CN116139159A - 一种prdx6蛋白的抑制剂在制备改善氧化应激损伤的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PRDX6蛋白的抑制剂在制备改善氧化应激损伤的药物中的应用，涉及生物医药技术领域。本发明揭示了PRDX6蛋白在触发NADPH氧化酶2(NOX2)组装激活过程中的生物学过程和作用，发现PRDX6蛋白可以促使RAC亚基从RAC‑GDI复合物中解离与NOX2的组装激活，而抑制PRDX6蛋白的磷脂酶A2口袋，有效提高RAC‑GDI复合物的稳定性，从而降低超氧阴离子的产生。本发明为缓解超氧阴离子诱导的氧化应激损伤提供了新的应对策略，为预防和/或治疗氧化应激疾病提供了新靶点和候选药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种PRDX6蛋白的抑制剂在制备改善氧化应激损伤的药物中的应用。
背景技术
细胞功能的调节依赖于氧化还原稳态的平衡。在生物系统中活性氧(reactiveoxygen species，ROS)是一组异质的可氧化靶标的高活性的自由基和非自由基分子，包含了超氧阴离子(O2 -)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)、臭氧(O3)和单线态氧(1O2)等。机体内ROS的主要来源之一是由线粒体内膜的呼吸链蛋白酶复合体Ⅰ和Ⅲ产生。在电子传递过程中，线粒体电子传递链复合物将一部分O2还原形成O2 -或H2O2。另一部分ROS是由NADPH氧化酶(NOX)产生的。NOX是氧化细胞内NADPH/NADH的跨膜酶，通过电子跨膜传输将分子氧还原为超氧化物，即超氧自由基(·O2-)，并能引发体内脂质过氧化，从而导致广泛的细胞破坏。其催化亚基被称为NADPH氧化酶2(NADPH oxidase2，NOX2/gp91phax)。NOX2可以大量存在于吞噬细胞和其他组织细胞中，可产生杀死摄入病原体所需的氧化风暴，参与多形核白细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和内皮细胞等的超氧自由基产生。同时也是受损组织中超氧自由基的最主要来源，可以加快皮肤和器官的衰老过程，并可诱发氧化应激损伤、心血管疾病、癌症等，严重危害人体健康。
NOX2由两个膜结合亚基gp91 phox和p22 phox和四个细胞质亚基p47 phox、p67phox、p40 phox和RAC。当受到刺激时，细胞质亚基被激活，转移到细胞膜上，并与膜亚基结合。其中，细胞质亚基RAC脱离与Rho-GDI结合状态的异源二聚体，将由非活性GDP-RAC转变为活性GTP-RAC。细胞质亚基和膜蛋白亚基的共组装是激活NOX2所必需的。研究发现，细菌、细胞因子和脂多糖(LPS)相关的信号级联已被确定为激活NOX2的生理刺激物。然而，NOX2的过度活化会增加超氧自由基的产生，诱导脂质过氧化，并最终导致体内超氧自由基介导的氧化应激损伤。
PRDX6属于过氧化物酶的抗氧化酶家族，它能水解过氧化物和过氧化大分子以保护细胞免受氧化应激损伤，其涉及神经变性、急性和慢性组织损伤以及癌症等各种疾病。在哺乳动物过氧化物酶家族中，PRDX6是一种同时具有磷脂酶A2(PLA2)和过氧化物酶活性的过氧化物酶。PLA2活性可以催化甘油磷脂sn-2位酰基的水解，该酶对磷脂酰胆碱具有特殊的亲和力，可生成游离脂肪酸、花生四烯酸(AA)和溶血磷脂，可以引发细胞过氧化和膜损伤。
基于NOX2作为改善氧化应激类疾病的关键靶点及其在疾病治疗中的作用，中国专利公开了系列NOX2酶的相关专利。包括NADPH氧化酶2作为治疗靶点在制备治疗血管功能紊乱的药物中的应用(CN 114515337 A)；NADPH氧化酶2抑制剂在制备药物中的用途(CN114129732 A)；NADPH在制备预防和/或治疗神经退行性疾病药物中的应用(CN 114469982A)；五味子乙素在制备氧化酶抑制剂中的应用(CN 104147001A)；一种NADPH的纯化工艺(CN108431015 B)；一种NADPH的分离纯化方法(CN108132318B)等。但对PRDX6抑制剂及其在疾病防治中的作用则没有涉及。
明确PRDX6蛋白在NOX2激活过程中的生物学过程和机制，发现改善氧化应激作用新靶点，开发有效的抑制剂药物，可以为临床治疗氧化应激损伤相关疾病提供新的策略。
发明内容
本发明的目的是提供一种PRDX6蛋白的抑制剂在制备改善氧化应激损伤的药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明公开抑制PRDX6的磷脂酶A2口袋，可以有效提高RAC-GDI复合物的稳定性，从而降低超氧阴离子的产生，本发明为缓解超氧阴离子诱导的氧化应激损伤提供了新的应对策略，为预防和/或治疗氧化应激疾病提供了新靶点。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种PRDX6蛋白的抑制剂在制备改善氧化应激损伤的药物中的应用。
进一步地，所述抑制剂通过抑制磷脂酶A2口袋的活性来抑制PRDX6蛋白活性。
进一步地，所述抑制剂为MJ33和/或黄芪甲苷。
进一步地，所述抑制剂通过防止RAC亚基从RAC-GDI复合物中解离，来抑制NADPH氧化酶2的组装激活。
进一步地，所述氧化应激损伤的发生部位为肺、肝和/或肾。
本发明还提供一种改善氧化应激损伤的药物，活性成分包括PRDX6蛋白的抑制剂。
进一步地，所述抑制剂为MJ33和/或黄芪甲苷。
进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
进一步地，所述药物的剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、注射剂、丸剂或口服液。
本发明公开了以下技术效果：
1、本发明揭示了PRDX6蛋白在触发NADPH氧化酶2(NOX2)组装激活过程中的生物学过程和作用，为开发拮抗超氧阴离子引发的氧化应激损伤的药物研发提供了新的靶点。本发明公开了PRDX6蛋白抑制剂在制备抑制超氧阴离子引发的氧化应激损伤药物中的应用。通过靶向PLA2口袋可以降低PRDX6蛋白的PLA2酶活性，稳定RAC-GDI复合物，阻止NOX2的组装激活和超氧阴离子产生，进而达到防止氧化应激损伤的作用。
2、本发明公开了PRDX6蛋白PLA2口袋的抑制剂MJ33和黄芪甲苷。其通过靶向PRDX6催化三联体抑制了PRDX6酶活性，阻止了PRDX6与RAC的结合，稳定RAC-GDI蛋白复合物结构，延缓了NOX2的组装激活。
3、本发明公开了PRDX6抑制剂MJ33和黄芪甲苷对LPS诱导的RAW264.7细胞中磷脂酶A2、花生四烯酸及ROS的产生具有抑制作用。靶向PRDX6的PLA2口袋可以抑制NOX2复合物组装，并减轻RAW 264.7细胞中的超氧阴离子的释放。
4、本发明公开了利用铜绿假单胞菌诱导的小鼠急性肺损伤模型，PRDX6抑制剂黄芪甲苷可以阻止RAC的活化解离，减缓NOX2的组装，抑制肺组织ROS的产生，改善了氧化应激损伤，提高了小鼠存活率。
5、本发明公开了利用LPS诱导的小鼠急性肝肾损伤模型，PRDX6抑制剂黄芪甲苷及MJ33可以改善肝肾组织生化指标，增强肝肾功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为黄芪甲苷(AST)为PRDX6蛋白PLA2口袋的抑制剂；其中，A：黄芪甲苷对PRDX6的过氧化物酶活的影响；B：对PRDX6的PLA2活性的影响；C：黄芪甲苷和PRDX6的表面等离子共振分析；D：PRDX6蛋白和100μM黄芪甲苷之间的荧光热漂移分析；E：圆二色谱技术测定100μM黄芪甲苷对PRDX6蛋白二级构象的影响；F：黄芪甲苷与PRDX6蛋白的PLA2催化三联体口袋之间的分子对接；G：黄芪甲苷与野生型PRDX6蛋白或其催化三联体突变体(H26G、S32G、D140G)蛋白的表面等离子共振互作分析；
图2为基于LPS诱导RAW264.7细胞的PRDX6免疫共沉淀蛋白质谱鉴定分析；
图3为RAC-GDI的蛋白结合模式分子动力学模拟；
图4为RAC-PRDX6的蛋白结合模式分子动力学模拟；
图5为RAC-PRDX6/AST的蛋白结合模式分子动力学模拟；
图6为微量热泳动法考察RAC、GDI与PRDX6的相互作用；
图7为微量热泳动法考察PRDX6对RAC-GDI互作的影响；
图8为黄芪甲苷对PRDX6-RAC互作的微量热泳动分析；
图9为氧化应激条件下黄芪甲苷对PRDX6-RAC互作的免疫共沉淀分析；###P<0.001vs.Con；**P<0.01vs.LPS；
图10为检测氧化应激条件下黄芪甲苷对RAC-GDI互作的免疫共沉淀分析；#P<0.05vs.Con；*P<0.05vs.LPS；
图11为PRDX6的蛋白干扰对黄芪甲苷抑制ROS释放的影响；###P<0.001vs.Con；**P<0.01vs.LPS；
图12为PRDX6抑制剂影响NOX2复合物组装减缓RAW 264.7细胞超氧阴离子的释放；其中，A：PRDX6的PLA2抑制剂MJ33和黄芪甲苷对RAW 264.7细胞PLA2活性的影响；B：MJ33和黄芪甲苷对RAW 264.7细胞花生四烯酸(AA)生产的影响；C：MJ33和黄芪甲苷对RAW 264.7细胞ROS生成的影响；D：PRDX6和RAC蛋白亚基的荧光共定位分析；E：p47 phox和gp91phox蛋白亚基的荧光共定位分析；F：RAW264.7细胞中超氧化物酶活性；G：RAW 264.7细胞中超氧阴离子含量；##P<0.01，###P<0.001vs.Con；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs.LPS；
图13为黄芪甲苷抑制NOX2复合物组装改善铜绿假单胞菌诱导的小鼠急性肺损伤；其中，A：黄芪甲苷对急性肺损伤模型小鼠存活率的影响；B：急性肺损伤小鼠肺组织的H&E染色分析；C：铜绿假单胞菌小鼠肺组织的免疫荧光染色考察；D：DCFH-DA法小鼠肺组织ROS水平的考察；E：黄芪甲苷对小鼠肺组织中PLA2的影响；F：黄芪甲苷对小鼠肺组织中AA含量的影响；G：急性肺损伤小鼠肺组织PRDX6和RAC蛋白亚基的荧光共定位分析；H：急性肺损伤小鼠肺组织p47 phox和gp91phox蛋白的荧光共定位分析；###P<0.001vs.Con和*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs.Mod；
图14为PRDX6的PLA2口袋抑制剂可以改善LPS诱发的氧化应激导致的急性肝肾损伤；其中，A：LPS诱导急性损伤小鼠外周血中ROS含量的测定；B-K：代表性肝肾功能指标间接胆红素(B)、总蛋白(C)、谷丙转氨酶(D)、谷草转氨酶(E)、总胆红素(F)、白球比(G)、球蛋白(H)、白蛋白(I)、尿素(J)和肌酐(K)的测定；###P<0.001，#P<0.05，vs.Con；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs.Mod。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1黄芪甲苷作为PRDX6蛋白PLA2口袋的抑制剂
1.材料与方法
1.1过氧化物酶和PLA2酶活的测定
过氧化物酶活性的测定利用谷胱甘肽还原酶对谷胱甘肽的还原过程中对NADPH的氧化作用间接的测定。将重组PRDX6(野生和突变的PRDX6质粒均委托深圳华大基因公司设计合成并表达纯化)与等摩尔量的πGST(胎盘型谷胱甘肽-S-转移酶)混合后，室温下预孵育30min。采用多功能酶标仪(Spark 10M)连续观测荧光强度的变化，(λEx:340nm，λEe:460nm)。待基线稳定后，加入底物(7.6μM H2O2)开始反应，记录荧光30min内的变化，考察过氧化物酶的活性。阳性药物采用10μM过氧化物酶抑制剂NAC(上海碧云天生物技术有限公司，ST1546-10g)，供试品采用10μM和100μM黄芪甲苷(AST，上海麦克林生化科技股份有限公司，A928102-5g)。另外根据
PLA2 Assay Kit说明书(Invitrogen，E10217)，分别测定1.56μM至100μM黄芪甲苷对PRDX6蛋白PLA2酶活的抑制活性。重组PRDX6蛋白、细胞以及组织中的过氧化物酶和PLA2的酶活均采用上述方法测定。
重组PRDX6蛋白的氨基酸序列为：
MPGGLLLGDVAPNFEANTTVGRIRFHDFLGDSWGILFSHPRDFTPVCTTELGRAAKLAPEFAKRNVKLIALSIDSVEDHLAWSKDINAYNCEEPTEKLPFPIIDDRNRELAILLGMLDPAEKDEKGMPVTARVVFVFGPDKKLKLSILYPATTGRNFDEILRVVISLQLTAEKRVATPVDWKDGDSVMVLPTIPEEEAKKLFPKGVFTKELPSGKKYLRYTPQP。
1.2表面等离子共振(SPR)
采用GE公司的Biacore T200表面等离子共振仪分析小分子抑制剂与重组PRDX6蛋白的相互作用。本发明选取CM5芯片，将纯化的PRDX6蛋白固定于芯片的通道上，将黄芪甲苷溶液作为流动相流过芯片。流动相流速30μL/min，浓度设定在1.95μM至62.5μM，监测解离150s。通过结合力计算得到解离常数KD值的大小。
1.3荧光热漂移(FTS)
采用荧光热漂移法探究黄芪甲苷对PRDX6蛋白热稳定性的影响。PRDX6蛋白浓度设定为10μM，黄芪甲苷浓度为10μM。采用Protein Thermal Shift Dye KitTM(美国赛默飞科技公司，4461146)进行检测。储备液按照说明稀释到4000倍作为工作浓度，操作过程避光。取50μL蛋白溶液、50μL黄芪甲苷溶液及1μL稀释后的Dye KitTM充分混匀，加入96孔PCR板中，采用实时
96PCR仪(瑞士罗氏公司，LC96)进行检测。数据使用/>
96SW 1.1进行处理。
1.4圆二色光谱法(CD)
取纯化后的PRDX6蛋白(10μM)与黄芪甲苷(10μM)4℃下孵育过夜。采用圆二色谱仪(法国biologic公司，MOS-450)进行检测。扫描参数设置为：波长范围200nm至300nm，间隔1nm，重复1扫描次，测试完毕后进行数据处理及分析。
2.结果
过氧化物酶酶活检测结果如图1中A所示，10μM NAC对过氧化物酶活性的具有显著抑制作用，而高剂量的黄芪甲苷(100μM)几乎不影响其过氧化物酶活性。而相对PLA2酶活，黄芪甲苷可剂量依赖性的抑制PLA2酶活(图1中B)。结果表明，黄芪甲苷通过抑制PRDX6蛋白的PLA2活性来发挥作用。
小分子与蛋白的互作分析的SPR测量结果也显示，黄芪甲苷与固定化的PRDX6蛋白的结合解离常数(KD)为6.4μM(图1中C)。荧光热漂移测定显示，100μM黄芪甲苷可以使PRDX6的解链温度增加了5.2℃(ΔTm)(图1中D)。进一步的圆二色光谱分析提示，经黄芪甲苷处理后，PRDX6的二级结构发生了变化，由原来的α-螺旋-84.3％、β-折叠-9.4％、转角-6.3％变为α-螺旋-54.8％、β-折叠-21.9％、转角-23.3％(图1中E)。上述结果表明，黄芪甲苷与PRDX6蛋白存在相互作用，可以改变PRDX6的构象和结构稳定性。
从PDB数据库中下载PRDX6蛋白的晶体结构，采用AutoDock(Vina 1.1.2)用于PRDX6(PDB ID:1PRX)和AST之间的模拟对接分析。独立计算运行30次，通过获取稳定结合状态展示出黄芪甲苷与PRDX6的关键氨基酸的结合情况。AutoDock对接结果如图1中F，黑色圆圈标记了以Cys47为活性中心的过氧化物酶袋，黄色虚线方块是PRDX6的PLA2酶催化三联体域。如右测放大图像所示，黄芪甲苷与PLA2催化三联体(SER32-HIS26-ASP140)之间存在相互作用。进一步将PLA2口袋中催化三联体的关键残基(H26、S32和D140)突变为甘氨酸后，采用SPR再次测定黄芪甲苷与PRDX6的结合亲和力。结果如图1中G显示，与野生型(WT)PRDX6相比，黄芪甲苷与三联突变体3个蛋白(H26G、S32G和D140G)的结合几乎完全消失。上述结果表明，黄芪甲苷作为PRDX6的磷脂酶A2抑制剂通过与PLA2口袋的催化三联体相互作用而发挥脂酶抑制活性。
实施例2 PRDX6可以促使RAC-GDI复合物解离和ROS产生
1.材料与方法
1.1免疫共沉淀检测(CO-IP)
取200μLRAW264.7细胞裂解物(5mg/mL)与5μg PRDX6抗体(ABCAM，ab73350)或GDI抗体(ABCAM，ab108977)在4℃下孵育过夜。随后将2wt％脱脂牛奶预处理的蛋白A/G琼脂糖珠(Med Chem Express，HY-K0202)加入到裂解液中孵育3h。将珠子用预冷的PBS充分洗涤后，分别采用蛋白质印迹分析和HPLC-MS/MS鉴定(委托深圳华大基因公司检测)考察CO-IP情况。
1.2分子动力学模拟
分别从RCSB蛋白质数据库(www.rcsb.org)下载RAC(PDB ID:1HH4)、GDI(PDBID:1HH4)和PRDX6(PDB ID:1PRX)的3D蛋白结构。利用Amber 14和AmberTools15程序用于选取动力学优势构象。所有的分子模拟均采用Dell Precision T5500工作站进行。使用AmberTools 15软件计算结合自由能(ΔGbind，单位为kcal/mol)。结合自由能计算方法如下：ΔGbind＝Gcomplex-Gprotein-Gligand。其中ΔGbind是结合自由能，Gcomplex、Gprotein和Gligand分别是复合物、蛋白质和配体的自由能。
1.3微量热泳动(MST)
使用MonolithNT.115仪器(Germany，Nano Temper，Munich)进行MST测量。蛋白质标记试剂盒RED-NHS染料(L001 Monolith NT.115)用于标记纯化的蛋白质。将小分子或蛋白样品与标记的蛋白孵育，并按照浓度梯度浸入亲水性硅毛细管(K004MonolithNT.115)中，收集MST曲线并使用Monolith软件进行数据评估。
1.4活性氧ROS的测定
采用DCFH-DA探针法进行ROS测定。将RAW264.7细胞(购自武汉普诺赛生命科技有限公司)以1×105/mL的细胞密度接种在共聚焦培养皿或96孔细胞培养板中，使用脂多糖LPS(1μg/mL)诱导细胞产生氧化应激损伤。分别采用不同浓度的药物干预8h后，考察细胞ROS的变化。具体将5μM DCFH-DA探针(ROS分析试剂盒，北京索莱宝生物科技有限公司，CA1410)加入到RAW264.7细胞中，避光孵育30min。经预冷PBS洗三次后，采用多功能酶标仪(λEx：488nm，λEe：525nm)测量荧光值。
1.5细胞PRDX6蛋白的干扰表达
PRDX6 siRNA(abx904221)质粒购自Abbexa，Ltd.。待RAW264.7细胞生长至70％密度后，使用LipofectamineTM 3000转染试剂(Invitrogen，L3000015)转染PRDX6siRNA质粒6h。随后更换为新鲜的培养基继续培养24h。通过蛋白质印迹检查PRDX6蛋白的表达情况检查干扰效率。
2.结果
氧化应激下NOX2的活化是超氧自由基的主要来源，为了进一步探索在氧化应激下PRDX6与其他氧化应激相关蛋白的相互作用(PPI)，利用LPS诱导RAW264.7细胞构建氧化应激模型，通过免疫共沉淀分析以及蛋白质谱鉴定分析考察PRDX6与其相关蛋白的互作情况。结果如图2所示，LPS诱导后与正常细胞相比Pwp1、Phb、Eef2和RAC四个蛋白的表达量有明显增加(LPS/Con>2)。其中，经生物信息学分析只有RAC蛋白与超氧自由基释放相关，被认为是与PRDX6相关的氧化应激靶点。
RAC-GDI异源二聚体是NOX2的激活因子，为了证明PRDX6通过竞争RAC-GDI异源二聚体，使RAC亚基游离并促使NOX2组装激活，本发明进行了分子动力学模拟计算。结果如图3-5所示，RAC-GDI和RAC-PRDX6复合物分别共享了多个结合位点，主要残基在柱形图中以红色标记。在RAC-GDI复合物(ΔGbind＝-126.5kcal/mol)中除氢键相互作用外，RAC的Leu-67、Leu-70和Pro-73残基与GDI存在范德华力相互作用，在RAC-PRDX6复合物(ΔGbind＝-30.5kcal/mol)中也存在以上三个位点进行相互作用。但在黄芪甲苷的存在下，PRDX6与RAC的结合受到很大影响，氢键数量明显减少，结合能降为ΔGbind＝-19.1kcal/mol。以上结果表明，黄芪甲苷靶向PRDX6通过抑制PLA2活性，破坏了PRDX6与RAC的结合，从而维持RCA-GDI复合物的稳定性，阻断了NOX2的组装活化。
为了证实分子动力学模拟的正确性，本实施例采用大肠杆菌表达通过常规方法分别表达纯化了RAC和GDI蛋白，并使用MST考察了PRDX6、RAC和GDI的相互作用。结果如图6所示，PRDX6和GDI之间不存在相互作用，但与RAC有较强的结合(KD＝3.59μM)。虽然RAC和GDI也存在相互作用(KD＝1.6μM)，但PRDX6可以有效削弱RAC-GDI的结合(KD＝11.3μM)(图7)，表明PRDX6可以竞争性破坏与RAC-GDI复合物的形成。当黄芪甲苷存在时，PRDX6与RAC的结合解离常数从8.4μM降低到29.8μM(图8)。
同样基于RAW264.7细胞的PRDX6和RAC或GDI和RAC之间的免疫共沉淀也表明(图9)，模型组(Mod)中PRDX6捕获RAC的效果明显优于空白组(Con)。经黄芪甲苷处理后RAC-GDI复合物的稳定性得到显着增加(图10)。当使用siRNA(siPRDX6)特异性干扰了PRDX6的表达后，siPRDX6转染细胞中黄芪甲苷对ROS的清除效果显著消失(图11)。上述结果表明通过抑制PRDX6与RAC的结合可以稳定RAC-GDI复合物并阻碍RAC的解离活化，抑制活性氧ROS的产生。
实施例3PRDX6抑制剂稳定RAC-GDI复合物阻止NOX2的组装活化
1.材料与方法
1.1花生四烯酸(AA)的检测
PLA2是一种能催化磷脂甘油分子上二位酰基(sn-2)的水解酶，亦是花生四烯酸(AA)等生物活性物质生成的限速酶。本实施例测定了RAW264.7细胞中AA的含量，具体的采用LPS诱导RAW264.7细胞释放AA，并考察了PLA2抑制剂MJ33(Cayman，90001844)及黄芪甲苷的抑制效果。具体操作按照小鼠花生四烯酸(AA)ELISA检测试剂盒进行(上海江莱生物科技有限公司，JL13827)。
1.2免疫荧光共定位分析
在LPS诱导损伤的RAW264.7细胞中分别给药10μM MJ33和10μM黄芪甲苷，继续孵育6h后，固定细胞并使用羊血清封闭排除非特异性干扰。分别采用兔源PRDX6抗体(ab73350)以及鼠源的RAC抗体(ab282581)；兔源的P47 phox(bs-6966R)和鼠源gp91phox(ab80897)的抗体4℃孵育过夜，经PBS清洗后，采用山羊抗兔IgG H&L(Alexa
594，ab150080)和山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa/>
488，ab150113)荧光二抗进行识别。使用共聚焦显微镜(德国徕卡，TCS SP8)分析捕获荧光信号并进行数据分析。
1.3超氧化物酶活性测定
本实施例采用细胞色素c还原法测定超氧化物酶的活性。通过胰蛋白酶消化收获细胞并在预冷的PBS中洗涤后，加入7.5mM葡萄糖、0.5mM氯化镁、0.9mM氯化钙和1mg/mL细胞色素c至PBS中37℃孵育5min。置于550nm处测定吸光度，监测反应的酶活曲线变化。此外，本实施例除PLA2抑制剂MJ33和黄芪甲苷外，另设置NOX2抑制剂GSK2795039(Sigma-Aldrich，SML2770)作为阳性对照。
1.4超氧阴离子含量测定
超氧阴离子(·O2 -)与盐酸羟胺反应生成NO2 -，NO2 -在对氨基苯磺酰胺和萘乙二胺盐酸盐的作用下，生成紫红色的偶氮化合物，在530nm有特征吸收峰，可以根据A530值计算样本中超氧阴离子含量。根据此原理测定RAW264.7细胞在LPS诱导下超氧阴离子的含量。具体操作按照超氧阴离子含量检测试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司，BC1295)说明书进行。
2实验结果
使用RAW 264.7细胞分别测定PRDX6对RAC-GDI复合物的破坏作用及对NOX2活化的影响。首先基于细胞水平测量了黄芪甲苷及MJ33对PLA2活性、AA水平和ROS释放的影响。如图12中A-C所示，MJ33或黄芪甲苷分别以剂量依赖性方式抑制RAW264.7细胞中的PLA2活性，减少AA的产生并减轻ROS的释放。
此外，在免疫荧光共定位实验中，PRDX6(绿色)和RAC(红色)在LPS诱导的氧化应激条件下有高度重叠，并细胞膜上有明显的聚集(图12中D)。在采用PRDX6抑制剂MJ33或黄芪甲苷干预后，RAC从RAC-GDI二聚体中释放明显减少，RAC-GDI的稳定性得到提高，故PRDX6与RAC的重合显着减少。随后，RAW264.7细胞在LPS刺激下，NOX2亚基p47 phox的膜易位，以及与膜上gp91phox亚基组装为NOX2复合物的比例也明显减少(图12中E)。同NOX2抑制剂GSK2795039一样，PRDX6抑制剂MJ33以及黄芪甲苷阻止了p47 phox(红色)和gp91phox(绿色)在膜上组装并抑制了NOX2的活化。因此，NOX2的超氧化物酶活也得到了有效控制(图12中F)，由此产生的超氧阴离子含量也显着降低(图12中G)。综上，本实施例在细胞水平上的证明了，PRDX6的PLA2抑制剂可以稳定RAC-GDI复合物结构并抑制NOX2的组装激活。
实施例4PRDX6的PLA2口袋抑制剂可以改善NOX2引发氧化应激导致的急性肺损伤
1.材料与方法
1.1动物损伤模型的构建实验
雄性KM小鼠(18-22g，SCXK2016-0006)购自北京维通利华实验动物科技有限公司。小鼠在标准无病原体条件下，根据饲养标准进行饮食管理。实验操作均符合《实验室动物使用和保养和动物实验管理规程指南》的要求。
将活化的铜绿假单胞菌PseudomonasAeruginosa 14(由南开大学白芳教授赠送，购自苏州北纳创联生物技术研究院)生理盐水混悬液(5×107CFU/20μL)滴入小鼠鼻腔以诱导急性肺部感染。同时采用抗生素左氧氟沙星(Lev，上海麦克林生化科技股份有限公司，L830182)作为治疗铜绿假单胞菌感染的阳性对照。将48只小鼠随机分为6组(每组8只)：对照组(Con)、模型组(Mod)、左氧氟沙星阳性对照(Lev，60mg/kg)和黄芪甲苷给药组(AST：40mg/kg，20mg/kg和10mg/kg)。除对照组和模型组外，小鼠PA-14细菌感染后立即分别腹腔注射左氧氟沙星和黄芪甲苷，并连续记录24h内小鼠的存活率。
1.2H&E染色以及冰冻切片的制作与染色
另取36只小鼠分成与上述实验相同的组(每组6只小鼠)。采用活化的PA-14细菌生理盐水混悬液以5×106CFU/20μL的浓度滴入鼻腔，构建轻度感染模型。感染24h后，肺组织一部分用4％多聚甲醛固定，将固定好的肺组织用于石蜡组织切片制备以及常规H&E染色。
另将新鲜的肺组织使用SAKURA.4583冷冻切片包埋剂进行组织的固定，随后制备冷冻切片。冷冻切片的ROS的染色操作与细胞中的DCFH-DA探针检测保持一致，参照实施例2进行。组织水平的免疫荧光染色参照实施例3进行。此外，PA 14菌株的免疫荧光染色采用PseudomonasAeruginosa抗体(1001/214)[Alexa 
488]进行，并采用聚焦显微镜进行图像的捕获分析。
1.3组织水平花生四烯酸与PLA2酶活的测定
取上述轻度感染模型的小鼠肺组织组，采用普通RAPI组织裂解液进行组织匀浆的制作，并在4℃下，12000转离心10min，取裂解液上清，按照实施例3方法所述进行花生四烯酸的含量测定。另外根据
PLA2 Assay Kit说明，参照实施例1方法进行测量PLA2活性。
2.实验结果
本实施例通过铜绿假单胞菌所构建的急性肺损伤模型评价PRDX6抑制剂黄芪甲苷抗氧化应激损伤的疗效。如图13中A所示，模型组的小鼠存活率为25％，Lev组为87.5％。而不同浓度的黄芪甲苷(40mg/kg-62.5％；20mg/kg-62.5％；10mg/kg-37.5％)均在不同程度上提高了急性损伤小鼠的存活率。
H&E染色用于观察小鼠肺组织的组织病理学变化，如图13中B，与空白组相比，铜绿菌感染引起严重出血、肺泡间隔增宽和炎性细胞浸润。而Lev和黄芪甲苷处理都显示出对可见损伤的部分保护作用。PA 14菌株的免疫荧光染色表明，黄芪甲苷组肺组织上菌体与感染组相比无明显的变化，而Lev抗生素组肺组织几乎未检测到PA 14菌株的增殖(图13中C)。在随后对小鼠肺组织进行DCFH-DA荧光成像分析显示(图13中D)，模型组的ROS绿色荧光集中在肺气道附近，且明显高于空白组。黄芪甲苷或Lev组的治疗显著降低了ROS水平，黄芪甲苷组效果更为明显。这表明黄芪甲苷改善氧化应激损伤的保护机制与Lev的抗菌作用存在不同。
此外，本实施例还评估了PA 14菌株诱导小鼠肺急性损伤过程中肺组织的PLA2活性和花生四烯酸AA的水平。结果表明，黄芪甲苷可以剂量依赖性地抑制PLA2活性并减少AA的产生(图13中E和F)。基于肺组织NOX2亚基的组装激活的荧光共定位检测结果也显示了同RAW264.7细胞一致的结果(图13中G和H)。以上结果再次表明，PRDX6抑制剂可以阻止RAC的活化(PRDX6/RAC)，减缓NOX2的组装(gp91phox/p47 phox)，改善小鼠氧化应激诱导的急性肺损伤。
实施例5PRDX6的PLA2口袋抑制剂可以改善LPS诱发的氧化应激导致的急性肝肾损伤
1.材料与方法
1.1动物肝肾损伤模型的构建实验
采用腹腔注射10mg/kg的LPS诱导小鼠肝肾组织急性损伤模型，同时采用MJ33(Cayman Chemical，90001844)作为阳性对照。将36只小鼠随机分为6组(每组6只)：对照组(Con)、模型组(Mod)、MJ33阳性对照(100μM/kg)和黄芪甲苷给药组(AST-H，40mg/kg；AST-M，20mg/kg；AST-L，10mg/kg)。给药24h后，根据实施例2中1.4所述方法测定小鼠外周血中ROS水平，并使用全自动生化分析仪(Pointcare M4)测定小鼠血清中肝、肾功能代表性生化指标。
2.实验结果
本实施例评价了PRDX6的抑制剂AST和MJ33对LPS诱导的肝肾损伤的保护作用。研究发现LPS诱导血液中ROS明显升高，而AST和MJ33可以有效降低血清中ROS水平，如图14中A所示。同时，生化检测指标如图14中B-K所示。其中肝功能代表性指标谷丙转氨酶-ALT、谷草转氨酶-AST、总胆红素-TBIL、间接胆红素-IBIL、总蛋白-TP、白蛋白-ALB、球蛋白-GLO、白球比-A/G，以及肾功能指标尿素-UREA、肌酐-CRE均进行了测定。结果可见在LPS诱导下，肝肾功能都有了不同程度的损伤，而MJ33和高浓度40mg/kgAST治疗组可对急性损伤模型具有明显保护作用，阻止了超氧阴离子ROS产生，进而达到防止氧化应激导致的肝肾损伤的发生及发展。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种PRDX6蛋白的抑制剂在制备改善氧化应激损伤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂通过抑制磷脂酶A2口袋的活性来抑制PRDX6蛋白活性。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为MJ33和/或黄芪甲苷。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制剂通过防止RAC亚基从RAC-GDI复合物中解离，来抑制NADPH氧化酶2的组装激活。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氧化应激损伤的发生部位为肺、肝和/或肾。
6.一种改善氧化应激损伤的药物，其特征在于，活性成分包括PRDX6蛋白的抑制剂。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述抑制剂为MJ33和/或黄芪甲苷。
8.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
9.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、注射剂、丸剂或口服液。
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