CN109125458A - 橘叶提取物在制备治疗/预防自身免疫性睾丸炎药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了橘叶提取物在制备治疗/预防自身免疫性睾丸炎药物中的应用。以我国资源丰富的柑橘的叶为原料，经乙醇冷浸提取得到的橘叶乙醇浸膏，后经大孔树脂洗脱，合并乙醇及丙酮洗脱部位浓缩物，将其分散于水中，依次用环己烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取后浓缩。经药理实验表明，橘叶提取物具有抗自身免疫性睾丸炎作用，可开发成治疗/预防自身免疫性睾丸炎药物。

Description

橘叶提取物在制备治疗/预防自身免疫性睾丸炎药物中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及橘叶提取物在制备自身免疫性睾丸炎药物中的应用。
背景技术
不育已成为全球性的医学和社会问题，目前，全世界约有15%的育龄夫妇罹患不育症，其中由男性因素造成的不育约占50%。随着平均生育年龄的推迟及二胎政策的全面放开，我国的不育问题日益凸显。根据2012年中国人口协会和国家计生委联名发布的《中国不孕不育现状调研报告》显示，中国育龄人口的不孕不育率从20年前的2.5%-3%攀升到12.5%-15%，患者人数已经超过4000万，即每8对夫妇中就有1对有不孕不育问题，其中有一定比例是由男方因素造成。
自身免疫性睾丸炎（autoimmune orchitis, AO）是导致男性不育的重要原因之一。近年的研究发现，在男性不育症患者中，睾丸的免疫损伤普遍存在，微生物感染、组织损伤、隐睾、输精管结扎或切除等都可引起免疫性睾丸炎。当睾丸发生炎症性病变时，白介素-1（IL-1）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等主要的细胞因子分泌增加，影响精子发生和雄性激素分泌。高浓度IL-lα可抑制睾丸间质中的Leydig细胞合成睾酮，由此导致的雄激素不足缺乏可行的睾酮替代疗法。IL-1β在正常的睾丸中浓度较低，但在发生炎症反应时表达迅速上升，损伤精子发生。低水平的TNF-α能够在生理条件下保护生精细胞，减少调亡的发生，而在炎症环境下，高水平的TNF-α则会直接诱导生精细胞的凋亡，破坏由支持细胞（Sertolicell, SC）形成的血-睾屏障（Blood-testis barrier, BTB），使受其保护的隐蔽抗原暴露，产生抗精子抗体，致使精子发生障碍，进而影响男性生育功能。对睾丸炎导致的睾丸功能受损目前尚无直接改善精液质量的有效疗法，只能考虑辅助生殖技术。因此，寻找和开发出安全有效的抗AO的药物是治疗男性不育的可行途径之一。然而，目前还未发现合适的，可有效治疗属于慢性炎症的AO的药物。
橘叶为芸香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus L.）植物橘（Citrus reticulataBlanco）及其栽培变种的叶。我国柑橘资源丰富，被誉为“世界柑橘资源库”，包括浙江、福建、湖南、四川、广西和云南等19个省（市、自治区）生产柑橘，其栽培面积已位居全球之冠。2016年，全国的柑橘栽培面积为255.67万公顷，为同期世界柑橘栽培面积的29.02%。橘叶性平，味苦、辛，无毒，归肝经，具有疏肝解郁、化痰散结、行气止痛的功效，未见橘叶抗AO的现代药理学研究报道，其活性部位也不明确。我们在研究过程中，意外的发现橘叶提取物具有良好的抗AO作用。
发明内容
本发明的目的在于提供橘叶提取物在制备治疗/预防自身免疫性睾丸炎药物中的应用。
本发明的目的是这样实现的：
橘叶提取物在制备治疗/预防自身免疫性睾丸炎药物中的应用。
橘叶提取物的制备方法为：
（1）乙醇提取：橘叶干燥样品粉碎，用质量浓度为80-90%的乙醇冷浸提取3-6次，每次用量为橘叶干燥样品的质量体积（kg/L）5-15倍，每次1-7天。减压浓缩提取液至无醇味得乙醇提取浸膏，乙醇提取浸膏减压浓缩蒸干得乙醇提取物；
（2）大孔树脂洗脱：乙醇提取浸膏加水稀释后过D101大孔树脂，依次用重蒸水、乙醇及丙酮洗脱，乙醇及丙酮洗脱部位浓缩后合并；
（3）萃取浓缩：将合并的浓缩物加水混悬，依次用环己烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取,每种溶剂萃取3-6次，萃取液浓缩后分别得环己烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位。
橘叶提取物为步骤（1）中所述的乙醇提取物、步骤（3）中所述的乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位。
步骤（1）中所述的乙醇质量浓度为80-90%，冷浸提取3-6次，每次1-7天；步骤（2）中所述的稀释用水用量为乙醇提取浸膏（A）的1-2倍体积，D101大孔树脂用量为乙醇提取浸膏（A）的8-15倍体积，洗脱重蒸水、乙醇及丙酮的用量分别为2-5倍柱体积，乙醇质量浓度为90-100%；步骤（3）中所述的混悬用水用量为乙醇提取浸膏（A）的1-3倍，每次萃取时，环己烷、乙酸乙酯及正丁醇用量为的水相体积的1/6-1/2。
橘叶提取物的剂量为每日1-2次，每次5-10 g。
优选剂量为每日1次，每次10 g。
一种橘叶提取物的制剂，为橘叶提取物中加入药学上可接受的辅料制备成片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、丸剂、颗粒剂。
一种药物组合物，包含橘叶提取物作为活性成分或者是药用载体。
本发明优点：
本发明的优点和积极效果在于，通过生物学研究发现，橘叶乙醇提取物及正丁醇部位对实验性自身免疫性睾丸炎小鼠血清中炎症因子IL-1β释放有显著的抑制作用，对TNF-α释放有一定抑制；乙酸乙酯部位及水部位对IL-1β释放抑制较明显，对TNF-α释放则未显示明显活性。提示橘叶提取物具有开发新的抗AO药物的前景，有利于提高橘叶的利用价值。
附图说明
图1为HE 染色观察橘叶乙醇提取部位（C）和正丁醇部位（F）对EAO小鼠睾丸组织病理学改变。
图2为HE 染色观察橘叶不同提取部位对EAO小鼠睾丸组织病理学改变。
编号A、B、D、E、G依次分别为：空白组、模型组、环己烷部位、乙酸乙酯部位和水部位。
图3为橘叶不同提取部位对EAO小鼠血清炎症因子IL-1β的作用。
与空白组比较，* P <0.05，** P <0.01；与模型组比较，# P <0.05，## P <0.01。
编号A~G依次分别为：空白组、模型组、乙醇提取物、环己烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。
图4为橘叶不同提取部位对EAO小鼠血清炎症因子TNF-α的作用。
与空白组比较，* P <0.05，** P <0.01；与模型组比较，# P <0.05，## P <0.01。
编号A~G依次分别为：空白组、模型组、乙醇提取物、环己烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。
具体实施方式
本发明提供了橘叶提取物在制备治疗/预防自身免疫性睾丸炎药物中的应用。
橘叶提取物的制备方法为：
（1）乙醇提取：橘叶干燥样品粉碎，用质量浓度为80-90%的乙醇冷浸提取3-6次，每次用量为橘叶干燥样品的质量体积（kg/L）5-15倍，每次1-7天。减压浓缩提取液至无醇味得乙醇提取浸膏，乙醇提取浸膏减压浓缩蒸干得乙醇提取物；
（2）大孔树脂洗脱：乙醇提取浸膏加水稀释后过D101大孔树脂，依次用重蒸水、乙醇及丙酮洗脱，乙醇及丙酮洗脱部位浓缩后合并；
（3）萃取浓缩：将合并的浓缩物加水混悬，依次用环己烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取,每种溶剂萃取3-6次，萃取液浓缩后分别得环己烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位。
橘叶提取物为步骤（1）中所述的乙醇提取物、步骤（3）中所述的乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位。
步骤（1）中所述的乙醇质量浓度为80-90%，冷浸提取3-6次，每次1-7天；步骤（2）中所述的稀释用水用量为乙醇提取浸膏（A）的1-2倍体积，D101大孔树脂用量为乙醇提取浸膏（A）的8-15倍体积，洗脱重蒸水、乙醇及丙酮的用量分别为2-5倍柱体积，乙醇质量浓度为90-100%；步骤（3）中所述的混悬用水用量为乙醇提取浸膏（A）的1-3倍，每次萃取时，环己烷、乙酸乙酯及正丁醇用量为的水相体积的1/6-1/2。
橘叶提取物的剂量为每日1-2次，每次5-10 g。
优选剂量为每日1次，每次10 g。
一种橘叶提取物的制剂，为橘叶提取物中加入药学上可接受的辅料制备成片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、丸剂、颗粒剂。
一种药物组合物，包含橘叶提取物作为活性成分或者是药用载体。
下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换，均属于本发明的保护范围。
实施例1
橘叶提取物的制备
（1）橘叶干燥样品17 kg粉碎，用85％的乙醇85 L冷浸提取5次，减压浓缩至无醇味得浸膏（A）5.58 L,将浸膏（A）于60 °C水浴锅上加热搅匀，取100 mL浸膏减压浓缩蒸干得乙醇提取物（C）43.5 g，5.58 L浸膏折合得乙醇提取物（C）2.43 kg。
（2）乙醇提取浸膏（A）加水稀释后过D101大孔树脂，依次用重蒸水、95%工业乙醇及丙酮洗脱，减压浓缩回收95%工业乙醇及丙酮洗脱部位，将浓缩物点TLC板对照后合并得到（B）。
（3）浓缩物（B）加水混悬，依次用环己烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取5次，分别得环己烷部位（D）166.68 g、乙酸乙酯部位（E）93.75 g、正丁醇部位（F）195 g及水部位（G）984.1g。
实施例2
方法同实施例1，不同的地方是步骤（1）中乙醇质量浓度、每次提取乙醇用量，冷浸提取次数、每次冷浸提取时间；步骤（2）中水和D101大孔树脂用量，洗脱重蒸水、乙醇及丙酮的用量，乙醇质量浓度；步骤（3）中混悬用水用量，环己烷、乙酸乙酯及正丁醇用量、每种溶剂萃取次数；相应得到的提取物的质量也不同。详细数据见表1：
表1橘叶提取物的制备
实施例3
橘叶不同提取物对冰醋酸诱导的小鼠EAO模型的药效观察
1.试验方法
1.1 实验用药
橘叶提取物由本发明实施例1得到。
1.2 实验动物分组和建立模型
通过文献查阅未找到合适的阳性对照药，故本次实验未设阳性药组。健康成年雄性小鼠随机分为生理盐水组、模型组及橘叶不同提取物组 (10只/组)。空白组不进行手术，其余各组小鼠称重、4%水合氯醛按0.2 mL/10 g腹腔注射，麻醉小鼠，取仰卧位固定，将小鼠左侧睾丸赶到阴囊处，微量注射器向左侧睾丸内注射100 mL/L (10%)冰醋酸0.03 mL，所有小鼠同等条件下饲养。存活的手术后的小鼠随机分为模型组和药物组。药物组按照设定药物浓度灌胃给药，空白组和模型组小鼠给等量生理盐水，共给药21 d。
1.3 标本采集及HE染色观察睾丸组织病理学改变
距第1次免疫 21 d，小鼠麻醉后颈椎脱曰法处死。取右侧睾丸称重后，去除包膜修剪睾丸入Bouin液固定24 h，常规石蜡包埋，4 μm切片；常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明；浸石蜡、包埋修蜡块和切片；切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗；苏木素染色，自来水冲洗；盐酸乙醇分化30 s (注意操作速度要快)；自来水浸泡15 min或温水约50 °C 5 min；置伊红液2 min，自来水冲洗；常规脱水，透明，中性树脂封片。光镜下观察睾丸炎组织病理形态变化。
1.4 ELISA法测血清炎症因子IL-1β和TNF-α浓度
给药结束后眼球取血，室温下放置2 h后10000 rpm离心10 min，取血清-20 °C保存。根据ELISA试剂盒操作说明书进行操作。TMB显色，每步间均需要混匀、温育、洗版；终止液终止后，酶标仪测OD值，根据标准曲线测各组血清炎症因子IL-1β和TNF-α浓度。采用SPSS20.0软件包单因素方差分析和t检验，数据结果用Meanvaule±SEM表示，P< 0. 05差界有统计学意义。
试验结果
通过文献查阅未找到合适的阳性对照药，故未设阳性药组。
2.1 HE染色观察小鼠睾丸组织病理变化
空白组（A）小鼠睾丸生精小管分布均匀，无生精细胞脱落，各级生精细胞排列整齐，核大圆，偏位，层次清楚，管腔中可见大量精子。模型组（B）小鼠睾丸生精小管显示明显地退行性变，周围向中心部逐渐加重，生精小管管壁生精细胞层次减少，排列紊乱，基本无精子存在，有的生精小管可见细胞变性，生精细胞脱落。与对照组相比，橘叶乙醇提取物（C，图1）、正丁醇部位（F）和水部位（G）给药后能明显改善睾丸组织病变，减轻炎症反应，其它给药组治疗效果不明显 (见图2)。
2.2 ELISA法测EAO小鼠血清中炎症因子IL-1β及TNF-α水平
ELISA法测EAO小鼠血清中炎症因子IL-1β及TNF-α水平，实验结果见 (表二)。
结合睾丸炎小鼠血清炎症因子IL-1β及TNF-α分析，模型组中炎症因子较空白组显著升高（P＜0.01），表明我们的睾丸炎模型建立成功。橘叶样品中，橘叶乙醇提取物及正丁醇部位对EAO小鼠血清中炎症因子IL-1β释放有显著的抑制作用，对TNF-α释放有一定抑制；乙酸乙酯部位及水部位对IL-1β释放抑制较明显，对TNF-α释放则未显示明显活性，乙酸乙酯部位及正丁醇部位抗炎效果较好，其中很可能含抗炎活性强的化合物。
结合睾丸炎小鼠血清炎症因子IL-1β及TNF-α分析，模型组中炎症因子较空白组显著升高（P＜0.01），表明我们的睾丸炎模型建立成功。实验结果的数值见表二；图3为橘叶不同提取部位对EAO小鼠血清炎症因子IL-1β的作用；图4为橘叶不同提取部位对EAO小鼠血清炎症因子TNF-α的作用。橘叶样品中，乙醇提取物（C）和乙酸乙酯部位（D）能显著的降低炎症因子抗炎效果较好，其中很可能为发挥抗炎作用的主要部位。
表二 橘叶各组分对小鼠EAO血清IL-1β及TNF-α抑制作用
药物 剂量 (g/ kg·d) IL-1β (pg/mL) TNF-α (pg/mL)
空白组 生理盐水 36.7±6.06 35.2±9.42
模型组 生理盐水 75.4±8.69 75.6±11.57
乙醇提取物 1.136 45.5±6.74<sup>**</sup> 52.4±15.97<sup>*</sup>
环己烷部位 0.0784 81.8±9.04 62.3±14.08
乙酸乙酯部位 0.0440 49.7 ±7.05<sup>**</sup> 66.2±11.66
正丁醇部位 0.0880 43.9±6.62<sup>**</sup> 51.2±9.44<sup>**</sup>
水部位 0.4632 45.1±6.71<sup>**</sup> 63.4±12.65
注：与空白组比较 P&lt;0.05 *, P&lt;0.01 **
结论：橘叶乙醇提取物（C）和乙酸乙酯部位（D）和水部位（E）具有抗自身免疫性睾丸炎作用。
以实施例2制备得到的橘叶乙醇提取物（C）和乙酸乙酯部位（D）和水部位（E）进行试验，试验方法同实施例3，结果表明，本发明所述的橘叶提取物是安全的，具有抗自身免疫性睾丸炎作用，可开发成治疗/预防自身免疫性睾丸炎药物。剂量为：产品的剂量为每日1-2次，每次5-10 g。剂量最优为每日1次，每次10 g。

Claims (8)

1.一种橘叶提取物的应用，其特征在于所述的橘叶提取物在制备治疗/预防自身免疫性睾丸炎药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是所述的橘叶提取物的制备方法为：
（1）乙醇提取：橘叶干燥样品粉碎，用质量浓度为80-90%的乙醇冷浸提取3-6次，每次用量为橘叶干燥样品的质量体积（kg/L）5-15倍，每次1-7天；减压浓缩提取液至无醇味得乙醇提取浸膏（A），乙醇提取浸膏（A）减压浓缩蒸干得乙醇提取物（C）；
（2）大孔树脂洗脱：乙醇提取浸膏（A）加水稀释后过D101大孔树脂，依次用重蒸水、乙醇及丙酮洗脱，乙醇及丙酮洗脱部位浓缩后合并得到（B）；
（3）萃取浓缩：将合并的浓缩物（B）加水混悬，依次用环己烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取,每种溶剂萃取3-6次，萃取液浓缩蒸干分别得环己烷部位（D）、乙酸乙酯部位（E）、正丁醇部位（F）及水部位（G）。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的橘叶提取物为步骤（1）中所述的乙醇提取物（C）、步骤（3）中所述的乙酸乙酯部位（E）、正丁醇部位（F）及水部位（G）。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于步骤（1）中所述的乙醇质量浓度为80-90%，冷浸提取3-6次，每次1-7天；步骤（2）中所述的稀释用水用量为乙醇提取浸膏（A）的1-2倍体积，D101大孔树脂用量为乙醇提取浸膏（A）的8-15倍体积，洗脱重蒸水、乙醇及丙酮的用量分别为2-5倍柱体积，乙醇质量浓度为90-100%；步骤（3）中所述的混悬用水用量为乙醇提取浸膏（A）的1-3倍，每次萃取时，环己烷、乙酸乙酯及正丁醇用量为的水相体积的1/6-1/2。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的橘叶提取物的剂量为每日1-2次，每次5-10 g。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的橘叶提取物的剂量为每日1次，每次10 g。
7.一种权利要求1-6任一所述的橘叶提取物的制剂，其特征在于所述的橘叶提取物中加入药学上可接受的辅料制备成片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、丸剂、颗粒剂。
8.一种药物组合物，其特征是包含权利要求1-6所述的橘叶提取物作为活性成分或者是药用载体。
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CN111035646A (zh) * 2020-01-13 2020-04-21 云南中医药大学 柠檬苦素在制备治疗预防自身免疫性睾丸炎药物中的应用
CN111135163A (zh) * 2020-01-13 2020-05-12 云南中医药大学 多甲氧基黄酮类化合物在制备治疗预防自身免疫性睾丸炎药物中的应用

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