KR20040023197A - 진피, 적복령, 당귀, 조구등, 석창포, 창출, 백지,산조인, 숙지황, 산수유, 원지를 주성분으로 함유하는치매치료의 약학적 효능 - Google Patents

진피, 적복령, 당귀, 조구등, 석창포, 창출, 백지,산조인, 숙지황, 산수유, 원지를 주성분으로 함유하는치매치료의 약학적 효능 Download PDF

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Abstract

본 발명은 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium), 적복령(Hoelen), 당귀(Ligusticum acutilobum), 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus), 석창포(Acorus gramineus), 창출(Atractyodis Rhizoma), 백지(Angelica dahurica), 산조인(Zizyphi Spinosi Semen), 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata), 산수유(Cornus officinalis) 및 원지(Polygala tenuifolia)의 분말이나 또는 물, 저급알콜, 초산에틸, 방향족 탄화수소, 염소화탄화수소에서 선택된 용매, 또는 그 혼합용매로 추출한 엑스를 주성분으로 함유하고, 필요하면 여기에 향부자(Cyperus rotundus), 반하(Pinellia ternata), 천궁(Cnidium officinale), 적작약(Paeonia lactiflora), 길경(Platycodi Radix), 지실(Ponciri Fructus), 용골(keel), 모려(Ostreae Concha), 목향(Inula helenium), 백자인(Biotae Semen), 오미자(Schizandra chinensis), 계피(Cinnamomum loureirii), 산약(Disocorea batatas), 구기자(chinese matrimony vine), 맥문동(snake's beard), 감초(GLYCYRRHIZAE RADIX) 및 오미자(SCHIZANDRAE FRUCTUS)에서 선택된 1종 이상의 보조생약 또는 이의 물, 저급알콜, 초산에틸에서 선택된 용매 또는 그 혼합용매로 추출한 엑스로 조성된 의약 조성물의 Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료에 탁월한 효능을 가지는 용도에 관한 것이다.

Description

진피, 적복령, 당귀, 조구등, 석창포, 창출, 백지, 산조인, 숙지황, 산수유, 원지를 주성분으로 함유하는 치매치료의 약학적 효능 {Phamaceutical use for treating Alzheimer of composition comprising, as main ingredients, Aurantii Nobilis Pericarpium, Hoelen, Ligusticum acutilobum, Uncariae Ramulus et Uncus, Acorus gramineus, Atractyodis Rhizoma, Angelica dahurica, Zizyphi Spinosi Semen, Rehmanniae Radix Preparata, Cornus officinalis, Polygala tenuifolia pharmaceutical preparations containing them}
본 발명은 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium), 적복령(Hoelen),당귀(Ligusticum acutilobum), 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus), 석창포(Acorus gramineus), 창출(Atractyodis Rhizoma), 백지(Angelica dahurica), 산조인(Zizyphi Spinosi Semen), 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata), 산수유(Cornus officinalis) 및 원지(Polygala tenuifolia)를 주성분으로 함유하는 조성물의 Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료용 약학적 용도에 관한 것이다.
치매는 뇌의 질환으로 인해 생기는 하나의 증후군으로서 대개 만성적이고 진행성으로 나타나며, 기억력, 사고력, 지남력, 계산능력, 학습능력, 언어 및 판단능력을 포함하는 뇌 기능의 다발성 장애를 말한다. 증상으로는 점차적인 기억력 손상, 일상생활의 장애, 방향감각의 상실, 판단력 손상, 성격변화, 학습능력 장애, 그리고 언어소통능력의 상실 등이다. 정상적이던 사람이 이 질환으로 점진적인 기억력장애 및 다른 지적능력의 상실로 더 이상의 정상적인 가정생활, 사회생활 및 다양한 대인 관계를 유지할 수 없는 상황이 되는 무서운 노인성 질환이다. 특히 알츠하이머성 치매는 심한 지적능력의 손상을 가져와 일상생활을 방해하고 결국 죽음에 이르게 하는 가장 흔한 형태의 치매이다. 발병률은 남.녀 모두 비슷하여, 이것은 4번째로 높은 노인의 사망원인이며, 치매의 발병은 거의 알아차릴 수 없을 정도이다. 이 질병은 결국 환자로 하여금 전혀 자신을 돌볼 수 없게 만든다. 또한 이 질병은 3년에서 20년까지 계속 진행된다.
현재 우리나라에서도 우리나라는 지난해 65세 이상 노인이 전체의 8%를 넘었으며 2020년께는 10%를 넘을 것으로 예상된다. 이처럼 노령화가 진행되면 치매환자도 늘수 밖에 없다. 한국은 노인의 10%가량이 치매증세를 보이고 있는 것으로 추산되고 있다. 치매는 밝혀진 원인만 80여가지를 넘는다. 알츠하이머병은 뇌의 신경세포막 구성성분이 변해 아밀로이드라는 독성 단백질이 끼고 학습능력 및 기억력과 밀접한 관계가 있는 아세틸콜린이라는 신경전달물질이 감소되는 치매의 유형이다.
최근에 베타 아밀로이드 단백질이 Alzheimer병의 발생에 중요한 원인적 인자의 하나가 된다는 것이 밝혀지고 있기 때문에 베타 아밀로이드에 대한 분자생물학적 연구가 이 질병 해결에 가장 큰 공헌을 하리라 예견되고 있다. 이 노인성 치매의 중요한 병변은 39개~43개의 아미노산으로 구성된 베타 아밀로이드 단백질이 세포내와 외에 침착하여 신경섬유 덩어리(neurofibrillary tangle)와 신경반(neuritic plaque)을 형성하는 것이다. 전술한 바, 전뇌 기저부(basal forebrain)의 콜린성 신경핵과 해마구조에 주로 침착이 된다. 이 베타 아밀로이드 단백질은 큰 분자량의 전구단백질(amyloid precursor protein 695, 751, 770: APP 695, 751, 770)에서 잘라져서 형성된다. 그러나 현재 아밀로이드 전구 단백질이 어떤 효소에 의해서, 어떤 대사 과정에 의해서 잘라져서 베타 A4단백질을 만들어 내는지는 아직 전혀 모르고 있다. 따라서 베타 아밀로이드 단백질의 형성을 촉진하는 프로테아제(protease)와 이 프로테아제의 유전자를 발현하려는 노력이 현재 연구의 핵심이 되고 있으며, 이 프로테아제 효소 단백질이나 프로테아제 유전자의 발현을 억제하는 약물의 개발이 미래의 약물 개발에 가장 큰 목표가 되고 있다. 또한 정상에서 이 베타 단백질의 대사효소(amyloid degrading enzyme: ADE)를 활성화시키는방법도 중요한 개발 목표가 될 수 있다(도 1).
또한 세포막에 붙어 있는 아밀로이드 전구 단백질들의 세포내 기능과 이 아밀로이드 전구 단백질에서 잘려나가 형성되어 조직에 침착된 베타A4단백질의 기능이 무엇인지에 대해서도 많은 논란이 제기되고 있다.
따라서 이러한 연구 개발을 진행시키기 위하여 필요한 당면 과제는 최신 유전공학적 기법을 이용한 아밀로이드 전구 단백질 및 베타 A4 아밀로이드 단백질의 발현과 대량 생산, 및 순수정제가 될 것이다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 단백질을 이용하여 항체를 생성할 수 있을 뿐만 아니라, 아밀로이드 전구 단백질들의 생체내 기능과 베타 아밀로이드 단백질이 Alzheimer병 발생 기전에서 차지하는 역할을 정확히 규명할 수 있을 것이며 또한 아밀로이드 전구 단백질에서 어떤 효소에, 어떻게 대사가 이루어지는 가를 연구할 수 있을 것이다. 그러나 현재까지 아밀로이드 전구 단백질과 카복실 말단부(carboxyl terminal)단백질을 대량 생산한 연구 보고나 이들 단백질을 직접 이용한 효과 실험은 현재까지 이루어진 바가 없다. 따라서 아밀로이드 전구 단백질을 분자생물학적으로 대량 생성, 분리, 및 정제하여 그 대사 과정을 연구해 보이는 것은 극히 중요하다고 생각한다(도 2).
최근에 신경전달물질 체계에 대한 연구가 진행되고 있어서 치료에 대한 합리적 접근 방법이 모색되고 있고, 콜린(cholin)성 기능을 향진시키려는 시도들이 이루어지고 있으며 포도당과 산소 대사촉진제들도 시도되고 있다. 그러나 이미 거론된 가능한 약리학적 접근 방법은 잘해야 일시적으로 증세를 경감시키는 효과 밖에 없다.
알츠하이머병의 치료제는 아세틸콜린의 감소를 막기위해 아세틸콜린을 분해,고갈시키는 효소를 억제하는 작용을 한다. 대표적인 제품이 아리셉트(성분명 도네페질.한국에자이), 엑셀론(성분명 리바스티그민.한국노바티스), 레미닐(성분명 갈란타민.한국얀센) 등 3가지다. 3년전만 해도 뇌의 미토콘드리아를 활성화하는 타크린, 피라세탐, 이데베논등이 많이 쓰였으나 부작용이 많고 약효가 미흡해 지금은 거의 쓰이지 않는다. 알츠하이머병 치료제 가운데 일부가 혈관성 치매에도 효과가 있으며 정신 및 행동 이상증상을 완화시킨다는 연구결과가 나와있다. 그러나 인지기능이 악화되는 것을 회복시킬 수는 없고 경증이나 중등도의 증상을 보이는 환자에 사용할 경우 2~5년간 인지기능을 유지 시킬수 있다고 보고되고 있다.
치매치료제 연구동향으로 캐나다, 영국 등에서 이뤄진 연구에 따르면 아리셉트는 중등도 혹은 중증의 알츠하이머병 환자에게도 효과가 있으며 약효나 부작용 등의 측면에서 엑셀론이나 레미닐에 비해 나은 것으로 평가됐다. 또 아리셉트는 하루 한번만 복용하면 된다. 그러나 엑셀론과 레미닐은 치료효과를 얻기 위해 서서히 용량을 증가시켜야 하고하루에 2~3회 복용해야 한다. 이들 약은 얼굴 홍조 소화불량 오심 구토 설사 등의 부작용을 나타내며 대부분 참을 수 있을 정도이고 시간이 지나면서 회복된다. 고용량에서는 식욕부진 서맥 근육약화 어지럼증 등이 나타나는데 저절로 사라지기도 하지만 약 복용이 힘들어 중도 포기하는 경우도 있다. 이밖에 알츠하이머병의 증상을 완화시킬 수 있을 것으로 기대되는 약물들로는 토코페롤(비타민 E), 은행잎 추출물, 에스트로겐 등이 있다. 혈관성 치매는 고혈압 당뇨병 고지혈증 심장병 흡연비만 운동부족 등으로 뇌혈관질환이 누적적으로 손상되고 막혀서 나타나는 치매다. 따라서 이같은 원인을 치료하는게 우선이다. 다음으로 뇌혈관이 좁아져 막히는 것을 방지하기 위하여 아스피린이나 티클로피딘처럼 혈전이 생기는 것을 예방하는 약이나 혈액이 끈끈해지는 것 억제하는 와파린 등을 투여하기도 한다.
현재까지 많이 사용된 코그넥스, 아리셉트 그리고 최근에 독일 메르츠(Merz + Co.)가 개발한 혈관 치매(vascular dementia) 치료제 신약인 메만틴(Memantine)에 대한 제 3임상 연구 결과가 발표되었다. 임상 연구는 무작위, 위약-비교 시험법으로 수행되었으며 연구 결과는 스웨덴의 수도 스톡홀름에서 4월 5일부터 8일에 걸쳐 개최된 제 6차 국제 스톡홀름/스프링필드 알츠하이머병 치료법 개발 심포지엄(International Stockholm/Springfield Symposium on Advances in Alzheimer Therapy)을 통해 발표되었으며 미국 노바티스사가 개발한 엑 셀론를 유럽에서 임상에 적용시키고 있으나 FDA에 인가되지 못했다. 미국 노바티스사가 개발한 '엑셀론'은 유럽에서 널리 사용되고 있으나, 아직 FDA 승인은 받지 못했다. 이 약물은 뇌 속 신경전달물질인 아세틸콜린의 분해효소의 작용을 억제함으로써 기억력과 인지능력을 높힌다. 미국서 초기 또는 중기의 알츠하이머 환자 9백41명을 대상으로 이 약을 임상시험한 결과, 26%에서 현저하게 증상이 개선되는 등 82%에게서 증상이 악화되지 않거나 좋아지는 효과가 있는 것으로 보고됐는데 기존 치료제 '코그넥스'(성분명 타크린)에 비해 간 독성이 없고, 복용이 간편해 졌다는 점에서 획기적이다. 아세틸콜린 분해효소 억제제로 효과는 비슷하나 간 독성 때문에 환자는 수시로 간 기능검사와 혈액검사를 받아야 했다. 또 하루 네 번 복용하기 때 문에, 환자에게 약을 복용시키기가 무척 어려웠다. 아리셉트는 하루 한번, 엑셀론은 하루 두번 복용한다. 국내의 치매치료제 개발동향은 카르복실기 말단(C단)쪽에 위치한 1백개 안팎의 아미노산 덩어리가 떨어져 나와 신경세포를 직접 파괴할 뿐만 아니라 주위의 교(膠)세포를 자극해 염증을 유발함으로써 치매가 생긴다는 내용으로 서울의대 서 유헌 교수는 "현재 6~7종의 독성단백질이 뇌에 작용해 치매를 일으키는 것으로 알려져 있지만 C단 단백질은 보다 근본적인 치매의 원인으로 여겨지고 있다"고 밝혔는데 치매치료제를 오수유에서 추출한 디하이드로에보디아민으로 개발중이라고 말했고 작년말 전(前)임상시험이 끝나 금년부터 1상 임상에 착수했다. 원광대 연구팀이 개발한 치매단은 혈액순환 및 기억력 향상제인 코그넥스나 아리셉트 보다 효능이 우수한 결과를 보였다고 보고하였다.
기타 치매치료제로 흔히 쓰이지는 않지만 세레길린(파킨슨병 및 경증의 치매치료제), 니세르골린(뇌경색후유증 및 혈관성치매 치료제)등도 치매치료제로 쓰인다.
치매환자는 인지장애 외에 불안 초조 우울증 망상 환각 난폭성 불면 등의 증상을 보이므로 항우울제, 항불안제 등을 같이 복용하는 경우가 많지만 아직까지 부작용이나 확실한 치료약이 없는 가운데 전래로 전해지는 처방전에서 보다 안전하고 독성의 부작용이 없으면서 효과가 탁월한 약의 출현이 요구되는 실정이다.
이와 같이 치매 치료제는 동서양에 의거해서 천연약제를 근거로 많은 치료성과를 거두고 있다. 본 발명은 한방 생약으로부터 전래 내려오는 약제로부터 치매 치료에 유용한 약물을 제공하는 것이다.
도 1은 인체내 치매유발원인 βAPP의 작용기전을 나타낸 것이다.
도 2은 인체내 치매유발원인 βAPP의 생성기전을 나타낸 것이다.
도 3은 유효약물의 추출과정에 따르는 의약 조성물의 건조중량을 회수하는 방법을 나타낸 것이다.
도 4은 pCT105발현에 의한 신경세포 생존도에 미치는 영향의 막대그래프를 나타낸 것이다.
도 5은 pCT105발현에 의한 신경세포 형태학적 변화에 미치는 영향의 현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 6은 pCT105발현에 의한 신경세포에 미치는 DNA fragmentation의 agarosegel를 나타낸 것이다.
도 7은 pCT105발현에 의한 신경세포내 미치는 영향의 GFP단백질 발현을 형광현미경하에서 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 8은 pCT105발현에 의한 신경세포의 세포사에 미치는 영향을 Tunel assay으로 나타낸 것이다.
도 9은 pCT105발현에 의한 신경세포의 세포사에 미치는 영향을 Hoechst 33258와 acridine orange염색법으로 나타낸 것이다.
도 10은 pCT105발현에 의한 신경세포의 신경돌기의 신장에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 11은 pCT105발현에 의한 신경세포의 growth cone-collapse의 함몰에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 12은 pCT105발현에 의한 신경세포의 mRNA전사 발현에 미치는 영향을 RT-PCR로 나타낸 것이다.
도 13은 pCT105발현에 의한 신경세포의 단백질발현에 미치는 영향을 western blot으로 나타낸 것이다.
본 발명자들은 치매과 그의 관련 뇌질환에 사용될 수 있는 한방제제에 관하여 오랜 연구를 행하여 왔다. 그 결과 본 발명은 물추출물에 존재하는 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium), 적복령(Hoelen), 당귀(Ligusticum acutilobum), 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus), 석창포(Acorus gramineus), 창출(Atractyodis Rhizoma), 백지(Angelica dahurica), 산조인(Zizyphi Spinosi Semen), 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata), 산수유(Cornus officinalis) 및 원지(Polygala tenuifolia)의 분말이나 또는 물, 저급알콜, 초산에틸, 방향족 탄화수소, 염소화탄화수소에서 선택된 용매로 추출한 엑스를 주성분으로 함유하고, 필요하면 여기에 향부자(Cyperus rotundus), 반하(Pinellia ternata), 천궁(Cnidium officinale), 적작약(Paeonia lactiflora), 길경(Platycodi Radix), 지실(Ponciri Fructus), 용골(keel), 모려(Ostreae Concha), 목향(Inula helenium), 백자인(Biotae Semen), 오미자(Schizandra chinensis), 계피(Cinnamomum loureirii), 산약(Disocorea batatas), 구기자(chinese matrimony vine), 맥문동(snake's beard), 감초(GLYCYRRHIZAE RADIX) 및 오미자(SCHIZANDRAE FRUCTUS)에서 선택된 1종 이상의 보조생약 또는 이의 물, 저급알콜, 초산에틸, 방향족탄화수소 또는 염소화탄화수소에서 선택된 용매로 추출한 엑스로 조성된 의약조성물을 제공하는 것이며 본 조성물은 Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료에 탁월한 효과를 놀라운 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 따라서 치매 CT105를 억제하는 약물은 현재 개발이 진행되고 있다. 그리고 현재의 연구는 이 약물들이 장래의 유용한 치매 치료제의 역할을 할 것이라고 제시했다
본 발명은 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium)50 내지 500중량부, 적복령(Hoelen) 50 내지 500중량부, 당귀(Ligusticum acutilobum) 50 내지 500중량부, 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus) 50 내지 500중량부, 석창포(Acorus gramineus) 50 내지 500중량부, 창출(Atractyodis Rhizoma) 50 내지 500중량부, 백지(Angelica dahurica) 50 내지 500중량부, 산조인(Zizyphi Spinosi Semen) 50 내지 500중량부, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 50 내지 500중량부, 산수유(Cornus officinalis) 50 내지 500중량부, 원지(Polygala tenuifolia) 50 내지 500중량부 또는 그의 엑스를 주성분으로 함유하고 필요하면, 향부자(Cyperus rotundus) 50 내지 500중량부, 반하(Pinellia ternata) 50 내지 500중량부, 천궁(Cnidium officinale) 50 내지 500중량부, 적작약(Paeonia lactiflora) 50 내지 500중량부, 길경(Platycodi Radix) 50 내지 500중량부, 지실(Ponciri Fructus) 50 내지 500중량부, 용골(keel) 50 내지 500중량부, 모려(Ostreae Concha) 50 내지 500중량부, 목향(Inula helenium)50 내지 500중량부, 백자인(Biotae Semen) 50 내지 500중량부, 오미자(Schizandra chinensis) 50 내지 500중량부, 계피(Cinnamomum loureirii) 50 내지 500중량부, 산약(Disocorea batatas) 50 내지 500중량부, 구기자(chinese matrimony vine) 50 내지 500중량부, 맥문동(snake's beard) 50 내지 500중량부, 감초(GLYCYRRHIZAE RADIX) 50 내지 500중량부, 오미자(SCHIZANDRAE FRUCTUS) 50 내지 500중량부에서 선택된 1종 이상의 보조생약 또는 이의 물, 저급알콜, 초산에틸, 방향족탄화수소 또는 염소화탄화수소에서 선택된 용매 또는 그 혼합용매로 추출한 엑스가 첨가된 조성물이 신경세포를 대상으로 분자생물학적 실험에서 치매 진행을 억제하는 놀라운 효과를 보이는 용도를 제공하는 것이다.
상기의 생약성분은 각각 분말화하거나 또는 각각 단독으로 추출하여 엑스를 얻고, 이들 엑스를 혼합하거나 또는필요한 생약성분을 합하고 함께 추출하여도 좋다.
다음의 실시예 및 실험예로서 본 발명을 더욱 상세히 기재하며, 이들이 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1
1. 건조된 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium) 100g, 적복령(Hoelen) 100g, 당귀(Ligusticum acutilobum) 90g, 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus) 90g, 석창포(Acorus gramineus) 90g, 창출(Atractyodis Rhizoma) 90g, 백지(Angelica dahurica) 90g, 산조인(Zizyphi Spinosi Semen) 90g, 숙지황(Rehmanniae RadixPreparata) 90g, 산수유(Cornus officinalis) 90g 및 원지(Polygala tenuifolia) 80g을 3차 증류수 또는 정제수를 2 - 5배량의 부피로 가학하고, 75℃ 조건하에 12시간동안 서서히 열을 가한 다음, 여과한후, 최종적인 부피가 500 ml이 되게 증발시킨다음, 이를 감압 농축하여 200 ml이 되게 한 후 이를 동결시켜 75g의 동결건조중량을 얻었다(이하 CHU-1이라 명명 )(도 2).
2. 상기 방법으로 추출하되, 각각의 생약을 약 10배량을 증류수 약 3000ml로 각각 추출한다음, 추출물을 합하고, 상기방법으로 처라하여 동결건조물 약 75g을 얻는다.
실시예 2
건조된 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium) 100g, 적복령(Hoelen) 100g, 당귀(Ligusticum acutilobum) 90g, 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus) 90g, 석창포(Acorus gramineus) 90g, 창출(Atractyodis Rhizoma) 90g, 백지(Angelica dahurica) 90g, 산조인(Zizyphi Spinosi Semen) 90g, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 90g, 산수유(Cornus officinalis) 90g 및 원지(Polygala tenuifolia) 80g을 에탄올 50%(v/v)를 넣은 정제수를 2 - 5배량의 부피로 가하고, 60℃ 조건하에 12시간동안 서서히 열을 가한 다음, 여과한후, 최종적인 부피가 500 ml이 되게 증발시킨다음, 이를 감압 농축하여 200 ml이 되게 한 후 이를 동결시켜 약 75g의 동결건조중량을 얻었다
실시예 3
건조된 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium) 100g, 적복령(Hoelen) 100g, 당귀(Ligusticum acutilobum) 90g, 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus) 90g, 석창포(Acorus gramineus) 90g, 창출(Atractyodis Rhizoma) 90g, 백지(Angelica dahurica) 90g, 산조인(Zizyphi Spinosi Semen) 90g, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 90g, 산수유(Cornus officinalis) 90g 및 원지(Polygala tenuifolia) 80g을 정제수중의 70%(v/v)의 에탄올에 가하고, 75℃ 조건하에 12시간동안 서서히 열을 가한 다음, 여과한후, 최종적인 부피가 500 ml이 되게 증발시킨다음, 이를 감압 농축하여 200 ml이 되게 한 후 이를 동결시켜 동결건조된 엑스를 얻었다.
실시예 4
건조된 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium) 100g, 적복령(Hoelen) 100g, 당귀(Ligusticum acutilobum) 90g, 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus) 90g, 석창포(Acorus gramineus) 90g, 창출(Atractyodis Rhizoma) 90g, 백지(Angelica dahurica) 90g, 산조인(Zizyphi Spinosi Semen) 90g, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 90g, 산수유(Cornus officinalis) 90g 및 원지(Polygala tenuifolia) 80g 향부자(Cyperus rotundus) 100g, 반하(Pinellia ternata) 100g, 천궁(Cnidium officinale) 100g을 실시예 1-1의 방법으로 처리하여 동결건조물을 얻었다.
실시예 5
건조된 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium) 100g, 적복령(Hoelen) 100g, 당귀(Ligusticum acutilobum) 90g, 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus) 90g, 석창포(Acorus gramineus) 90g, 창출(Atractyodis Rhizoma) 90g, 백지(Angelica dahurica) 90g, 산조인(Zizyphi Spinosi Semen) 90g, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 90g, 산수유(Cornus officinalis) 90g 및 원지(Polygala tenuifolia) 80g, 적작약(Paeonia lactiflora) 50g, 길경(Platycodi Radix) 50g, 지실(Ponciri Fructus) 50g을 실시예 1-1의 방법으로 처리하여 동결건조물을 얻었다.
실시예 6
건조된 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium) 100g, 적복령(Hoelen) 100g, 당귀(Ligusticum acutilobum) 90g, 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus) 90g, 석창포(Acorus gramineus) 90g, 창출(Atractyodis Rhizoma) 90g, 백지(Angelica dahurica) 90g, 산조인(Zizyphi Spinosi Semen) 90g, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 90g, 산수유(Cornus officinalis) 90g 및 원지(Polygala tenuifolia) 80g, 용골(keel) 50g, 모려(Ostreae Concha) 50g, 목향(Inula helenium) 50g, 백자인(Biotae Semen) 50g, 계피(Cinnamomum loureirii) 50g을 실시예 1-1의 방법으로 처리하여 동결건조물을 얻었다.
실시예 7
건조된 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium) 100g, 적복령(Hoelen) 100g, 당귀(Ligusticum acutilobum) 90g, 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus) 90g, 석창포(Acorus gramineus) 90g, 창출(Atractyodis Rhizoma) 90g, 백지(Angelica dahurica) 90g, 산조인(Zizyphi Spinosi Semen) 90g, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 90g, 산수유(Cornus officinalis) 90g 및 원지(Polygala tenuifolia) 80g, 산약(Disocorea batatas) 50g, 구기자(chinese matrimony vine) 50g, 맥문동(snake's beard) 50g, 감초(GLYCYRRHIZAE RADIX) 50g, 오미자(SCHIZANDRAE FRUCTUS) 50g을 실시예 1-1의 방법으로 처리하여 동결건조물을 얻었다.
실시예 8
건조된 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium) 100g, 적복령(Hoelen) 100g, 당귀(Ligusticum acutilobum) 90g, 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus) 90g, 석창포(Acorus gramineus) 90g, 창출(Atractyodis Rhizoma) 90g, 백지(Angelica dahurica) 90g, 산조인(Zizyphi Spinosi Semen) 90g, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 90g, 산수유(Cornus officinalis) 90g 및 원지(Polygala tenuifolia) 80g, 향부자(Cyperus rotundus) 100g, 반하(Pinellia ternata) 100g, 천궁(Cnidium officinale) 100g 산약(Disocorea batatas) 50g, 구기자(chinese matrimony vine) 50g, 맥문동(snake's beard) 50g, 감초(GLYCYRRHIZAE RADIX) 50g, 오미자(SCHIZANDRAE FRUCTUS) 50g을 실시예 1-1의 방법으로 처리하여 동결건조물을 얻었다.
실시예 9
건조된 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium) 100g, 적복령(Hoelen) 100g, 당귀(Ligusticum acutilobum) 90g, 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus) 90g, 석창포(Acorus gramineus) 90g, 창출(Atractyodis Rhizoma) 90g, 백지(Angelica dahurica) 90g, 산조인(Zizyphi Spinosi Semen) 90g, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 90g, 산수유(Cornus officinalis) 90g 및 원지(Polygala tenuifolia) 80g, 향부자(Cyperus rotundus) 100g, 반하(Pinellia ternata) 100g, 천궁(Cnidium officinale) 100g 산약(Disocorea batatas) 50g, 구기자(chinese matrimony vine) 50g, 맥문동(snake's beard) 50g, 감초(GLYCYRRHIZAE RADIX) 50g, 오미자(SCHIZANDRAE FRUCTUS) 50g을 실시예 1-1의 방법으로 처리하여 동결건조물을 얻었다.
실시예 10
건조된 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium) 50g, 적복령(Hoelen) 50g, 당귀(Ligusticum acutilobum) 50g, 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus) 50g, 석창포(Acorus gramineus) 50g, 창출(Atractyodis Rhizoma) 50g, 백지(Angelica dahurica) 50g, 산조인(Zizyphi Spinosi Semen) 50g, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 50g, 산수유(Cornus officinalis) 50g 및 원지(Polygala tenuifolia) 50g, 향부자(Cyperus rotundus) 50g, 반하(Pinellia ternata) 50g, 천궁(Cnidium officinale) 50g 산약(Disocorea batatas) 50g, 구기자(chinese matrimony vine)50g, 맥문동(snake's beard) 50g, 감초(GLYCYRRHIZAE RADIX) 50g, 오미자(SCHIZANDRAE FRUCTUS) 50g을 실시예 1-1의 방법으로 처리하여 동결건조물을 얻었다.
실시예 11
건조된 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium) 100g, 적복령(Hoelen) 100g, 당귀(Ligusticum acutilobum) 90g, 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus) 90g, 석창포(Acorus gramineus) 90g, 창출(Atractyodis Rhizoma) 90g, 백지(Angelica dahurica) 90g, 산조인(Zizyphi Spinosi Semen) 90g, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 90g, 산수유(Cornus officinalis) 90g 및 원지(Polygala tenuifolia) 80g을 분말화하여 분말을 얻었다.
실험예 1
pCT 105 형질 이입시킨 세포주의 배양
본 연구에 사용된 세포주인 SK-N-SH은 서울대학교 암연구소 한국 세포주은행으로부터 분양받아서 계대배양시켜 5% FBS가 함유한 RPMI 배지에 penicillin/streptomycin을 첨가하여 flask내지 cell culture용 dish에 배양하면서 pCT105의 플라스미드를 본 연구에 사용 세포주를 구축하기 위해 미리 103세포를 6-well plate에 분주하고 37℃에서 하룻밤 배양하여 80%정도 조밀차게 배양한 다음반응액 A으로 pCT105 2㎍와 serum free medium (이하 SFM이라 명명) 100㎕을 혼합하고, 반응액 B으로 lipofectin 10㎕와 SFM 100㎕을 혼합하여 45분간 반응시킨다음 상기 반응액 A와 B를 다시 혼합하여 15분간 반응시킨 후 세포를 PBS로 2회 세척하고 SFM 배지 1.5 ml와 반응 혼합액을 분주한 다음 6시간정도 37℃, 5% CO2incubator에서 유지하고 5% RPMI배지를 첨가하여 하룻밤 배양한다. 이를 새로운 6well plate에 다시 계대배양 하면서 G-418 450㎍/ml로 selection을 2주간 실시하고 CT105가 잘 유도되는 단일 clone을 선정하여 본 실험에 사용하였다(도 3 B, E).
실험예 2
pCT105발현에 의해 신경세포 생존도에 미치는 영향
CT105 유도발현 SK-N-SH cell lines를 103세포수로 96-well에 분주하고 하룻밤 배양한 다음 CHU-1의 5, 10, 15, 25, 50 ㎍/ml농도별로 처리하여 MTT (3-[4,5-dimethiozol-2y-]2,5-diphenytetrazolium bromide) 용액 20 ㎕을 첨가하여 3시간동안 배양한 다음 DMSO 50 ㎕을 첨가하고 실온에서 30분이상 반응을 시켜서 심홍색의 색상이 변화되는 정도를 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) reader의 A570/A630nm에서 흡광도를 측정하였는데 CHU-1농도별로 처리한 결과로는 대조군에 비해 신경세포의 생존율로 볼 때 IC50의 농도로 설정하는데 약 15~25 ㎍/ml에 해당되며 앞으로 본 연구에 25 ㎍/ml을 선정하여 수행하였고 50 ㎍/ml에서 가장생존율이 높았는데 이는 도 5의 형태학적인 변화와 비교시 CT105발현에 의해 세포사가 CHU-1을 통해 억제되는 것을 확인할 수 있었는데 신경돌기의 신장이나 정상군과 동일하게 형태학적인 변화를 유도하였다(도 4).
실험예 3
pCT105발현에 의해 신경세포 형태학적 관찰
CT105 유도발현 SK-N-SH cell lines를 103세포수로 6-well에 분주하고 하룻밤 배양한 다음 약물군의 25 ㎍/ml농도로 처리하여 상기 세포주의 세포사를 억제하는지 조사하기 위해 5% FBS가 함유한 RPMI medium, penicilin / streptomycin이 함유한 배지를 37℃에서 12시간 배양하여 반응을 관찰하였다. 세포사 관찰은 현미경의 200배율에서 세포사가 유도된 200개정도 세포수를 촬영하여 조사하였으며 세포사의 유도양상을 보기 위해 세포사가 억제되는 농도를 선정하여 조사하였는데 도 5처럼 정상군에서는 형태학적으로 현미경하에서 관찰시 증식이 왕성하고 신경돌기가 잘 발달되어 신장되지만 CT105의 발현은 형광현미경하에서 FITC의 녹색형광체는 전혀 유도되지 않았지만 대조군 경우 FITC의 녹색형광체가 강하게 나타내므로 CT105의 발현으로 인해 세포사가 유도된 것을 알수 있었으며 CHU-1 경우 세포의 증식이 왕성하게 진행되고 신경돌기도 신장되는 것을 보아 FITC의 발현이 약하게 감소되는 것을 알 수 있었는데 이는 CHU-1가 CT105의 발현에 의해 유도된 신경세포의 세포사를 억제하거나 신경세포의 보호 및 방어효과를 나타낼 것으로 사료된다(도 5).
실험예 4
pCT105발현에 의해 신경세포의 DNA fragmenation 억제효과 측정
CT105 유도발현 SK-N-SH cell lines를 103세포수로 6-well에 분주하고 하룻밤 배양한 다음 약물군의 25 ㎍/ml농도로 처리하여 DNA fragmenation를 유도하는 정도를 파악하기 위해 세포 용해액인 lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.2% Triton X-100) 200㎕를 첨가한 후 30 min간 얼음에 유지한 다음 proteinase K(100 ㎍/ml)를 첨가하고 50℃에서 5시간동안 항온조에 유지한다음 이를 phenol/chloroform의 동량을 넣고 잘 혼합후 상기와 같이 15,000 rpm에서 15분간 원심분리한다. 상등액을 취해 100% EtOH로 침전시켜 침전물을 건조시켜 이를 RNase(50 ㎍/ml)가 함유한 dH2O 35㎕를 첨가하여 녹인 후 이 용액을 1.5% agarose gel을 제조하여 전기영동을 실시한 다음 DNA fragmenation의 유무를 조사하였는데 도 6처럼 정상군에서는 상기 결과처럼 형태학적으로 현미경하에서 관찰시 증식이 왕성하고 신경돌기가 잘 발달되어 신장되기 때문에 세포주기가 제대로 잘 진행한 결과로 염색체가 완전한 형태로 lane에 존재하지만 CT105의 발현에 의해 세포사가 유도되는 과정에 있는 상태이므로 염색체의 histone단백질에 둘러싸여 있지 않은 곳에 endonuclease에 의해 절단하여 200-400 bp 길이 만큼 불연속적으로 ladder가 출현되는 것을 확인되는데 이런 현상을 DNA fragmentation이라하는데 보통 1K bp이하에서 주로 나타난다. CHU-1 경우 세포의 증식이 왕성하게 진행되고 신경돌기도 신장되는 것을 보아 점점 약하게 ladder가 감소되는 것을 알 수 있었는데 CHU-1가 CT105의 발현에 의해 유도된 신경세포의 세포사를 유도하는 관련단백질의 활성을 억제하여 신경세포의 세포사의 보호 및 방어효과를 나타낼 것으로 사료된다(도 6).
실험예 5
pCT105발현에 의해 신경세포의 단백질발현을 형광현미경 분석
CT105 유도발현 SK-N-SH cell lines를 103세포수로 slide glass위에 laminin coated 된 slipe round cover glass에 분주하고 하룻밤 배양한 다음 약물농도가 25 ㎍/ml농도가 되도록 가한 다음 5시간 후에 세포사를 유도하는지 조사하기 pCT105-GFP vector를 형질이입시켜 형광현미경하에서 관찰시 도 7에서처럼 도 7b의 vector를 구축하여 이를 신경세포에 주입시 항생제 첨가에 의해 유도되면 대조군은 vector의 강력한 promoter인 바이러스 유래 CMV (cytomegalo-viruses)으로 인해 CT105의 발현이 유도된 후에 fusion protein 말단부에 ORF(open reading frame)의 stop이 결여된 상태에서 연결된 GFP(green fluorscent protein)가 발현되므로 이에 비해 CHU-1의 처리에 의해 CT105로 인한 신경세포의 세포사는 CT105의 발현이 억제됨과 동시에 녹색형광의 발현이 감소하는 경향을 보임과 동시에 세포사가 억제되는 경향을 보였고(도 7), 상기 결과를 좀 더 자세히 CT105의 발현의 감소로 세포사가억제되는 원인을 확인하기 위해 Tunel assay방법으로 조사하였다. 103세포수를 분주하고 하룻밤 배양한 후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 다음 세포를 4% p-formaldehyde로 12시간동안 4℃에서 고정시킨 다음 0.5% Tween 20, 0.2% BSA ( bovine serum albumin)을 첨가하여 실온에서 15분간 침투과정을 실시하고 PBS로 3회 세척을 실시하고 세포내 염색체 DNA nick 말단을 표지하기 위해 terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)용액 (dT완충액, biotin-dUTP, TdT=18:1:1) 5㎕를 떨어 뜨려서 37℃에서 1시간 유지하고 증류수로 3회 세척한다음 blocking 용액인 0.5% BSA를 50㎕정도 첨가하여 실온에서 10분간 정치하여 놓는 다음 avidine-FITC용액 50㎕첨가하여 30분간 실온에서 유지하고 PBS로 3회 세척한 다음 slide glass 위에 mounding 용액을 약간 떨어뜨리고 엎어놓고 형광현미경하에서 관찰하였는데 도 8에서처럼 CT105의 발현에 의해 염색체의 C 말단의 3-OH기가 유도시 avidine-FITC의 결합에 의해 녹색형광을 나타내는 대조군에 비해 CHU-1경우는 점차 CT105의 발현이 감소되면서 염색체의 절단이 감소하는 apoptosis 현상이 감소되는 경향을 나타내었고(도 8), 그리고 이런 현상을 확증할 근거로 도 9에서처럼 acridine orange 시약 1㎍/ml으로 세포사가 유도시 핵응축이 일어날 경우에 염색을 하면 응축성 염색질에 오렌지색 내지 적색으로 염색유무를 판정할 수 있는데 대조군은 CT105발현에 의해 세포사를 확인할 수 있는데 이는 녹색은 생존한 세포, 오렌지색(세포사 초기), 적색(세포사 후기)으로 나타내었으며, 그리고 세포사에 의해 핵의 응축이 유도되는 것을 약물을 통해 신경세포의 보호효과를 관찰하기 위해 상기의 방법을 통해 고정된 세포에 Hoechst dye 33258 (1㎍/ml)을 가해 준 후 상온에서 약 30분간 배양하여 PBS로 3회 세척한 다음 0.1% ρ-phenylene diamine을 90% glycerol/PBS에 녹인 용액을 가해준 후 cover slip을 덮어준 다음 형광현미경하에서 각각의 핵을 관찰하여 본 결과 Hoechst 33258은 대조군처럼 세포사가 일어난 세포의 염색체 절단 끝부분에 결합하여 U.V하에서 형광현미경에서 녹색 내지 파란색으로 형광체가 보이는데 이는 세포사가 일어남을 알 수 있고 CHU-1 경우 점점 감소하는 경향을 보였으며 CHU-1에 의해 세포사가 억제됨을 알 수 있었다(도 9).
실험예 6
CT105에 의한 신경세포의 배양액에서 분비되는 용존 NO 생성도 측정
본 발명의 방법에 따라 수득된 CHU-1에 대하여 pCT105배양세포의 배양액에서 NO생성량을 측정하기 위해 CHU-1 25 ㎍/㎕이 되게 가한 다음 NO생성도의 억제능력을 확인하기 위해 medium 100㎕을 96 well에 분주하고 이를 여기에 발색시약인 Griess 시약(1% sulphanilamide, 0.1% naphlethyendiamine dihydrochloride, 4% phosphoric acod) 50 ㎕정도 처리하여 혈액내의 NO생성도를 570 nm에서 ELISA reader로 측정하였는데 정상군은 4.0±1.8μM이고 대조군은 99.2±2.4μM정도이었지만 CHN-1은 19.1±3.5μM으로 나타내었다 이는 대조군보다 약 5배정도 NO생성을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다 (표 1).
실험예 7
pCT105발현에 의해 신경세포 neurite outgrowth의 길이 변화
CT105 유도발현 SK-N-SH cell lines를 103세포수로 laminin coated 6-well (BECTON DICKINSON)에 분주하고 하룻밤 배양한 다음 NGF를 50 ng/ml이 되게 하여 첨가하고 5시간동안 자극을 가한 다음 약물군의 무혈청 내지 25 ㎍/ml농도별로 처리하여 100개의 세포에서 neurite outgrowth length를 현미경하에서 관찰하였는데 신경세포의 신경돌기 신장 상해는 세포사에 영향을 주기 때문에 CT105로 신경이 손상을 입은 세포의 신경돌기는 도 10에서처럼 대조군에서는 CT105의 발현에 의해 신경돌기가 손상을 입은 경우 성장이 억제된 상태로 나타내고 있으며, CT105의 25 ㎍/ml처리시 신경돌기가 잘 발달되어 성장하고 있음을 알 수 있었다(도 10). CT105로 인한 신경돌기의 상해는 신경돌기를 구성하고 있는 구성분의 이상으로 신경재생이 억제되나 CT105가 CHU-1에 의해 발현이 억제되면서 신경돌기를 구성하는 구성단백질을 촉진하는 가능성을 시사하고 이런 재생을 유도하는 기능의 성분이 함유할 것으로 사료된다(도 10).
실험예 8
CT105에 의한 신경세포 growth-cone collapse assay
CT105 유도발현 SK-N-SH cell lines를 103세포수로 laminin coated 6-well (BECTON DICKINSON)에 분주하고 하룻밤 배양한 다음 NGF를 50 ng/ml이 되게 하여 첨가하고 5시간동안 자극을 가한 다음 약물군의 무혈청 내지 25 ㎍/ml농도별로 처리하여 100개의 세포에서 Dyer 방법에 의해 growth-cone collapse assay를 현미경하에서 관찰하여 조사한 결과 신경세포의 신경돌기 신장 상해는 세포사에 영향을 주기 때문에 CT105로 신경이 손상을 입은 세포의 신경돌기는 도 11에서처럼 대조군에서는 CT105의 발현에 의해 신경돌기가 손상을 입은 경우 신경돌기 말단부분의 함몰이 유도되는 분자적으로 관련단백질의 발현이상으로 유도되는데 CHU-1 25 ㎍/ml처리시 신경돌기가 잘 발달되어 신경세포의 돌기 성장과 밀접한 관계가 있는collaspe cone 억제정도를 측정한 결과 도 11에서처럼 정상군은 4.65±5.5이고 대조군은 0.85±1.5이고 CHU-1 25 ㎍/ml처리시 각각 약 4.65±1.5 수치를 보였는데 CHU-1농도가 증가할수록 collaspe cone형성이 감소함을 확인하였고 도 11처럼 정상군은 신경돌기의 분지가 잘 분포한 반면 대조군은 신경돌기 말단에 함몰된 양상으로 보인 결과로 볼 때 아마도 CT105에 의해 Rho family에 이상이 있음을 사료되어진다. CT105로 인한 신경돌기의 상해는 신경돌기 말단에 분포하는 Rho family에 의해 함몰되는 양상을 유도하여 신장을 억제되고 신경돌기의 신장불능으로 인한 신경재생이 억제되나 CHU-1에 의해 Rho에서 서서히 Rac으로 유도되면서 신경돌기의 신장이 촉진되는 가능성을 시사하고 collapse cone을 억제시키는데 아마도 CHU-1에 신경재생의 기능성분이 함유할 것으로 사료된다(도 11).
실험예 9
pCT105발현에 의해 신경세포 mRNA 발현에 미치는 영향
CT105 유도발현 SK-N-SH cell lines를 103세포수로 laminin coated 6-well (BECTON DICKINSON)에 분주하고 하룻밤 배양한 다음 약물농도가 25 ㎍/ml농도가 되도록 가한 다음 5시간후에 세포를 1.5ml eppendorf tube에 모아서 15,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 RNAzol 용액을 200㎕를 첨가한 다음 chloroform 50㎕를 가하고 조심스럽게 pippeting하여 세포를 lysis하고 이를 15,000 rpm에서 4℃하에 15분간 원심분리하여 total RNA를 회수한 다음isopropanol 동량을 넣고 4℃에서 15분간 침전시켜 75% EtOH로 한번 세척하여 건조시킨 다음 RNase free dH20를 20㎕을 넣고 60℃ 에서 30분간 가하여 녹인 다음 total RNA 5㎕에 10 mM dNTP 5㎕, 25mM MgCl2 6㎕, 10x RNA PCR buffer 5㎕, RNase inhibitor 1㎕, AMV-Optimized Taq 1㎕, AMV reverse Transcriptase XL 1㎕, 20 pM specific primer (sense/ antisense) 1㎕, RNase free dH20 26㎕을 첨가하여 42℃에서 60분간 역전사 반응을 실시하고, 92℃에서 2분간 반응을 정지시켜서 PCR(polymerase chain reaction)를 실시하였는데 반응조건은 92℃ 2min, 92℃ 60sec, 54℃ 60sec, 72℃ 60sec에서 35 cycles를 진행시켜 72℃에서 최종적으로 5분간 elogation 반응을 실시하여 종결한 후 이 PCR 산물을 1% agarose gel에 elute시켜 사이즈 마커를 기준으로 band유무를 확인하였다. 그 결과는 mRNA발현을 확인하여 전사 수준에서 신경재생효과를 분석하였는데 세포사에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향이 DNA의 유전적인 문제 내지 전사 수준에서 조절하는지 βAPP의 CT105 cell lines에서 알아보기 위해 CHU-1 25 ㎍/ml 농도로 처리하여 분석한 결과는 도 12에서처럼 신경돌기의 신장에 중요한 인자인 CT105에 의해 CT105, COX-II 그리고 iNOS, calpain mRNA발현 경우 대조군에서는 강하게 전사 발현되지만 CHU-1 25 ㎍/ml에서 발현이 감소되는 경향을 확인되었고 세포증식이나 생존에 영향을 미치는 MAPK mRNA의 전사 발현은 증가하는 양상를 보였다(도 12). 세포의 전사수준에서 단백질 발현에 표준의 지표인 β-actin mRNA 발현 경우 모든 군에서 일정하게 발현되었다. 본 CHU-1이 CT105로 인한 신경세포의 세포사가 유도되는 양상을 억제하여 신경세포의 파괴를 조절하는 유효성분이 함유하는 것으로 사료된다(도 12).
실험예 10
pCT105발현에 의해 단백질발현에 미치는 영향을 Western Blot 분석
CT105 유도발현 SK-N-SH cell lines를 103세포수로 6 well에 분주하고 상기와 같은 방법으로 실시하고 lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1% (v/v) Triton X-100, 150 mM NaCl, 10% (v/v) glycerol, 2 mM dithiothreitol, 10 mM MgCl2)로 처리하여 그 추출액 30μg을 10% polyacrylamide SDS gels (SDS-PAGE)에 용출한 후 Immobilon-P membrane (Amersham)에 옮겨서 단백질의 발현을 확인하기 위해 ehanced chemilumenescence (ECL)로 발색시켜 확인하는데 antibody를 일차적으로 (Santa Cruz, 1:1,000 희석) 일차항체인 Caspase3, APP, iNOS, MAPK, p42/44를 표지하고 PBS로 세척한 다음 blotting 용액을 첨가하여 부반응을 제거하고 이차항체인 Horseradish Peroxidase-conjugate anti-goat IgG (HRP) 항체를 표지하고 ECL blotting reagent로 3분간 배양하고 chemiluminescence은 30 sec에서 20분간 X-ray film에 노출시켜 발색정도를 확인한 바 단백질의 발현을 확인한 바 대조군은 COX-II, iNOS, APP(CT105)단백질 발현을 강하게 증가한 반면 CHU-1 경우 감소 내지 억제된 경향을 보였고 세포증식이나 생존에 관여하는 ERK1/2와 MAPK가 대조군은 감소하지만 CHU-1 경우 발현이 증가하는 경향을 보여 상기 여러 결과에서처럼 세포사가 억제되면서 세포생존에 관여하는 세포주기의 활발한 진행과 신경돌기의 신장이왕성하고 재생이 촉진되면서 CT105로 인한 신경세포의 세포사가 억제되는 경향을 보아 신경세포의 보호와 방어효과가 본 CHU-1에 유의한 성분이 함유함과 치매치료에 적용할 수 있으리라 사료되어진다(도 13).
이상의 실험결과로부터 확인 되는 바와 같이, 본 발명의 신규 조성물의 효능은 탁월한 치매 억제효능를 가진다. 따라서, 본 발명의 조성물은 약학적 치매제제으로서 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 환자의 성별, 나이, 질병의 정도 등에 의하여 그 사용량이 달라질 수 있으나, 본 발명의 조성물을 물이나 유기용매로 추출하지 않고, 생약 자체를 사용하는 경우에는 일일 1.0g 내지 50g의 양을 사용할 수 있으며, 엑스의 형태로 사용될 경우에는 일일 10mg 내지 1000mg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
본 발명의 화합물은 Alzheimer병, 혈관 질환 (다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료효과를 가지고 있기 때문에 물엑스는 본 발명의 조성물에서 유효성분에 효능을 가지는 기존에 이미 약제로 사용되고 있는 코그넥스, 아리셉트, 메만틴(Memantine), 엑셀론, 디하이드로에보디아민, 레미닐, 타크린, 피라세탐, 이데베논, 토코페롤(비타민 E), 은행잎 추출물, 에스트로겐, 아스피린, 티클로피딘, 와파린, 세레길린, 니세르골린에서 선택된 1종 이상의 약물을 더 함유하고, 여기에 약제학적으로 통상으로 허용되는 부형제, 보조제, 희석제, 등장화제, 보존제, 활탁제, 용해보조제와 함께등과 같은 약물과병용하여 사용될 수도 있다.
본 발명의 화합물과 상기의 약물을 병용하면, 기존 약물의 상용량을 줄일 수 있고, 따라서 기존 약물들이 가지는 문제점들을 경감시킬 수 있다.
본 발명의 화합물은 약제학적으로 통상으로 사용되는 부형제, 보조제, 무통화제, 등장화제, 보존제, 및 기타 약제학적으로 통상으로 허용되는 보조제와 혼합하고 약제학적으로 통상으로 허용되는 제제형태로 제제화하여 약학적 제제를 제조할 수 있다. 이러한 약제학적 제제형태로는 주사제, 액제, 정제, 캡슐제, 산제, 시럽제 등으로 제제화 할 수 있다.
다음에 제제실시예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
제제실시예 1
CHU-1 500mg
주사용 멸균증류수 적량
pH 조절제 적량
CHU-1을 주사용 증류수에 용해하고 pH 조절제로 pH약 7.6로 조절한 다음 전체를 2ml로 한 후 2ml용량의 앰플에 충진하고 멸균하여 약침 주사제를 제조한다.
제제실시예 2
실시예 2의 엑스 500mg
주사용 멸균증류수 적량
pH조절제 적량
실시예 2의 엑스 500mg을 주사용 멸균증류수에 용해하고 pH조절제로 pH약 7.2로 조절하고 전체를 2ml로 한 다음 2ml용량의 앰플에 충진하여 약침 주사제를 제조한다.
제제실시예 3
실시예 3 의 물엑스 분말 500mg
유당 100mg
전분 100mg
스테아린산 마그네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제실시예 4
실시예 5의 엑스 500mg
유당 100mg
전분 50mg
스테아린산 마그네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를제조한다.
제제실시예 5
실시예 6의 엑스 500mg
유당 100mg
스테아린산 마그네슘 2mg
상기의 성분을 혼합한 후 내부가 폴리에틸렌클로라이드로 코팅된 지포에 충진하고 씰링하여 산제를 제조한다.
제제실시예 6
실시예 8의 엑스 500mg
유당 50m
전분 50mg
탈크 2mg
스테아린산마그네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.
제제실시예 7
실시예 9의 엑스 500mg
유당 100mg
전분 93mg
탈클 2mg
스테아린산 마그네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.
제제실시예 8
실시예 1-1의 엑스 5g
설탕 20g
이성화당 20g
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 100ml
상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 혼합하고 100ml 의 갈색병에 충진하고 멸균시켜서 액제를 제조한다.
제제실시예 9
실시예 2의 엑스 5g
설탕 20g
이성화당 20g
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 100ml
상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 혼합하고 100ml 의 갈색병에 충진하고 멸균시켜서 액제를 제조한다.
제제실시예 10
실시예 10의 엑스 500mg
코그넥스 10mg
주사용 멸균증류수 적량
pH조절제 적량
실시예 10의 엑스 500mg을 주사용 증류수에 용해하고 pH 조절제로 pH약 7.6로 조절한 다음 전체를 2ml로 한 후 2ml용량의 앰플에 충진하고 멸균하여 주사제를 제조한다.
제제 실시예 11
실시예 1-1의 엑스 500mg
아리셉트 10mg
주사용 멸균증류수 적량
pH조절제 적량
실시예 1-1의 엑스 500mg을 주사용 멸균증류수에 용해하고 pH조절제로 pH약7.2로 조절하고 전체를 2ml로 한 다음 2ml용량의 앰플에 충진하여 주사제를 제조한다.
제제실시예 12
실시예 1-1의 엑스 500mg
메만틴 20mg
유당 100mg
전분 100mg
스테아린산 마그네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제실시예 13
실시예 1-1의 엑스 500mg
엑셀론 50mg
유당 100mg
전분 50mg
스테아린산 마그네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제실시예 14
실시예 2의 엑스 500mg
유당 50mg
전분 50mg
탈크 2mg
스테아린산마그네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.
제제실시예 15
실시예 1-1의 엑스 1000mg
디하이드로에보디아민 10mg
유당 50mg
전분 50mg
탈크 2mg
스테아린산마그네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.
제제실시예 16
실시예 6의 엑스 100mg
레미닐 20mg
유당 100mg
전분 93mg
탈클 2mg
스테아린산 마그네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.
제제실시예 17
실시예 7의 엑스 1000mg
타크린 1000mg
설탕 20g
이성화당 20g
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 100ml
상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 혼합하고 100ml의 갈색병에 충진하고 멸균시켜서 액제를 제조한다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium), 적복령(Hoelen), 당귀(Ligusticum acutilobum), 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus), 석창포(Acorus gramineus), 창출(Atractyodis Rhizoma), 백지(Angelica dahurica), 산조인(Zizyphi Spinosi Semen), 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata), 산수유(Cornus officinalis), 원지(Polygala tenuifolia) 분말이나 또는 물, 저급알콜, 초산에틸, 방향족 탄화수소, 염소화탄화수소 또는 그 혼합용매에서 선택된 용매로 추출한 엑스를 주성분으로 함유하고, 필요하면 향부자(Cyperus rotundus), 반하(Pinellia ternata), 천궁(Cnidium officinale), 적작약(Paeonia lactiflora), 길경(Platycodi Radix) , 지실(Ponciri Fructus), 용골(keel), 모려(Ostreae Concha), 목향(Inula helenium), 백자인(Biotae Semen), 오미자(Schizandra chinensis), 계피(Cinnamomum loureirii), 산약(Disocorea batatas), 구기자(chinese matrimony vine), 맥문동(snake's beard), 감초(GLYCYRRHIZAE RADIX), 오미자(SCHIZANDRAE FRUCTUS)에서 선택된 1종 이상의 보조생약 또는 이의 물, 저급알콜, 초산에틸, 방향족탄화수소, 염소화탄화수소 또는 그 혼합용매에서 선택된 용매로 추출한 엑스를 함유하는 조성물은 Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료에 의약용도로 사용될 수 있다.

Claims (4)

  1. 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium), 적복령(Hoelen), 당귀(Ligusticum acutilobum), 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus), 석창포(Acorus gramineus), 창출(Atractyodis Rhizoma), 백지(Angelica dahurica), 산조인(Zizyphi Spinosi Semen), 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata), 산수유(Cornus officinalis) 및 원지(Polygala tenuifolia)을 분말화하거나, 또는 물이나 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 추출한 엑스를 주성분으로 함유하고, 필요하면, 여기에 향부자(Cyperus rotundus), 반하(Pinellia ternata), 천궁(Cnidium officinale), 적작약(Paeonia lactiflora), 길경(Platycodi Radix) , 지실(Ponciri Fructus), 용골(keel), 모려(Ostreae Concha), 목향(Inula helenium), 백자인(Biotae Semen), 계피(Cinnamomum loureirii), 산약(Disocorea batatas), 구기자(chinese matrimony vine), 맥문동(snake's beard), 감초(GLYCYRRHIZAE RADIX), 오미자(SCHIZANDRAE FRUCTUS)에서 선택된 1종 이상의 보조생약 또는 이의 물, 저급알콜, 초산에틸, 방향족탄화수소, 염소화탄화수소에서 선택된 용매로 추출한 엑스를 함유한 조성물의 중풍, 뇌경색, 고혈압, Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료제로서의 용도.
  2. 제 1항에 있어서, 진피(Aurantii Nobilis Pericarpium) 50 내지 500중량부 , 적복령(Hoelen) 50 내지 500중량부, 당귀(Ligusticum acutilobum) 50 내지 500중량부, 조구등(Uncariae Ramulus et Uncus) 50 내지 500중량부, 석창포(Acorus gramineus) 50 내지 500중량부, 창출(Atractyodis Rhizoma) 50 내지 500중량부, 백지(Angelica dahurica) 50 내지 500중량부, 산조인(Zizyphi Spinosi Semen) 50 내지 500중량부, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 50 내지 500중량부, 산수유(Cornus officinalis) 50 내지 500중량부, 원지(Polygala tenuifolia) 50 내지 500중량부 또는 그의 엑스를 주성분으로 함유하고 필요하면 여기에, 향부자(Cyperus rotundus) 50 내지 500중량부, 반하(Pinellia ternata) 50 내지 500중량부, 천궁(Cnidium officinale) 50 내지 500중량부, 적작약(Paeonia lactiflora) 50 내지 500중량부, 길경(Platycodi Radix) 50 내지 500중량부, 지실(Ponciri Fructus) 50 내지 500중량부, 용골(keel) 50 내지 500중량부, 모려(Ostreae Concha) 50 내지 500중량부, 목향(Inula helenium)50 내지 500중량부, 백자인(Biotae Semen) 50 내지 500중량부, 오미자(Schizandra chinensis) 50 내지 500중량부, 계피(Cinnamomum loureirii) 50 내지 500중량부, 산약(Disocorea batatas) 50 내지 500중량부, 구기자(chinese matrimony vine) 50 내지 500중량부, 맥문동(snake's beard) 50 내지 500중량부, 감초(GLYCYRRHIZAE RADIX) 50 내지 500중량부, 오미자(SCHIZANDRAE FRUCTUS) 50 내지 500중량부에서50 내지 500중량부에서 선택된 1종 이상의 보조생약 또는 이의 물, 저급알콜, 초산에틸, 방향족탄화수소, 염소화탄화수소에서 선택된 용매로 추출한 엑스를 함유한 조성물의 중풍, 뇌경색, 고혈압 , Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료제로서의 용도.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 조성물을 약제학적으로 통상으로 허용되는 부형제, 보조제, 희석제, 등장화제, 보존제, 활탁제, 용해보조제와 함께 약제학적으로 통상으로 허용되는 약학적 제제형태로 제제화한 제제의 중풍, 뇌경색, 고혈압, Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료제로서의 용도.
  4. 제 3항에 있어서, 기존에 이미 약제로 사용되고 있는 코그넥스, 아리셉트, 메만틴(Memantine), 엑 셀론, 디하이드로에보디아민, 레미닐, 타크린, 피라세탐, 이데베논, 토코페롤(비타민 E), 은행잎 추출물, 에스트로겐, 아스피린, 티클로피딘, 와파린, 세레길린, 니세르골린에서 선택된 1종 이상의 약물을 더 함유하고, 여기에 약제학적으로 통상으로 허용되는 부형제, 보조제, 희석제, 등장화제, 보존제, 활탁제, 용해보조제와 함께 약제학적으로 통상으로 허용되는 약학적 제제형태로 제제화한 제제의 중풍, 뇌경색, 고혈압, Alzheimer병, 혈관 질환(다경색 치매: Multi-infarct dementia), Alzheimer병과 다경색 치매의 혼합형, Parkinson병, 저갑상선증(hypothyrodism), 알코올성 치매 Alzheimer 치료제로서의 용도.
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