CN104189012A - 一种人羊膜间充质干细胞悬液的应用 - Google Patents
一种人羊膜间充质干细胞悬液的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,提供了一种人羊膜间充质干细胞悬液在制备治疗对化疗药物导致的不孕症药物中的应用。本发明制备的羊膜间充质干细胞悬液可以通过:1.增加化疗药物损伤的卵巢中卵泡数量,防止卵巢组织的纤维化;2.改善下丘脑-垂体-卵巢性腺轴的生殖内分泌功能,从而恢复受损卵巢的排卵功能,对化疗药物导致的不孕症小鼠具有明显的治疗作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种人羊膜间充质干细胞悬液的应用。
背景技术
随着化疗药物的广泛应用,许多恶性肿瘤和自身免疫性疾病患者的病情得到控制或缓解,寿命延长;但年轻女性患者面临的一个问题是化疗本身引起的卵巢损伤,甚至导致卵巢早衰,引起不孕,给患者带来一系列生理、心理、社会问题;现已成为影响妇女生殖健康和社会稳定的不可忽视的因素。如何减轻或预防化疗所致的卵巢损伤、恢复育龄女性的生育功能,目前已成为生殖医学、再生医学界研究的热点。
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是一种具有自我更新、复制和多潜能细胞,体外培养下的间充质干细胞可向不同的谱系分化,有望充当多种器官改建或损伤后修复的细胞。羊膜和绒毛膜是胎盘的两个主要部分,羊膜跟绒毛膜紧贴在一起,为胎膜的最内层,从细胞滋养层衍化而来,为光滑、无血管、神经以及淋巴的半透明薄膜,有一定弹性,其厚度为0.02-0.05mm。羊膜由羊膜上皮(AmnioticEpithelial cells,AEC)和间质层(Amniotic Stromal,AS)组成,上皮层由紧密排列的柱状上皮细胞构成,面向胎儿,而间质层则为疏松的结缔组织,羊膜间充质干细胞(Human Amniotic Mesenchymal StemCells,hAMSCs)就分散于该间质层。作为取材相对容易的间充质干细胞,目前羊膜间充质干细胞已成为继骨髓间充质干细胞之后另一备受关注的间充质干细胞,已成为间充质干细胞来源的新的研究热点,羊膜间充质干细胞作为种子细胞在临床移植治疗过程中有着潜在的运用前景。
化疗药物引起的卵巢损伤,属于目前研究的热点与难点,尚无统一、有效的治疗手段,尤其对其所导致的无排卵性不孕症,更是一筹莫展;间充质干细胞的研究,为此类患者带来了曙光。以往对该病的生物医学治疗、研究,主要集中在人骨髓或者胚胎来源的间充质干细胞向卵母细胞的诱导分化方面,但由于人骨髓来源的间充质干细胞的获得需要通过骨髓穿刺,而且其数量随年龄的增长而急剧下降。众所周知,由于组织中间充质干细胞含量极少,人骨髓中的间充质干细胞含量极低,一般104-105个单核细胞中仅含有1个间充质干细胞,这就限制了人骨髓源间充质干细胞的应用。在间充质干细胞培养过程中,众多因素影响细胞扩增和分化,其中营养物耗竭和代谢副产物累积所导致的培养环境恶化是限制、抑制细胞扩增和分化的主要问题之一。而胚胎干细胞多来源于行辅助生殖助孕周期(即试管婴儿),病人废弃的胚胎;这些细胞组织来源稀少,取材比较困难,具有携带传染病的风险、免疫排斥反应、远期致瘤性等弊端,同时受到医学伦理学的限制,难以广泛开展相关基础及临床研究;且胚胎干细胞在体外长期扩增过程中易于丧失自我更新能力和多向分化潜能,因此其在临床上的应用受到严重限制。
羊膜作为孕妇分娩后的废弃物,与捐献骨髓、胚胎或采集脐带、脐血等其它组织来源间充质干细胞相比,具有组织来源广泛、易于获得,且污染机会少;获取方便、对供体无伤害;无血液制品携带传染病的风险;羊膜为胚胎时期的组织,且直接由中胚层发育而来,分化程度较低,因此羊膜间充质干细胞免疫原性更低,无免疫排斥反应;不具有无远期致瘤性;无伦理道德问题,对其研究和应用无伦理学的争论等优势。羊膜间充质干细胞和其他胎盘源性干细胞相比,在未来的应用中具有明显优势。作为取材相对容易的间充质干细胞,目前羊膜间充质干细胞已成为继骨髓间充质干细胞之后另一备受关注的间充质干细胞,已成为间充质干细胞来源的新的研究热点,羊膜间充质干细胞作为种子细胞在临床移植治疗过程中有着潜在的运用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种人羊膜间充质干细胞悬液的新应用。
具体而言,本发明提供一种人羊膜间充质干细胞悬液在制备治疗对化疗药物导致的不孕症药物中的应用。
优选的,所述不孕症为卵巢早衰导致的下丘脑-垂体-卵巢性腺轴的生殖内分泌失调、无排卵性不孕症。
优选的,人羊膜间充质干细胞悬液浓度为1×106/ml~2×106/ml干细胞悬液。
优选的,用1ml注射器将0.6ml人羊膜间充质干细胞悬液注入静脉中;隔日注射一次,共注射两次。
所述人羊膜间充质干细胞悬液可由常规方法制备而成,优选的,人羊膜间充质干细胞悬液的制备方法,包括以下步骤:
1)选取无菌条件下获取的剖腹产足月胎儿的胎盘储存于无菌玻璃器皿;
2)超净台内钝性机械剥离胎盘羊膜组织,PBS缓冲液反复冲洗清除血凝块,小弯眼科剪将羊膜剪碎为面积约1cm×1cm的组织碎片;光镜下分辨羊膜上皮层及间质层;
3)将羊膜间质层组织以无菌PBS缓冲液洗涤后,剪碎,置于培养瓶中,加入0.25%胰酶,封好瓶口,放于摇床中,37℃、震荡150次/min,消化60min;加入溶液体积10%的胎牛血清终止,PBS缓冲液充分洗涤去除胰酶残留;1.0g/L胶原酶IV型37℃消化60min;羊膜组织的最终消化液通过200目不锈钢网滤过制备为单细胞悬液;
4)细胞悬液转入离心管,1000转/min离心5min;弃上清液,PBS缓冲液10ml再次洗涤和悬浮细胞,1000转/min离心5min弃上清液,反复三次;离心管加入2ml含10%胎牛血清的L-DMEM,轻柔吹打,制成(4-5)×106/ml的羊膜间充质干细胞细胞悬液,置于5%CO2、37℃培养箱中培养。
5)羊膜间充质干细胞原代培养至第3天后首次换液,此后每3天更换培养基,定期倒置显微镜下观察细胞贴壁情况,待细胞铺满瓶底达80%-90%,进行首次传代(一般12-14天后细胞按常规方法传代),代培养过程每3天全量换液。
6)选择生长良好的第2代的羊膜间充质干细胞,用等体积的0.25%胰酶和0.02%EDTA消化,1000r/min离心,弃去培养基。PBS缓冲液洗涤后制成悬液浓度为(1-2)×106干细胞/ml。
本发明的有益效果:
1、本发明使用的“种子细胞”——羊膜间充质干细胞悬液,取材于人胎羊膜组织,具有来源广泛、易于获得,且污染机会少;获取方便、对供体无伤害;无血液制品携带传染病的风险;免疫原性更低,无免疫排斥反应;不具有无远期致瘤性;其研究和应用不涉及伦理学问题等优点。
2、目前并无明确、安全、有效的治疗化疗药物导致的不孕症的药物及方法,本发明通过羊膜间充质干细胞悬液对化疗药物导致的不孕症小鼠进行治疗,其妊娠率与正常小鼠的妊娠率无显著性差异,对该类不孕症的治疗效果明显,无副作用及伦理学争议。
3、本发明制备的羊膜间充质干细胞悬液可以通过:1.增加化疗药物损伤的卵巢中卵泡数量,防止卵巢组织的纤维化;2.改善下丘脑-垂体-卵巢性腺轴的生殖内分泌功能,从而恢复受损卵巢的排卵功能,对化疗药物导致的不孕症小鼠具有明显的治疗作用。
附图说明
图1造模后第30天正常组小鼠阴道脱落细胞涂片;
图2造模后第30天模型组小鼠阴道脱落细胞涂片;
图3造模后第30天补佳乐组小鼠阴道脱落细胞涂片;
图4造模后第30天羊膜间充质干细胞移植组小鼠阴道脱落细胞涂片;
图5造模后第30天正常组小鼠卵巢组织切片;
图6造模后第30天模型组小鼠卵巢组织切片;
图7造模后第30天补佳乐组小鼠卵巢组织切片;
图8造模后第30天羊膜间充质干细胞移植组小鼠卵巢组织切片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1
羊膜间充质干细胞悬液的制备,包括以下步骤:
1)选取无菌条件下获取的剖腹产足月胎儿的胎盘储存于无菌玻璃器皿;
2)超净台内钝性机械剥离胎盘羊膜组织,PBS缓冲液反复冲洗清除血凝块,小弯眼科剪将羊膜剪碎为面积约1cm×1cm的组织碎片;光镜下分辨羊膜上皮层及间质层;
3)将羊膜间质层组织以无菌PBS缓冲液洗涤后,剪碎,置于培养瓶中,加入0.25%胰酶,封好瓶口,放于摇床中,37℃、震荡150次/min,消化60min;加入适量胎牛血清终止,PBS缓冲液充分洗涤去除胰酶残留;1.0g/L胶原酶IV型37℃消化60min;羊膜组织的最终消化液通过200目不锈钢网滤过制备为单细胞悬液;
4)细胞悬液转入离心管,1000转/min离心5min;弃上清液,PBS缓冲液10ml再次洗涤和悬浮细胞,1000转/min离心5min弃上清液,反复三次;离心管加入2ml含10%胎牛血清的L-DMEM,轻柔吹打,制成(4-5)×106/ml的羊膜间充质干细胞细胞悬液,置于5%CO2、37℃培养箱中培养。羊膜组织中间充质干细胞含量同样很少,1克羊膜组织中可分离到约106个有核细胞。
5)羊膜间充质干细胞原代培养至第3天后首次换液,此后每3天更换培养基,定期倒置显微镜下观察细胞贴壁情况,待细胞铺满瓶底达80%-90%,进行首次传代(一般12-14天后细胞按常规方法传代),代培养过程每3天全量换液。
6)选择生长良好的第2代的羊膜间充质干细胞,用等体积的0.25%胰酶和0.02%EDTA消化,1000r/min离心,弃去培养基。PBS洗涤后制成悬液浓度为1×106/ml~2×106/ml干细胞悬液。
实施例2
试验动物为昆明种SPF小白鼠(6-8周龄、体重约27-29g,经阴道脱落细胞涂片检查确定其动情周期正常),由河南省试验动物中心提供。
将雌性小鼠60只随机分为4组,正常对照组、模型组、补佳乐组、羊膜间充质干细胞移植组,每组15只;除正常对照组外,其余各组分别给予腹腔注射环磷酰胺(0.1g,粉针剂,国药准字H32020857,由江苏恒瑞医药股份有限公司提供,将0.1g环磷酰胺溶解于100ml氯化钠注射液,浓度为1mg/ml,环磷酰胺是一种治疗肿瘤的化疗药物,在此处用来制备化疗药物导致不孕症的动物模型),首次50mg/kg/d的负荷量,以8mg/kg/d的剂量维持14天,共给药15天;停药7天后,开始每日定时观察阴道细胞形态,连续1周,如呈现动情周期紊乱,动情间期延长的即为卵巢早衰模型成功,环磷酰胺停药后2周,各治疗组开始给药。
预防或减轻化疗导致的卵巢损伤,缓解由于低雌激素导致的潮热、出汗、烦躁、骨质疏松等临床症状是该病的主要治疗原则。目前临床主要的方法为雌激素替代治疗(Hormone Replacement Therapy,HRT);因此,本实施例选择雌激素制剂(补佳乐)作为治疗的对照药物。
将补佳乐(戊酸雌二醇片,1mg/片,国药准字J20080036,由拜耳医药保健有限公司广州分公司提供)用蒸馏水配制成混悬液备用,对补佳乐组小鼠进行灌胃。按临床该类患者补佳乐生理替代剂量(2mg/50kg/d,连续使用3个月经周期计算)计算,每只小鼠灌胃剂量为0.3mg/kg/d,连续15天(2-3个动情周期)。
对羊膜间充质干细胞移植组小鼠,用1ml注射器将实施例1制得的羊膜间充质干细胞悬液0.6ml注入尾静脉中。隔日注射一次,共注射两次,待末次注射完成等待小鼠恢复三天;各组给予定时饲养、定期观察。饲养、观察条件为:12h:12h的明、暗光照,温度为18~25℃,空气相对湿度为40~60%,噪音≤60分贝条件下饲养、观察(每日上午8时,观察、记录小鼠皮毛变化,进食、体重、活动情况,对外界刺激的反应性、灵活性)。
小鼠性成熟早,35日龄雄性附睾精液中有运动的精子,雌鼠在35日龄即可发情排卵、受孕。将各组15只小鼠于造模后第30天,雌雄鼠1:1合笼。合笼、交配前,查看雌鼠外阴和阴道口,外阴充血肿胀,阴道口张开且呈干燥状态,确认为动情期雌鼠。取雌鼠阴道分泌物涂片、经巴氏染色,10×10倍光学显微镜镜检,观察阴道涂片的组织细胞学变化,可确定小鼠动情情况。
参见图1,正常组小鼠阴道涂片的特征为角化上皮细胞占绝大多数,由散在增至集块,白细胞和有核上皮细胞很少。
参见图2,模型组期阴道涂片的特征为白细胞占绝大多数,有核上皮细胞和角质化上皮细胞很少。
参见图3,补佳乐组小鼠阴道涂片的特征为片状角化上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞3种细胞都有,并且比例无明显差异。
参见图4,羊膜间充质干细胞移植组小鼠阴道涂片的特征为椭圆形的有核上皮细胞占绝大多数,白细胞和角质化上皮细胞很少。
正常情况下,雌鼠在每隔4-5天为一个动情周期,发情后2-3小时即可排卵。由于小鼠交配后能产生阴栓,它是由雄性小鼠精囊腺和凝固腺的分泌物在阴道内凝固而形成的产物;所以常把阴栓的有无作为判断是否交配的重要标志。进行本研究所用雄鼠均单只单笼饲养,雄鼠每次交配至少间隔3天以上。合笼后第二天清晨检查雌鼠阴栓判断交配情况,观察小鼠妊娠、分娩情况,参见表1。
表1 卵巢早衰性不孕症小鼠经羊膜间充质干细胞悬液治疗后妊娠情况(n=15,x2)
由表1可见,各组间两两比较妊娠动物数及妊娠率,本发明组与正常对照组比较,P>0.05,没有显著性差异;与模型组和补佳乐组比较,P<0.05,有显著性差异。本发明可恢复卵巢早衰小鼠的排卵,恢复其正常动情周期,达到合笼后受孕的目的,并且妊娠率与正常组没有显著性差异。
对其他导致卵巢早衰的药物,如:顺铂、卡铂、雷公藤也是同样适用的。
实施例3 小鼠的性激素水平测定
实施例2中各组分别于造模后30天,各取10只小鼠,乙醚麻醉后断颈取血,取颈静脉血0.5~1.0ml,1000转/min离心10min,移液器吸取其上层血清,化学免疫发光法测定血清FSH(促卵泡生成素)、LH(促黄体生成素)E2(雌激素)水平。试剂盒均为日本TOSOH公司生产,FSH、LH灵敏度为0.1IU/L,E2灵敏度为0.1ng/L,批内误差<5%,批间误差<10%。参见表2。
表2 卵巢早衰性不孕症小鼠经羊膜间充质干细胞悬液治疗后性激素情况(n=10,x±S)
由表2可见,造模后,小鼠血清性激素出现分泌异常,FSH、LH升高,E2下降,提示小鼠卵巢功能衰竭。在造模后第30天,各组间分别比较血清性激素(FSH、LH、E2)情况,本发明组与正常对照组比较,P>0.05,没有显著性差异;与模型组和补佳乐组比较,P<0.05,有显著性差异。说明本发明的治疗方法可以明显改善下丘脑-垂体-卵巢性腺轴的生殖内分泌功能,缓解化疗药物导致的性激素紊乱,从而恢复受损卵巢的排卵功能、达到治疗不孕症的目的。
实施例4 卵巢的病理改变
实施例2中各组分别于各造模后第30天,将上述乙醚麻醉、断颈处死的10只小鼠,腹部向上固定在动物手术台上,消毒皮肤,沿下腹部正中线纵向剪开皮肤,剪刀钝性分离,切开筋膜,游离、暴露子宫、输卵管、卵巢。镊子固定卵巢,分离周围脂肪,剪下卵巢组织,用4%多聚甲醛固定24h,石蜡包埋,5μm厚度连续切片,每隔20μm取一张,取20张切片,常规HE染色,10×10倍光镜下观察各组标本的切片中各阶段的卵泡情况,同时观察卵巢中颗粒细胞、黄体及间质等的组织学变化。参见图5-图8。
在造模第30天,与正常组相比,补佳乐组与模型组:卵巢在使用化疗药物后,光镜下见卵巢组织都受到损伤,卵巢未闭锁原始卵泡和各阶段生长卵泡数目均减少,在造模第30天均出现卵巢萎缩,模型组尤为严重,表现为卵巢间质严重纤维化,皮质中仅存极少量甚至所有的原始卵泡均消失;生长、成熟期的卵泡数目锐减或完全消失;正常的皮质基质细胞液大量丢失,卵巢由多个大黄体样物质形成,偶有淋巴细胞浸润。
在造模第30天,与正常组对比,本发明组:光镜下见卵巢皮质略增厚、结构基本正常、各阶段生长卵泡数目未见明显减少,闭锁卵泡、卵母细胞及透明带细胞形态未见明显异常,未发生变性、萎缩或消失等退行性变化及空泡样改变;卵母细胞周边颗粒细胞层次存在、无排列紊乱及细胞间隙增大,无黄体纤维化及数目增加;无血管减少及间质纤维化、坏死。
在造模第30天,与模型组、补佳乐组对比,本发明组:光镜下见卵泡数量明显增加,HE染色可见卵巢组织中空泡及闭锁卵泡明显减少,颗粒细胞数量增多且呈放射状整齐排列,并开始出现各级卵泡,成熟卵泡明显增多,可见很多排卵前的窦状卵泡;小鼠卵巢功能得到了有效改善。
因此,本发明制备的羊膜间充质干细胞悬液可以通过:1.增加化疗药物损伤的卵巢中卵泡数量,防止卵巢组织的纤维化;2.改善下丘脑-垂体-卵巢性腺轴的生殖内分泌功能,从而恢复受损卵巢的排卵功能,对化疗药物导致的不孕症小鼠具有明显的治疗作用。
目前对该病的主要治疗手段仍然是雌激素替代法,但存在副作用大、作用单一及有较多禁忌症等缺点。性激素的长期应用一直是一个有争议的问题,虽然可以肯定地防止骨折和升高高密度脂蛋白而间接有利于预防动脉硬化,但对乳腺的刺激以及雌激素促进血凝的作用,可以增加乳腺癌、子宫内膜癌及心血管病的患病风险,是应用的顾虑。对于该病的治疗目前尚无特别有效、安全及可长期使用的方法。本发明制备的羊膜间充质干细胞悬液对化疗药物导致的不孕症小鼠治疗效果肯定,并且无雌激素类药物长期治疗的上述风险,取材广泛、使用安全,值得推广应用。
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.一种人羊膜间充质干细胞悬液在制备治疗对化疗药物导致的不孕症药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述不孕症为卵巢早衰导致的下丘脑-垂体-卵巢性腺轴的生殖内分泌失调、无排卵性不孕症。
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