CN113444684B - 修复子宫内膜并提高生育力的干细胞凋亡小体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干细胞再生医学领域。目的是提供一种用于修复子宫内膜并提高生育力的干细胞凋亡小体的制备方法,获得的凋亡小体可调控创面微环境,有效促进子宫内膜修复,显著提高生育率,避免了传统外源性细胞移植所带来的安全隐患;所述方法制备工艺简单,可操作性强。技术方案是:一种用于修复子宫内膜并提高生育力的干细胞凋亡小体的制备方法,所述方法非用于疾病诊断治疗;按如下步骤进行:生长状态良好的干细胞,在汇合度大于75%时,采用500‑700mJcm‑2的紫外线照射,继续在完全培养基中培养18‑30小时,取细胞培养上清进行离心处理,所得沉淀物为干细胞凋亡小体。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞再生医学领域,特别涉及一种用于修复子宫内膜并提高生育力的生物活性小体。
背景技术
宫腔粘连是女性继发不孕的第二大病因,主要由创伤、感染等引起;子宫内膜受损伴发再生修复障碍,内膜纤维化,最终导致宫腔粘连和内膜萎缩。子宫内膜纤维化作为宫腔粘连的主要病理特征,不仅会形成纤维疤痕导致宫腔形态异常致不孕或流产,而且会加重缺血缺氧造成再生障碍-纤维化的恶性循环。临床上现有的治疗手段包括:手术,雌激素和术后放置屏障装置。但对于中重度宫腔粘连患者治疗效果差,难以恢复子宫内膜生理功能。如何促进受损子宫内膜的修复再生是临床治疗的难题。
干细胞具有多向分化能力、自我更新复制和免疫调节功能,已成为宫腔粘连细胞治疗的首要选择。然而,细胞疗法在内膜修复的临床应用中存在局限性例如:干细胞的体外运输和储存过程中的干性丢失、干细胞的致瘤性、干细胞的免疫源性、干细胞治疗难以标准化等。因此,不能将活细胞视为临床应用的现成产品。而干细胞旁分泌因子代替干细胞治疗,可克服活细胞治疗的不足,提供了一种无细胞的临床上可行的疗法。与传统的干细胞治疗相比,干细胞旁分泌因子具有易渗透入组织,低免疫源性,易储存等特点。目前研究较多的干细胞外泌体具有类似干细胞的内膜修复作用。
近年来,有多项研究表明,细胞凋亡小体在组织再生和胚胎发生过程中发挥了重要作用。细胞凋亡后产生的凋亡小体,包含多种活性小分子物质,促进临近细胞的修复再生。研究发现外源性干细胞移植后绝大多数移植细胞在短期内发生凋亡,然而干细胞移植仍发挥了一定的效应,因此推测干细胞凋亡后释放的凋亡小体具有一定的生物学功能。
发明内容
本发明的目的是克服上述背景技术的不足,提供一种用于修复子宫内膜并提高生育力的干细胞凋亡小体的制备方法,获得的凋亡小体可调控创面微环境,有效促进子宫内膜修复,显著提高生育率,避免了传统外源性细胞移植所带来的安全隐患;所述方法制备工艺简单,可操作性强。
本发明提供的技术方案是:
一种用于修复子宫内膜并提高生育力的干细胞凋亡小体的制备方法,所述方法非用于疾病诊断治疗;按如下步骤进行:
生长状态良好的干细胞,在汇合度大于75%时,采用500-700mJcm-2的紫外线照射,继续在完全培养基中培养18-30小时,取细胞培养上清进行离心处理,所得沉淀物为干细胞凋亡小体。
一种用于修复子宫内膜并提高生育力的干细胞活性小体的制备方法,所述方法非用于疾病诊断治疗;按如下步骤进行:
生长状态良好的干细胞,在汇合度达到80-90%时,采用600mJcm-2的紫外线照射,继续在完全培养基中培养24小时,取细胞培养上清使用300g离心10分钟,继续取上清使用12000g 4℃离心30分钟,所得沉淀物为干细胞凋亡小体。
所述干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、子宫内膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的一种或多种。
所述干细胞凋亡小体,其形貌为圆形,颗粒大小200-4800nm;表达Histone H3.3、Histone H2B、C3b、C1QC蛋白;其通过调节细胞能量代谢来促进子宫内膜细胞增殖、血管网状结构形成、巨噬细胞表型转变。
所述干细胞凋亡小体可用于制备干细胞凋亡小体透明质酸混合水凝胶复合体;制备方法是:将溶于磷酸盐缓冲液的干细胞凋亡小体与透明质酸水凝胶按照1:1体积比混合,4℃平衡24小时,即获得凋亡小体透明质酸混合水凝胶复合体。
一种用于修复子宫内膜并提高生育力的干细胞凋亡小体,应用于制备促进损伤子宫内膜修复和提高生育力潜能的药物。
本发明的有益效果是:所提供的干细胞凋亡小体通过激活细胞的能量代谢促进细胞增殖、血管网形成、巨噬细胞的表型改变;由于不含有活细胞,能避免使用外源性细胞移植带来的安全隐患;干细胞凋亡小体与透明质酸水凝胶联合构建水凝胶复合体的方式促进凋亡小体的潴留和在机体内的可持续释放,该水凝胶复合体的移植促进子宫内膜修复和生育功能恢复。本发明制备方法简单,不含外源细胞,生物安全性高。
附图说明
图1为实验计划和干细胞凋亡小体的表征图;其中:
图1中的a图为本发明的实验计划示意图;
图1中的b图为本发明所述干细胞凋亡小体的提取过程示意图;
图1中的c图为正常干细胞和诱导凋亡干细胞凋亡染色图;
图1中的d图为正常干细胞的凋亡小体产量和诱导凋亡干细胞的凋亡小体产量对比图;
图1中的e图为干细胞凋亡小体的电镜图和粒径分布图;
图1中的f图为干细胞凋亡小体的蛋白表达图。
图2为干细胞凋亡小体的体外生物学效应示意图;其中:
图2中的a图为巨噬细胞受凋亡小体作用后CD163与CD86的染色荧光图;
图2中的b图为巨噬细胞受干细胞凋亡小体作用后CD163与CD86的染色荧光表达统计图;
图2中的c图为巨噬细胞受凋亡小体作用后的促炎症基因表达改变图;
图2中的d图为巨噬细胞受凋亡小体作用后的促修复基因表达改变图;
图2中的e图为凋亡小体对子宫内膜间质细胞和Ishikawa细胞增殖影响图;
图2中的f图为血管内皮细胞在凋亡小体作用下的血管网形成情况图;
图2中的g图为血管内皮细胞在凋亡小体作用的血管网状结构的数量和面积统计图;
图2中的h图为凋亡小体对巨噬细胞、子宫内膜间质细胞、血管内皮细胞线粒体呼吸的影响图。
图3为含有凋亡小体的透明质酸水凝胶复合体的构建及其在小鼠子宫内膜急性损伤模型中的修复效应示意图;其中:
图3中的a图为水凝胶复合体的荧光图(其中凋亡小体带有红色荧光);
图3中的b图为水凝胶复合体的冷冻电镜图;
图3中的c图为水凝胶复合体中凋亡小体在体外的累积释放分析图;
图3中的d图为动物实验流程图;
图3中的e图为不同处理后12天内膜的HE染色和Masson染色图;
图3中的f图为子宫内膜厚度的统计图;
图3中的g图为腺体数目的统计图;
图3中的h图为纤维化程度的统计图。
图4为含有凋亡小体的透明质酸水凝胶复合体对生育功能的影响的影响示意图;其中:
图4中的a图为不同处理后各组子宫内膜容受性相关指标的荧光表达图;
图4中的b图为pan-CK表达的统计分析图;
图4中的c图为pan-CK和FOXA2共表达的统计分析图;
图4中的d图为pan-CK和ESR共表达的统计分析图;
图4中的e图为pan-CK和LIF共表达的统计分析图;
图4中的f图为每子宫妊娠数目统计图;
图4中的g图为水凝胶复合体移植组妊娠子宫随着妊娠时间延长的变化情况图;
图4中的h图水凝胶复合体移植组妊娠19天的子宫、相应的胚胎以及新生鼠图;
图4中的i图为水凝胶复合体移植组妊娠19天胎盘的HE染色图。
图5为体内机制的探索示意图,其中:
图5中的a图为不同处理后3天、7天各组内膜中巨噬细胞数目的统计分析图;
图5中的b图为不同处理后3天、7天各组内膜中M2型巨噬细胞数目的统计分析图;
图5中的c图为不同处理后3天、7天各组内膜中M1型巨噬细胞数目的统计分析图;
图5中的d图为不同处理后3天、7天各组内膜中增殖细胞数目的统计分析图;
图5中的e图为不同处理后3天、7天各组内膜中新生血管数目的统计分析图。
图6为含有凋亡小体的透明质酸水凝胶复合体在大鼠宫腔粘连模型中的修复效应示意图;其中:
图6中的a图为动物实验流程图;
图6中的b图为不同处理后30天、60天内膜的HE染色和Masson染色图;
图6中的c图为子宫内膜厚度的统计图;
图6中的d图为腺体数目的统计图;
图6中的e图为纤维化程度的统计图;
图6中的f图为每子宫妊娠数目统计图;
图6中的g图为水凝胶复合体移植组妊娠19天的子宫、相应的胚胎以及新生鼠图;
图6中的h图为水凝胶复合体移植组妊娠19天胎盘的HE染色图。
具体实施方式
下面结合附图所示实施例进一步说明。
发明人发现:间充质干细胞凋亡后的凋亡小体可进一步调节相关细胞的免疫反应、细胞增殖、细胞的能量代谢和血管再生,将凋亡小体和透明质酸水凝胶结合构建的水凝胶复合体移植最终促进组织再生修复。因此,本发明首次突破性地采用了诱导干细胞凋亡所产生的活性小体,制备过程简单,产量高,可改善受损子宫内膜创面微环境,进而促进内膜修复并显著提高生育力。
本发明由此提供的技术方案是:一种用于修复子宫内膜并提高生育力的干细胞凋亡小体的制备方法,按如下步骤进行:
所述干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、子宫内膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的一种或多种。
生长状态良好的干细胞,在汇合度达到80-90%时,采用600mJcm-2的紫外线照射或使用100mM H2O2处理1小时,继续在完全培养基中培养24小时,取细胞培养上清使用300g离心10分钟,继续取上清使用12000g 4℃离心30分钟,所得沉淀物使用磷酸盐缓冲液重悬,再次使用12000g 4℃离心30分钟,最后所得沉淀物为干细胞凋亡小体。
干细胞凋亡小体透明质酸混合水凝胶复合体的制备方法是:将溶于磷酸盐缓冲液的干细胞凋亡小体与透明质酸水凝胶按照1:1(体积比)混合,4℃平衡24小时,获得凋亡小体透明质酸混合水凝胶复合体。
分析
1、干细胞凋亡小体生物学功能的体外表征
提取腹腔巨噬细胞,在巨噬细胞培养上清中加入干细胞凋亡小体,培养24小时后,进行免疫荧光染色。提取巨噬细胞RNA,进行PCR检测。
采用血管内皮细胞进行小管形成试验,在血管内皮细胞的培养上清中加入干细胞凋亡小体,培养2小时后,光学显微镜观察小管形成情况。
提取人子宫内膜间质细胞,在培养上清中加入干细胞凋亡小体,分别在共培养后不同时间点(1、2、3、4、5、6、7、8天)采用CCK8试剂盒检测以获得细胞生长曲线。
上述3种细胞与干细胞凋亡小体共培养24小时后,使用Agilent Seahorse XF进行细胞氧气消耗速率检测以判断细胞的线粒体功能。
2、凋亡小体透明质酸水凝胶复合体的制备
将溶于磷酸盐缓冲液的干细胞凋亡小体与透明质酸水凝胶按照1:1(体积比)混合,4℃平衡24小时,获得凋亡小体透明质酸混合水凝胶复合体。
3、凋亡小体透明质酸水凝胶复合体在小鼠子宫内膜损伤模型中的效果。
采用C57雌鼠进行动物实验,过程如下:1、通过机械损伤法构建小鼠子宫内膜损伤模型,评估模型效果;2、将小鼠分2群,第一群小鼠的一侧子宫宫腔中进行子宫内膜损伤(NR),另一侧子宫宫腔中进行子宫内膜损伤和干细胞凋亡小体灌注(ABs);第二群小鼠的一侧子宫宫腔中进行子宫内膜损伤和透明质酸灌注(HA),另一侧子宫宫腔中进行子宫内膜损伤和干细胞凋亡小体透明质酸水凝胶复合体灌注(HA/ABs);在术后3天、7天进行免疫荧光检测探索机制,在术后12天比较各组子宫内膜修复效果,3、在手术后12天,将C57雌鼠与公鼠2:1合笼,在见阴道栓后4天检查子宫内膜处容受性相关指标的表达,在见阴道栓后15-17天处死小鼠,观察两侧子宫的妊娠情况及妊娠胚胎数量。
4、凋亡小体透明质酸水凝胶复合体在大鼠宫腔粘连模型中的效果。
采用雌性SD大鼠进行动物实验,过程如下:1、通过机械损伤后,经历15天的纤维组织形成,构建大鼠宫腔粘连模型,评估模型效果;2、将大鼠分2群,第一群大鼠的一侧子宫行宫腔粘连分离术(NR),另一侧子宫宫腔中进行宫腔粘连分离术和干细胞凋亡小体灌注(ABs);第二群大鼠的一侧子宫宫腔中进行宫腔粘连分离术和透明质酸灌注(HA),另一侧子宫宫腔中进行宫腔粘连分离术和干细胞凋亡小体透明质酸水凝胶复合体灌注(HA/ABs);在术后30、60天比较各组子宫内膜修复效果,3、在手术后60天,将雌鼠与公鼠2:1合笼,在见阴道栓后15-17天处死大鼠,观察两侧子宫的妊娠情况及妊娠胚胎数量。
所得结果如下:
1)实验设计和干细胞凋亡小体的表征
(1)总体实验设计如下:诱导凋亡后的干细胞释放凋亡小体,同透明质酸水凝胶结合后,构建一种凋亡小体透明质酸复合体,将该复合物注入受损宫腔后促进子宫内膜修复和生育功能恢复(参见图1中a图)。
(2)凋亡小体通过差速离心法获得,干细胞诱导凋亡后继续培养24小时,取培养上清,300×g离心10分钟去除死细胞,弃去沉淀,取上清12000×g离心30分钟,弃去上清,磷酸盐缓冲液重悬沉淀,再次12000×g离心30分钟,最后的沉淀即为凋亡小体(参见图1中b图)。
(3)经TUNEL染色(绿色)显示干细胞经诱导凋亡达到93%的凋亡率(参见图1中c图)。图中:Control为正常干细胞,UV为经紫外光照射后继续培养24小时的干细胞。
(4)紫外光照射诱导凋亡后的干细胞继续培养24小时,所获上清提取的凋亡小体(UV),较正常干细胞培养24小时后上清内提取的凋亡小体(Control)蛋白含量显著增加(参见图1中d图)。所用的统计学方法为t检验,**代表P<0.01。
(5)扫描电镜下显示的凋亡小体呈圆形,内含高密度物质(参见图1中e图);通过对扫描电镜下活性小体的颗粒直径统计获得活性小体的粒径分布,活性小体的颗粒大小在200-4800nm(参见图1中e图);
(6)Western-Blot实验显示活性小体表达了典型凋亡小体相关的蛋白成分:Histone H3.3、Histone H2b、C3b、C1QC。β-actin为内参蛋白(参见图1中f图)。
2)干细胞凋亡小体促使巨噬细胞向修复型转变、细胞增殖、血管网形成和提高细胞的能量代谢
(1)干细胞凋亡小体共培养后,巨噬细胞表达更多的CD163(修复型巨噬细胞标志),对CD86(炎症型巨噬细胞的标志)无影响(参见图2中a图和b图)。所用的统计学方法t检验,**代表P<0.01。
(2)干细胞凋亡小体共培养显著抑制了巨噬细胞中炎症相关基因(IL-1β、TNFα、IL-6、IFN-γ)的表达,促进了修复相关基因(IL-10、VEGFA、IGF1、TGFβ1)的表达(参见图2中c、d图)。所用的统计学方法为t检验,**代表P<0.01。图中:Con为巨噬细胞组,ABs为凋亡小体共培养24小时后的巨噬细胞组。
(3)干细胞凋亡小体共培养显著促进了子宫内膜间质细胞HESCS和Ishikawa细胞的增殖(参见图2e)。所用的统计学方法为t检验,**代表P<0.01。图中:Con为子宫内膜间质细胞组或Ishikawa细胞组;ABs为凋亡小体共培养下的子宫内膜间质细胞组或Ishikawa细胞组。
(4)干细胞凋亡小体共培养促进血管内皮细胞血管样结构的形成(参见图2中f、g图)。所用的统计学方法为t检验,**代表P<0.01。图中:Con为血管内皮细胞组,ABs为凋亡小体共培养下的血管内皮细胞组。
(5)干细胞凋亡小体共培养增加了巨噬细胞、子宫内膜间质细胞、血管内皮细胞基础呼吸和质子漏的耗氧,也增加了细胞的最大氧耗潜能(参见图2中h图)。所用的统计学方法为t检验,*代表P<0.05,**代表P<0.01。图中:Con为巨噬细胞组、子宫内膜间质细胞组或血管内皮细胞组,ABs为凋亡小体共培养下的巨噬细胞组、子宫内膜间质细胞组或血管内皮细胞组。
3)凋亡小体透明质酸水凝胶复合体的表征及其移植在小鼠子宫内膜损伤模型中促使子宫内膜修复和降低纤维化
(1)凋亡小体在凋亡小体透明质酸水凝胶复合体中均匀分布(参见图3中a图);扫描电镜显示凋亡小体嵌入在透明质酸水凝胶的孔隙中(参见图中3b图);体外研究显示凋亡小体从凋亡小体透明质酸水凝胶复合体中持续缓慢释放(参见图3中c图)。
(2)动物实验流程图表示:在术后3、7天进行机制探索,在术后12天观察修复效果,并开始合笼,在见阴道栓后4天观察子宫内膜容受性,在见阴道栓后6-19天观察妊娠情况(参见图3中d图)。
(3)凋亡小体透明质酸水凝胶复合体移植促进了子宫内膜厚度增加(参见图3中e、f图),腺体数目增加(参见图3中e、g图),降低了纤维化(参见图3中e、h图)。所用的统计学方法为ANOVA和Tukey多重比较,*代表P<0.05,**代表P<0.01。图中:NR为自然修复组;ABs为凋亡小体宫腔注射组;HA为透明质酸水凝胶注射组;HA/ABs,为凋亡小体透明质酸复合体注射组。
4)凋亡小体透明质酸水凝胶复合体在小鼠子宫内膜损伤模型中促进生育功能恢复
(1)凋亡小体透明质酸水凝胶复合体移植促进了子宫内膜容受性相关的各项指标的表达,包括pan-cytokeratin(pan-CK)、FOXA2、ESRα、LIF(参见图4中a、b、c、d、e图)。所用的统计学方法为ANOVA和Tukey多重比较,*代表P<0.05,**代表P<0.01。图中:NR为自然修复组;ABs为凋亡小体宫腔注射组;HA为透明质酸水凝胶注射组;HA/ABs,为凋亡小体透明质酸复合体注射组。
(2)凋亡小体透明质酸水凝胶复合体移植在小鼠子宫内膜损伤模型中提高了妊娠率(表1)。所用的统计学方法为Chi-square test,*代表P<0.05,**代表P<0.01。
(3)凋亡小体透明质酸水凝胶复合体移植在小鼠子宫内膜损伤模型中提高了每子宫妊娠胚胎数(参见图4中f图)。所用的统计学方法为Kruskal–Wallis test,**代表P<0.01。图中:NR为自然修复组;ABs为凋亡小体宫腔注射组;HA为透明质酸水凝胶注射组;HA/ABs,为凋亡小体透明质酸复合体注射组。
(4)凋亡小体透明质酸水凝胶复合体移植组显示了接近正常的胚胎发育进程,见栓后19天的胚胎外观正常,胎盘发育正常(参见图4中g、h、i图)。图中:GD代表见小鼠阴道栓后天数。
5)凋亡小体透明质酸水凝胶复合体在小鼠子宫内膜损伤模型中促进巨噬细胞免疫调控、细胞增殖和血管形成
(1)凋亡小体透明质酸水凝胶复合体移植促进了巨噬细胞募集(参见图5中a图,F4/80免疫荧光染色统计),促进了修复型巨噬细胞的募集(参见图5中b图,CD163免疫荧光染色统计),同样促进了炎症型巨噬细胞的募集(参见图5中c图,CD86免疫荧光染色统计)。所用的统计学方法为ANOVA和Tukey多重比较,*代表P<0.05,**代表P<0.01。图中:NR为自然修复组;ABs为凋亡小体宫腔注射组;HA为透明质酸水凝胶注射组;HA/ABs,为凋亡小体透明质酸复合体注射组。
(2)凋亡小体透明质酸水凝胶复合体移植促进了增殖细胞数量增加(参见图5中d图,Ki67免疫荧光染色统计)。所用的统计学方法为ANOVA和Tukey多重比较,*代表P<0.05,**代表P<0.01。图中:NR为自然修复组;ABs为凋亡小体宫腔注射组;HA为透明质酸水凝胶注射组;HA/ABs,为凋亡小体透明质酸复合体注射组。
(3)凋亡小体透明质酸水凝胶复合体移植促进了新生血管数量增加(参见图5中e图,CD31免疫荧光染色统计)。所用的统计学方法为ANOVA和Tukey多重比较,*代表P<0.05,**代表P<0.01。图中:NR为自然修复组;ABs为凋亡小体宫腔注射组;HA为透明质酸水凝胶注射组;HA/ABs,为凋亡小体透明质酸复合体注射组。
6)凋亡小体透明质酸水凝胶复合体在大鼠宫腔粘连模型中促进子宫内膜修复和生育功能恢复
(1)动物实验流程图表示:在术后30、60天观察修复效果,在术后60天交配,在见阴道栓后8-19天观察妊娠情况(参见图6中a图)。
(2)凋亡小体透明质酸水凝胶复合体在大鼠宫腔粘连模型中促进子宫内膜厚度增加(参见图6中b、c图),腺体数目增加(参见图6中b、d图),降低纤维化(参见图6中b、e图)。所用的统计学方法为ANOVA和Tukey多重比较,*代表P<0.05,**代表P<0.01。图中:NR为宫腔粘连分离后自然修复;ABs为宫腔粘连分离,同时凋亡小体宫腔内灌注;HA为宫腔粘连分离,同时透明质酸水凝胶宫腔内灌注;HA/ABs,为宫腔粘连分离,同时凋亡小体透明质酸水凝胶复合体宫腔内灌注。
(3)凋亡小体透明质酸水凝胶复合体在大鼠宫腔粘连模型中促进妊娠率提高(表2)。所用的统计学方法为Chi-square test,*代表P<0.05,**代表P<0.01。
(4)凋亡小体透明质酸水凝胶复合体移植在大鼠宫腔粘连模型中提高了每子宫妊娠胚胎数(参见图6中f图)。所用的统计学方法为Kruskal–Wallis test,**代表P<0.01。图中:NR为宫腔粘连分离后自然修复;ABs为宫腔粘连分离,同时凋亡小体宫腔内灌注;HA为宫腔粘连分离,同时透明质酸水凝胶宫腔内灌注;HA/ABs,为宫腔粘连分离,同时凋亡小体透明质酸水凝胶复合体宫腔内灌注。
(6)凋亡小体透明质酸水凝胶复合体移植组显示在见阴道栓后19天的胚胎外观正常,胎盘发育正常(参见图6中g、h图)。
结论:利用诱导间充质干细胞凋亡所产生的凋亡小体,其形貌为圆形,颗粒大小200-4800nm;表达Histone H3.3、Histone H2B、C3b、C1QC蛋白;该凋亡小体体外可调节参与修复的子宫内膜间质细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞的能量代谢,体外促进子宫内膜间质细胞增殖,巨噬细胞表型改变,血管样结构的形成。凋亡小体通过与透明质酸水凝胶结合构建了一种复合水凝胶体系,该体系可以促进凋亡小体的潴留和可持续释放。凋亡小体透明质酸水凝胶复合体移植促进子宫内膜修复、降低纤维化、提高子宫内膜容受性,最终促进生育功能恢复。
表l
a)p<0.05NR versus HA.b)p<0.01NR versus HA/ABs.
c)p<0.05ABs versus HA.d)p<0.01ABs versus HA/ABs.
表中:NR,自然修复组;ABs,凋亡小体宫腔注射组;HA,透明质酸水凝胶注射组;HA/ABs,凋亡小体透明质酸复合体注射组。
表2
a)p<0.01NR versus HA/ABs.b)p<0.05ABs versus HA/ABs.
c)p<0.01HA versus HA/ABs.
表中:NR,宫腔粘连分离后自然修复;ABs,宫腔粘连分离,同时凋亡小体宫腔内灌注;HA,宫腔粘连分离,同时透明质酸水凝胶宫腔内灌注;HA/ABs,宫腔粘连分离,同时凋亡小体透明质酸水凝胶复合体宫腔内灌注。
本发明的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。应当理解,在阅读了本发明的阐述内容后,本领域技术人员对本发明所做的修改,同样落于本发明所附权利要求书限定范围。
Claims (6)
1.一种用于修复子宫内膜并提高生育力的干细胞凋亡小体的制备方法,所述方法非用于疾病诊断治疗;按如下步骤进行:
生长状态良好的间充质干细胞,在汇合度达到80-90%时,采用600 mJcm-2的紫外线照射或使用 100mM H2O2 处理1小时,继续在完全培养基中培养24小时,取细胞培养上清使用300g离心10分钟,继续取上清使用12000g 4ºC离心30分钟,所得沉淀物使用磷酸盐缓冲液重悬,再次使用12000g 4ºC离心30分钟,最后所得沉淀物为干细胞凋亡小体。
2.根据权利要求1所述用于修复子宫内膜并提高生育力的干细胞凋亡小体的制备方法,其特征在于:所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、子宫内膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述用于修复子宫内膜并提高生育力的干细胞凋亡小体的制备方法,其特征在于:所述干细胞凋亡小体,其形貌为圆形,颗粒大小200-4800nm;表达HistoneH3.3、Histone H2B、C3b、C1QC蛋白;其通过调节细胞能量代谢来促进子宫内膜细胞增殖、血管网状结构形成、巨噬细胞表型转变。
4.一种凋亡小体透明质酸混合水凝胶复合体的制备方法,其特征在于:将溶于磷酸盐缓冲液的权利要求3所述制备方法制备得到的干细胞凋亡小体与透明质酸水凝胶按照1:1体积比混合,4ºC平衡24小时,即获得凋亡小体透明质酸混合水凝胶复合体。
5.权利要求1-3任一项所述的干细胞凋亡小体或权利要求4所述凋亡小体透明质酸混合水凝胶复合体在制备促进损伤子宫内膜修复和提高生育力潜能的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述药物的活性成分为所述的干细胞凋亡小体。
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