CN114984028A - 黄芪甲苷的用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种黄芪甲苷的用途。本申请从卵巢组织形态、卵泡数量、大鼠动情周期、卵巢组织雌激素受体蛋白表达水平、大鼠血清相关氧化和抗氧化指标、血清激素水平和生育力几方面，证明了黄芪甲苷与间充质干细胞联合治疗卵巢功能不全的效果较好。黄芪甲苷通过改善体内微环境提升迁移至受损卵巢组织间充质干细胞的数量和质量，从而解决临床和基础研究中，间充质干细胞移植治疗卵巢功能不全效率低的问题，继而促进间充质干细胞对卵巢结构和功能损伤修复。

Description

黄芪甲苷的用途
技术领域
本申请涉中药活性成分的应用领域，尤其涉及一种黄芪甲苷的用途。
背景技术
原发性卵巢功能不全(POI)是一种妇科领域常见的卵巢功能下降的疾病状态，是一种对医学、心理和生殖影响的疾病。它会导致月经紊乱、不孕以及各种健康问题，伴随着一些更年期症状，如潮热、盗汗、抑郁、焦虑和失眠等，有可能会贯穿女性的一生。中药黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，性微温，味甘，归脾、肺、肝、肾经，具有补气升阳，益卫固表等功效，是我国最古老的补气中药材之一。黄芪中的主要活性成分有黄芪多糖、黄芪苷和黄芪异黄酮。黄芪苷分为黄芪苷Ⅰ、黄芪苷Ⅱ和黄芪苷Ⅳ，其中生物活性最好的是黄芪苷Ⅳ即黄芪甲苷(AS-IV)。现药理研究已证实，黄芪甲苷具有抗炎、免疫调节、抗氧化、抗细胞凋亡、调节代谢、抗纤维化、抑制肿瘤、降糖及改善胰岛素抵抗活性等多种生物活性。脐带间充质干细胞是一种能分化成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的多能干细胞。其具有强大的增殖能力，且参与构成造血微环境，因此被广泛应用于组织工程，细胞治疗和基因治疗。
大量研究表明，人类间充质干细胞对卵巢组织微环境、激素水平、卵巢发育等均有一定的改善效果。间充质干细胞对卵巢早衰或卵巢功能不全的动物模型都有很好的治疗效果，具体机制包括间充质干细胞归巢作用、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、分化、免疫调节、分泌多种细胞因子、调节细胞自噬和调节卵巢微环境等。因此，可以通过移植人类间充质干细胞，治疗卵巢功能不全。
但是，因长期环境化学物的暴露和医源性化疗药物的使用，造成卵巢内缺血、缺氧及高自由基环境，导致移植后间充质干细胞(MSCs)的数量不足、存活率下降和存活时间有限，修复卵巢功能不全的效果不好。因此，需要药物能够改善机体和卵巢环境，从而提高人胎盘间充质干细胞(hPMSCs)迁移至受损卵巢组织的数量和质量，促进hPMSCs发挥修复卵巢功能不全的作用。
发明内容
本申请提供了一种黄芪甲苷的用途，黄芪甲苷作为药物的活性成分之一，用于治疗卵巢功能不全；所述药物与间充质干细胞联合治疗卵巢功能不全。
干细胞具有自我修复和再生的潜力，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)由于其巨大的治疗潜力，大量研究表明不同来源的间充质干细胞对卵巢组织微环境、激素水平、卵巢发育等均有一定的改善效果。但是因长期环境化学物的暴露和医源性化疗药物的使用，造成卵巢内缺血、缺氧及高自由基环境，导致移植后间充质干细胞(MSCs)的数量不足、存活率下降和存活时间有限，需要改善体内微环境，提高干细胞质量和数量，增强干细胞的治疗效果。
黄芪甲苷不仅具有黄芪多糖的作用，还有些是黄芪多糖无法比拟的作用，其药效强度是常规黄芪多糖的2倍多，抗病毒作用更是黄芪多糖的30倍。现药理研究已证实具有抗炎、免疫调节、抗氧化、抗细胞凋亡、调节代谢、抗纤维化、抑制肿瘤、降糖及改善胰岛素抵抗活性等多种生物活性，可纠正体内氧化-抗氧化失衡及免疫-炎症平衡紊乱。
可选的，所述间充质干细胞为人胎盘间充质干细胞，所述卵巢功能不全为原发性卵巢功能不全。
可选的，所述黄芪甲苷通过改善体内微环境，提升迁移至受损卵巢组织间充质干细胞的数量和质量，促进间充质干细胞修复卵巢功能不全，治疗卵巢功能不全；所述黄芪甲苷通过抑制氧化应激、抗炎、改善纤维化的作用改善机体和卵巢内环境；所述黄芪甲苷通过促进雌激素受体蛋白表达水平起作用，改善卵巢的微环境，促进间充质干细胞修复卵巢功能不全，治疗卵巢功能不全；所述卵巢微环境包括卵巢内的缺血、缺氧、高自由基环境。
黄芪甲苷可通过抑制NF－κB相关信号通路改善心、肝、肾等多种组织器官纤维化和功能损害，可持续抑制纤维化发展。
黄芪甲苷作用的机制，是黄芪甲苷先干预通过促进雌激素受体蛋白表达水平起作用，改善卵巢的微环境，然后再移植间质干细胞，通过黄芪甲苷的预先干预，让移植的效果比没有干预的时候更好。
可选的，所述黄芪甲溶解时的溶剂包括乙醇和羧甲基纤维素钠。
可选的，黄芪甲苷在制备治疗卵巢功能不全药物中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为分组试验设计的示意图；
图2为显微镜下观察到的苏木精-伊红(HE)染色的卵巢组织形态图片；
图3为黄芪甲苷联合干细胞治疗对卵巢功能不全模型大鼠卵泡计数的影响(横坐标分别为空白对照组、模型组、芬吗通组、黄芪甲苷组、干细胞组和联合治疗组，纵坐标为各组的卵泡计数情况，*p<0.05vs.空白组，#p<0.05vs.模型组)；
图4为黄芪甲苷联合干细胞治疗对卵巢功能不全模型大鼠动情周期的影响(横坐标分别为空白对照组、模型组、芬吗通组、黄芪甲苷组、干细胞组和联合治疗组，纵坐标动情周期的紊乱率，*p<0.05vs.空白组，#p<0.05vs.模型组)；
图5为光学显微镜下观察卵巢切片的免疫组织化学法染色结果；
图6为黄芪甲苷联合干细胞治疗对卵巢功能不全模型大鼠激素相关雌激素受体β(ER-β)蛋白表达影响(横坐标分别为空白对照组、模型组、芬吗通组、黄芪甲苷组、干细胞组和联合治疗组，纵坐标为阳性细胞的比例，*p<0.05vs.空白组，#p<0.05vs.模型组)；
图7为黄芪甲苷联合干细胞治疗对卵巢功能不全模型大鼠的促卵泡素(FSH)水平的影响结果(横坐标分别为空白对照组、模型组、芬吗通组、黄芪甲苷组、干细胞组和联合治疗组，纵坐标为促卵泡素(FSH)水平，*p<0.05vs.空白组，#p<0.05vs.模型组)；
图8为黄芪甲苷联合干细胞治疗对卵巢功能不全模型大鼠的雌二醇(E2)水平的影响结果(横坐标分别为空白对照组、模型组、芬吗通组、黄芪甲苷组、干细胞组和联合治疗组，纵坐标为雌二醇(E2)水平，*p<0.05vs.空白组，#p<0.05vs.模型组)；
图9黄芪甲苷联合干细胞治疗对卵巢功能不全模型大鼠的抗缪勒管激素(AMH)水平的影响结果(横坐标分别为空白对照组、模型组、芬吗通组、黄芪甲苷组、干细胞组和联合治疗组，纵坐标为抗缪勒管激素(AMH)水平，*p<0.05vs.空白组，#p<0.05vs.模型组)；
图10为黄芪甲苷联合干细胞治疗对卵巢功能不全模型大鼠的生育力的影响(横坐标分别为空白对照组、模型组、芬吗通组、黄芪甲苷组、干细胞组和联合治疗组，纵坐标中，每组左侧的为产仔数，右侧的为第1-10天受孕率)；
图11为大鼠动情前期、动情期、动情后期、动情间期的判断标准；
图12为各组大鼠血清MDA、SOD和CAT水平的比较结果(mean±sd，n＝6，与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.05)。
具体实施方式
下面将详细地对实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下实施例中描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。仅是与权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的系统和方法的示例。
实施例中应用到的大鼠，均购自于宁夏医科大学动物实验中心。hUCMSCs细胞源于足月产妇自愿捐赠，经宁夏医科大学总医院伦理学委员会批准并获得患者知情同意，并经过宁夏医科大学总医院宁夏人类干细胞研究所提取和流式细胞鉴定，hUCMSCs传代4-5次并达到足够数量时进行移植注射。
环磷酰胺(CTX)使用安道生Endoxan注射用环磷酰胺(规格：0.2g/支)，用生理盐水稀释至5mg/ml。
黄芪甲苷(AS-IV)从上海源叶生物科技有限公司(货号：S31401-1g，产品规格：≥98％)购入，用乙醇溶解后再用羧甲基纤维素钠(CMCNA)稀释至2mg/ml、4mg/ml、8mg/ml。
实施例1：筛选动情周期合格的大鼠
选用具有正常动情周期的SPF级SD(Sprague-Dawley)大鼠，8-12周龄，体重200±20g，共70只。对实验大鼠行阴道脱落细胞学涂片，筛选出动情周期在5～6d规律呈现出动情前期、动情期、动情后期、动情间期为一个循环的大鼠为受试动物。
首先固定大鼠，初步观察外阴变化，然后右手持巴氏管吸0.1-0.2ml生理盐水，轻插入阴道5-6mm，抽吸2-3次，固片后置于显微镜下观察。
大鼠的阴道上皮细胞在动情周期内，显微镜下的情况如下：动情前期:大量的椭圆有核上皮细胞，少量的角化阴道上皮细胞；动情期：大量的角化阴道上皮细胞，形状大而不规则，成堆的落叶状排列，尚可有少量圆形有核上皮细胞；动情后期:角质化上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞，其三者呈等比例分布；动情间期:大量的白细胞，有时可见较小的的有核上皮细胞。
最后筛选得到动情周期在5～6d的大鼠70只。
实施例2：建立大鼠POI模型
将纳入实验的70只大鼠适应性饲养3天后，随机分为2组，空白对照组(15只)、POI模型组(55只)，开始制备大鼠POI模型。
空白对照组腹腔注射生理盐水，正常饲养14d；POI模型组腹腔注射等剂量CTX，诱导POI模型建立。CTX初始剂量为50mg/kg.d，之后腹腔注射8-10mg/kg.d，持续14天，每天观察大鼠阴道涂片，观察大鼠动情周期变化。第15天两组各随机处死5只大鼠，取卵巢和子宫组织做组织学检查，观察大鼠子宫和卵巢的形态及组织学变化。
模型组大鼠阴道脱落细胞学涂片提示动情周期紊乱、动情间期延长；模型组大鼠FSH水平明显上升，E2、AMH水平显著降低；处死大鼠后进行卵巢组织石蜡切片，HE染色可见空白对照组有初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡；模型组大鼠卵巢上存在闭锁卵泡,卵泡数、黄体数减少，卵泡较小，颗粒细胞层次较少，黄体偏小，以上标准为POI模型建立成功。
实施例3：试验的分组设计和标本的采集处理
将空白对照组的10只动情周期正常的SD雌性大鼠和POI造模成功的50只SD雌性大鼠随机分为6组，每组10只，如图1所示，分别是空白对照组(Normal+NaCMC)、POI模型对照组(POI+NaCMC)、激素治疗阳性对照组(即芬吗通组)(POI+E2+P)、干细胞治疗对照组(POI+PMSCs)、黄芪甲苷对照组(POI+AS-IV)、黄芪甲苷联合干细胞治疗组(POI+AS-IV+PMSCs)。
空白对照组(Normal+NaCMC)及POI模型对照组(POI+NaCMC)用等量羧甲基纤维素钠(CMCNA)灌胃28天，每天一次；
激素治疗阳性对照组(即芬吗通组)(POI+E2+P)按照药品说明书，连续灌胃雌二醇(E2)0.3mg/kg/d 14天，后灌胃地屈孕酮(P)3mg/kg/d 14天，每天一次，其中E2和P用羧甲基纤维素钠(NaCMC)溶剂溶解；
黄芪甲苷对照组(POI+AS-IV)在POI造模后10天(提前干预5天)，以40mg/kg/d的剂量连续灌胃AS-IV 28天，其中AS-IV用羧甲基纤维素钠(NaCMC)溶剂溶解；
干细胞治疗对照组(POI+PMSCs)经大鼠尾静脉注入PMSCs液0.5ml(细胞数为2.5×106个)，分别在首日和第7天各注射1次；
黄芪甲苷联合干细胞治疗组(POI+AS-IV+PMSCs)：按照黄芪甲苷(AS-IV)对照组和干细胞治疗对照组(POI+PMSCs)组的处理方法联合处理28天。
在各组治疗后第29天，每组处死5只收集血样和卵巢组织，剩下的4只大鼠与适龄雄性大鼠合笼(雌雄2：1)，评估处理对生殖能力的影响。
大鼠用7％水合氯醛麻醉后，心脏取血用于ELISA检测。常规消毒后，取出双侧卵巢，一侧卵巢于液氮迅速冷冻并转移至-80℃长期保存用于Western Blot检测，另一侧卵巢用4％多聚甲醛固定24h后，行梯度脱水、石蜡包埋并制备组织切片。
实施例4：对卵巢组织形态的影响
卵巢组织行常规梯度酒精脱水后二甲苯透明，采用石蜡包埋切片，厚度为5μm，HE染色后在显微镜下观察苏木精-伊红(HE)染色的卵巢组织形态并拍照。
各组的卵巢形态学HE切片染色，显微镜下观察结果如图2所示。正常组卵巢卵泡形态正常，可见各级卵泡，卵泡颗粒细胞较多，卵泡液丰富，闭锁卵泡较少；POI模型组：卵巢略萎缩，皮质变薄，颗粒细胞层减少，出现大量闭锁卵泡，窦卵泡较少；跟模型组相比，芬吗通治疗组、黄芪甲苷治疗组和干细胞移植组可见窦卵泡增多，闭锁卵泡数量减少；联合治疗组卵泡颗粒细胞增多，闭锁卵泡数量减少，窦卵泡增多，有初级卵泡和次级卵泡，并可见多个较厚颗粒层。
综上，干细胞和黄芪甲苷的联合治疗，对POI模型的卵巢形态有明显的改善作用。
实施例5：对窦卵泡数量的影响
取大鼠左侧卵巢，HE染色后观察大鼠卵巢切片，确定观察卵巢皮质窦卵泡及卵泡内颗粒细胞分布情况，结果如图3所示。
按照物理重建的方法对窦卵泡进行计数，窦卵泡的标志为:周围有多层颗粒细胞围绕，中间有空腔，且内有卵细胞。窦卵泡计数采用单盲法计数，计数者不清楚具体实验分组内的各大鼠编号。
可见，干细胞和黄芪甲苷的联合治疗，对POI模型的卵泡数量有明显的改善作用。
实施例6：对大鼠动情周期的影响
大鼠正常的生理周期为3-5天，动情周期分为“动情前期、动情期、动情后期、动情间期”，判断标准如图11所示。周期过长、过短或者长时间处于同一周期被认为是周期紊乱。
空白组大鼠动情周期紊乱率为10％。与空白对照组相比，模型组均出现动情周期延长，8-10d/次，多处于动情间期，甚至无正常的动情周期。大鼠动情周期紊乱率显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。联合治疗组和芬吗通组比较，差异有统计学意义，联合治疗组与空白对照组比较，差异无统计学意义。
结果如图4所示。模型组大鼠动情周期紊乱，动情间期延长最为明显，动情期与正常组相比较显著缩短，较正常组相比动情周期显著延长，动情周期紊乱率显著延长(P<0.01)；阳性芬吗通治疗组、黄芪甲苷治疗组和干细胞移植组大鼠动情周期较正常组延长，但与模型组相比有所改善，动情间期缩短，动情期延长，动情周期紊乱率显著缩短(P<0.01)；联合治疗组与模型组相比较，动情周期显著缩短，动情周期紊乱率显著降低(P<0.05)。
实施例7：对各组卵巢组织雌激素受体蛋白表达水平的影响
卵巢切片常规脱蜡脱水，枸橼酸钠微波修复、封闭后滴加一抗(一抗稀释浓度官网可查询)、于4℃孵育过夜。次日滴加二抗并进行DAB显色，显色终止后苏木素复染，用中性树胶封片，于光学显微镜下观察免疫组织化学法染色结果并拍照，结果如图5所示
对阳性细胞灰度扫描的统计结果如图6所示，模型组大鼠卵巢组织ER-β蛋白表达明显低于模空白对照组(P＜0.01)，而经过干预后，ER-β蛋白表达量均高于模型组(P＜0.01)。
实施例8：对大鼠血清相关氧化与抗氧化指标的影响
各组大鼠麻醉后心脏取血，3000r/min离心l0min后分离上层血清，ELISA法对各组大鼠血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平检测，监测结果如图12所示。
与正常组相比较，模型组大鼠血清MDA水平明显升高，SOD,CAT水平明显下降(P<0.01)；和模型组相比，各组MDA水平明显降低(P<0.05),SOD,CAT水平明显升高(P<0.05)。
实施例9：对大鼠血清激素水平的影响
造模成功后眼角取血，将大鼠血液静置30min，12000r/min、4℃离心15min，吸取上清。使用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测造模后大鼠的促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)和抗缪勒管激素(AMH)水平。
治疗结束后心脏取血，将大鼠血液静置30min，12000r/min、4℃离心15min，吸取上清。使用ELISA法检测治疗后大鼠的促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)和抗缪勒管激素(AMH)水平。
对大鼠的促卵泡素(FSH)水平的影响结果如图7所示，对大鼠的雌二醇(E2)水平的影响结果如图8所示，对大鼠的抗缪勒管激素(AMH)水平的影响结果如图9所示。
与正常组相比较，模型组大鼠血清E2水平明显下降，FSH和AMH明显升高(P<0.01)；和模型组相比，阳性芬吗通治疗组、黄芪甲苷治疗组和干细胞移植组FSH和AMH水平降低，E2水平升高(P<0.5)，联合治疗组与模型组相比较，E2水平显著升高，FSH和AMH水平显著降低(P<0.05)。
可见黄芪甲苷联合干细胞治疗能够改善卵巢功能，缓解卵巢功能不全。
实施例10：对大鼠生育力的影响
治疗第29天，每组将剩下的4只大鼠与适应环境的适龄雄性大鼠合笼(雌雄2:1)，每日早晨7点钟检查阴栓及阴道涂片检查精子，以发现阴栓、精子的当天作为怀孕第0天，以雌鼠分娩确定受孕成功，计算合笼后第1-10天的受孕率(％)和产仔率(合笼50天后的总仔数)。孕鼠妊娠期平均为20天(19-22天)。并对其生育能力开展评估。
结果如图10所示。与空白组比较，阳性芬吗通治疗组、黄芪甲苷组和干细胞移植组以及联合治疗组大鼠合笼50天内产仔总数、第1-10天的受孕率与空白组相比差异均无统计学意义；与模型组比较，各组大鼠的产仔总数均较多，第1-10天的受孕率均较高，差异具有统计学意义((P<0.01)。
本申请提供的实施例之间的相似部分相互参见即可，以上提供的具体实施方式只是本申请总的构思下的几个示例，并不构成本申请保护范围的限定。对于本领域的技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下依据本申请方案所扩展出的任何其他实施方式都属于本申请的保护范围。

Claims (8)

1.一种黄芪甲苷的用途，其特征在于：黄芪甲苷作为药物中的活性成分之一，用于治疗卵巢功能不全；所述药物与间充质干细胞联合治疗卵巢功能不全。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述间充质干细胞为人胎盘间充质干细胞。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述卵巢功能不全为原发性卵巢功能不全。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述黄芪甲苷通过改善体内微环境，提升迁移至受损卵巢组织间充质干细胞的数量和质量，促进间充质干细胞修复卵巢功能不全的效果，治疗卵巢功能不全。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述黄芪甲苷通过抑制氧化应激、抗炎、改善纤维化的作用改善机体和卵巢内环境。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述黄芪甲苷通过促进雌激素受体蛋白表达水平起作用，改善卵巢的微环境，促进间充质干细胞修复卵巢功能不全，治疗卵巢功能不全。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述卵巢微环境包括卵巢内的缺血、缺氧、高自由基环境。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述黄芪甲苷溶解时，溶剂包括乙醇和羧甲基纤维素钠。
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