CN101357127A - 红花黄色素在制备治疗和/或预防心肌细胞凋亡药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从中药红花中提取制备的红花黄色素的新用途，即在制备治疗和/或预防心肌细胞凋亡药物的新用途，上述红花黄色素制成的药物及其制剂。

Description

红花黄色素在制备治疗和/或预防心肌细胞凋亡药物的应用

技术领域：

本发明涉及从中药红花中提取制备的红花黄色素的新用途，即在制备治疗和/或预防心肌细胞凋亡药物的新用途，上述红花黄色素组成的药物组合物。

背景技术：

随着经济与社会的发展，心脑血管疾病已日益成为影响人民生命健康的重要问题。而在冠心病、高血压及心肌病等多种心血管疾病中，心肌细胞凋亡在其病理生理变化中起了重要的作用。与缺血心肌细胞坏死的机制不同，心肌细胞凋亡是心肌缺血引起细胞损伤的另一方式，一旦心肌细胞受损启动细胞凋亡程序，心肌细胞即走向不可逆的死亡过程，这使心功能下降，加重了心肌的损伤。心肌梗死病灶常起始于细胞凋亡，心肌细胞凋亡的程度常影响心梗面积的大小，且对其后的心室重构影响较大，这种影响被认为是缺血性心肌病演化为心衰的细胞基础[胡野，凌志强，单小云，细胞凋亡的分子医学，军事医学科学出版社，北京29-30，2002.8第一版]。缓解心肌细胞凋亡是减轻心肌缺血性损伤、保护心脏功能的重要途径。心肌缺血、自由基反应、炎症反应、细胞因子刺激、毒素作用等多种病理因素均可引发心肌细胞凋亡。与心肌细胞凋亡有关的基因主要有两类：抑制细胞凋亡的基因主要包括bcl-2、bcl-X_L、mcl-1等基因；促进细胞凋亡的基因主要包括bax、bcl-X_s、ced-3、ced-4、c-myc、p53、fas基因等，这些基因的表达调控影响了细胞凋亡的过程。Caspase途径为凋亡信号在细胞内主要转导通路：心肌缺血再灌注过程中，细胞线粒体受损可引发细胞色素c释放，激活Caspase-9；多种病理变化中产生的Fas配体激活心肌细胞膜TNF受体后，可导致Casepase-8激活，Casepase-8及Casepase-9激活后可致Casepase-3激活，进而使心肌细胞凋亡[DesagherS，Martinou JC.Mitochondroa as the central control point of apoptosis.Trends CellBiol，2000；10(9)：369-377]，心肌缺血再灌注过程中可产生大量氧自由基进而诱发细胞凋亡，凋亡相关基因的表达可能为其重要机理；细胞凋亡诱导因子常可使线粒体膜通透性增高，导致线粒体膜电位下降，细胞色素c释放，使电子传递与呼吸链解偶联，影响线粒体的功能，进而引发细胞凋亡[Crompton M.The mitochondrial permeability transition pore and itsrole in cell death.Biochem J，1999；341：233-249.]。凋亡抑制基因bcl-2表达的Bcl-2蛋白多位于线粒体膜上巨型通道附近，具有抑制线粒体膜通透性变化的能力，而基因bax表达的Bax蛋白可与Bcl-2蛋白形成二聚体，拮抗Bcl-2的作用。细胞调亡因子作用于细胞的有关受体，可引发许多第二信使的变化，其中Ca²⁺的作用非常重要。Ca²⁺浓度升高或分布改变可激活胞核中的核酸酶，致DNA降解；Ca²⁺参与激活一系列蛋白激酶使有关蛋白磷酸化，可调节有关基因的表达等变化[胡野，凌志强，单小云，细胞凋亡的分子医学，军事医学科学出版社，北京278-279，2002.8第一版]。细胞凋亡过程中经历一系列代谢变化后，细胞的染色质浓缩，核仁裂解，核皱缩，细胞器浓缩，内质网扩张，进而发生核膜皱褶，核碎片产生及凋亡小体形成等形态学变化。细胞凋亡与多种凋亡基因的表达调控密切相关，探讨心肌细胞凋亡的规律及其防治手段为目前病理生理及药物作用机理研究的重要内容。

中药红花为菊科植物Carthamus tinctorius L.的干燥花，为一活血化瘀代表性药物。红花活血通经，散瘀止痛，主要用治冠心病，脑血栓等多种血液循环障碍性疾病。临床上红花多以水煎液入药，红花黄色素为红花的主要水溶性组分，为多种查耳酮苷的混合物。研究结果表明，红花黄色素为红花活血化瘀的有效部位，具扩张血管、降血压、抗凝等作用[王会玲，红花黄色素的现代研究概述。中国中医药科技，1998，5(5)：333-334]。羟基红花黄色素A(分子结构见图1)为红花黄色素中的主要有效成分[金鸣，高子淳，李金荣，臧宝霞，吴伟，大孔树脂色谱法制备羟基红花黄色素A及红花黄色素，中草药，2004，35(1)：25-28]，该成分可抑制血小板激活[臧宝霞，金鸣，司南，张彦，吴伟，朴永哲，羟基红花黄色素A对血小板活化因子的拮抗作用。药学学报，2002，37(9)：696-699]，具多方面的药理作用。药理研究结果表明，静注红花黄色素对于实验性心肌梗塞兔不同缺血区有不同程度的缓解作用[魏道武，郑云霞，齐文萱.红花黄色素对实验性家兔心肌梗塞的影响.甘肃中医学院学报，1991，8(1)：47-48.]，红花黄色素还可改善心肌能量代谢，缓解心肌缺氧性损伤，改善心功能；抑制Ca²⁺内流而扩张冠状动脉，缓解心肌缺血[李中原，涂秀华，红花黄色素的药理研究进展，中药新药与临床药理，2005，16(2)：153-156]。虽然红花缓解心肌缺血的药效已有不少报道，但红花黄色素缓解心肌细胞凋亡、抑制心肌细胞凋亡基因表达的研究尚未见报道。

发明内容：

本发明的目的是提供红花黄色素的一种新用途。

本发明发明人的研究表明，红花黄色素具有治疗和/或预防心肌细胞凋亡的作用。

本发明所述的红花黄色素所含红花主要有效成分羟基红花黄色素A的含量按重量计为50-100％。

本发明提供一种治疗和/或预防心肌细胞凋亡的药物组合物，其特征在于含有治疗和/或预防心肌细胞凋亡有效量的红花黄色素和可药用的载体，它可以制成胶囊、注射剂、片剂、栓剂或口服液等可使用的制剂，上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

以下实验结果说明了红花黄色素的新药效，表明了本发明的有益效果。

红花黄色素抑制异丙肾所致心肌缺血大鼠心肌细胞的凋亡及红花黄色素对原代培养大鼠乳鼠心肌细胞凋亡缓解作用的实验

一、实验材料

1动物

Wistar大鼠，

200-250g，北京维通利华公司清洁级动物；北京安贞医院二级动物房以北京维通利华公司清洁级动物繁育的乳鼠，雌雄不限。

2药品与试剂

红花黄色素为大孔树脂-凝胶层析法制备，HPLC面积归一化法测定大鼠实验所用的红花黄色素纯度大于92％，细胞实验所用的红花黄色素纯度大于96％，该红花黄色素调至pH 7.4后除菌过滤备用。

其它试剂见下表：

试剂名称	生产厂家
		盐酸异丙基肾上腺素	上海上海大众药业有限公司产原料药
Trizol	Invitrogen公司
		DEPC	Genview
MOPS	华美公司
		随机引物	鼎国生物
dNTP	Takara公司
		M-MLV	鼎国生物
rTaq polymerase	Takara
		DNA marker	鼎国生物
beta-actin、bcl-2、bax引物	上海生工合成
		即用型SABC试剂盒，兔抗IgG(Bax，Bcl-2)，DAB显色试剂盒，细胞凋亡检测试剂盒	武汉博士德生物工程有限公司
胰蛋白酶，1∶250	Amresco分装
		胎牛血清	华美生物工程公司

DMEM-LOW培养基	GIBCO
		细胞培养瓶	CORNING
Rhodamine 123	Sigma公司
		其它试剂	国产分析纯

3实验设备

美国Biometra产PCR扩增仪；日本nikon公司ECLIPSE 80i型显微镜。SANYO公司产MCO175型CO₂培养箱；重庆光学仪器厂XDS-1B型倒置显微镜；美国Coulter公司EDICS XL型流式细胞仪。

二、实验方法

1红花黄色素缓解大鼠急性心肌缺血时心肌细胞凋亡的作用

实验随机分为6组，即正常组、心肌缺血组、普萘洛尔+心肌缺血组、红花黄色素高剂量+心肌缺血组、红花黄色素中剂量+心肌缺血组、红花黄色素低剂量+心肌缺血组。红花黄色素+心肌缺血组实验方法：每次腹腔注射红花黄色素30min后皮下注射10mg/kg异丙肾上腺素每日一次连续3日。第三日注射红花黄色素前以20％乌拉坦(1g/kg)麻醉，给异丙肾后4h腹主动脉取血约2ml，开胸迅速摘取心脏，用冷生理盐水冲净表面血液后切取心尖部(横跨白色梗死区和非梗死区)并分为两部分，第一部分4％多聚甲醛固定24h，免疫组化染色备用；第二部分加入Trizol试剂匀浆后-20℃保存以备提取RNA。正常组以NS代替异丙肾和红花黄色素，其它处理均同红花黄色素+心肌缺血组。心肌缺血组以NS代替红花黄色素，其它处理均同红花黄色素+心肌缺血组。普萘洛尔+心肌缺血组以普萘洛尔(PPL)代替红花黄色素，其它处理均同红花黄色素+心肌缺血组。

2 Tunel细胞凋亡检测

进行依赖核酸内切酶的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)，取前述红花黄色素缓解大鼠急性心肌缺血时心肌细胞凋亡的作用实验所取心肌切片4％多聚甲醛固定24h后脱水包埋制成石蜡切片，然后脱蜡再水合。将脱蜡再水合的切片进行微波修复至枸橼酸修复液沸腾，20mg/L蛋白酶K37℃消化5min，滴加3％H₂O₂反应10min，再用末端脱氧核糖核酸转移酶和地高辛标记的抗地高辛抗体反应混合液进行标记37℃2小时，加转化物过氧化物酶(peroxidase，POD)于样本上37℃60min后，以磷酸缓冲液浸泡2次每次3min，样本加POD底物二氨基联苯胶DAB进行显色。最后用苏木素复染，中性树脂封片，倒置显微镜下镜检，阳性细胞可见棕黄色深染细胞核。在高倍镜下选取10个视野用图像分析软件计算呈阳性细胞数占细胞总数的平均百分率进行组间比较。

3免疫组织化学染色法检测凋亡相关基因Bax，Bcl-2蛋白的表达

取前述红花黄色素缓解大鼠急性心肌缺血时心肌细胞凋亡的作用实验所取心肌切片4％多聚甲醛固定后，石蜡包埋，切片常规脱蜡，滴加3％H₂O₂，微波修复抗原。滴加Bax、Bcl-2一抗(1∶200，兔IgG)37℃保温1hr，再滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃保温20min，滴加链霉亲和素，加底物二氨基联苯胶DAB显色。最后用苏木素复染，中性树脂封片，倒置显微镜下镜检，阳性细胞细胞质均匀的染成棕黄色。在高倍镜下选取10个视野用图像分析软件计算呈阳性反应的细胞的积分光密度值(integrated optical density，IOD)进行组间比较。

4 RT-PCR法检测心肌组织凋亡相关基因Bcl-2，Bax的表达量

4.1Trizol试剂一步法提取RNA

取前述红花黄色素缓解大鼠急性心肌缺血时心肌细胞凋亡的作用实验所取大鼠心肌组织每5～10mg加入1ml Trizol试剂匀浆加入1ml Trizol试剂，置于1.5ml离心管内，加入200μl氯仿振荡，4℃12000g离心15min，取上清液加入0.5ml异丙醇沉淀，4℃12000g离心沉淀15min，75％乙醇洗一次，0.1％DEPC-H₂O溶解RNA，然后测样品OD260/OD280，计算RNA浓度，甲醛变性电泳鉴定RNA的完整性。

4.2 RT-PCR检测凋亡相关基因Bcl-2，Bax的表达量

反转录反应：取前述提取的RNA 7～8μl70℃10min，冰浴中加入随机引物2μl，dNTP 10mM2μl，5×反转录缓冲液8μl，M-MLV 50U，H₂O补足至总体积40μl，37℃5min，95℃5min，得到反转录产物。

PCR反应：选取以Bcl-2，Bax为特异基因的适宜引物，以beta-actin为内对照，进行半定量PCR反应。体系：反转录产物5-7μl，10×PCR buffer 2.5μl，dNTP 10mM 2μl，primer 25pmol，rTaq 1U，H2O补足至总体积25μl。首次循环先在94℃变性5min，变性、退火、延伸分别为94℃，45sec，56℃，45sec，72℃，45sec，共25个循环。聚合酶链反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并以beta-actin为对照，电泳条带经灰度扫描后计算并比较各组Bcl-2及Bax的相对表达量。

引物名称           引物序列                                 产物长度(bp)

beta-actin         5′-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GG-3′       540

               5′-CAA CGT CAC ACT TCA TGA TGG-3′

               5’-TCC，ATT，ATA，AGC，TGT，CAC，AG-3’

Bcl-2                                                         350

               5-’GAA，GAG，TTC，CTC，CAC，CAC-3’

               5’-GCA，GAG，GAT，GAT，TGC，TGA，TG-3’

Bax                                                           354

               5’-CTC，AGC，CCA，TCT，TCT，TCC，AG-3’

5乳鼠心肌细胞的原代培养

1-3日龄Wistar大鼠乳鼠，无菌条件下剪取心室肌，以含糖PBS(Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L，Glucose 5.6mmol/L，pH7.4)洗去血迹，剪碎后加入0.25％胰酶消化液，37℃水浴振摇1hr，吸出消化液，加入半量消化液继续消化0.5hr，消化成单细胞悬液，200目细胞筛过滤，78g离心8min心弃上清，加入含15％胎牛血清、2000IU/L青霉素的低糖DMEM培养液，放入37℃5％CO₂的培养箱中差速贴壁1.5-2hr。调整细胞数量为3×10⁹/L，接种到25cm²培养瓶，放入37℃5％CO₂的培养箱中培养，2-3天换培养液一次，在显微镜下观察细胞贴壁生长情况及搏动情况。

6红花黄色素缓解乳鼠心肌细胞缺糖缺氧再复氧损伤试验

红花黄色素+缺糖缺氧/再复氧组实验方案：取乳鼠心肌原代培养细胞，以预先用高纯N₂(99.9％)饱和无糖台氏液(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，CaCl₂ 1.8mmol/L，MgCl₂0.49mmol/L，NaH₂PO₄ 0.42mmol/L，NaHCO₃ 11.9mmol/L)置换正常培养液后，加入红花黄色素，于培养瓶中通入高纯N₂ 30sec，盖紧培养瓶盖，37℃空气浴缺氧保温3hr。再以含糖台氏液(无糖台氏液，Glucose 11.1mmol/L)置换无糖台式液，加入与前次相同剂量的红花黄色素，开放培养瓶，37℃空气浴复氧20hr。缺糖缺氧/再复氧组：实验过程中不加红花黄色素，其余同红花黄色素+缺糖缺氧/再复氧组。正常对照组：以含糖台式液代替无糖台式液，且不通N₂，即为正常对照。所得心肌细胞用于本文各项检测。

7碘化丙啶染色流式细胞术检测红花黄色素缓解缺糖缺氧再复氧损伤心肌细胞凋亡率升高试验

取红花黄色素缓解乳鼠心肌细胞缺糖缺氧再复氧损伤试验处理的心肌细胞，用0.25％胰蛋白酶消化分离贴壁生长的心肌细胞，PBS洗涤沉淀，离心80g 5min去上清。加入预冷的70％乙醇混匀固定后PBS重悬。加入终浓度为25mg/L的RNase去除RNA，终浓度为50mg/L的碘化丙啶染色37℃30min，过300目筛，流式细胞仪检测，激发波长为488nm。G1前的亚二倍体峰即为凋亡峰，峰面积反映心肌细胞凋亡的百分率。

8 Rhodamine 123流式细胞术检测红花黄色素缓解缺糖缺氧再复氧损伤心肌细胞线粒体跨膜电位下降试验

取红花黄色素缓解乳鼠心肌细胞缺糖缺氧再复氧损伤试验处理的心肌细胞，用PBS调整细胞至1×10⁶/ml加入荧光探针rhodamine 123，使终浓度为0.5mg/L，37℃30min孵育，80g5min离心去上清，PBS洗涤沉淀，离心80g 5min去上清，加入PBS重新悬浮细胞。流式细胞仪检测，激发波长450nm，检测Rhodaminel23嵌入线粒体膜后的荧光强度，以反映线粒体膜电位的变化，以实验组膜电位数据与正常组的比值表示实验组的相对膜电位。

9统计学方法

应用SPSS10.0进行数据处理，结果以均数±标准差表示，多组样本量的比较采用单因素方差分析和q检验，P＜0.05表示差异的显著性有统计学意义。

三.实验结果

1红花黄色素对细胞凋亡TUNEL染色的影响

图2的结果表明，空白组心肌组织排列整齐，细胞核蓝染，核质均匀，表明未发生明显的细胞凋亡；而单纯异丙肾损伤组细胞核黄染，且有的细胞核出现空泡或核固缩，提示心肌细胞已发生凋亡；红花黄色素处理组和PPL处理组心肌组织排列虽不象空白组那样整齐，但细胞核黄染较单纯异丙肾损伤组明显减少，且核质较均匀，提示细胞凋亡得到缓解。

2红花黄色素对心肌组织中凋亡相关基因BAX，BCL-2蛋白表达和细胞凋亡的影响

表1红花黄色素抑制缺血心肌BAX，BCL-2蛋白表达和细胞凋亡的作用(n＝8)

与NS+NS组比较，^△△P＜0.01；与异丙肾+NS组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.001

由表1结果可见，单纯异丙肾损伤组BAX的表达量较空白组明显提高(p＜0.01)，而红花黄色素处理组和PPL处理组则较单纯异丙肾损伤组BAX表达量减少，提示红花黄色素可抑制凋亡促进基因BAX的表达。与空白组比较，其余各组的BCL-2表达量明显提高，而红花黄色素处理组和PPL处理组较单纯异丙肾损伤组BCL-2表达量增高，但无统计学意义。表1经TUNEL染色所显示的凋亡比率结果表明，异丙肾造成心肌缺血后TUNEL反应阳性细胞比率明显升高，提示心肌组织发生细胞凋亡；红花黄色素和PPL保护组TUNEL反应阳性细胞比率均较异丙肾+NS明显下降，提示药物缓解了心肌细胞的凋亡。

3红花黄色素对心肌缺血大鼠心肌组织凋亡相关基因Bcl-2，Bax mRNA表达量的影响

表2红花黄色素对心肌缺血大心肌组织凋亡相关基因Bcl-2，Bax mRNA表达量的影响(n＝8)

与NS+NS组比较，^△△P＜0.01；与异丙肾+NS组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

由表2结果可见，单纯异丙肾损伤组促凋亡基因Bax的表达量较空白组明显升高(p＜0.01)，而红花黄色素和PPL处理组则较单纯异丙肾损伤组Bax表达量降低，且Bax的表达量红花黄色素120mg/kg、240mg/kg以及PPL4mg/kg处理组与单纯异丙肾损伤组的差异有统计学意义，提示这些药物可抑制促凋亡基因Bax的表达。与空白组比较，其余各组的Bcl-2表达量有增高趋势，而红花黄色素处理组较单纯异丙肾损伤组Bcl-2表达量增高，但无统计学意义。

4红花黄色素抑制缺氧/缺糖心肌细胞凋亡率升高的作用及缓解细胞线粒体跨膜电位变化的作用

表3红花黄色素抑制缺氧/缺糖心肌细胞凋亡率升高的作用及缓解细胞线粒体跨膜电位变化的作用(n＝6)

与正常对照组比较，^△△P＜0.01；与缺氧缺糖组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

表3可见，心肌细胞碘化丙啶染色流式细胞术检测结果表明，缺氧缺糖组心肌细胞凋亡比率明显升高，缺氧缺糖+红花黄色素组心肌细胞凋亡比率明显较缺氧缺糖组降低；心肌细胞rhodamine 123染色流式细胞仪检测结果表明，缺氧缺糖组心肌细胞线粒体膜电位较正常组明显降低，缺氧缺糖+红花黄色素中高剂量组心肌细胞线粒体膜电位较缺氧缺糖组明显升高，提示红花黄色素具有缓解心肌细胞缺氧缺糖所致的凋亡的作用，红花黄色素还可缓解心肌细胞缺氧缺糖心肌细胞线粒体膜电位的下降。

上述实验结果表明红花黄色素可抑制心肌细胞凋亡相关基因的表达，缓解心肌细胞的凋亡。

附图说明：

图1：红花黄色素的分子结构

图2：红花黄色素缓解大鼠急性心肌缺血时心肌细胞凋亡试验心肌组织TUNEL染色结果(400×)

A：NS+NS组；B：异丙肾+NS组；C：异丙肾+PPL组；D：异丙肾+60mg/kg红花黄色素组；E：异丙肾+120mg/kg红花黄色素组；F：异丙肾+240mg/kg红花黄色素组

具体实施方式：

以下实施例是为了更详细地说明本发明的实施方法，而不是为了限制本发明。

实施例1

大孔树脂-凝胶柱层析法制备红花黄色素

实验材料

红花生药购自新疆维吾尔族自治区乌鲁木齐药材公司，产地为新疆维吾尔族自治区吉木萨尔县。鉴定人北京中医药大学中药学院生药系李家实教授，为菊科植物红花Carthamustinctorius L.的干燥花。95％卫生酒精北京市远弘药用酒精有限责任公司生产；D-4020型非极性大孔树脂为天津南开大学化工厂产品；本发明的大孔树脂柱层析实验还可用其它型号的大孔树脂如D-3520，X-5，NKA-9等。新购大孔树脂用5％NaOH液浸泡2hr后，用水洗至中性，再用5％HCl浸泡2hr，水洗至中性，湿法装柱，95％乙醇洗至流出液中加水无白色混浊，水冲洗至无醇味备用。本实验所用的凝胶为Sephadex LH-20，为Pharamacia公司产品；本发明的凝胶柱层析实验除可用Sephadex LH-20外，还可用Sephadex G-25或Sephadex G-50等凝胶。羟基红花黄色素A对照品为发明人自制[臧宝霞，金鸣，司南，张彦，吴伟，朴永哲，羟基红花黄色素A对血小板活化因子的拮抗作用。药学学报，2002，37(9)：696-699]。乙腈为Fisher公司HPLC级产品，甲醇为国产优级纯，其它试剂均为国产分析纯。

设备

岛津LC-6A型高效液相色谱仪，色谱软件为泰立化公司TL9000液相色谱工作站；XZR-A型20升旋转蒸发器，中科院生物物理所科龙仪器厂产品。

红花水提取液的制备

红花生药20kg，加400L水，室温浸泡并不时搅动，24hr后放出提取液，再加400L水同法冷浸24hr，弃药渣，合并两次水提液，离心过滤除去药渣，80℃减压浓缩至1g生药/mL，过滤即得红花水提取液。

HPLC法分析红花黄色素方法

色谱柱为Inertsil ODS-35μm 4.6I.D×250mm分析柱，日本Glscience公司产品，检测波长403nm，流动相为甲醇—乙腈—水(20∶10∶70)含0.02％磷酸，pH2.6，流速1mL/min。大孔树脂-凝胶层析法制备红花黄色素

取1g生药/mL红花水提液4000mL上直径40厘米×高120厘米的D-4020型非极性大孔树脂层析柱，蒸馏水洗至Molish反应阴性后用20％乙醇洗脱，为了得到纯度较高的红花黄色素，可在红花水提液进行大孔树脂柱层析时，以HPLC法分析每份流出液，将羟基红花黄色素A含量较高的流出液合并后浓缩即得羟基红花黄色素A含量较高的红花黄色素粗品浓缩液。此羟基红花黄色素A含量较高的红花黄色素粗品浓缩液再上直径10厘米×高70厘米的凝胶层析柱，蒸馏水洗脱除去先流出的棕色杂质，以HPLC技术检测黄色洗脱液，收集羟基红花黄色素A含量较高的流出液合并即得高纯度红花黄色素洗脱液，60℃减压浓缩即得高纯度红花黄色素。

以本发明实施例1制备的红花黄色素按以下实施例方法可制得可使用的红花黄色素药物制剂。

实施例2

红花黄色素口服硬胶囊剂

红花黄色素                                100克

干淀粉                                    100克

上述组分混合后装入1000个硬胶囊，即得红花黄色素口服硬胶囊剂

实施例3

红花黄色素注射剂

红花黄色素                                50克

注射用水                                  适量

全量                                      1000毫升

取50克红花黄色素以适量注射用水溶解后加至1000毫升按常规方法经灌装，封口等步骤制得红花黄色素注射剂。

实施例4

红花黄色素栓剂

红花黄色素                                500克

半合成脂肪酸甘油脂                        适量

制成                                      1000粒

取半合成脂肪酸甘油脂加热使融，适当降温后加入500克红花黄色素混匀，制栓，冷却即得红花黄色素栓剂。

实施例5

红花黄色素口服液

红花黄色素                                0.5克

蒸馏水                                    10毫升

红花黄色素溶解后按常规方法经灌装，封口等步骤生产即得红花黄色素口服液。

实施例6

红花黄色素片剂

红花黄色素                                500克

硬脂酸镁                                  5克

淀粉                                      20克

制成                                      1000片

红花黄色素，硬脂酸镁与淀粉混匀后按常规方法经压片，包衣，装瓶等工艺即得红花黄色素片剂。

此外，在未违背本发明精神内，可以对给定的实施例进行各种变化和改进。由本技术领域中熟练的技术人员认识到的可选择的实施例，它们也被包括在权利要求的范围内。

Claims (4)

1.红花黄色素在制备治疗和/或预防心肌细胞凋亡药物的应用。

2.权利要求1所述的应用，其特征在于红花黄色素所含的红花主要有效成分羟基红花黄色素A的含量按重量计为50-100％。

3.一种治疗和/或预防心肌细胞凋亡的药物，其特征在于含有治疗和/或预防心肌细胞凋亡有效量的红花黄色素和可药用的载体。

4.权利要求3的药物，其特征在于可以制成胶囊、注射剂、片剂、栓剂或口服液等可使用的制剂。

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