CN113413377B

CN113413377B - 3-羟基-β-紫罗兰酮在制备血管相关性疾病的药物中的用途

Info

Publication number: CN113413377B
Application number: CN202110699520.6A
Authority: CN
Inventors: 孙静; 张小飞; 郭东艳; 王赟泽
Original assignee: Shaanxi University of Chinese Medicine
Current assignee: Shaanxi University of Chinese Medicine
Priority date: 2021-06-23
Filing date: 2021-06-23
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2041-06-23
Also published as: CN113413377A

Abstract

本发明3‑羟基‑β‑紫罗兰酮在制备扩张血管和/或修复血管内皮受损细胞的药物中的用途，通过体外活性实验进行活血作用机制的研究发现，3‑羟基‑β‑紫罗兰酮对血管内皮炎症细胞具有显著的保护作用；在血管功能实验中表现出的显著舒张和抑制收缩作用，使其在治疗高血压、周围循环障碍性疾病(如肢端动脉痉挛症、偏头痛、内耳眩晕症、闭塞性脉管炎、脑栓塞和、或闭塞性动脉硬化症)，以及组织代谢机能混乱导致的并发症(如高血脂、血管性痴呆、糖尿病勃起功能障碍、急性高尿酸血症导致血管功能疾病)方面具有综合开发与应用前景。

Description

3-羟基-β-紫罗兰酮在制备血管相关性疾病的药物中的用途

技术领域

本发明涉及3-羟基-β-紫罗兰酮在制备血管相关性疾病的药物中的用途，具体涉及3-羟基-β-紫罗兰酮在制备扩张血管和/或修复血管内皮受损细胞的药物中的用途。

背景技术

循环障碍(circulatory disturbance)心血管系统结构、功能以及血液容量和性质的异常或失调，常导致组织代谢机能混乱，甚至造成组织死亡。循环障碍分全身性和局部性两种，前者由心脏血管系统的疾病或血液本身状态的改变所造成，并波及全身各器官；后者则是机体某一局部或个别器官发生的循环障碍，二者之间存在密切联系。局部性循环障碍常是全身性循环障碍的局部表现，如心力衰竭时常见四肢和胸前水肿；全身性循环障碍又可因局部性循环障碍而引起，如局部创伤的大出血可使血量减少，引起全身性贫血。

3-羟基-β-紫罗兰酮存在于多种植物中，如陆瑶等，《栽培尼泊尔菊三七化学成分的研究》从具有清热凉血，散瘀消肿功效的尼泊尔菊三七中分离出了(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮，何江波等，《骆驼蹄瓣中萜类成分研究》从具有止咳化痰、祛风止痛的骆驼蹄瓣中分离到了该化合物。

目前，还没有关于3-羟基-β-紫罗兰酮用于治疗循环障碍相关疾病的报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了3-羟基-β-紫罗兰酮在制备扩张血管和/或修复血管内皮受损细胞的药物中的用途；所述3-羟基-β-紫罗兰酮结构式为：

进一步地，所述药物是抑制血管收缩的药物。

进一步地，所述药物是舒张血管的药物。

进一步地，所述药物是消炎的药物。

更进一步地，所述药物是治疗高血压的药物。

更进一步地，所述药物是治疗周围循环障碍性疾病的药物。

更进一步地，，所述药物是治疗肢端动脉痉挛症、偏头痛、内耳眩晕症、闭塞性脉管炎、脑栓塞和、或闭塞性动脉硬化症的药物。

本发明还提供了一种具有扩张血管和/或修复血管内皮受损细胞的药物，它是以3-羟基-β-紫罗兰酮为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

进一步地，所述制剂为口服制剂或注射剂。

本发明3-羟基-β-紫罗兰酮在制备扩张血管和/或修复血管内皮受损细胞的药物中的用途，通过体外活性实验进行活血作用机制的研究发现，(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮对血管内皮炎症细胞具有显著的保护作用；能使PE诱导的血管收缩作用由90％降至23.31％，亦能使KCl诱导的血管收缩作用由93.06％降至64.53％；对PE诱导的肠系膜动脉血管环收缩具有较强的舒张作用，舒张率达60.31％，与非内皮依赖性舒张剂SNP的作用效果相近。(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮在血管功能实验中表现出的显著舒张和抑制收缩作用，使其在治疗高血压、周围循环障碍性疾病(如肢端动脉痉挛症、偏头痛、内耳眩晕症、闭塞性脉管炎、脑栓塞和、或闭塞性动脉硬化症)，以及组织代谢机能混乱导致的并发症(如高血脂、血管性痴呆、糖尿病勃起功能障碍、急性高尿酸血症导致血管功能疾病)方面具有综合开发与应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮分离流程图

图2(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮对LPS损伤HUVEC细胞的修复作用(注：给药组与模型组比较，^**P<0.01，^***P<0.001)

图3(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮对PE刺激引起血管扩张图

图4(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮对KCl刺激引起血管扩张图

图5(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮舒张血管作用图

具体实施方式

实施例1(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮的制备

1、制备方法

1)取2018年采摘于陕西省柞水县的黄花油点草(10.0kg)，干燥粉碎后室温下加4.5倍量v/w，ml/g的80％甲醇，采用浸渍法提取4次，依次间隔时间为3，5，7，7天，合并滤液，减压回收甲醇，浓缩，得到甲醇提取浸膏495.0g；

2)将步骤1)提取的浸膏分散于水中，用乙酸乙酯萃取5次得到乙酸乙酯相，取乙酸乙酯浸膏用甲醇溶解，干法拌样，以50％、75％、85％和100％甲醇经大孔树脂(10×60cm,5×6L)洗脱，得到四个馏分(Fr.1-4)；

3)以50％、75％和85％三种浓度的甲醇洗脱步骤2)所得Fr.2(24.0g)，采用中压分离系统在MCI柱(6×20cm,6×180mL)上分离得到三个馏分(Fr.2A-2C)，再使用硅胶粉为300-400目的硅胶柱(5×6L)将Fr.2C(1.8g)以氯仿-甲醇体系(v/v,40:1→2:1)洗脱，粗分得到5个亚组分(2C1-2C5)；

4)取步骤3)所得亚组分2C2(73.2mg)采用半制备HPLC法，以甲醇-水为流动相(40:60,2.5mL/min)进行了粗分，得到了2C2a-2C2j十个亚组分分支，其中分支2C2j(4.9mg)通过半制备HPLC法，用流动相为乙腈-水体系(32:68)再次纯化，得到了(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮(3.6mg,t_R＝14.2min)，分离流程图见图1。

2、检测

(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮为淡黄色粉末，经核磁共振光谱仪、旋光仪检测得到该化合物的光谱学数据.具体为：[α]2D6-21.9(c 0.2,MeOH)；¹H-NMR(CD₃OD,600MHz)δ:1.10,1.76,2.28,3.95,6.08,7.14；¹³C-NMR(CD₃OD,150MHz)δ:201.46,144.68,137.04,134.45,133.37,65.02,49.43,43.62,37.92,30.72,28.95,27.36,21.89。

实施例2体外活性确认及作用机制研究

a.抗炎实验

①方法

采用脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)炎性损伤构建得到的炎症模型为研究对象，对制得的(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮抑制HUVEC炎性损伤能力进行评价。将HUVEC细胞浓度调整为2×10⁴个/mL，用完全培养基接种于96孔板中，每孔200μL放入恒温培养箱中孵育24h至细胞完全贴壁，小心移去每孔中液体，更换为不含FBS(胎牛血清)的DMEM-F12(含各种氨基酸、葡萄糖、多种微量元素混合营养液的培养基)空白培养基，饥饿处理12h，加药前30min取适量LPS配制成10μM的浓度，加药时空白对照组更换为空白培养基、模型组同时加入LPS及相应剂量的空白培养基保持每孔总体积不变、各给药组加入不同浓度的化合物使其终浓度为50、30、10、5和1μM，同时加入LPS，每个浓度设置六个复孔。

各组处理完成后继续置于恒温培养箱中孵育16h后，使用MTT法进行细胞活力检测。每孔准确加入10μL的MTT溶液，恒温培养箱中培养4-6h，小心移除上清液，每孔加入150μL的DMSO(二甲基亚砜)溶液，在酶标仪490nm处震荡10min测定各孔的吸光度值。细胞相对存活率计算公式如下：

②结果

(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮在1、5、10、30、50μM五个浓度下比较修复炎症损伤效果，并记录抑制损伤作用效果最显著时对应浓度，通过计算各化合物最优浓度下细胞活力与模型组细胞活力的差值，绘制出图2；从图2可见：化合物(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮对LPS诱导的HUVEC炎症模型具有较强的保护作用；经统计学分析，在5μM时具有显著的统计学差异，即该化合物在5μM时对LPS诱导的细胞损伤具有较好的保护效果，此时炎性损伤后细胞活力比模型组细胞活力高出17.11％。

b.血管功能实验

1)主要溶液的配制

Krebs-Henseleit K-H(mmol/L)缓冲液：称取6.903g NaCl、0.358g KCl、2.1gNaHCO₃、0.163g KH₂PO₄、0.278g CaCl₂、0.144g MgSO₄、1.938g D-葡萄糖，用去离子水定容到1L，PH＝7.4。

高K⁺K-H缓冲液：称取3.674g NaCl、4.470g KCl、2.1g NaHCO₃、0.163g KH₂PO₄、0.278g CaCl₂、0.144g MgSO₄、1.938g D-葡萄糖，使用去离子水定容到1L，PH＝7.4。

2)血管环的制备

处死SD大鼠后迅速取出肠系膜主动脉，浸入K-H缓冲液中，在显微镜下分离血管外包裹的脂肪以及多余结缔组织，再将分离后的血管剪至长度约2-3mm的血管环备用。

在37℃的超级恒温槽中加入1mL的K-H缓冲液，并向其中不断通入95％的O₂与5％的CO₂混合气体，模拟体内环境。并将制备好的血管环挂在两个L型的金属针上，其中一个连接张力换能器，另一个连接调节负荷张力的微调装置上。将安装好的血管环放入准备好的超级恒温槽环境中，调节张力，给予5mg的预张力，平衡60min，期间每10min更换一次K-H缓冲液。平衡完毕后用高K⁺K-H缓冲液检验血管环的收缩性，选取两次收缩幅度10％的血管环用于实验。用正常K-H缓冲液洗涤血管环至张力稳定在基线后开始加药检测。

3)收缩实验

①PE(苯肾上腺素)收缩血管实验

1.1方法

向血管中加入5μM的(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮，孵育30min,以浓度累积法加入PE(终浓度为1×10^-10～1×10^-4M)，检测化合物抑制PE收缩血管的功效，记录血管张力变化情况计算浓度梯度量效曲线，并计算收缩率，选取收缩率最低的样品作为活血效果最强的化合物，进行下一步体内实验研究。

1.2结果：化合物(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮对PE诱导的血管收缩均具有较强的抑制作用，使得最大收缩率E_max从90.15％±10.70％降至23.1％±5.03％，明显低于不加药的空白组，实验结果见图3。

②KCl收缩血管

2.1方法

以浓度累积法加入KCl(终浓度为1×10^-3～3×10^-3M),检测化合物抑制KCl刺激引起血管平滑肌收缩的功效，其余方法同PE收缩血管实验。

2.2结果：(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮亦能抑制KCl诱导的血管收缩作用，使得最大收缩率从93.06％±12.5％降至64.53％±3.82％，明显低于未给药的空白对照组，实验结果见图4。

4)舒张实验

①方法

常用的预收缩血管物质有PE、KCl等，由于KCl对血管平滑肌由一定的损伤作用，所以采用PE预收缩血管环。舒张实验需预先给予0.5mg的预张力，在PE(1×10^-2M)预收缩血管引起最大收缩张后，以终浓度1×10^-10～1×10^-5M为梯度，采用累积浓度法加入内皮依赖性血管舒张剂Ach(乙酰胆碱)、非内皮依赖性血管舒张剂SNP(硝普纳)，以及(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮，诱导血管舒张，记录张力变化并计算舒张率。

②、结果

具体结果见图5，从图5可见，红色曲线为阳性对照药Ach(乙酰胆碱)，最大舒张值为69.1％±4.14％；绿色曲线为阳性对照药SNP，最大舒张值为74.0％±10.23％。(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮舒张血管作用与阳性药SNP作用的最终结果相近，最大舒张值为60.31％±2.21％。

综上，本发明通过体外活性实验进行活血作用机制的研究发现，3-羟基-β-紫罗兰酮对血管内皮炎症细胞具有显著的保护作用；能使PE诱导的血管收缩作用由90％降至23.31％，亦能使KCl诱导的血管收缩作用由93.06％降至64.53％；对PE诱导的肠系膜动脉血管环收缩具有较强的舒张作用，舒张率达60.31％，与非内皮依赖性舒张剂SNP的作用效果相近。(-)-3-羟基-β-紫罗兰酮在血管功能实验中表现出的显著舒张和抑制收缩作用，使其在治疗高血压、周围循环障碍性疾病方面具有综合开发与应用前景。

Claims

1.3-羟基-β-紫罗兰酮在制备治疗高血压的药物中的用途；所述3-羟基-β-紫罗兰酮结构式为：

。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物可抑制血管收缩。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物可舒张血管。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物可消炎。