CN115068519B - 女贞子黄酮提取物在制备少弱精症治疗药物中的应用 - Google Patents

Abstract

女贞子黄酮提取物在制备少弱精症治疗药物中的应用，涉及生殖医学技术领域。本发明中，女贞子黄酮提取物的功能包括：(a)提高少弱精症小鼠模型附睾脏器重量；(b)提高少弱精症小鼠模型精子质量；(c)提高少弱精症小鼠模型血清中睾酮水平；(d)降低少弱精症小鼠模型血清中促卵泡激素和促黄体生成激素水平；(e)提高少弱精症小鼠模型睾丸组织中SOD水平；(f)降低少弱精症小鼠模型睾丸组织中MDA水平。本发明利用腺嘌呤构建了少弱精症小鼠模型，研究了女贞子黄酮提取物对少弱精症小鼠模型的具体作用机制，为女贞子黄酮提取物治疗少弱精症机制的研究奠定了一定基础，为临床运用女贞子黄酮提取物治疗少弱精症提供了理论依据。

Description

女贞子黄酮提取物在制备少弱精症治疗药物中的应用

技术领域

本发明涉及生殖医学技术领域，具体涉及女贞子黄酮提取物在制备少弱精症治疗药物中的应用。

背景技术

男性不育症因其发病率高和疗效欠佳，受到越来越多的关注，是生殖医学领域里的研究热点问题。据世界卫生组织统计，全球不孕不育夫妇约占育龄夫妇的8％(EstevesSC,Hamada A,Kondray V,et al.What every gynecologist should know about maleinfertility:An update[J].Archives of Gynecology and Obstetrics,2012,286(1):217-229.)，男性因素导致的不育约占50％(王田园，肖晓素，郑宝，等.男性不育的遗传病因研究[J].中国优生与遗传杂志，2018,26(2):105-107,95)。

男性不育症受多种疾病和多种因素的影响，其中精子浓度降低(少精症)、活力减弱(弱精症)是常见因素，二者可合并出现，统称为少弱精症。男性不育症的病因学研究发展缓慢，发病因素与发病机制尚不完全明确，大多数表现为精子质量异常(Anton L,PriskornL,Nordkap L,et al.Bone mineral density is preserved inmenwithidiopathicinfertility.Andrology,2019,2:12688-12688.)。另外，有研究显示，生精细胞凋亡调控失衡可能是导致男性不育的重要原因之一(Baccetti B,Collodel G,Piomboni P.Apoptosisinhuman ejaculated sperms cells(notulae seminologicae 9)[J].J SubmicroscCytol Pathol,1996,28(4):587-596.)。

腺嘌呤被证实有损伤生殖功能的作用，可用于构建肾虚型少弱精症模型，且该模型广泛使用，深受科研工作者的认可(孙筱婷，刘宣，李琦.肾虚证动物模型研究概况[J].中华中医药杂志，2017,32(2):659-662.)。腺嘌呤构建的少弱精症模型原理可能与自由基的大量生成有关。腺嘌呤可通过黄嘌呤氧化酶反应产生大量的自由基，进而损伤性腺，导致生精功能障碍(王胜超，李本科，阚玉璇，等.杜仲补天素胶囊剂对腺嘌呤诱导的雄性大鼠生殖功能损伤的影响[J].中华男科学杂志，2020,26(1):63-73.)。此外，腺嘌呤还能通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统改变睾丸组织的血液循环，睾酮合成会减少(张盼盼，刘凤霞，阿地力江·伊明.少弱精症动物模型建立的研究进展[J].新疆医科大学学报，2014,37(8):974-976+980.)。

“肾藏精，主生殖”是对男性生殖功能的核心概括，中医将男性生殖能力的强弱归结于肾气的盛衰、肾精的盈亏，临床上治疗男性不育症以补肾填精法为核心治疗原则(马凰富，王彬，党进，等.李海松治疗男性不育症临床思路[J].中华中医药杂志，2016,31(8):3082-3084.)(2016,31(8):3082-3084.管斯琪，祝雨田，王彬，等.广嗣育麟汤对雷公藤多苷诱导的生精障碍大鼠模型生精功能改善的研究[J].中国性科学，2019,28(5):126-131.)。

女贞子是木犀科植物女贞(Ligustrum lucidum Ait)的干燥成熟果实，具有疏肝补气、滋补肝肾等功效。目前从女贞子中可分离到的化合物主要有三萜类、苯乙烯醇类、黄酮类以及环烯醚萜类等成分。其中，女贞子黄酮类化合物包括芹菜素、大波斯菊苷、芹菜素-7-O-乙酰-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-芦丁糖苷、木樨草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素等(徐小花，杨念云，钱士辉，等.女贞子黄酮类化合物的研究[J].中药材,2007,30(5):538-540.)。

截至目前，女贞子中的黄酮类化合物是否对生殖系统有治疗效果，尚未见相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种女贞子黄酮提取物在制备少弱精症治疗药物中的应用。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的女贞子黄酮提取物在制备少弱精症治疗药物中的应用。

作为优选的实施方式，所述女贞子黄酮提取物的制备方法如下：

向AB-8大孔树脂中加入95％乙醇，浸泡24h后水洗至中性，加入2％盐酸，浸泡4h后水洗至中性，加入2％氢氧化钠，浸泡4h后水洗至中性，加入层析柱中，蒸馏水流速11mL/min，压柱12h，按60％乙醇与女贞子的液料比30:1mL/g向女贞子中加入60％乙醇，45℃超声提取30min，超声功率为100W，加入2倍体积蒸馏水进行装柱，去色素，加入60％乙醇洗出黄酮提取物，滤液进行浓缩冻干，测定黄酮含量。

作为优选的实施方式，所述黄酮含量为(1.24±0.05)mg/g。

作为优选的实施方式，所述女贞子黄酮提取物的使用剂量为100-300mg/kg。

作为优选的实施方式，所述女贞子黄酮提取物的使用剂量为300mg/kg。

作为优选的实施方式，所述女贞子黄酮提取物的功能包括：

(a)提高少弱精症小鼠模型附睾脏器重量；

(b)提高少弱精症小鼠模型精子质量；

(c)提高少弱精症小鼠模型血清中睾酮水平；

(d)降低少弱精症小鼠模型血清中促卵泡激素和促黄体生成激素水平；

(e)提高少弱精症小鼠模型睾丸组织中SOD水平；

(f)降低少弱精症小鼠模型睾丸组织中MDA水平。

本发明的有益效果是：

本发明以女贞子为原料，提取了黄酮成分，将其给予腺嘌呤所致的少弱精症小鼠模型。实验结果提示，女贞子黄酮提取物可明显改善少弱精症小鼠睾丸组织形态，提高精子活力和数量，显著改善精子的运动能力，促进性腺轴功能恢复。

本发明利用腺嘌呤构建了少弱精症小鼠模型，研究了女贞子黄酮提取物对少弱精症小鼠模型的具体作用机制，为女贞子黄酮提取物治疗少弱精症机制的研究奠定了一定基础，为临床运用女贞子黄酮提取物治疗少弱精症提供了理论依据。

附图说明

图1为各组小鼠睾丸组织形态学检查(HE，200×)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1材料与方法

1.1试剂和仪器

AB-8大孔树脂(上海源叶生物科技有限公司)；芦丁标准品(Sigma)；ELISA睾酮测定试剂盒(北京博奥拓达科技有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和BCA蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所)；其余试剂均为化学纯。

SynergyH1M酶标仪(美国BioTek)；EV311旋转蒸发仪(北京莱伯泰科仪器股份有限公司)；Freezone2.5冷冻干燥机(美国Labconco)；SCA-H-01P精液分析自动检测系统(西班牙SCA)；T10组织分散机(德国IKA公司)；BS224S-CW电子分析天平(德国赛多利斯科技仪器)；EG1150生物组织包埋机(德国Leica)；RM2245病理切片机(德国Leica)。

1.2实验动物

1月龄ICR雄性小鼠购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司(合格证号：SCXK(吉)-2018-0007)，动物带回实验室后继续饲养至8月龄。

饲料购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司(许可证号：SCXK(吉)-2018-01092)；饲养条件：温度18～22℃，湿度45～65％，12h明暗交替。

1.3女贞子黄酮的提取、纯化及含量测定

向AB-8大孔树脂中加入95％乙醇，浸泡24h后水洗至中性，加入2％盐酸，浸泡4h后水洗至中性，加入2％氢氧化钠，浸泡4h后水洗至中性，加入层析柱中，蒸馏水流速11mL/min，压柱12h，按照60％乙醇与女贞子的液料比(30:1mL/g)向女贞子中加入60％乙醇，45℃超声提取30min，超声功率为100W，加入2倍体积蒸馏水进行装柱，去色素，随后加入60％乙醇洗出黄酮提取物，滤液进行浓缩冻干，采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定纯化后的女贞子黄酮含量。

1.4动物分组及给药

60只ICR雄性小鼠，按体质量随机分为对照组、模型组、阳性对照组、黄酮低剂量组、黄酮中剂量组和黄酮高剂量组。对照组给予相同剂量的0.5％羧甲基纤维素钠灌胃，其余各组均每天给予250mg/kg腺嘌呤悬溶液经口灌胃(用0.5％羧甲基纤维素钠配成腺嘌呤悬溶液)，连续灌胃20d。黄酮低剂量组、黄酮中剂量组和黄酮高剂量组每天分别给予女贞子黄酮提取物溶液灌胃(剂量分别为100、200和300mg/kg)，阳性对照组每天给予10mg/kg甲睾酮水溶液灌胃，连续灌胃20d。

小鼠给予腺嘌呤后，饮食减少，形体消瘦，随着给药时间的延长，小鼠的症状逐渐加重，表现为精神萎靡、反应迟钝、懒动喜卧、掉毛等现象增多，同时，小鼠还出现了弓背蜷缩、大便稀溏等现象，提示模型复制较为成功。建模20d时，肾脏损伤已经不可逆，且持续加重，束缚时小鼠放弃挣扎，生殖脏器质量下降，精子活力及浓度均低于对照组，差异明显，提示生殖脏器发育不良，可能会进一步影响内分泌，从而影响生殖机能，造成损伤，出现少弱精症。

1.5精子密度和精子活率测定

终末给药后24h处死小鼠，剪开腹壁暴露生殖系统，摘取双侧睾丸和附睾组织，在含有37℃恒温箱中预热的生理盐水表面皿中洗净、滤纸吸干水分并称重，按照公式计算脏器系数(脏器系数/％＝脏器质量/小鼠终末体质量×100)。右侧睾丸放入4％多聚甲醛固定，左侧睾丸制成匀浆，以3000rpm离心10min，取上清液，置于-80度冰箱保存，用于睾酮水平和氧化损伤指标测定。附睾组织迅速置入1mL、37℃孵育的生理盐水，轻轻剪开附睾尾，37℃恒温箱中孵育10min，擦镜纸过滤，取10μL加入精子计数板，于光镜下观察并拍照，遵循记头不记尾原则，SCA软件自动统计精子密度及活力参数。

1.6睾酮、促卵泡激素、促黄体生成激素、MDA和SOD水平的测定

取-80度冰箱保存的左侧睾丸上清液并严格按照试剂盒说明书测定睾丸组织中的MDA和SOD水平。取全血，3000rpm离心10min，取上清，按照试剂盒说明书测定血清中睾酮(T)、促卵泡激素(FSH)、促黄体生成激素(LH)水平。

1.7小鼠睾丸组织形态学观察

取小鼠睾丸石蜡切片，HE染色，光镜下观察睾丸组织内精原细胞和各级生精细胞的分布情况。

1.8统计学处理

SPSS16.0软件进行数据处理，所有数据均用均数±标准差表示，各组间均数比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，组间两两比较采用最小显著差法(LSD)检验，检验水准α＝0.05。

2结果

2.1女贞子黄酮含量测定

亚硝酸钠-硝酸铝法测定纯化后的女贞子黄酮含量为(1.24±0.05)mg/g，女贞子黄酮提取物外观呈黄褐色，冻干后为蓬松的细粉末。

2.2女贞子黄酮对各组小鼠睾丸和附睾脏器系数的影响

由表1可知，与对照组比较，模型组小鼠附睾脏器系数显著降低(p<0.05)。与模型组比较，阳性对照组、黄酮各剂量组小鼠附睾脏器系数显著升高(p<0.05)。阳性对照组小鼠睾丸脏器系数显著高于模型组(p<0.05)。

表1女贞子黄酮对各组小鼠睾丸和附睾脏器系数的影响(n＝6，)

表中，与对照组比较，*p<0.05；与模型组比较，^#p<0.05；与阳性对照组比较，^$p<0.05；与黄酮低剂量组比较，

2.3女贞子黄酮对各组小鼠精子活力参数的影响

由表2可知，与对照组比较，模型组小鼠附睾中，前向运动精子浓度显著降低，非前向运动和不活动精子浓度显著升高(p<0.05)。与模型组比较，黄酮高剂量组小鼠附睾中前向运动精子浓度显著升高，非前向运动和不活动精子浓度显著降低(p<0.05)。

表2女贞子黄酮对各组小鼠精子活力参数的影响(n＝6，)

表中，与对照组比较，*p<0.05；与模型组比较，^#p<0.05。

2.4女贞子黄酮对各组小鼠精子运动学参数的影响

由表3可知，与对照组比较，模型组小鼠精子曲线速度(VCL)和直线速度(VSL)等各项运动学参数显著降低(p<0.05)。阳性对照组小鼠精子的VCL显著高于模型组(p<0.05)。黄酮中剂量组小鼠精子的VSL、平均速度(VAP)、直线指数(STR)、头部侧向运动平均振幅(ALH)和鞭打频率(BCF)显著高于模型组(p<0.05)。黄酮高剂量组小鼠精子的VCL、VSL、VAP、线性指数(LIN)、STR、ALH和BCF显著高于模型组。黄酮高剂量组小鼠精子的VCL显著高于黄酮低剂量组和黄酮中剂量组(p<0.05)。

表3女贞子黄酮对各组小鼠运动学参数的影响(n＝6，)

表中，与对照组比较，*p<0.05；与模型组比较，^#p<0.05；与阳性对照组比较，^$p<0.05；与黄酮低剂量组比较，与黄酮中剂量组比较，^■p<0.05。VCL：曲线速度；VSL：直线速度；VAP：平均速度；LIN：线性指数；STR：直线指数；WOB：振动指数；ALH：头部侧向运动平均振幅；BCF：鞭打频率。

2.5女贞子黄酮对各组小鼠血清T、FSH和LH水平的影响

由表4可知，模型组小鼠血清中T水平显著低于对照组，FSH和LH水平显著高于对照组(p<0.05)。黄酮高剂量组小鼠血清中T水平显著高于模型组和黄酮低剂量组，阳性对照组和黄酮各剂量组小鼠血清中FSH水平显著低于模型组，阳性对照组、黄酮中剂量组和高剂量组小鼠血清中LH水平显著低于模型组(p<0.05)。随着黄酮给药剂量的增加，小鼠血清中睾酮水平逐渐升高，而FSH和LH水平逐渐降低。

表4女贞子黄酮对各组小鼠血清中T、FSH和LH水平的影响(n＝6，)

表中，与对照组比较，*p<0.05；与模型组比较，^#p<0.05；与阳性对照组比较，^$p<0.05；与黄酮低剂量组比较，

通过上述试验可知，黄酮中剂量组和高剂量组T水平呈升高趋势，且黄酮高剂量组最显著，而黄酮低、中和高剂量组降低了FSH和LH水平，黄酮高剂量组的FSH和LH水平接近对照组。睾酮水平的提高与精子质量的提高有关，FSH和LH水平的降低说明少弱精症小鼠的性激素负反馈调控系统运作趋于正常，病理性的促性腺激素大量分泌问题得到改善。因此，女贞子黄酮提取物对少弱精症具有明确的改善效果。

2.6女贞子黄酮对各组小鼠睾丸组织MDA和SOD水平的影响

由表5可知，模型组小鼠睾丸组织中MDA水平显著高于对照组，SOD水平显著低于对照组(p<0.05)。黄酮高剂量组小鼠睾丸组织中MDA水平显著低于模型组，SOD水平显著高于模型组(p<0.05)。黄酮中剂量组小鼠睾丸组织中SOD水平显著高于模型组。黄酮高剂量组小鼠睾丸组织中SOD水平显著高于黄酮低剂量组(p<0.05)。

表5女贞子黄酮对各组小鼠睾丸组织MDA和SOD水平的影响(n＝6，)

表中，与对照组比较，*p<0.05；与模型组比较，^#p<0.05；与黄酮低剂量组比较，

通过上述试验可知，女贞子黄酮提取物对腺嘌呤造成的小鼠睾丸组织损伤有一定的保护作用，其机制是通过增强SOD活性，降低MDA水平，进而维持类固醇合成相关酶的活性，从而维持生殖重要激素-睾酮的合成和代谢水平。睾酮(T)可经由下丘脑-垂体-睾丸实行双向调控分泌，呈脉冲式分泌的促性腺激素释放激素在下丘脑产生，后作用于垂体，使垂体前叶分泌合成促卵泡激素(FSH)和黄体生成素(LH)。睾丸内的间质细胞受LH的刺激生成T，以促进精子的成熟；而FSH则能通过结合相应受体提高曲精管腔的睾酮浓度，加快成熟精子的分化程度。

2.7小鼠睾丸组织形态学观察

取小鼠睾丸石蜡切片，HE染色，光镜下观察睾丸组织内精原细胞和各级生精细胞的分布情况。结果如图1所示，对照组小鼠睾丸组织显示正常的组织结构。在模型组小鼠睾丸组织细胞中可见较多的染色质边缘化以及核固缩的细胞，有部分精母细胞和精子细胞发生空泡化、乃至脱落。黄酮高剂量组小鼠睾丸组织中边缘化以及和核固缩的现象明显改善，细胞空泡化以及脱落情况减轻。但黄酮低剂量组和黄酮中剂量组小鼠睾丸组织的改善情况与模型组比较，不十分显著。

本发明公开了一种女贞子黄酮提取物在制备少弱精症治疗药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

Claims (5)

1.女贞子黄酮提取物在制备少弱精症治疗药物中的应用，其特征在于，所述女贞子黄酮提取物的制备方法如下：

向AB-8大孔树脂中加入95%乙醇，浸泡24h后水洗至中性，加入2%盐酸，浸泡4h后水洗至中性，加入2%氢氧化钠，浸泡4h后水洗至中性，加入层析柱中，蒸馏水流速11mL/min，压柱12h，按60%乙醇与女贞子的液料比30:1mL/g向女贞子中加入60%乙醇，45℃超声提取30min，超声功率为100W，加入2倍体积蒸馏水进行装柱，去色素，加入60%乙醇洗出黄酮提取物，滤液进行浓缩冻干，测定黄酮含量。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黄酮含量为（1.24±0.05）mg/g。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述女贞子黄酮提取物的使用剂量为100-300 mg/kg。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述女贞子黄酮提取物的使用剂量为300mg/kg。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述女贞子黄酮提取物的功能包括：

（a）提高少弱精症小鼠模型附睾脏器重量；

（b）提高少弱精症小鼠模型精子质量；

（c）提高少弱精症小鼠模型血清中睾酮水平；

（d）降低少弱精症小鼠模型血清中促卵泡激素和促黄体生成激素水平；

（e）提高少弱精症小鼠模型睾丸组织中SOD水平；

（f）降低少弱精症小鼠模型睾丸组织中MDA水平。