3min；

(6)无水酒精脱水，二甲苯透明。中性树胶封固，镜检。

2.6血管eNOS蛋白表达测定

取定量的各组大鼠胸主动脉，抽提相应的蛋白，具体步骤如下：

(1)称取大鼠同一部位的胸主动脉组织，置于5ml离心管中；

(2)RIPA裂解液，使用前加入终浓度为1mM的PMSF备用，目的是抑制样品中蛋白酶的活性；

(3)按照1：5的比例在主动脉中加入RIPA裂解液，冰水浴并使用超声匀浆机研磨使组织块充分裂解；

(4)4℃离心机10000rmp离心30min，取上清；

(5)检测样品中的蛋白总量，使用BCA法进行蛋白含量的测定。

2.7Western blot检测组织中蛋白含量的表达

(1)上样蛋白的制备，将样品蛋白含量调整至同一水平，加入4×的上样缓冲液，沸水浴5min进行蛋白变性，制备好的样品存放于-80℃备用；

(2)按照表3-3顺序配制浓缩胶和分离胶：

(3)稀释10×电泳缓冲液至1×，以30ug为上样蛋白浓度进行SDS-PAGE电泳，80V电压电泳至浓缩胶边缘，分离胶电泳电压为120V，电泳至凝胶边缘；

(4)配制1×转移缓冲液，PVDF膜甲醇活化20min后，转移缓冲液平衡10min，250mA恒流湿转2h；

(5)封闭：将转移后的PVDF膜放入浓度为5％的BSA的平皿，30℃摇床封闭1h；

(6)孵育一抗：按比例用5％的BAS稀释一抗，封闭后的PVDF膜根据分子量裁取相应的目的条带，加一抗，4℃过夜；

(7)洗膜：一抗孵育完成后，TBST洗膜3×5min次；

(8)孵育二抗：清洗后PVDF膜加入二抗，37℃孵育1h；

(9)洗膜：二抗孵育完成后，TBST洗膜3×5min次；

(10)显影与定影：采用ECL试剂盒曝光，显影并定影。

3.统计学处理

4.实验结果

4.1杨梅黄酮对L-NAME诱导大鼠收缩压的影响

L-NAME是公认的NOS抑制剂，大鼠服用4week以后会产生明显的血压上升，是研究eNOS激动剂最为合适的高血压模型。在造模的同时，使用杨梅黄酮(100mg/kg)预防给药，结果如表3所示，正常组血压维持在120mmHg左右，模型组在给药2week后出现收缩压显著升高，至造模8周时血压为171±8.3mmHg。杨梅黄酮组(100mg/kg)在给药4week时与模型组相比，与模型组相比，血压出现显著降低，降血压作用一直持续到第8week(P<0.01)，阳性对照硝苯地平组从给药第2week就出现显著的降血压作用，直到实验结束(P<0.01)。

表3.杨梅黄酮对L-NAME诱导大鼠高血压大鼠收缩压的影响(mmHg)

注：其中##P<0.01，#P<0.05vs正常组，^**P<0.01，^*P<0.05vs模型组

4.2杨梅黄酮对L-NAME诱导大鼠舒张压的影响

结果如表4所示，模型组在给药2week后出现舒张压显著升高，至造模8周时血压为48±4.9mmHg。杨梅黄酮组(100mg/kg)在给药6week时与模型组相比，与模型组相比，血压出现显著降低，降血压作用一直持续到第8week(P<0.01)，阳性对照硝苯地平组从给药第4week就出现显著的降血压作用，直到实验结束(P<0.01)。

表4.杨梅黄酮对L-NAME诱导大鼠高血压大鼠收缩压的影响(mmHg)

注：其中^##P<0.01，^#P<0.05vs正常组，P<0.01，P<0.05vs模型组

4.3杨梅黄酮对L-NAME诱导大鼠高血压内皮素含量的影响

使用ELISA法测定高血压大鼠血清内ET-1的含量，结果如表5。内皮损伤所致的内皮细胞功能不全常以血管收缩与舒张因子、生长与抑制因子以及促凝与抗凝因子间的平衡被打破为主要特征。其中，ET-1是调节血管收缩重要因子，反应了高血压大鼠中血管内皮的损伤情况。实验结果如表5所示，正常组、模型组、杨梅黄酮组(100mg/kg)、硝苯地平(10mg/kg)组内皮素含量分别为21.3±2.1、48.7±3.9、29.3±4.1、30.1±5.3pg/ml。模型组血清中ET-1的含量显著升高(P<0.01)，杨梅黄酮组显著降低ET-1含量(P<0.01)，硝苯地平组也显著降低ET-1含量(P<0.05)，说明杨梅黄酮可以通过抑制内皮素的释放保护血管内皮细胞以及防止血压升高。

表5杨梅黄酮对L-NAME诱导大鼠高血压内皮素含量的影响

组别	含量(pg/ml)
		正常组	21.3±2.1
模型组	48.7±3.9^##
		杨梅黄酮组(100mg/kg)	29.3±4.1**
硝苯地平(10mg/kg)	30.1±5.3*

注：其中^##P<0.01，^#P<0.05vs正常组，P<0.01，P<0.05vs模型组

4.4杨梅黄酮对高血压血管病理变化的影响

结果如图3所示，与正常组比较，HE染色观察到L-NAME组胸主动脉管壁厚度及各层结构变化不明显，但是血管内皮不够平滑完整，有部分缺失；硝苯地平组(10mg/kg)治疗组血管内皮也有部分缺失；杨梅黄酮(100mg/kg)组血管内皮较为完整，未出现明显缺失。

4.5杨梅黄酮对高血压大鼠血管eNOS蛋白表达的影响

为了进一步研究杨梅提取物保护肾脏和血管的作用机制，我们通过western blot对高血压大鼠主动脉中的eNOS蛋白表达水平进行测定，结果如图4所示。提示在大鼠主动脉中，L-NAME组中eNOS的表达被显著抑制，杨梅黄酮可以增加血管内eNOS的表达，而硝苯地平对eNOS的表达没有显著的影响。

四、杨梅总黄酮通过激活eNOS预防糖尿病肾病

1.实验材料

1.1实验仪器与试剂

光学显微镜，奥林巴斯；

Masson染液，武汉谷歌生物有限公司；

杨梅粉，陕西森弗天然制品有限公司；

NO含量测定试剂盒，南京建成生物技术有限公司；

NO测定荧光探针，江苏碧云天生物技术有限公司；

BUN测定试剂盒，南京建成生物技术有限公司；

兔抗eNOS多克隆抗体，北京中山金桥生物有限公司；

四氧嘧啶，上海阿拉丁试剂有限公司；

1.2实验动物

32只SPF级SD大鼠，体重范围为200±20g，购于湖北省实验动物研究中心，许可证号为SCXK(鄂)2015-0018；

2.实验方法

2.1动物实验

2.1.1动物分组与给药

SD雄性大鼠随机分为正常组，模型组，模型+杨梅醇提物(100mg/kg)组，模型+厄贝沙坦组(17mg/kg)预防组；每组8只。造模组ip四氧嘧啶150mg·kg^－1，每隔7d注射1次，连续3次；杨梅黄酮与厄贝沙坦组灌胃给药一次，连续给药12周。

2.1.3大鼠脏器固定

实验第12周，大鼠禁食不禁水24h，以10％Chloral hydrate腹腔注射进行麻醉，麻醉剂量为3mL/kg。眼球取血，使用血糖仪测定血糖，剩余血液在4℃静置24h后离心取血清放入-80℃保存备用。处死大鼠后，打开腹腔与胸腔，分离肾脏，取部分4％多聚甲醛固定，常规包埋，石蜡切片。

2.1.4血生化指标测定

实验结束前1天，收集1次24h尿蛋白，采用考马斯亮蓝法测24h尿白蛋白含量。取收集血清全自动生化仪测定血清中血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)。

(7)无水酒精脱水，二甲苯透明。中性树胶封固，镜检。

2.1.5肾脏eNOS蛋白表达测定

采用免疫组化方法测定eNOS蛋白表达

(1)石蜡切片彻底脱蜡至水(同HE染色)；

(2)入PBS液洗2min(3次)后，浸入枸橼酸缓冲液中，用高压锅抗原修复2min，流水冲淋冷却至常温；

(3)入PBS液洗2min(3次)后，擦拭玻片周围多余液体，将玻片水平摆放在湿盒内，及时滴加eNOS一抗(1：50稀释)，使其均匀、完全覆盖组织，盖好湿盒盖，将湿盒置于恒温箱中，37℃孵育90min；

(4)孵育完成后，取出湿盒，室温放置30min；

(5)入PBS液洗2min(3次)，擦拭玻片周围多余液体，滴加二抗，湿盒再次放入恒温箱，37℃孵育30min；

(6)孵育完成后，入PBS液洗2min(3次)；

(7)配DAB显色液：EP管依次加入lml蒸馏水、l滴显色剂A、l滴显色剂B、1滴显色剂C，混匀。暗室中显色，镜下观察显色程度，控制显色时间(约4min)，自来水终止显色；

(8)苏木素复染2min左右，过水，然后于盐酸酒精中分化几秒钟，再过水，于氨水中反蓝几秒中，过水：

(9)梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，粘贴相应的标签；

(10)光镜下以棕黄色染色区域为阳性表达。

3.统计学处理

4.实验结果

4.1杨梅黄酮对糖尿病肾病生化指标的影响

请参阅表6，正常组、模型组、杨梅黄酮组(100mg/kg)、厄贝沙坦组(17mg/kg)的血糖分别为6.2±1.1、20.7±3.7、11.3±2.4与15.6±6.1mmol/L；蛋白尿分别为5.6±0.5、37.4±2.1、18.1±2.0、22.1±1.5mg；肌酐30.6±2.4、84.3±5.9、59.3±4.8、64.3±7.7μmol/L；尿素氮为5.3±0.9、16.4±1.2、9.4±1.7、11.9±2.3。说明杨梅黄酮具有预防和保护糖尿病肾病的作用。

表6.杨梅黄酮对糖尿病肾病生化指标的影响

注：其中^##P<0.01，^#P<0.05vs正常组，^**P<0.01，^*P<0.05vs模型组

4.2杨梅黄酮对糖尿病肾脏eNOS表达的影响

采用免疫组化实验方法测定肾脏中eNOS蛋白的表达情况，结果如图5所示，与正常组相比，模型组eNOS阳性表达下调，杨梅黄酮组逆转这一变化，而厄贝沙坦组作为一类血管紧张素II受体拮抗剂，并没有激活eNOS的作用。

综上所述，可以看出，上述的杨梅黄酮在eNOS介导的内皮功能障碍中的用途。

采用人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)细胞血管紧张素II(AngII)诱导的内皮损伤模型，分组为Control组、杨梅黄酮组(20μg/ml)、Ang II组、Ang II+杨梅黄酮组(20μg/ml)组。使用MTT法测定细胞活性结果表明单独使用杨梅黄酮对HUVECs细胞活性没有影响，而在AngII的刺激下，细胞活性下降；杨梅黄酮可以逆转这一损伤；使用荧光探针测定细胞内NO含量，与Control组相比，单独使用杨梅黄酮(20μg/ml)，会增加HUVECs中NO的浓度。加入AngII组显著降低NO含量，杨梅黄酮(20μg/ml)可以逆转这一损伤。通过western blot方法测定细胞eNOS蛋白的表达，与Control组相比，单独使用杨梅黄酮(20μg/ml)，会增加HUVECs中sNOS的浓度。加入Ang II组显著降低eNOS含量，杨梅黄酮(20μg/ml)可以逆转这一变化。

采用一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)造成的高血压大鼠模型，SD雄性大鼠随机分为正常组，模型组，模型+杨梅醇提物(100mg/kg)预防组，模型+硝苯地平(10mg/kg)预防组。与模型组相比，杨梅黄酮具有降低收缩压和舒张压的作用；ELISA法测定内皮损伤标记物内皮素含量，正常组、模型组、杨梅黄酮组(100mg/kg)、硝苯地平(10mg/kg)组内皮素含量分别为21.3±2.1、48.7±3.9、29.3±4.1、30.1±5.3pg/ml，说明杨梅黄酮可以通过抑制内皮素的释放保护血管内皮细胞以及防止血压升高；血管病理观察发现L-NAME组胸主动脉管壁厚度及各层结构变化不明显，但是血管内皮不够平滑完整，有部分缺失；硝苯地平组(10mg/kg)治疗组血管内皮也有部分缺失；杨梅黄酮(100mg/kg)组血管内皮较为完整，未出现明显缺失；eNOS表达结果显示L-NAME组中eNOS的表达被显著抑制，杨梅黄酮可以增加血管内eNOS的表达，而硝苯地平对eNOS的表达没有显著的影响。

采用四氧嘧啶制备的糖尿病肾病模型，SD雄性大鼠随机分为正常组，模型组，模型+杨梅醇提物(100mg/kg)组，模型+厄贝沙坦组(17mg/kg)预防组。正常组、模型组、杨梅黄酮组(100mg/kg)、厄贝沙坦组(17mg/kg)的血糖分别为6.2±1.1、20.7±3.7、11.3±2.4与15.6±6.1mmol/L；蛋白尿分别为5.6±0.5、37.4±2.1、18.1±2.0、22.1±1.5mg；肌酐30.6±2.4、84.3±5.9、59.3±4.8、64.3±7.7μmol/L；尿素氮为5.3±0.9、16.4±1.2、9.4±1.7、11.9±2.3。说明杨梅黄酮具有预防和保护糖尿病肾病的作用。采用免疫组化实验方法测定肾脏中eNOS蛋白的表达情况，结果如图所示，与正常组相比，模型组eNOS阳性表达下调，杨梅黄酮组逆转这一变化，而厄贝沙坦组作为一类血管紧张素II受体拮抗剂，并没有激活eNOS的作用。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.杨梅总黄酮在制备治疗或预防eNOS介导疾病的药物中的应用。

2.杨梅总黄酮在制备上调eNOS表达的药物中的应用。

3.杨梅总黄酮在制备增加eNOS活性的药物中的应用。

4.杨梅总黄酮在制备治疗或预防血管内皮障碍疾病的药物中的应用，所述血管内皮障碍疾病包括高血压、动脉粥样硬化和糖尿病肾病中的一种或多种。

5.一种杨梅总黄酮的制备方法，其特征在于，其包括取杨梅100-150重量份，粉碎，加入500-1200重量份的提取溶剂提取1-3次，每次提取60-120min，将多次获得的提取液过滤合并，浓缩，其中，所述提取溶剂包括乙醇和/或乙酸乙酯。

6.根据权利要求5所述的杨梅总黄酮的制备方法，其特征在于，在将所述杨梅粉碎后，在加入所述提取溶液之前，还包括：向所述杨梅中加入水300-400重量份、纤维素酶0.5-0.6重量份和果胶酶1-1.2重量份进行酶解，酶解温度为40～60℃，酶解时间为100～120min，酶解完成后加热至80-100℃进行灭酶，得到酶解液；向所述酶解液中加入pH值为4-5的无机酸，接着以2-5℃/min的降温速度降温至50-60℃，反应1-2h，得到酸洗液；将所述酸洗液离心，取上清液，向所述上清液中加入所述提取溶剂。

7.根据权利要求6所述的杨梅总黄酮的制备方法，其特征在于，再向所述上清液中加入所述提取溶剂之前，还包括对所述上清液进行超声波-微波复合提取，所述超声波-微波复合提取包括：依次进行的第一次超声波-微波复合提取和第二次超声波-微波复合提取，其中，第一次超声波-微波复合提取的超声波的提取时间为1～3min，微波的提取时间为1～2min，微波的辐射功率为500～600W；第二次超声波-微波复合提取的超声波的提取时间为0.5～1.5min，微波的提取时间为0.5～1.5min，微波的辐射功率为700～900W。

8.一种杨梅总黄酮，其特征在于，其是由如权利要求5-7任一项所述的杨梅总黄酮的制备方法制备而成，优选地，所述杨梅总黄酮中黄酮含量为10-95％v/v，优选为40-95％v/v，更优选为60-90％v/v。

9.一种eNOS激动剂，其特征在于，其原料包括如权利要求8所述的杨梅总黄酮。

10.根据权利要求9所述的eNOS激动剂，其特征在于，所述原料仅包括杨梅总黄酮一种组分或者还包括用于制备口服制剂或注射剂的辅料。