CN117624269A - 从青钱柳中提取的吡喃糖苷类化合物、其提取方法及在抗前列腺癌药物中的应用 - Google Patents

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CN117624269A CN202311314409.6A CN202311314409A CN117624269A CN 117624269 A CN117624269 A CN 117624269A CN 202311314409 A CN202311314409 A CN 202311314409A CN 117624269 A CN117624269 A CN 117624269A
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石孟琼
贺君宇
潘朝旺
张舒苒
何毓敏
潘尚铠
徐小军
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Abstract

本发明提供了一种从青钱柳中提取的吡喃糖苷类化合物、其提取方法及其在抗前列腺癌药物中的应用。该化合物是以中药青钱柳的叶为原料，经碱液脱色、洗涤、溶剂提取、二氯甲烷萃取、凝胶柱色谱分离步骤得到，该分离方法简单有效、纯度高，可适用于工业化生产。该吡喃糖苷类化合物经前列腺癌细胞实验、前列腺癌裸鼠原位移植瘤动物实验的抗前列腺癌活性分析，抗前列腺癌效果显著，具有良好的治疗前列腺癌功效，有望开发成新的治疗前列腺癌天然药物。

Description

从青钱柳中提取的吡喃糖苷类化合物、其提取方法及在抗前 列腺癌药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及从青钱柳中提取的吡喃糖苷类化合物、其提取方法及在抗前列腺癌药物中的应用。
背景技术
随着社会的发展，人口老龄化加剧，前列腺疾病已经逐步成为危害中老年男性生命健康的常见疾病，尤其是前列腺癌在全球的发病率位居男性恶性肿瘤第2位，仅2013年美国就有233,000例新发前列腺癌和86,930例前列腺癌死亡患者。近年来我国前列腺癌发病率也逐渐升高，自2008年起前列腺癌已成为我国泌尿系统发病率最高的恶性肿瘤，部分地区前列腺癌已经成为男性最常见的恶性肿瘤。由于患者前期临床症状不明显，50％～70％的前列腺癌患者在确诊时已属晚期，其中约80％的晚期前列腺癌患者可出现骨转移。
当前，前列腺癌症的治疗方案包括手术、放疗、激素治疗和化疗。手术和放疗是局限性前列腺癌症的主要治疗方法，而雄激素剥夺治疗是晚期前列腺癌症患者的主要治疗手段。尽管雄激素剥夺疗法最初显示出良好的疗效，但治疗往往失败，因为患者对雄激素阻断不敏感，最终发展为去势抵抗性前列腺癌或转移性去势抵抗性前列腺癌。一旦病情进展为去势抵抗性前列腺癌，再行放疗、化疗、靶向治疗等方法均较难有效地减缓病情的进展。且雄激素剥夺治疗通常会产生诸多不良反应，降低治疗期间患者的生活质量。因此，仍需要探索研发新来源的新型抗抗前列腺癌药物。近年来，国内外学者将目光转移到中草药的提取物，新发现了许多有抗前列腺癌作用的天然药物。如姜黄、鸦胆子提取物等天然提取物都已开发为临床抗前列腺癌药物。所以，从中草药中寻找天然的抗前列腺癌药物前景广阔。
青钱柳Cyclocarya paliurus(Batal)Iljinskaja系双子叶植物纲胡桃科青钱柳属落叶乔木，是中国特有的单种属植物，也是国家重点保护的濒危植物之一，又名青钱李、摇钱树、甜茶树等。主要广泛分布于江西、浙江、湖北、江苏、安徽、福建、台湾、四川、贵州等地，为畲族、土家族、苗族常用草药，具有清热消肿、止痛质功效。因其叶具有甘甜的味道，少数民族采用其嫩叶制茶饮用，该茶具有生津止渴、清热解暑、降压强心、延年益寿等作用。现代药理学研究表明，青钱柳叶具有降血糖、降血脂、降血压、抗菌、抗氧化等多种活性。
发明内容
本发明提供一种从青钱柳中提取的吡喃糖苷类化合物、其提取方法及在抗前列腺癌药物中的应用。
本发明的技术方案是，一种吡喃糖苷类化合物，分子式为C35H58O9，其结构式如下：
命名为：(23E)-(12R,20S)-12,20,25-三羟基-3,4-三羟甲基-4(28),23-二烯-3-酸12-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。
本发明还涉及所述化合物的提取方法，包括以下步骤：
S1、将青钱柳叶加碱溶液进行浸泡，过滤、洗涤后晾干；
S2、晾干的青钱柳叶用醇水溶液加热回流提取，后经过滤、减压浓缩成浸膏a；
S3、将浸膏a加水混悬，用二氯甲烷萃取，回收溶剂，收集馏分，减压浓缩成浸膏b；
S4、将浸膏b加醇溶解，上凝胶柱，用醇的水溶液洗脱，合并洗脱液，减压浓缩，即得吡喃糖苷类化合物。
进一步地，S1中的碱溶液为氢氧化钠溶液，pH为10～15。
进一步地，S2中的醇水溶液为体积百分数90～95％的乙醇水溶液。
进一步地，S4中的醇为甲醇，醇的水溶液为甲醇的水溶液
进一步地，甲醇的水溶液体积百分数浓度为70～90％。
本发明还涉及所述的吡喃糖苷类化合物在制备抗前列腺癌药物中的应用。
进一步地，所述抗前列腺癌药物为液体制剂、固体制剂、喷剂或者气雾剂或其他药学上可接受的剂型。
本发明具有以下有益效果：
本发明从青钱柳中提取分离出一种吡喃糖苷类化合物，该化合物能显著抑制前列腺癌LNCaP、PC-3和DU145细胞的增殖，对人正常前列腺上皮RWPE-1细胞无明显的细胞毒性；能显著抑制前列腺癌裸鼠原位移植瘤的生长和全身性转移，可促进肿瘤组织细胞凋亡，具有明显的抗前列腺癌作用。本发明从细胞和动物水平证实该化合物具有良好的抗前列腺癌效果，有望开发成为新的抗前列腺癌天然药物。
附图说明
图1本发明化合物13C-NMR谱图。
图2本发明化合物对人正常前列腺上皮RWPE-1细胞活力的影响(n＝5，与空白对照组比较：#P＜0.05，##P＜0.01)。
图3本发明化合物对前列腺癌LNCaP细胞活力的影响(n＝5，与空白对照组比较：#P＜0.05，##P＜0.01)。
图4本发明化合物对前列腺癌PC-3细胞活力的影响(n＝5，与空白对照组比较：#P＜0.05，##P＜0.01)。
图5本发明化合物对前列腺癌DU145细胞活力的影响(n＝5，与空白对照组比较：#P＜0.05，##P＜0.01)。
图6本发明化合物不同作用时间对前列腺癌LNCaP细胞生长的影响(n＝5，与空白对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与同一浓度本发明化合物作用4h组比较比较：#P＜0.05，##P＜0.01)。
图7本发明化合物不同作用时间对前列腺癌PC-3细胞生长的影响(n＝5，与空白对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与同一浓度本发明化合物作用4h组比较比较；#P＜0.05，##P＜0.01)。
图8本发明化合物不同作用时间对前列腺癌DU145细胞生长的影响(n＝5，与空白对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与同一浓度本发明化合物作用4h组比较比较：#P＜0.05，##P＜0.01)。
图9本发明化合物对前列腺癌裸鼠抑瘤率的影响(A：瘤体质量，B：抑瘤率；n＝10，与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01)。
图10本发明化合物对前列腺癌裸鼠血清中PSA的影响(n＝10，与假手术组比较：#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01)。
图11本发明化合物对前列腺癌裸鼠原位移植瘤组织形态学的影响(200×)。
图12本发明化合物对前列腺癌裸鼠原位移植瘤组织细胞凋亡的影响(200×)。
图13本发明化合物对前列腺癌裸鼠原位移植瘤组织细胞凋亡的影响(n＝10，与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1：吡喃糖苷类化合物的制备和结构解析
制备方法包括如下步骤：
步骤A、将青钱柳叶加入pH为12的氢氧化钠溶液，浸泡，过滤，收集青钱柳叶；
步骤B、将步骤A所得的青钱柳叶用自来水洗涤，直致青钱柳叶的洗涤水经pH计检测pH值为7为止，然后晾干；
步骤C、将步骤B所得的青钱柳叶用95％乙醇溶液加热回流提取后经、过滤、减压浓缩成浸膏a；
步骤D、二氯甲烷萃取：浸膏a加水混悬，用二氯甲烷萃取，回收溶剂，收集馏分，减压浓缩成浸膏b；
步骤E、凝胶柱色谱分离：浸膏b加甲醇溶解，上凝胶柱，用80％甲醇洗脱，合并洗脱液，减压浓缩即得吡喃糖苷类化合物。
该化合物的结构解析：
化合物的物理常数和波谱数据：无定形白色粉末，mp 138-142℃；[α]22 D+21.3(c0.23,MeOH)；1H NMR(500MHz,CD3OD)δ5.68(1H,m,H-23),5.62(1H,d,J＝15.5Hz,H-24),4.85(1H,bs,H-28a),4.72(1H,bs,H-28b),4.28OH,d,J＝6.5Hz,H-1'),4.12(1H,ddd,J＝4.5,10.5,H-12),3.89(1H,dd,J＝1.5,13Hz,H-5'a),3.79(1H,m,H-4'),3.52(1H,overlappingwith HzO,H-5'b),3.51(1H,m,H-2'),3.50(1H,m,H-3'),2.62(1H,m,H-2a),2.50(1H,m,H-1a),2.40(1H,m,H-11a),2.24(1H,m,H-2b),2.20(1H,m,H-22a1,2.04(1H,m,H-171,1.95(1H,m,H-22b),1.94(1H,m,H-131,1.90(1H,m,H-16b),1.82(1H,m,H-91,1.80(1H,m,H-51,1.77(1H,m,H-W,1.77(3H,s,CH3-29),1.61(1H,m,H-6b),1.55(1H,m,H-15a),1.52(1H,m,H-1b),1.42(1H,m,H-7a),1.33(1H,m,H-11b),1.31(1H,m,H-16a),1.28(3H,s,CH3-26),1.28(3H,s,CH3-27),1.21(1Hm,H-15b)1.16(3H,s,CH3-21),1.09(3H,s,CH3-19),1.08(1H,m,H-7b),1.07(3H,s,CH3-30),0.98(3H,s,CH3-18)；1H NMR(300MHz,C5D5N)δ6.27(1H,m,H-23),6.03(lH,d,J＝15.6Hz,H-24),4.97(1H,s,H-28a),4.96(1H,s,H-28b),4.84(1H,d,J＝6.6,H-1'),4.50(1H,m,H-12),4.49(1H,m,H-2'),4.25(1H,d,H-5'a),4.22(1H,s,H-4'),4.09(1H,m,H-3'),3.61(1H,d,H-5'b),1.85(3H,S,CH3-29),1.57(6H,S,CH3-26和CH3-27),1.50(3H,S,CH3-21),1.23(3H,S,CH3-19),1.03(3H,S,CH3-30),0.94(3H,s,CH3-18)；UVλmax,(MeOH)207nm(末端吸收)；IR vmax(KBr)3424,2967,2874,1701,1636,1551,1456,1387,1306,1254,1142,1088,1001,893,781,654,534cm-l；FABMS m/z(M-H)-621,(M-C5H8O4)；HRFABMS m/z 621.40043，结构式为C35H57O9，分子量621.40026。根据以上物理常数和波谱数据，鉴定该化合物为(23E)-(12R,20S)-12,20,25-三羟基-3,4-三羟甲基-4(28),23-二烯-3-酸12-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。13C-NMR谱图见图1。
实施例2：上述化合物抗前列腺癌细胞实验
1.实验材料
1.1实验药物：
本发明化合物从青钱柳叶中分离制备，实验时用二甲基亚砜(DMSO)溶解样品配制成浓度为10mg/mL化合物溶液，再用细胞培养液稀释成所需浓度，经过0.22μm孔径滤膜过滤除菌后，4℃保存备用；阳性药丝裂霉素购于浙江海正药业股份有限公司，用二甲基亚砜配成250mg/mL储备液备用。
1.2实验细胞株
人正常前列腺上皮细胞RWPE-1细胞株和前列腺癌细胞LNCaP、PC-3、DU145细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。
1.3实验试剂
RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、DMSO购自美国Amresco公司；其他试剂为国产分析纯。
1.4实验仪器
ME204E型电子天平，瑞士Mettler Toledo公司；VORTEX-6型高速旋涡混合器，美国奥然公司；5427R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；HVA-110型高压灭菌锅，日本Hirayama公司；MCO175型CO2培养箱，日本Sanyo公司；SW-CJ-1FD型超净工作台，苏州净化设备有限公司；ECLIPSE TS100TS100-F型倒置显微镜，日本Nikon公司；M200 PRO型酶联免疫检测仪，瑞士Tecan公司。
2 实验方法
2.1 细胞培养
人正常前列腺上皮RWPE-1细胞和前列腺癌LNCaP、PC-3和DU145细胞用RPMI 1640培养液培养(另加2.0g/L HEPES、2.0g/L NaHCO3、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和10％胎牛血清)，于孵箱中37℃、5％ CO2饱和湿度下培养。细胞单层长到80％时，用0.25％的胰蛋白酶消化，传代。
2.2本发明化合物不同药物浓度对人正常前列腺上皮细胞生长的影响
取对数期生长的人正常前列腺上皮RWPE-1细胞，调整细胞悬液浓度并以1×105个/mL接种于96孔板中，每孔100μL，四周用PBS液封，于孵箱中37℃、5％CO2饱和湿度下培养12h待细胞贴壁后，更换培养液，将本发明化合物配制成8个浓度梯度(终浓度3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400μg/mL)，每孔加入浓度梯度药物100μL，每个浓度梯度设5个复孔，并设置空白孔(含细胞的培养液+MTT+DMSO)、阳性药物孔(含细胞的培养液+50μg/mL丝裂霉素+MTT+DMSO)及调零孔(培养液+MTT+DMSO)。37℃、5％ CO2饱和湿度下培养24h后加入20μLMTT，继续培养4h后终止培养，取出96孔板小心移走孔内液体，每孔加入DMSO 150mL。置摇床上低速振荡10min后，用酶标仪于490nm处测量各孔的吸光度值(OD490nm)，根据公式：细胞增殖率＝(OD实验组–OD空白组)/(OD对照组–OD空白组)×100％]计算细胞增殖率。
2.3本发明化合物不同药物浓度对前列腺癌细胞生长的影响
取对数期生长的前列腺癌LNCaP、PC-3和DU145细胞，调整细胞悬液浓度并以1×105个/mL接种于96孔板中，每孔100μL，四周用PBS液封，于孵箱中37℃、5％ CO2饱和湿度下培养12h待细胞贴壁后，更换培养液，将本发明化合物配制成8个浓度梯度(终浓度3.125、4.688、6.25、9.375、12.5、18.75、25.0、50.0μg/mL)，每孔加入浓度梯度药物100μL，每个浓度梯度设5个复孔，并设置空白孔(含细胞的培养液+MTT+DMSO)、阳性药物孔(含细胞的培养液+丝裂霉素+MTT+DMSO)及调零孔(培养液+MTT+DMSO)。37℃、5％CO2饱和湿度下培养24h后加入20μL MTT，继续培养4h后终止培养，取出96孔板小心移走孔内液体，每孔加入DMSO150mL。置摇床上低速振荡10min后，用酶标仪于490nm处测量各孔的吸光度值(OD490 nm)，根据公式：细胞抑制率＝(OD对照组–OD实验组)/(OD对照组–OD空白组)×100％计算细胞抑制率。
2.4本发明化合物不同作用时间对前列腺癌细胞生长的影响
取对数期生长的前列腺癌LNCaP、PC-3和DU145细胞，调整细胞悬液浓度并以1×105个/mL接种于96孔板中，每孔100μL，四周用PBS液封，于孵箱中37℃、5％CO2饱和湿度下培养12h待细胞贴壁后，更换培养液，依据“2.3”确定的前列腺癌LNCaP、PC-3和DU145细胞生长的最佳浓度(10.0、25.0、50.0μg/mL)，进行药物作用时间(4、8、12、24、48h)的细胞活性测试，其它实验步骤同“2.3”。
2.5统计学处理
实验结果用均数±标准差表示，在SPSS23.0和GraphPad Prism 6.01软件上进行数据分析；组间比较用T-test，多组间比较用单因素方差分析；P＜0.05被认为组间具有统计学差异。
3实验结果
3.1本发明化合物不同药物浓度对人正常前列腺上皮细胞生长的影响
本发明化合物在3.125～100μg/mL浓度范围内对人正常前列腺上皮RWPE-1细胞具有较强促进增殖活性，其中浓度为50和100μg/mL浓度的本发明化合物明显可促进人正常前列腺上皮RWPE-1细胞增殖活性，与空白对照组比较具有显著性差异(P＜0.05)；当其超过100μg/mL时，则表现出抑制人正常前列腺上皮RWPE-1细胞增殖的活性，当其中浓度为400μg/mL可明显抑制人正常前列腺上皮LNCaP细胞增殖，与空白对照组比较具有显著性差异(P＜0.05)。而丝裂霉素(50μg/mL)表现出很强的抑制人正常前列腺上皮RWPE-1细胞增殖活性，与空白对照组比较具有显著性差异(P＜0.01)(图2)。实验结果表明本发明化合物对人正常前列腺上皮细胞具有非常弱的细胞毒性。
3.2本发明化合物不同药物浓度对前列腺癌细胞生长的影响
本发明化合物对前列腺癌LNCaP、PC-3和DU145细胞有明显的抑制作用，如图3～5所示，本发明化合物在3.125～50μg/mL浓度范围内对LNCaP、PC-3和DU145细胞均具有明显的抑制作用，且呈良好的剂量依赖关系，当其浓度为50μg/mL时，其抑制率高达71.67％、66.50％和77.77％，与空白对照组比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)；经IC50分析软件进行计算其IC50值分别为25.17、28.32和20.00μg/mL；阳性药丝裂霉素(50μg/mL)的抑制率分别为79.71％、77.94％和80.06％。实验结果表明本发明化合物抗前列腺癌效果好，其活性与阳性药接近，但其对正常的前列腺上皮细胞毒副作用小。在后续本发明化合物不同作用时间对前列腺癌细胞生长的影响实验中，我们用12.5、25、50.0μg/mL本发明化合物进行实验。
3.2本发明化合物不同作用时间对前列腺癌细胞生长的影响
由图6～8可见：本发明化合物在不同作用时间(4、8、12、24、48h)点和不同浓度(12.5、25.0、50.0μg/mL)时对前列腺癌LNCaP、PC-3和DU145细胞生长均有抑制作用，与空白对照组比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)；而且同一浓度的化合物物1对LNCaP、PC-3和DU145细胞的生长抑制率随作用时间的延长而提高，与作用4h比较比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。实验表明本发明化合物对前列腺癌细胞的生长抑制作用呈现明显的时间-剂量依赖性；其中50.0μg/mL本发明化合物剂量的抑制前列腺癌细胞增殖活性与阳性药(50.0μg/mL)丝裂霉素接近。
4实验结论
由本发明化合物的抗前列腺癌细胞实验可知：本发明化合物对前列腺癌LNCaP、PC-3和DU145细胞增殖具有明显的抑制作用，而且呈现明显的时间-剂量依赖性；其中50.0μg/mL本发明化合物抑制前列腺癌细胞增殖活性与阳性药(50.0μg/mL)丝裂霉素接近；与丝裂霉素比较，其对人正常前列腺上皮RWPE-1细胞无明显的细胞毒性。
实施例3：本发明化合物对前列腺癌裸鼠原位移植瘤的抑制作用实验
1.实验材料
1.1实验药物
本发明化合物从青钱柳叶中分离制备，实验时用0.5％羧甲基纤维素钠溶液配成相应浓度的本发明化合物溶液，4℃保存备用；阳性药丝裂霉素购于浙江海正药业股份有限公司。
1.2实验细胞株
前列腺癌细胞DU145细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。
1.3实验动物
6周龄SPF级雄性BALB/c裸鼠70只，体质量20～22g，购于北京维通利华实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2022-0001，动物使用许可证号：SCXK(鄂)2022-0061。裸鼠饲养于三峡大学动物实验中心SPF动物房，饲养温度24～26℃，湿度50％～70％，12h/12h明暗交替。本实验由三峡大学动物实验中心伦理委员会审查批准，批准号：CTGUAEWC-2023-028。
1.4实验试剂
RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO)购自美国Amresco公司；台盼蓝购自碧云天生物技术有限公司；0.9％氯化钠注射液购自武汉滨湖双鹤药业有限责任公司；前列腺特异性抗原(PSA)购自上海雅吉生物科技有限公司；TUNEL试剂盒购自美国Roche公司；其他试剂为国产分析纯。
1.5实验仪器
ME204E型电子天平：瑞士Mettler Toledo公司；VORTEX-6型高速旋涡混合器：美国奥然公司；5427R型高速冷冻离心机；德国Eppendorf公司；HVA-110型高压灭菌锅：日本Hirayama公司；MCO175型CO2培养箱，日本Sanyo公司；SW-CJ-1FD型超净工作台：苏州净化设备有限公司；ECLIPSE TS100TS100-F型倒置显微镜、EcliPse Ts2R荧光倒置显微镜：日本Nikon公司；M200 PRO型酶联免疫检测仪，瑞士Tecan公司。
2实验方法
2.1细胞培养
前列腺癌DU145细胞用RPMI 1640培养液培养(另加2.0g/L HEPES、2.0g/LNaHCO3、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和10％胎牛血清)，于孵箱中37℃、5％CO2饱和湿度下培养每3天传代一次。使用0.25％的胰蛋白酶消化传代细胞，选取状态好且处于对数生长期的细胞，消化后1500rpm离心收集细胞沉淀，用PBS重悬细胞，反复3次，最后一次重悬细胞后细胞计数，稀释配置成1.0×108个/mL细胞悬液，使用台盼蓝染色在显微镜下检测活细胞比率大于95％用于后续实验。
2.2造模与分组
实验裸鼠在造模前按3.5mL/g体重腹腔10％水合氯醛麻醉裸鼠，将裸鼠腹部朝上固定于无菌手术台上，切开下腹部显露出腹腔，在10倍显微镜下进行精细操作，找到裸鼠膀胱和生殖腺之后向两侧推开，暴露前列腺，除假手术组外所有裸鼠用微量注射器分别向两侧前列腺侧叶注射DU145细胞悬液10μL，拔出针头后轻压30s；假手术组裸鼠在前列腺同一位置注入等体积的PBS溶液。注射完成后恢复所有移动脏器的位置后缝合裸鼠腹部切口，待裸鼠苏醒后给予正常饲料和无菌饮水。每日观察裸鼠一般情况，1周后部分裸鼠可触及粟粒样大小瘤体，接种2周后，裸鼠皮下可见长径约3mm左右的瘤体，即为裸鼠肿瘤模型构建成功。将全部造模成功的裸鼠按随机数字表法分为模型组、本发明化合物低剂量组、本发明化合物中剂量组、本发明化合物高剂量组和丝裂霉素组，每组10只。
2.3实验给药
根据药理实验中动物与人体间的等效剂量换算及本实验实际情况，本发明化合物低、中、高剂量组裸鼠分别灌胃给予质量浓度为12.5、25.0、50mg/mL的本发明化合物药液，其剂量分别相当于成人等效剂量的0.5倍、1倍、2倍；阳性药组前列腺癌裸鼠腹腔注射给予丝裂霉素2mg/kg，相当于成人等效剂量的2倍；假手术组和模型组裸鼠灌胃给予0.5％羧甲基纤维素钠溶液，灌胃体积均为10mL/kg。1次/d，连续给药3周。
2.4观察指标
1)裸鼠一般情况观察：观察裸鼠造模前后及每日灌胃后的精神状态、活动度、皮肤光泽度、食欲、大小便情况；记录所有组别裸鼠在前列腺癌细胞原位移植造模前和造模治疗期间体重变化。
2)抑瘤率计算：给药第21天，末次灌胃12h(禁食不禁水)后，于无菌环境中摘取各组裸鼠眼球采血备用；采取颈椎脱臼法处死，用剪刀和镊子小心剥离出完整肿瘤包块，滤纸擦拭表面液体，测量瘤体质量，计算抑瘤率。抑瘤率＝(1-药物干预组平均瘤质量/模型组平均瘤质量)×100％。
3)裸鼠血清中PSA检测
取上述各组裸鼠血液样品，室温下静置4h，于4000r/min离心15min，留取上层血清，使用ELISA试剂盒检测裸鼠血清中PSA。鉴定原位移植模型中前列腺癌转移状态及本发明化合物干预对前列腺癌的转移率的影响作用。具体方法参照ELISA试剂盒说明书的步骤进行。
4)前列腺癌裸鼠肿瘤组织形态学观察：随机选取各组裸鼠原位移植瘤组织，用4％多聚甲醛溶液固定原位移植瘤，石蜡包埋，切片5μm，行HE染色后于显微镜下观察。
5)前列腺癌裸鼠肿瘤组织细胞凋亡检测
取肿瘤组织切片经脱蜡后，滴加蛋白酶K(20μg/mL)，室温放置20min，PBS洗涤3次，然后滴加TUNEL反应液(酶液：标记液＝1:9)，37℃孵育1h，PBS洗涤3次后，滴加POD液，37℃再次孵育30min。PBS洗涤3次，DAB显色(90s)，苏木精复染5min，中性树脂封片。在低倍镜下选取细胞均匀分布的视野，然后在高倍镜下随机选取0.04mm2的10个视野计算肿瘤组织中阳性细胞数。
2.5统计学处理
实验结果用均数±标准差表示，在SPSS23.0和GraphPad Prism 6.01软件上进行数据分析；组间比较用T-test，多组间比较用单因素方差分析；P＜0.05被认为组间具有统计学差异。
3实验结果
3.1本发明化合物对前列腺癌裸鼠一般状态的影响
模型组裸鼠精神状态差，活力低下，体型消瘦，皮肤枯槁、褶皱多，食物消耗速度慢，灌胃给药时基本无反抗行为，大小便大致正常；丝裂霉素组和本发明化合物低剂量组裸鼠精神状态一般，活力一般，体型变化小，皮肤干枯，食物消耗速度较慢，灌胃给药时偶有挣扎行为，大小便正常；本发明化合物中剂量组裸鼠精神状态良好，活力可，体型基本无变化，皮肤尚且光滑，食物消耗速度基本如常，灌胃给药时常有挣扎行为，大小便正常；本发明化合物高剂量组裸鼠精神状态佳，活力较强，体型基本无变化，皮肤光滑，食物消耗速度如常，灌胃给药时挣扎剧烈，大小便正常。各组裸鼠间比较，以本发明化合物高剂量组的一般状态最佳，几乎接近假手术组。
3.2本发明化合物对前列腺癌裸鼠体质量的影响
所有裸鼠经历了麻醉后开腹腔和前列腺原位注射手术，在术后两天内裸鼠体质量均有所下降，从第3天开始假手术组裸鼠体重开始显著回升。给药期间，模型组体重下降最多，其次是阳性药丝裂霉素组，本发明化合物组体质量下降得到了明显抑制，其中本发明化合物高剂量组体质量接近假手术组。
3.3本发明化合物对前列腺癌裸鼠抑瘤率的影响
与模型组比较，本发明化合物低、中、高剂量组裸鼠瘤体质量均明显降低，与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)；其抑瘤率分别21.35±2.28％、43.83±3.14％和64.13±3.93％，其中本发明化合物高剂量抑制肿瘤生长效果阳性药丝裂霉素组(69.94±4.97)接近(见图9)。
3.4本发明化合物对前列腺癌裸鼠血清中PSA的影响
本研究中我们检测了前列腺癌血清转移指标PSA，我们发现在模型组中裸鼠血清中PSA浓度非常高，与假手术组比较具有显著性差异(P＜0.01)，这提示在原位注射模型中裸鼠体内前列腺癌发生了明显的转移；而本发明化合物和丝裂霉素治疗组PSA浓度显著下降，与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)，这表明本发明化合物能够有效的抑制原位前列腺癌的全身性转移(见图10)。
3.5本发明化合物对对前列腺癌裸鼠原位移植瘤组织形态学的影响
模型组裸鼠原位移植瘤组织细胞分布稀疏、排列紊乱，空泡及透明样改变多，形态不规则，核大、核深染，可见核分裂象，间质少；本发明化合物低剂量组裸鼠原位移植瘤组织细胞分布呈集中趋势，排列分散，空泡及透明样改变减少，形态大小不一，细胞核可见变形或碎裂；化合物2中剂量组裸鼠原位移植瘤组织细胞排列紧密，空泡及透明样改变明显减少，核分裂现象减少，部分融合呈液化坏死；本发明化合物高剂量组裸鼠原位移植瘤组织结构细胞与丝裂霉素组分布、排列相似，坏死区域广，核仁体积小，可见大量细胞崩解、结构消失(见图11)。
3.6本发明化合物对前列腺癌裸鼠原位移植瘤组织细胞凋亡的影响
由图12可见，凋亡细胞主要表现为细胞核固缩成均一致密物，呈棕黄色。模型组阳性反应区域较少，多呈蓝色；用本发明化合物(12.5、25.0和50mg/kg)和丝裂霉素治疗后，可见凋亡细胞明显增多，且随着本发明化合物剂量的增加，其作用效果更为明显。经统计分析发现本发明化合物(12.5、25.0和50mg/kg)和丝裂霉素对前列腺癌裸鼠原位移植瘤细胞凋亡率分别为8.31±0.95％、27.76±2.57％、46.62±4.41％和50.20±4.98％，与模型组(6.67±0.81％)％比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)；且随本发明化合物剂量的增加，其作用效果更为明显(见图13)。实验结果表明本发明化合物可通过诱导细胞凋亡来抑制前列腺癌裸鼠原位移植瘤的生长。
4实验结论
由本发明化合物对前列腺癌裸鼠原位细胞移植瘤的抑制作用实验可知：本发明化合物对前列腺癌裸鼠原位移植瘤的生长具有显著抑制作用，可促进肿瘤组织细胞凋亡和抑制原位前列腺癌向全身性转移，其中50.0mg/mL本发明化合物对原位移植瘤细胞的生长和迁移抑制作用及促进肿瘤细胞凋亡活性与阳性药丝裂霉素(50.0μg/mL)接近。
经药理实验发现：在本发明化合物在抗前列腺癌细胞实验中，其对前列腺癌LNCaP、PC-3和DU145细胞的增殖具有明显的抑制作用，对人正常前列腺上皮RWPE-1细胞无明显的细胞毒性；在本发明化合物对前列腺癌裸鼠原位移植瘤的抑制作用实验中，其对前列腺癌裸鼠原位移植瘤的生长具有显著抑制作用，可促进肿瘤组织细胞凋亡和抑制原位前列腺癌的全身性转移。
综上所述，本发明化合物对于前列腺癌具有明显的治疗作用，有望开发成为新的抗前列腺癌天然药物。

Claims (8)

1.一种吡喃糖苷类化合物，其特征在于，分子式为C35H58O9，其结构式如下：
命名为：(23E)-(12R,20S)-12,20,25-三羟基-3,4-三羟甲基-4(28),23-二烯-3-酸12-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。
2.权利要求1所述化合物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将青钱柳叶加碱溶液进行浸泡，过滤、洗涤后晾干；
S2、晾干的青钱柳叶用醇水溶液加热回流提取，后经过滤、减压浓缩成浸膏a；
S3、将浸膏a加水混悬，用二氯甲烷萃取，回收溶剂，收集馏分，减压浓缩成浸膏b；
S4、将浸膏b加醇溶解，上凝胶柱，用醇的水溶液洗脱，合并洗脱液，减压浓缩，即得吡喃糖苷类化合物。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于：S1中的碱溶液为氢氧化钠溶液，pH为10～15。
4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于：S2中的醇水溶液为体积百分数90～95％的乙醇水溶液。
5.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于：S4中的醇为甲醇，醇的水溶液为甲醇的水溶液。
6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于：甲醇的水溶液体积百分数浓度为70～90％。
7.权利要求1所述的吡喃糖苷类化合物在制备抗前列腺癌药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述抗前列腺癌药物为液体制剂、固体制剂、喷剂或者气雾剂或其他药学上可接受的剂型。
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