CN117224577B - 干细胞凋亡小体在制备治疗复发性流产的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种干细胞凋亡小体在制备治疗复发性流产或改善胎儿发育相关指标的药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明通过采用Staurosporine(STS)或者紫外照射诱导干细胞凋亡制备得到干细胞凋亡小体，发现这两种干细胞凋亡小体均能显著减少胚胎吸收率(即流产率)、改善胎鼠顶臀长、体重，促进子宫M2型巨噬细胞的极化。因此，这两种干细胞凋亡小体在治疗复发性流产或改善胎儿发育相关指标方面表现出极大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种干细胞凋亡小体在制备治疗复发性流产或改善胎儿发育相关指标的药物中的应用。
背景技术
复发性流产(RSA)，是指连续发生2次或2次以上的自然流产，多发生于妊娠早期，其发生率占育龄期妇女的5％以上。RSA的病因十分复杂，包括解剖学因素，内分泌因素，遗传因素，感染因素等。其中约有一半以上的RSA没有明确的病因，在临床上这被称为原因不明的RSA(URSA)。目前URSA尚无有效的治疗方法。
多项研究表明，复发性流产与母胎界面的巨噬细胞功能失调有关，复发性流产表现出子宫中M1型(促炎性)巨噬细胞异常增加，M2型(抑炎性)巨噬细胞减少的现象。因此增加母胎界面中M2型巨噬细胞可以缓解流产的发生。
然而，针对现有临床治疗手段的不足，如何开发一种能够针对原因不明的复发性流产的药物或是治疗手段，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明针对上述技术问题，从而提供一种干细胞凋亡小体在制备治疗复发性流产或改善胎儿发育相关指标的药物中的应用，以期为临床上原因不明的复发性流产提供一种新的药物或是治疗手段。
为了实现上述目的，本发明提供了一种干细胞凋亡小体在制备治疗复发性流产或改善胎儿发育相关指标的药物中的应用。
本发明人意外发明，通过制备干细胞凋亡小体，能够显著减少胚胎吸收率(即流产率)、改善胎鼠顶臀长、体重，促进子宫M2型巨噬细胞的极化。因此，本发明的干细胞凋亡小体在治疗复发性流产或改善胎儿发育相关指标方面具有很好的应用前景。
进一步的是，所述干细胞凋亡小体是通过采用Staurosporine(STS)或者紫外(UV)照射诱导干细胞凋亡制备得到。
进一步的是，所述Staurosporine(STS)的施用浓度为0.5μM。
进一步的是，所述紫外照射的强度为600mJ/cm2。
进一步的是，所述干细胞包括人脐带间充质干细胞。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明提供了一种干细胞凋亡小体的新的应用，其在治疗复发性流产或改善胎儿发育相关指标方面具有较好的应用前景；
(2)本发明提供的干细胞凋亡小体可以通过Staurosporine(STS)或者紫外(UV)照射诱导干细胞凋亡制备得到，这两种方法制备得到的干细胞凋亡小体均能显著减少胚胎吸收率(即流产率)、改善胎鼠顶臀长、体重，促进子宫M2型巨噬细胞的极化。
附图说明
图1为两种凋亡小体的制备方法和鉴定；(A)人脐带间充质干细胞(MSC)经Staurosporine(STS)药物或者紫外(UV)照射诱导凋亡小体(MSC-STS-ABs；MSC-UV-ABs)的流程示意图；(B)电镜下拍照观察MSC-STS-ABs和MSC-UV-ABs两种凋亡小体；(C)MSC-STS-ABs和MSC-UV-ABs分别标记Annexin V-FITC后，流式检测Annexin V的荧光强度；(D)MSC-STS-ABs和MSC-UV-ABs分别标记Annexin V-FITC后，在荧光显微镜下观察Annexin V的分布。
图2为腹腔注射LPS诱导的小鼠流产模型中，两种凋亡小体治疗效果；(A)各组小鼠的子宫、胎鼠和胎盘外观代表图：Control组指正常妊娠，LPS组指腹腔注射LPS诱导流产组，STS-ABs组指用腹腔注射STS-ABs治疗LPS诱导流产小鼠，UV-ABs组指用腹腔注射UV-ABs治疗LPS诱导流产小鼠；(B)各组小鼠的胚胎吸收率统计图；(C)各组小鼠的胎鼠顶臀长统计图；(D)各组小鼠的胎鼠重量统计图；(E)各组小鼠的胎盘重量统计图(*，P＜0.05，**，P＜0.01，***,P＜0.001，****,P＜0.0001，NS，无统计学意义)。
图3为腹腔注射LPS诱导的小鼠流产模型中，两种凋亡小体对子宫巨噬细胞的调控作用；(A)各组小鼠子宫F4/80+巨噬细胞CD163表达情况的代表性流式图：Control组指正常妊娠，LPS组指腹腔注射LPS诱导流产组，STS-ABs组指用腹腔注射STS-ABs治疗LPS诱导流产小鼠，UV-ABs组指用腹腔注射UV-ABs治疗LPS诱导流产小鼠；(B)各组小鼠子宫F4/80+巨噬细胞CD163阳性比例的统计图；(C)各组小鼠子宫F4/80+巨噬细胞CD86平均荧光强度的代表性流式图；(D)各组小鼠子宫F4/80+巨噬细胞CD86平均荧光强度的统计图(*，P＜0.05，**，P＜0.01，***,P＜0.001，****,P＜0.0001，NS，无统计学意义)。
图4为CBA/J雌鼠和DBA2雄鼠交配流产模型中，两种凋亡小体治疗效果；(A)各组小鼠的子宫、胎鼠和胎盘外观代表图：Control组指CBA/J雌鼠和Balb/c雄鼠交配正常妊娠，Abortion组指CBA/J雌鼠和DBA2雄鼠交配诱导流产组，STS-ABs组指用腹腔注射STS-ABs治疗CBA/J流产模型小鼠，UV-ABs组指用腹腔注射UV-ABs治疗CBA/J流产模型小鼠；(B)各组小鼠的胚胎吸收率统计图；(C)各组小鼠的胎鼠顶臀长统计图；(D)各组小鼠的胎鼠重量统计图；(E)各组小鼠的胎盘重量统计图(*，P＜0.05，**，P＜0.01，***,P＜0.001，****,P＜0.0001，NS，无统计学意义)。
图5为CBA/J雌鼠和DBA2雄鼠交配流产模型中，两种凋亡小体对子宫巨噬细胞的调控作用；(A)各组小鼠子宫F4/80+巨噬细胞CD163表达情况的代表性流式图：Control组指CBA/J雌鼠和Balb/c雄鼠交配的正常妊娠，Abortion组指CBA/J雌鼠和DBA2雄鼠交配诱导的流产，STS-ABs组指用腹腔注射STS-ABs治疗CBA/J流产模型小鼠，UV-ABs组指用腹腔注射UV-ABs治疗CBA/J流产模型小鼠；(B)各组小鼠子宫F4/80+巨噬细胞CD163阳性比例的统计图；(C)各组小鼠子宫F4/80+巨噬细胞CD86平均荧光强度的代表性流式图；(D)各组小鼠子宫F4/80+巨噬细胞CD86平均荧光强度的统计图(*，P＜0.05，**，P＜0.01，***,P＜0.001，****,P＜0.0001，NS，无统计学意义)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本发明提供的干细胞凋亡小体的制备方法如下：
(一)人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的提取及培养
无菌取剖宫产新鲜脐带(脐带标本均为正常足月剖宫产新生儿脐带，排除母儿各种传染性疾病及家族遗传病，获得产妇及家属知情同意)约10cm，生理盐水洗去脐带残留血液，漂洗2-3次，纵行剖开脐带，剔除1条脐静脉、两条脐动脉，剥离华通胶。用眼科剪将华通胶剪碎成1mm2的小组织块，转移至细胞培养皿中，加入含有体积分数为10％FBS、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM/F12培养液，于5％CO2、37℃的培养箱中静置培养。每2-3d半换液，待细胞长至80％～90％融合时用胰蛋白酶/EDTA消化液消化传代。
(二)人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的鉴定
采用流式细胞术检测hUC-MSCs表型特征为CD105(+)、CD73(+)、CD166(+)、CD44(+)、CD34(－)、CD45(－)、CD11b(－)、CD14(－)、HLA-DR(－)，并成功诱导hUC-MSCs发生成骨、成脂肪分化，确保所应用的hUC-MSCs已达科研标准。
(三)梯度离心法提取凋亡小体
P4-P8代hUC-MSCs细胞采用0.5μM Staurosporine(STS)药物或者600mJ/cm2紫外(UV)照射诱导凋亡，分别于5％CO2、37℃的培养箱中静置培养12小时与24小时后，收集上清，4℃，800g，10min离心去细胞碎片，取上清，4℃，16000g，30min离心获得凋亡小体，PBS清洗2遍，分别记为：MSC-STS-ABs和MSC-UV-ABs。使用BCA法测定蛋白浓度，2μg/μL储存。
(四)干细胞凋亡小体的鉴定
(1)透射电子显微镜观察hUC-MSCs-ABs形态
将所提的hUC-MSCs-ABs悬液稀释10倍，混匀，滴加10μL至2nm载样铜网上，在室温条件下静置3～5min后使用滤纸吸取多余液体；滴加10μL磷钨酸溶液染色3～5min后使用滤纸吸取多余染色剂；待样品干燥后，透射电子显微镜观察所提hUC-MSCs-ABs形态并拍照。
(2)hUC-MSCs-ABs标志物的检测
1、流式细胞学检测
取20μL所提的hUC-MSCs-ABs悬液稀释至100μL，加入5μLAnnxin V-FITC抗体(thermo 88-8005-74)，避光常温孵育15min后4℃、16000g离心10min，取出EP管倒掉上清液留沉淀，用PBS重悬hUC-MSCs-ABs后移至流式管中，上机检测。
2、免疫荧光检测
取20μL所提的hUC-MSCs-ABs悬液稀释至100μL，加入5μLAnnxin V-FITC抗体(thermo fisher 88-8005-74)，300nM DAPI(thermo fisher D3571)避光常温孵育15min，后4℃、16000g离心10min，取出EP管倒掉上清液留沉淀，用PBS重悬hUC-MSCs-ABs后滴加10μL至干净的载玻片上，盖上盖玻片，在盖玻片四周涂少量指甲油进行固定，置于暗盒中，使用激光扫描共聚焦显微镜进行图像采集。
(五)动物模型建立
LPS流产模型：8周龄ICR小鼠合笼后雌鼠见栓日记为D0.5，分别于之后第9.5天、11.5天、13.5天(分别记为D9.5、D11.5、D13.5)腹腔注射20μg/kg、200μL LPS诱导流产；于第8.5天、10.5天和12.5天(分别记为D8.5、D10.5、D12.5)腹腔注射100μg/次200μLhUC-MSCs-ABs缓解流产；同等体积PBS溶液腹腔注射作为空白对照，于第14.5天(D14.5)处死小鼠，统计胚胎吸收率(即流产率)、胎鼠顶臀长、体重、胎盘重量和子宫M1、M2型巨噬细胞比例。
CBA/J流产模型：CBA/J雌鼠和DBA2雄鼠交配诱导流产，CBA/J雌鼠和Balb/c雄鼠交配作为对照，合笼前CBA/J雌鼠腹腔注射100μg/次200μL hUC-MSCs-ABs 1次，见栓后分别于D8.5、D10.5、D12.5腹腔注射100μg/次、200μL hUC-MSCs-ABs缓解流产，同等体积PBS溶液腹腔注射作为空白对照，于D14.5处死小鼠，统计胚胎吸收率(即流产率)、胎鼠顶臀长、体重、胎盘重量和子宫M1、M2型巨噬细胞比例。
上述实验结果如图1-图5所示。
1.hUC-MSCs-ABss对小鼠流产总体的影响
在两种复发性流产小鼠模型中评估STS药物及紫外照射诱导的干细胞凋亡小体减轻流产的有效性。在图2和图4中显示Control组(对照组)胎鼠流产率接近于0，且胎鼠身型饱满，个头较大，颜色偏深。正相反，流产组胎鼠流产率高达50％，且存活胎鼠个头偏小，颜色偏浅。但与Control组相比，流产组存活胎鼠胎盘质量、大小、颜色无明显变化。与流产组相比，MSC-STS-ABs组与MSC-UV-ABs组流产率均明显下降，且存活胎鼠顶臀长、重量明显上升，表明hUC-MSCs-ABs具有良好的治疗复发性流产及改善胎儿生长指标的效果。
2.hUC-MSCs-ABss对流产小鼠子宫巨噬细胞比例的影响
本发明使用流式细胞术检测hUC-MSCs-ABss对流产小鼠子宫巨噬细胞比例的影响。我们通过巨噬细胞特异性表面标志分子F4/80筛选目的细胞群，并进一步检测M1型巨噬细胞表面标志分子CD86、M2型巨噬细胞表面标志分子CD163来反映细胞极化类型。在图3和图5中显示，Control组小鼠子宫M2型巨噬细胞约占10％，流产组中M2型巨噬细胞比例明显下降，M1型巨噬细胞比例明显上升。相对于流产组，MSC-STS-ABs组与MSC-UV-ABs组小鼠子宫M2型巨噬细胞均明显上升，但CD86无明显变化。表明hUC-MSCs-ABs促进子宫M2型巨噬细胞的极化。
因此，本发明提供的两种干细胞凋亡小体在治疗复发性流产或改善胎儿发育相关指标方面具有很好的应用前景，可用于制备相应的药物。
Claims (4)
1.人脐带间充质干细胞凋亡小体在制备治疗复发性流产或改善胎儿顶臀长和重量发育相关指标的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞凋亡小体是通过采用Staurosporine或者紫外照射诱导干细胞凋亡制备得到。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述Staurosporine的施用浓度为0.5μM。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述紫外照射的强度为600mJ/cm2。
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