CN101277614A - 通过调节花生四烯酸代谢或信号途径的骨治疗方法 - Google Patents

Abstract

公开了促进骨生成以加速或增强骨折愈合，治疗骨质缺损，和增强骨形成的方法。本方法通常调节花生四烯酸代谢或信号途径，并且，特别地，利用5－脂氧合酶抑制剂。这些分子可单独施用或与一种或多种抑制骨吸收、调节钙从骨中的再吸收、增强骨积累、增强骨形成、诱导骨形成、削弱微生物生长、减轻炎症、和/或减轻疼痛的药物组合施用。

Description

通过调节花生四烯酸代谢或信号途径的骨治疗方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2005年8月18日申请的美国临时申请No.60/709,838的优先权，该美国临时申请的全文为所有目的全部在此引入作为参考。

发明领域

本发明一般的涉及通过调节花生四烯酸代谢或信号途径加速或增强骨形成或骨折愈合，特别通过利用5-脂氧合酶活性抑制剂。

发明背景

骨折是一种常见的外伤。在美国每年大约报道有800-1000万例骨折，其中超过1百万需要住院治疗。估计每年治疗这些骨折的费用超过200亿美元。虽然这已经是很惊人的，但是预期这些数字会由于人群的老化而增长。而且，在军事人员中，骨折是常见的训练损伤。骨折，典型地位于手臂和大腿，也是常见的战斗创伤。除了外伤，骨折也可因疾病引起。骨质疏松症因成熟骨中骨矿物质密度的降低引起，并且在最小限度的外伤之后导致骨折。这种疾病是普遍的，并且有巨大的经济影响。最常见的骨折发生在椎骨、桡骨远端和髋部。估计三分之一的65岁以上的女性群体将发生椎骨骨折，其中部分是由于骨质疏松症引起的。而且，大约每三个妇女中有一个和每六个男性中有一个很可能由于极度老龄而发生髋部骨折。

骨折愈合是一个复杂的组织再生过程，涉及响应于生长因子、细胞因子、其他信号分子和机械环境的细胞迁移、增殖、细胞凋亡和分化。为了最佳的再生必须控制每个细胞过程的时间顺序和程度。骨折愈合的正常事件在下面描述为分4个阶段发生。在起始阶段，血肿形成和局部组织缺氧是骨折愈合的起始的细胞和分子事件。第二阶段，被称为早期阶段，特征为炎症，随后细胞在骨折部位快速积累。巨噬细胞和嗜中性粒细胞在炎症过程中在骨折部位的出现先于间充质细胞在骨折部位的快速迁移和增殖。在第三阶段，再生阶段，软骨内骨化产生了新骨，新骨连接骨折。在这一点上，骨折的骨痂具有明确的形态。膜内的骨化在骨痂外围产生了骨膜骨的支持物。在骨痂中的间充质细胞开始在骨膜骨支持物的界面分化为软骨细胞。每种新的软骨细胞如希望的那样发展为具有基质沉积，紧接着基质钙化，产生钙化的软骨，然后为细胞凋亡。通道从骨膜骨支持物开始形成为钙化软骨。成骨细胞在这些通道内的钙化软骨表面上迁移或分化，并开始沉积新骨。当软骨细胞分化从外围发生到骨痂中心(骨折部位)时，紧跟着为通道形成，成骨细胞分化，和新骨形成，直到软的骨痂被编织(woven)(未成熟的)骨取代。再生阶段的血管生成是关键的。在再生阶段产生的未成熟的编织骨在机械上不适于普通的承重。为补偿编织骨的降低的机械性能，骨折骨痂具有显著更大的直径，其提供更大的结构机械性能。最终为重塑阶段，骨折骨痂直径变小直到骨获得其通常大小，同时通过提高材料机械性能维持骨的总体机械性能。这伴随着用机械性强的薄片状(成熟的)骨取代机械性较差的编织骨。在连续几轮中，破骨细胞吸收编织骨，成骨细胞用薄片状骨取代它。控制破骨细胞形成和功能的分子机理贯穿于RANKL-RANK途径中，并且这种途径在骨折愈合过程中被活化。

通常通过骨折的闭合复位和患骨的固定来保守性治疗骨折。在这样的情况中，骨骼通过上述软骨内骨化途径愈合。包括维生素C、维生素D和钙在内的适当的营养物有助于愈合。自从20世纪中期骨折的切开复位和内部固定变得普遍以来，骨折的治疗没有重大的进展。提高骨折愈合的生长因子治疗的前景仍然没有实现。

不幸的是，许多骨折需要外科手术干预以提高愈合成功率并降低并发症的可能性。只有一种被批准的骨愈合的药理学增强，那就是用重组骨形态发生蛋白BMP-2或BMP-7(OP-1)治疗。这些生长因子的应用需要外科手术，并且由于费用和由使用超生理学水平的生长因子引起的未知的潜在副作用，BMP用作治疗顽固性骨折的最后手段。典型的病人护理也涉及在治疗过程中施用抗生素、镇静剂、NSAID、COX-2抑制剂或其他止痛药。

NSAID抑制环加氧酶，由此抑制花生四烯酸转化为前列腺素(PGD2、PGE2、PGF2α、PGI2、TXA2)。花生四烯酸也是白三烯(LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)、脂氧素(LXA4、LXB4)和5-羟二十碳四烯酸(5-HETE)的前体。例如，5-脂氧合酶(5-LO)将花生四烯酸转化为5-过氧羟基二十碳四烯酸(5-HpETE)。这是产生5-HETE、白三烯(LT)和脂氧素的代谢途径的第一步。白三烯也是促炎性的，具有吸引嗜中性粒细胞并且导致毛细管渗透性的能力。花生四烯酸代谢途径概括在图1中。

脂氧合酶是在植物和动物中发现的含非血红素铁的酶，催化某些聚不饱和脂肪酸例如脂和脂蛋白的氧化。已知几种脂氧合酶，每种具有特有的氧化作用。哺乳动物脂氧合酶根据被氧化的花生四烯酸中的位点来命名。例如，5-脂氧合酶将花生四烯酸转化为5-过氧羟基二十碳四烯酸(5-HpETE)，而12-脂氧合酶将花生四烯酸转化为12-HpETE。5-脂氧合酶的活性需要一种通常被称为FLAP(五脂氧合酶活化蛋白)的辅因子。白三烯合成被抑制FLAP的药物(MK866)或缺乏FLAP的小鼠所降低。

WO 95/30419公开了降低破骨细胞活性的5-LO抑制剂。破骨细胞活性的抑制抑制了骨吸收并且降低了人病理状况中的骨损失。骨吸收是骨折愈合的必要部分，因为它是将新形成的骨重塑为更强硬、更成熟的骨所必需的。骨吸收的抑制预计将削弱正常骨折愈合的后续阶段。Koivukangas等人，Long-term administration of clodronate does notprevent fracture healing in rats.Clinical Orthopaedics and RelatedResearch 408：268-278(2003)和Peter等人Effect of alendronate onfracture healing and bone remodeling in dogs。Journal of OrthopaedicResearch 14：74-79(1996)公开了二膦酸盐治疗对于骨折愈合的效果。数据显示削弱破骨细胞活性和骨重塑的二膦酸盐治疗不抑制骨折修复的起始阶段，但削弱后续的骨重塑阶段。揭示了二膦酸盐对于骨折愈合的效果为保持包含机械上未成熟的编织骨而不是机械上成熟的薄片状骨的大骨折骨痂。

WO 03/066048公开了12/15-脂氧合酶抑制剂可用于防止骨损失或增加骨质量。该公开文本描述的数据显示骨矿物质密度在过量表达IL-4和用15-LO抑制剂处理的转基因小鼠中保持。该公开文本没有公开15-LO抑制剂可辅助骨折愈合或治疗骨不连接。

Traianedes，K.，等人，5-Lipoxygenase metabolites inhibit boneformation in vitro.Endocrinology，139：3178-3184(1998)公开了LTB4、5-HETE和LTD4(5-LO功能的全部产品)对于大鼠胚胎颅顶(成骨细胞)细胞的分化的效果。数据显示5-HETE和LTB4在体外降低了骨结形成和碱性磷酸酶活性，但是LTD4没有效果。来自一种体外器官培养模型的结果显示了LTB4或5-HETE治疗防止了BMP2诱导的小鼠颅顶层厚度增加。但是，该公开文本没有公开使用任何5-LO抑制剂，也没有公开5-LO抑制将在培养的成骨细胞或在器官培养物中导致相同的效果。类似地，Ren和Dziak，Effects of leukotrieneson osteoblast cell proliferation.Calcified Tissue International 49：197-201(1991)公开了LTB4处理在体外降低了初级大鼠颅顶(成骨细胞)培养物的增殖，但是LTB4在较高浓度(0.3-1微摩尔)时在体外可促进建立的成骨细胞系(Saos-2和G292)的增殖。Ren和Dziak还公开了LTC4对于初级大鼠成骨细胞或Saos-2细胞的增殖没有效果，但是促进了G292细胞的增殖。而且，Ren和Dziak公开了用一种5-LO抑制剂(AA-861)处理Saos-2细胞对于Saos-2细胞增殖没有效果。该公开文本表明5-LO抑制对于骨生成应该没有效果。

因此，很明显非常期待加速或增强骨形成或骨折愈合的组合物和方法。

概述

本发明提供了通过施用降低5-脂氧合酶活性的化合物促进骨生成，以治疗骨折、骨质缺损或通过诱导骨形成而治疗的疾病的方法。

在本发明的另一方面，本方法可进一步包括一种附加活性剂例如环加氧酶活性调节剂。在一个方面，环加氧酶-2(COX-2)的活性被提高。在另一方面，环加氧酶-1(COX-1)的活性被降低。

在一个方面，本方法采用在体内施用化合物。在另一方面，离体(ex vivo)施用化合物。

在一个方面，所述化合物是一种小分子。在另一方面，所述化合物是一种反义化合物。在另一方面，所述化合物是一种RNAi化合物。

本发明的这些和其他方面在参考下面更详细的描述和附图后将成为明显的。另外，在此说明了多种参考文献，其详细描述了某种方法或组合物，并且因此全文引入作为参考。

附图说明

图1概述了一种示例性的花生四烯酸代谢或信号途径。

图2阐明了通过改变环加氧酶活性或脂氧合酶活性而对花生四烯酸代谢的调节，以加速或增强骨形成。图2A代表了该途径的正常功能。图2B显示了COX-2活性的抑制导致过量的白三烯的产生，这损害了骨折愈合或其他骨生成过程中的骨形成。图2C显示了脂氧合酶活性的抑制导致过量的前列腺素产生，其加速或增强了骨折修复或其他骨生成过程的骨形成。

图3显示了由5LO-/-小鼠和一种正常小鼠(C57BL/6)形成的股骨骨折的系列X-射线。X-射线显示了骨生成，并因此5LO-/-小鼠中的骨折愈合加速。

图4阐明了在骨折开始后28天和84天，在野生型(WT)和5-LO敲除小鼠(5LO-KO或5-LO-/-)中的骨折愈合的机械测试数据。转矩峰值(图4A)、刚度(图4B)、最大剪应力(图4C)和剪切模量(图4D)根据骨痂尺寸和转矩相对于角移位的曲线计算。

图5阐明了在骨折后7、10、14和21天，野生型(WT)和5-LO敲除小鼠(5-LOKO或5-LO-/-)的骨折愈合的组织形态测定数据。左栏显示了为新形成骨(矿化组织)的骨折骨痂面积百分比，右栏显示了为软骨的骨折骨痂面积百分比。

图6显示了在COX-2敲除小鼠中骨折愈合显著削弱，并且由于骨生成(新骨形成)的缺乏而发生愈合缺陷。图6A显示了来自X-射线的数据，图6B和6C显示了缺少功能性COX-1基因的小鼠中14天股骨骨折的组织学样本。图6D显示了来自X-射线的数据，图6E和6F显示了在缺少功能性COX-2基因的小鼠中14天股骨骨折的组织学样本。

图7阐明了在用5-LO抑制剂处理的大鼠中骨生成加速，导致骨折愈合快于未处理的大鼠。

图8阐明了用两种不同的5-LO抑制剂处理的大鼠的骨生成加速，导致骨折愈合快于未处理的大鼠。图8A、8B和8C显示了来自载体对照(8A)、NDGA(8B)和AA-861(8C)的X-射线的数据。图8D是显示5-LO的抑制提高了骨折骨痂转矩峰值的图。

发明详述

除非另外说明，本发明的实施将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学常规方法。所述技术在文献中充分说明。见例如，T.E.Creighton，Proteins：Structures andMolecular Properties(W.H.Freeman and Company，1993)；A.L.Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers，Inc.，current addition)；Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2ndEdition，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.，Academic Press，Inc.)；Remington′s Pharmaceutical Sciences，18thEdition(Easton，Pennsylvania：Mack Publishing Company，1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry 3^rd Ed.(Plenum Press)Vols Aand B(1992)。

所有的在此引用的出版物、专利和专利申请，无论是上文还是下文的，都全文在此引入作为参考。

I.定义

在描述本发明时，将使用下面的术语，它们如下所示定义。

“调节花生四烯酸代谢或信号途径”的意思是利用一种药物或化合物，该药物或化合物抑制或促进细胞或动物内花生四烯酸代谢或信号途径涉及到的任何酶或调节分子的活性或浓度。优选的药物或化合物可选自FLAP抑制剂例如BAYx 1005、MK-886和MK-0591；5-脂氧合酶抑制剂例如齐留通、BAY-G576、RS-43，179、Wy-47，288、ABT-761、维生素A和BW A4C；白三烯受体拮抗剂例如扎鲁司特、孟鲁司特、普仑司特、ICI 204，219、MK-571、MK-679、ONO-RS-411、SK&F 104，353和Wy-48，252；白三烯B4受体拮抗剂；白三烯C4合酶抑制剂；白三烯A4水解酶抑制剂；非甾体抗炎药(NSAID)，白三烯受体拮抗剂和白三烯类似物，调节白三烯形成和作用的化合物，影响环加氧酶活性的化合物，影响前列腺素活性的化合物例如受体激动剂或拮抗剂，前列腺类似物，影响白三烯活性的化合物例如受体激动剂或拮抗剂，和白三烯类似物。

“加速”意思是与未治疗的受试者或对照受试者相比，被治疗的受试者的骨生成发生得更快并且骨愈合需要的时间缩短，或骨愈合得更快。

“增强”意思是与未治疗的受试者或对照受试者相比，被治疗的受试者的愈合骨具有提高的性能，例如更高的骨强度。

“骨折愈合”或“骨折修复”意思是，特别是，促进骨折和骨质缺损的愈合，提高愈合的骨折或部位的机械稳定性。所述骨折可以是，例如，普通的、外伤性(伤残性和非骨质疏松性)骨折，由任何病因的骨质疏松或骨质减少引起的骨质疏松性骨折，由佩吉特病引起的骨折，或由其他药物的副作用所致骨损失引起的骨折，例如，在接受了高剂量的皮质类固醇的病人中，由其他先天性或获得性疾病例如成骨不全和乳癌引起的骨折，用于(例如)骨延长和肢体延长手术和治疗骨折延迟的连接或不连接的外科手术产生的骨折(截骨术)。本发明利用本领域熟练人员公知的技术通过加速或增强骨的形成而加强了骨折正常修复和固定后的骨折愈合。

“骨形成”意思是在根据本发明的方法治疗的受试者中，例如，在接受5-脂氧合酶抑制剂的受试者中，骨形成速度提高到超过未接受5-脂氧合酶抑制剂的受试者的骨形成速度。所述提高的骨形成在此用(例如)定量数字化形态测量法和骨形成的其他标记来确定。骨形成包括用于脊柱融合和其他关节或骨关节强硬应用的成骨过程，向假体装置内或周围的骨形成，或加强存在的骨或替代缺失的骨或骨节段的骨形成。

“骨生成”意思是与骨折修复相关的骨的产生，由故意或非故意损害引起的缺损骨的修复，或用于融合一个以上的骨或骨节段的骨形成的诱导。“骨生成”不包括与青少年正常骨生长相关的骨形成。“骨生成”也不包括与正常骨动态平衡相关的骨形成，其通常被称为骨重塑，其中骨通过破骨细胞吸收骨而成骨细胞使新骨替代被吸收的骨的方法正常更新。

“骨质缺损”意思是骨的损害以致骨的一部分被移除或缺失。所述骨质缺损包括用于诊断或治疗方法目的在骨中产生的不规则的洞、缺口或开口，由骨外伤或疾病、刺伤引起的骨节段的丧失，等等。

术语“调节”指调节物对于花生四烯酸代谢或信号途径的影响。调节物可以是，例如能够导致调节的多肽、核酸、大分子、复合分子、小分子、化合物等(天然存在或非天然存在的)。通过包含在测量该途径中酶活性的测试中，可以评价调节物作为功能性质、生物活性或过程或其组合的(直接或间接)抑制剂或活化剂(例如，激动剂、部分拮抗剂、部分激动剂、反向激动剂、拮抗剂等)的潜在活性。

术语“有效量”或“药物有效量”指提供期望的生物学结果的药剂的充分量。该结果可以是疾病的体征、症状或病因的降低和/或缓和，或其他任何期望的生物系统的改变。例如，治疗用途的“有效量”是包含提供以下效果所需的此处活性化合物的组合物的量：骨生成和骨折修复愈合速度临床上显著的增加；软骨缺损或疾病的逆转；骨折不连接、迟延连接和牵拉骨生成中骨形成的刺激和/或增强；骨向假体装置内生长的提高和/或加速；增强或加速的关节强硬、骨关节强硬或脊柱融合中的骨形成，为增强现存骨或取代缺失骨或骨节段的骨形成，例如在自体移植、异体移植或合成骨材料引入和牙体缺损修复中的骨形成。

如此处所用的术语“治疗”(treat)或“治疗”(treatment)可互换使用，表示根据本发明方法施用一种或多种化合物以促进骨生成以获得期望的治疗目的。该术语进一步包括改善现存骨或软骨缺损症状、防止其他症状、改善或防止症状的潜在代谢病因、和/或促进骨生长。

如此处所用的“小分子”表示一种分子量小于大约500道尔顿的化学化合物。小分子不包括生物聚合物例如多肽和聚核苷酸。

“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”表示在生物学上或其他方面无害的物质，即，该物质可以给个体施用而不导致任何不期望的生物学效应或以有害的方式与组合物中包含的任何成分相互作用。

“生理学pH”或“在生理学范围内的pH”表示在大约7.2到8.0(含)范围内，更典型地在大约7.2到7.6(含)的范围内的pH。

如此处所用的术语“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物的例子包括，但不限于，哺乳动物纲的任何成员：人，非人灵长类动物例如黑猩猩，和其他猿和猴种；农畜例如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜例如兔子、狗和猫；实验室动物包括啮齿动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠，等等。该术语不表示特定的年龄或性别。

本发明的化合物可以用于抑制或降低5-脂氧合酶、5-脂氧合酶和环加氧酶、和花生四烯酸代谢或信号途径中的其他酶和化合物的活性。在上下文中，酶活性的抑制和降低指测定的活性水平低于酶、细胞或受试者没有用测试化合物进行处理的对照试验。在特定实施方式中，测定的活性的抑制或降低至少是10％的降低或抑制。本领域技术人员将认识到测定的活性至少降低或抑制20％、50％、75％、90％或100％或10％到100％之间的任意量对于特定应用是优选的。酶活性的抑制可通过任何机理，包括，例如，但不限于，降低酶的存在量，对催化活性的竞争性或非竞争性抑制，干扰酶和辅因子或辅助蛋白质的相互作用，等等。另外，本发明的化合物还可用于提高COX-2活性。在特定的实施方式中，酶活性的提高指测定的活性水平高于酶、细胞或受试者没有用测试化合物进行处理的对照试验。在特定实施方式中，测定的活性的提高是至少10％的提高。本领域技术人员将认识到测定的活性至少提高20％、50％、75％、90％或100％或在10％到100％之间或更高的任意量对于特定应用是优选的。酶活性的提高可通过任何机理，包括，例如但不限于，提高酶的存在量，或提高酶的转化率，或改变其底物结合特性。

提到酶5-脂氧合酶(5-LO)、COX-1和COX-2，包括表1中引用的示例性序列，其中的一些紧接在下表1之后提供，还有与示例性序列至少90％相同，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％相同的序列，本领域普通技术人员通过常规序列比对算法例如BLAST就可确定这些序列。另外，还包括其他哺乳动物同源物。所述同源物根据例如序列类似性、功能类似性和通过染色体定位而鉴别。除了蛋白质序列以外，还提供了示例性的核酸序列，本领域普通技术人员根据这些序列可以容易地获得可用于根据本发明的方法抑制酶活性的反义和RNAi化合物的序列。用于实施本发明的反义化合物是本领域已知的，并且可通过商业途径获得，例如在Ding等人(1999)BBRC Vol.261，pp.218-223(引入作为参考)中描述。

表1-示例性序列

鼠							(n)88.11％(p)
								小鼠	Ptgs1	NA	19224	NC_000068	NM_008969	P22437	85.59％(n)89.78％(p)

1.mRNA序列之间的类似性。

2.蛋白质序列之间的类似性。

人5-脂氧合酶mRNA序列(GenBank RefSeq NM_000698)(SEQID NO：1)

   1 gccagggacc agtggtggga ggaggctgcg gcgctagatg cggacacctg gaccgccgcg

  61 ccgaggctcc cggcgctcgc tgctcccgcg gcccgcgcca tgccctccta cacggtcacc

 121 gtggccactg gcagccagtg gttcgccggc actgacgact acatctacct cagcctcgtg

 181 ggctcggcgg gctgcagcga gaagcacctg ctggacaagc ccttctacaa cgacttcgag

 241 cgtggcgcgg tggattcata cgacgtgact gtggacgagg aactgggcga gatccagctg

 301 gtcagaatcg agaagcgcaa gtactggctg aatgacgact ggtacctgaa gtacatcacg

 361 ctgaagacgc cccacgggga ctacatcgag ttcccctgct accgctggat caccggcgat

 421 gtcgaggttg tcctgaggga tggacgcgca aagttggccc gagatgacca aattcacatt

 481 ctcaagcaac accgacgtaa agaactggaa acacggcaaa aacaatatcg atggatggag

 541 tggaaccctg gcttcccctt gagcatcgat gccaaatgcc acaaggattt accccgtgat

 601 atccagtttg atagtgaaaa aggagtggac tttgttctga attactccaa agcgatggag

 661 aacctgttca tcaaccgctt catgcacatg ttccagtctt cttggaatga cttcgccgac

 721 tttgagaaaa tctttgtcaa gatcagcaac actatttctg agcgggtcat gaatcactgg

 781 caggaagacc tgatgtttgg ctaccagttc ctgaatggct gcaaccctgt gttgatccgg

 841 cgctgcacag agctgcccga gaagctcccg gtgaccacgg agatggtaga gtgcagcctg

 901 gagcggcagc tcagcttgga gcaggaggtc cagcaaggga acattttcat cgtggacttt

 961 gagctgctgg atggcatcga tgccaacaaa acagacccct gcacactcca gttcctggcc

1021 gctcccatct gcttgctgta taagaacctg gccaacaaga ttgtccccat tgccatccag

1081 ctcaaccaaa tcccgggaga tgagaaccct attttcctcc cttcggatgc aaaatacgac

1141 tggcttttgg ccaaaatctg ggtgcgttcc agtgacttcc acgtccacca gaccatcacc

1201 caccttctgc gaacacatct ggtgtctgag gtttttggca ttgcaatgta ccgccagctg

1261 cctgctgtgc accccatttt caagctgctg gtggcacacg tgagattcac cattgcaatc

1321 aacaccaagg cccgtgagca gctcatctgc gagtgtggcc tctttgacaa ggccaacgcc

1381 acagggggcg gtgggcacgt gcagatggtg cagagggcca tgaaggacct gacctatgcc

1441 tccctgtgct ttcccgaggc catcaaggcc cggggcatgg agagcaaaga agacatcccc

1501 tactacttct accgggacga cgggctcctg gtgtgggaag ccatcaggac gttcacggcc

1561 gaggtggtag acatctacta cgagggcgac caggtggtgg aggaggaccc ggagctgcag

1621 gacttcgtga acgatgtcta cgtgtacggc atgcggggcc gcaagtcctc aggcttcccc

1681 aagtcggtca agagccggga gcagctgtcg gagtacctga ccgtggtgat cttcaccgcc

1741 tccgcccagc acgccgcggt caacttcggc cagtacgact ggtgctcctg gatccccaat

1801 gcgcccccaa ccatgcgagc cccgccaccg actgccaagg gcgtggtgac cattgagcag

1861 atcgtggaca cgctgcccga ccgcggccgc tcctgctggc atctgggtgc agtgtgggcg

1921 ctgagccagt tccaggaaaa cgagctgttc ctgggcatgt acccagaaga gcattttatc

1981 gagaagcctg tgaaggaagc catggcccga ttccgcaaga acctcgaggc cattgtcagc

2041 gtgattgctg agcgcaacaa gaagaagcag ctgccatatt actacttgtc cccagaccgg

2101 attccgaaca gtgtggccat ctgagcacac tgccagtctc actgtgggaa ggccagctgc

2161 cccagccaga tggactccag cctgcctggc aggctgtctg gccaggcctc ttggcagtca

2221 catctcttcc tccgaggcca gtacctttcc atttattctt tgatcttcag ggaactgcat

2281 agattgatca aagtgtaaac accataggga cccattctac acagagcagg actgcacagc

2341 gtcctgtcca cacccagctc agcatttcca caccaagcag caacagcaaa tcacgaccac

2401 tgatagatgt ctattcttgt tggagacatg ggatgattat tttctgttct atttgtgctt

2461 agtccaattc cttgcacata gtaggtaccc aattcaatta ctattgaatg aattaagaat

2521 tggttgccat aaaaataaat cagttcattt aaaaaaaaaa aaaaaaaa

人5-脂氧合酶蛋白质序列(GenBank RefSeq NM_000698)(SEQID NO：2)

MPSYTVTVATGSQWFAGTDDYIYLSLVGSAGCSEKHLLDKPFYNDFERGAVDSYDVTVDEELGEIQLVRIEKR

KYWLNDDWYLKYITLKTPHGDYIEFPCYRWITGDVEVVLRDGRAKLARDDQIHILKQHRRKELETRQKQYRWM

EWNPGFPLSIDAKCHKDLPRDIQFDSEKGVDFVLNYSKAMENLFINRFMHMFQSSWNDFADFEKIFVKISNTI

SERVMNHWQEDLMFGYQFLNGCNPVLIRRCTELPEKLPVTTEMVECSLERQLSLEQEVQQGNIFIVDFELLDG

IDANKTDPCTLQFLAAPICLLYKNLANKIVPIAIQLNQIPGDENPIFLPSDAKYDWLLAKIWVRSSDFHVHQT

ITHLLRTHLVSEVFGIAMYRQLPAVHPIFKLLVAHVRFTIAINTKAREQLICECGLFDKANATGGGGHVQMVQ

RAMKDLTYASLCFPEAIKARGMESKEDIPYYFYRDDGLLVWEAIRTFTAEVVDIYYEGDQVVEEDPELQDFVN

DVYVYGMRGRKSSGFPKSVKSREQLSEYLTVVIFTASAQHAAVNFGQYDWCSWIPNAPPTMRAPPPTAKGVVT

IEQIVDTLPDRGRSCWHLGAVWALSQFQENELFLGMYPEEHFIEKPVKEAMARFRKNLEAIVSVIAERNKKKQ

LPYYYLSPDRIPNSVAI

人FLAP mRNA序列(GenBank RefSeq NM_001629)(SEQ ID NO：3)

  1 acttcccctt cctgtacagg gcaggttgtg cagctggagg cagagcagtc ctctctgggg

 61 agcctgaagc aaacatggat caagaaactg taggcaatgt tgtcctgttg gccatcgtca

121 ccctcatcag cgtggtccag aatggattct ttgcccataa agtggagcac gaaagcagga

181 cccagaatgg gaggagcttc cagaggaccg gaacacttgc ctttgagcgg gtctacactg

241 ccaaccagaa ctgtgtagat gcgtacccca ctttcctcgc tgtgctctgg tctgcggggc

301 tactttgcag ccaagttcct gctgcgtttg ctggactgat gtacttgttt gtgaggcaaa

361 agtactttgt cggttaccta ggagagagaa cgcagagcac ccctggctac atatttggga

421 aacgcatcat actcttcctg ttcctcatgt ccgttgctgg catattcaac tattacctca

481 tcttcttttt cggaagtgac tttgaaaact acataaagac gatctccacc accatctccc

541 ctctacttct cattccctaa ctctctgctg aatatggggt tggtgttctc atctaatcaa

601 tacctacaag tcatcataat tcagctcttg agagcattct gctcttcttt agatggctgt

661 aaatctattg gccatctggg cttcacagct tgagttaacc ttgcttttcc gggaacaaaa

721 tgatgtcatg tcagctccgc cccttgaaca tgaccgtggc cccaaatttg ctattcccat

781 gcattttgtt tgtttcttca cttatcctgt tctctgaaga tgttttgtga ccaggtttgt

841 gttttcttaa aataaaatgc agagacatgt ttt

人FLAP蛋白质序列(GenBank RefSeq NM_001629)(SEQ ID NO：4)

MDQETVGNVVLLAIVTLISVVQNGFFAHKVEHESRTQNGRSFQRTGTLAFERVYTANQNCVDAYPTFLAVLWS

AGLLCSQVPAAFAGLMYLFVRQKYFVGYLGERTQSTPGYIFGKRIILFLFLMSVAGIFNYYLIFFFGSDFENY

IKTISTTISPLLLIP

人COX-2mRNA序列(GenBank RefSeq NM_00963)(SEQ ID NO：5)

   1 caattgtcat acgacttgca gtgagcgtca ggagcacgtc caggaactcc tcagcagcgc

  61 ctccttcagc tccacagcca gacgccctca gacagcaaag cctacccccg cgccgcgccc

 121 tgcccgccgc tcggatgctc gcccgcgccc tgctgctgtg cgcggtcctg gcgctcagcc

 181 atacagcaaa tccttgctgt tcccacccat gtcaaaaccg aggtgtatgt atgagtgtgg

 241 gatttgacca gtataagtgc gattgtaccc ggacaggatt ctatggagaa aactgctcaa

 301 caccggaatt tttgacaaga ataaaattat ttctgaaacc cactccaaac acagtgcact

 361 acatacttac ccacttcaag ggattttgga acgttgtgaa taacattccc ttccttcgaa

 421 atgcaattat gagttatgtc ttgacatcca gatcacattt gattgacagt ccaccaactt

 481 acaatgctga ctatggctac aaaagctggg aagccttctc taacctctcc tattatacta

 541 gagcccttcc tcctgtgcct gatgattgcc cgactccctt gggtgtcaaa ggtaaaaagc

 601 agcttcctga ttcaaatgag attgtggaaa aattgcttct aagaagaaag ttcatccctg

 661 atccccaggg ctcaaacatg atgtttgcat tctttgccca gcacttcacg catcagtttt

 721 tcaagacaga tcataagcga gggccagctt tcaccaacgg gctgggccat ggggtggact

 781 taaatcatat ttacggtgaa actctggcta gacagcgtaa actgcgcctt ttcaaggatg

 841 gaaaaatgaa atatcagata attgatggag agatgtatcc tcccacagtc aaagatactc

 901 aggcagagat gatctaccct cctcaagtcc ctgagcatct acggtttgct gtggggcagg

 961 aggtctttgg tctggtgcct ggtctgatga tgtatgccac aatctggctg cgggaacaca

1021 acagagtatg cgatgtgctt aaacaggagc atcctgaatg gggtgatgag cagttgttcc

1081 agacaagcag gctaatactg ataggagaga ctattaagat tgtgattgaa gattatgtgc

1141 aacacttgag tggctatcac ttcaaactga aatttgaccc agaactactt ttcaacaaac

1201 aattccagta ccaaaatcgt attgctgctg aatttaacac cctctatcac tggcatcccc

1261 ttctgcctga cacctttcaa attcatgacc agaaatacaa ctatcaacag tttatctaca

1321 acaactctat attgctggaa catggaatta cccagtttgt tgaatcattc accaggcaaa

1381 ttgctggcag ggttgctggt ggtaggaatg ttccacccgc agtacagaaa gtatcacagg

1441 cttccattga ccagagcagg cagatgaaat accagtcttt taatgagtac cgcaaacgct

1501 ttatgctgaa gccctatgaa tcatttgaag aacttacagg agaaaaggaa atgtctgcag

1561 agttggaagc actctatggt gacatcgatg ctgtggagct gtatcctgcc cttctggtag

1621 aaaagcctcg gccagatgcc atctttggtg aaaccatggt agaagttgga gcaccattct

1681 ccttgaaagg acttatgggt aatgttatat gttctcctgc ctactggaag ccaagcactt

1741 ttggtggaga agtgggtttt caaatcatca acactgcctc aattcagtct ctcatctgca

1801 ataacgtgaa gggctgtccc tttacttcat tcagtgttcc agatccagag ctcattaaaa

1861 cagtcaccat caatgcaagt tcttcccgct ccggactaga tgatatcaat cccacagtac

1921 tactaaaaga acgttcgact gaactgtaga agtctaatga tcatatttat ttatttatat

1981 gaaccatgtc tattaattta attatttaat aatatttata ttaaactcct tatgttactt

2041 aacatcttct gtaacagaag tcagtactcc tgttgcggag aaaggagtca tacttgtgaa

2101 gacttttatg tcactactct aaagattttg ctgttgctgt taagtttgga aaacagtttt

2161 tattctgttt tataaaccag agagaaatga gttttgacgt ctttttactt gaatttcaac

2221 ttatattata agaacgaaag taaagatgtt tgaatactta aacactatca caagatggca

2281 aaatgctgaa agtttttaca ctgtcgatgt ttccaatgca tcttccatga tgcattagaa

2341 gtaactaatg tttgaaattt taaagtactt ttggttattt ttctgtcatc aaacaaaaac

2401 aggtatcagt gcattattaa atgaatattt aaattagaca ttaccagtaa tttcatgtct

2461 actttttaaa atcagcaatg aaacaataat ttgaaatttc taaattcata gggtagaatc

2521 acctgtaaaa gcttgtttga tttcttaaag ttattaaact tgtacatata ccaaaaagaa

2581 gctgtcttgg atttaaatct gtaaaatcag atgaaatttt actacaattg cttgttaaaa

2641 tattttataa gtgatgttcc tttttcacca agagtataaa cctttttagt gtgactgtta

2701 aaacttcctt ttaaatcaaa atgccaaatt tattaaggtg gtggagccac tgcagtgtta

2761 tctcaaaata agaatatttt gttgagatat tccagaattt gtttatatgg ctggtaacat

2821 gtaaaatcta tatcagcaaa agggtctacc tttaaaataa gcaataacaa agaagaaaac

2881 caaattattg ttcaaattta ggtttaaact tttgaagcaa actttttttt atccttgtgc

2941 actgcaggcc tggtactcag attttgctat gaggttaatg aagtaccaag ctgtgcttga

3001 ataacgatat gttttctcag attttctgtt gtacagttta atttagcagt ccatatcaca

3061 ttgcaaaagt agcaatgacc tcataaaata cctcttcaaa atgcttaaat tcatttcaca

3121 cattaatttt atctcagtct tgaagccaat tcagtaggtg cattggaatc aagcctggct

3181 acctgcatgc tgttcctttt cttttcttct tttagccatt ttgctaagag acacagtctt

3241 ctcatcactt cgtttctcct attttgtttt actagtttta agatcagagt tcactttctt

3301 tggactctgc ctatattttc ttacctgaac ttttgcaagt tttcaggtaa acctcagctc

3361 aggactgcta tttagctcct cttaagaaga ttaaaagaga aaaaaaaagg cccttttaaa

3421 aatagtatac acttatttta agtgaaaagc agagaatttt atttatagct aattttagct

3481 atctgtaacc aagatggatg caaagaggct agtgcctcag agagaactgt acggggtttg

3541 tgactggaaa aagttacgtt cccattctaa ttaatgccct ttcttattta aaaacaaaac

3601 caaatgatat ctaagtagtt ctcagcaata ataataatga cgataatact tcttttccac

3661 atctcattgt cactgacatt taatggtact gtatattact taatttattg aagattatta

3721 tttatgtctt attaggacac tatggttata aactgtgttt aagcctacaa tcattgattt

3781 ttttttgtta tgtcacaatc agtatatttt ctttggggtt acctctctga atattatgta

3841 aacaatccaa agaaatgatt gtattaagat ttgtgaataa atttttagaa atctgattgg

3901 catattgaga tatttaaggt tgaatgtttg tccttaggat aggcctatgt gctagcccac

3961 aaagaatatt gtctcattag cctgaatgtg ccataagact gaccttttaa aatgttttga

4021 gggatctgtg gatgcttcgt taatttgttc agccacaatt tattgagaaa atattctgtg

4081 tcaagcactg tgggttttaa tatttttaaa tcaaacgctg attacagata atagtattta

4141 tataaataat tgaaaaaaat tttcttttgg gaagagggag aaaatgaaat aaatatcatt

4201 aaagataact caggagaatc ttctttacaa ttttacgttt agaatgttta aggttaagaa

4261 agaaatagtc aatatgcttg tataaaacac tgttcactgt tttttttaaa aaaaaaactt

4321 gatttgttat taacattgat ctgctgacaa aacctgggaa tttgggttgt gtatgcgaat

4381 gtttcagtgc ctcagacaaa tgtgtattta acttatgtaa aagataagtc tggaaataaa

4441 tgtctgttta tttttgtact attta

人COX-2蛋白质序列(GenBank RefSeq NM_000963)(SEQ ID NO：6)

MLARALLLCAVLALSHTANPCCSHPCQNRGVCMSVGFDQYKCDCTRTGFYGENCSTPEFLTRIKLFLKPTPNT

VHYILTHFKGFWNVVNNIPFLRNAIMSYVLTSRSHLIDSPPTYNADYGYKSWEAFSNLSYYTRALPPVPDDCP

TPLGVKGKKQLPDSNEIVEKLLLRRKFIPDPQGSNMMFAFFAQHFTHQFFKTDHKRGPAFTNGLGHGVDLNHI

YGETLARQRKLRLFKDGKMKYQIIDGEMYPPTVKDTQAEMIYPPQVPEHLRFAVGQEVFGLVPGLMMYATIWL

REHNRVCDVLKQEHPEWGDEQLFQTSRLILIGETIKIVIEDYVQHLSGYHFKLKFDPELLFNKQFQYQNRIAA

EFNTLYHWHPLLPDTFQIHDQKYNYQQFIYNNSILLEHGITQFVESFTRQIAGRVAGGRNVPPAVQKVSQASI

DQSRQMKYQSFNEYRKRFMLKPYESFEELTGEKEMSAELEALYGDIDAVELYPALLVEKPRPDAIFGETMVEV

GAPFSLKGLMGNVICSPAYWKPSTFGGEVGFQIINTASIQSLICNNVKGCPFTSFSVPDPELIKTVTINASSS

RSGLDDINPTVLLKERSTEL

人COX-1mRNA序列(GenBank RefSeq NM_000962)(SEQ IDNO：7)

   1 aggtgacagc tggagggagg agcgggggtg gagccggggg aagggtgggg aggggatggg

  61 ctggagctcc gggcagtgtg cgaggcgcac gcacaggagc ctgcactctg cgtcccgcac

 121 cccagcagcc gcgccatgag ccggagtctc ttgctctggt tcttgctgtt cctgctcctg

 181 ctcccgccgc tccccgtcct gctcgcggac ccaggggcgc ccacgccagt gaatccctgt

 241 tgttactatc catgccagca ccagggcatc tgtgtccgct tcggccttga ccgctaccag

 301 tgtgactgca cccgcacggg ctattccggc cccaactgca ccatccctgg cctgtggacc

 361 tggctccgga attcactgcg gcccagcccc tctttcaccc acttcctgct cactcacggg

 421 cgctggttct gggagtttgt caatgccacc ttcatccgag agatgctcat gcgcctggta

 481 ctcacagtgc gctccaacct tatccccagt ccccccacct acaactcagc acatgactac

 541 atcagctggg agtctttctc caacgtgagc tattacactc gtattctgcc ctctgtgcct

 601 aaagattgcc ccacacccat gggaaccaaa gggaagaagc agttgccaga tgcccagctc

 661 ctggcccgcc gcttcctgct caggaggaag ttcatacctg acccccaagg caccaacctc

 721 atgtttgcct tctttgcaca acacttcacc caccagttct tcaaaacttc tggcaagatg

 781 ggtcctggct tcaccaaggc cttgggccat ggggtagacc tcggccacat ttatggagac

 841 aatctggagc gtcagtatca actgcggctc tttaaggatg ggaaactcaa gtaccaggtg

 901 ctggatggag aaatgtaccc gccctcggta gaagaggcgc ctgtgttgat gcactacccc

 961 cgaggcatcc cgccccagag ccagatggct gtgggccagg aggtgtttgg gctgcttcct

1021 gggctcatgc tgtatgccac gctctggcta cgtgagcaca accgtgtgtg tgacctgctg

1081 aaggctgagc accccacctg gggcgatgag cagcttttcc agacgacccg cctcatcctc

1141 ataggggaga ccatcaagat tgtcatcgag gagtacgtgc agcagctgag tggctatttc

1201 ctgcagctga aatttgaccc agagctgctg ttcggtgtcc agttccaata ccgcaaccgc

1261 attgccatgg agttcaacca tctctaccac tggcaccccc tcatgcctga ctccttcaag

1321 gtgggctccc aggagtacag ctacgagcag ttcttgttca acacctccat gttggtggac

1381 tatggggttg aggccctggt ggatgccttc tctcgccaga ttgctggccg gatcggtggg

1441 ggcaggaaca tggaccacca catcctgcat gtggctgtgg atgtcatcag ggagtctcgg

1501 gagatgcggc tgcagccctt caatgagtac cgcaagaggt ttggcatgaa accctacacc

1561 tccttccagg agctcgtagg agagaaggag atggcagcag agttggagga attgtatgga

1621 gacattgatg cgttggagtt ctaccctgga ctgcttcttg aaaagtgcca tccaaactct

1681 atctttgggg agagtatgat agagattggg gctccctttt ccctcaaggg tctcctaggg

1741 aatcccatct gttctccgga gtactggaag ccgagcacat ttggcggcga ggtgggcttt

1801 aacattgtca agacggccac actgaagaag ctggtctgcc tcaacaccaa gacctgtccc

1861 tacgtttcct tccgtgtgcc ggatgccagt caggatgatg ggcctgctgt ggagcgacca

1921 tccacagagc tctgaggggc aggaaagcag cattctggag gggagagctt tgtgcttgtc

1981 attccagagt gctgaggcca gggctgatgg tcttaaatgc tcattttctg gtttggcatg

2041 gtgagtgttg gggttgacat ttagaacttt aagtctcacc cattatctgg aatattgtga

2101 ttctgtttat tcttccagaa tgctgaactc cttgttagcc cttcagattg ttaggagtgg

2161 ttctcatttg gtctgccaga atactgggtt cttagttgac aacctagaat gtcagatttc

2221 tggttgattt gtaacacagt cattctagga tgtggagcta ctgatgaaat ctgctagaaa

2281 gttagggggt tcttattttg cattccagaa tcttgacttt ctgattggtg attcaaagtg

2341 ttgtgttcct ggctgatgat ccagaacagt ggctcgtatc ccaaatctgt cagcatctgg

2401 ctgtctagaa tgtggatttg attcattttc ctgttcagtg agatatcata gagacggaga

2461 tcctaaggtc caacaagaat gcattccctg aatctgtgcc tgcactgaga gggcaaggaa

2521 gtggggtgtt cttcttggga cccccactaa gaccctggtc tgaggatgta gagagaacag

2581 gtgggctgta ttcacgccat tggttggaag ctaccagagc tctatcccca tccaggtctt

2641 gactcatggc agctgtttct catgaagcta ataaaattcg ctttctaaag ttacctgtta

2701 tatatctctt ttggtcccat cctctaaagc agaggcaaca ctggaacatg gctagccttt

2761 cttgtagcca tggctgggcg tgctagaggt tgcagcatga gactttctgc tgggatcctt

2821 gggcccatca ctgtatagac atgctaccac tggtacttcc tttctccctg cgggccaggc

2881 actgcccttt tcaggaagct ctcttaaaat acccattgcc ccagacctgg aagatataac

2941 attcagttcc caccatctga ttaaaacaac ttcctccctt acagagcata caacagaggg

3001 ggcacccggg gaggagagca catactgtgt tccaatttca cgcttttaat tctcatttgt

3061 tctcacacca acagtgtgaa gtgcgtggta taatctccat ttcaaaacca aggaagcagc

3121 ctcagagtgg tcgagtgaca cacctcacgc aggctgagtc cagagcttgt gctcctcttg

3181 attcctggtt tgactcagtt ccaggcctga tcttgcctgt ctggctcagg gtcaaagaca

3241 gaatggtgga gtgtagcctc cacctgatat tcaggctact cattcagtcc caaatatgta

3301 ttttcctaag tgtttactat gtgccagttc ctgtaacagg tgtggggaca cagcagtgag

3361 taatcaatac agacaaggtt ctgcccttat ggagctcaca ctccagtggc agacaaacag

3421 accataaata aggaaacgat gaaataagat atatacaagg tgagtgtgac ttcccttcta

3481 accccctctg ctctgtcctc ccctattgcg ctctcaagac cagagaccca acagcagtga

3541 tctcagggca gacagccctc cactccagct ctgagaccct tttctcagga cctctgtagg

3601 cagcagagag agaggacaga ggggtaagat gaggggttga gggaaggttc ttcatgatcc

3661 acactttggg cttagtattt ctcaggaaga gctatggccc agaaacaaca ggggaaacta

3721 gagttcggtc tgacagtcct tggggttaag tctcctgtct tatggtccag aaactcctgt

3781 ttctccttag ttggctggaa actgctccca tcattccttc tggcctctgc tgaatgcagg

3841 gaatgcaatc cttccctgct cttgcagttg ctctgacgta gaaagatcct tcgggtgctg

3901 gaagtctcca tgaagagctt gtgtcctgtc ctttcttgca gattctattt cccctcttct

3961 gctaatacct cttactttgc ttgagaatcc tctcctttct tattaatttc agtcttggtg

4021 gttctatcag gggtgcattc tggccaaggg gtgggcctgt gaatcaatcc tgggcaatca

4081 gacaccctct ccttaaaaac tggcccgtgg agactgagat cactgactct gactcatccc

4141 cacagctggc tctgacaaga tggtccattt gttcctgctt ccgagatccc cagggcagcc

4201 tggatccctg cccttctcaa gactttagct tttccttcca tccggtggcc tattccagga

4261 attcctcttt tgcttaaatc agttggagtt tgtgtctgtt gcttgtaatc aagcctttat

4321 ggctgctggg ctgagtgaca caagcacttt aatggcctgg agggactttt aatcagtgaa

4381 gatgcaatca gacaagtgtt ttggaaagag caccctcgag aagggtggat gacagggcag

4441 agcaggaagg acaggaagct ggcagaacgg aggaggctgc agccgtggtc caaccaggag

4501 ctgatggcag ctggggctag gggaagggct ttgagggtgg aaggatggga tgggttccag

4561 aggtattcct ctcttaaatg caagtgccta gattaggtag actttgctta gtattgacaa

4621 ctgcacatga aagttttgca aagggaaaca ggctaaatgc accaagaaag cttcttcaga

4681 gtgaagaatc ttaatgcttg taatttaaac atttgttcct ggagttttga tttggtggat

4741 gtgatggttg gttttatttg tcagtttggt tgggctatag cacacagtta tttaatcaaa

4801 cagtaatcta ggtgtggctg tgaaggtatt ttgtagatgt gattaacatc tacaatcagt

4861 tgactttaag tgaaagagat tacttaaata atttgggtga gctgcacctg attagttgaa

4921 aggcctcaag aacaaacact gcagtttcct ggaaaagaag aaactttgcc tcaagactat

4981 agccatcgac tcctgcctga gtttccagcc tgctagtctg ccctatggat ttgaagtttg

5041 ccaaccccaa caattgtgtg aattaatttc taaaaataaa gctatataca gcc

人COX-1蛋白质序列(GenBank RefSeq NM_000962)(SEQ ID NO：8)

MSRSLLLWFLLFLLLLPPLPVLLADPGAPTPVNPCCYYPCQHQGICVRFGLDRYQCDCTRTGYSGPNCTIPGL

WTWLRNSLRPSPSFTHFLLTHGRWFWEFVNATFIREMLMRLVLTVRSNLIPSPPTYNSAHDYISWESFSNVSY

YTRILPSVPKDCPTPMGTKGKKQLPDAQLLARRFLLRRKFIPDPQGTNLMFAFFAQHFTHQFFKTSGKMGPGF

TKALGHGVDLGHIYGDNLERQYQLRLFKDGKLKYQVLDGEMYPPSVEEAPVLMHYPRGIPPQSQMAVGQEVFG

LLPGLMLYATLWLREHNRVCDLLKAEHPTWGDEQLFQTTRLILIGETIKIVIEEYVQQLSGYFLQLKFDPELL

FGVQFQYRNRIAMEFNHLYHWHPLMPDSFKVGSQEYSYEQFLFNTSMLVDYGVEALVDAFSRQIAGRIGGGRN

MDHHILHVAVDVIRESREMRLQPFNEYRKRFGMKPYTSFQELVGEKEMAAELEELYGDIDALEFYPGLLLEKC

HPNSIFGESMIEIGAPFSLKGLLGNPICSPEYWKPSTFGGEVGFNIVKTATLKKLVCLNTKTCPYVSFRVPDA

SQDDGPAVERPSTEL

II.5-脂氧合酶抑制剂

申请人现发现抑制5-脂氧合酶的活性可促进骨生成，可利用这一点加速和/或增强骨折的愈合，治疗骨质缺损，或通过诱导骨形成进行治疗。申请人的发现是基于他的如下假说：COX-2功能的丧失抑制骨折愈合的一种潜在的机理是通过将花生四烯酸分流到脂氧合酶途径，结果形成异常高的抑制性5-HETE、LTB4或其他5-LO代谢物水平(图2)。在正常的炎症反应例如骨折中，前列腺素和白三烯的合成达到平衡(图2A)。不束缚于一种理论，发明人建立了一种理论，认为抑制COX-2功能将花生四烯酸分流到脂氧合酶途径产生过量的白三烯，因而损害了骨形成(图2B)。相反，通过抑制5-脂氧合酶活性，花生四烯酸被分流到环加氧酶途径产生过量的前列腺素，前列腺素加速或增强骨形成(图2C)。

为检验这种潜在的机理，在5-LO-/-小鼠中评价了骨折愈合。申请人发现5-LO功能的丧失加速了愈合。对C57BL/6背景的年龄匹配的小鼠中骨折愈合的放射检查显示在5-LO-/-小鼠中到骨折后2周时发生骨折连接，对比之下，在正常小鼠中在骨折3周以后发生(图3)。而且，骨痂重塑显著加速，因此，基于扭转机械试验，5-LO-/-骨痂重获其起始结构和材料特性比正常小鼠快得多(图4和表2)。因此，5-LO功能的丧失加速并增强了骨折愈合和骨形成。

钙化样品的组织学检查支持了放射数据。正常和5-LO-/-小鼠骨折的塑料包埋的钙化切片用Stevenel’s blue和van Gieson’spicrofuchsin染色，显示在5-LO-/-小鼠中愈合仅仅2周之后骨折与钙化组织连接，然而正常小鼠(C57BL/6)仍然具有软骨质的柔软的骨痂。骨折骨痂区域的组织形态测定显示软骨区域在5-LO-/-小鼠中骨折7天后达到顶峰，在正常小鼠中骨折10天后(图5和表3)。骨折骨痂中的新骨(钙化组织)的测量显示愈合7天后在5-LO-/-中的新骨几乎是两倍，而且在第10天时有显著更多的新骨(图5和表2)。这些数据显示了在5-LO-/-小鼠中正常的(虽然显著加速的)软骨内的骨化途径用于愈合骨折。利用更年轻和更老的5-LO-/-小鼠在不同遗传背景下进行的试验给出了同样的结果：5-LO-/-功能丧失导致骨再生的加速。

这些试验的数据显示了在5-LO-/-小鼠中10天的骨折骨痂与正常小鼠中的14天的骨痂相等；14天5-LO-/-骨痂与21天正常骨痂相等；并且1个月的5-LO-/-骨痂与3个月正常骨痂相等(图3)。因此，5-LO功能的丧失加速和/或增强了骨折愈合的再生和重塑阶段。

在本发明的一个方面，抑制5-脂氧合酶活性的化合物加速和/或增强了骨折愈合或防止了骨吸收或促进了骨形成，为治疗人类疾病的努力提供了重要的益处。抑制5-脂氧合酶活性的化合物可用于，例如，治疗由于外伤或由于骨质疏松或骨关节炎引起的骨折的方法，治疗佩吉特病的方法，治疗其他疾病例如骨移植和与高骨折相关的疾病的方法，和需要骨形成的方法，例如脊柱融合，其他骨和关节强硬操作，骨或肢体延长，骨结构加强，向骨质缺损中引入同种异体移植物、自体移植物或合成骨材料，骨向假体装置内或周围生长，和其他类似的程序。

可用于实施本发明方法的几种5-脂氧合酶抑制剂和它们的给药是已知的。5-脂氧合酶抑制剂可以是3-[1-(4-氯苄基)-3-叔丁基-硫基-5-异丙基吲哚-2-基]-2，2-二甲基丙酸(MK886)或其衍生物；3-(1-(4-氯苄基)-3-(1-丁基-硫基)-5-(喹啉-2-基-甲氧基)-吲哚-2-基)-2，2-二甲基丙酸)(MK-591)或其衍生物；去甲二氢愈创木酸(NDGA)或其衍生物；2-(12-羟基十二碳-5，10-二炔基)-3，5，6-三甲基-1，4-苯醌(AA861)或其衍生物；或(N-(1-苯并(b)噻吩-2-基乙基)-N-羟基脲)(齐留通)或其衍生物。衍生物包括例如，可用作5-脂氧合酶抑制剂的药学上可接受的盐、前药，等等。示例性化合物的衍生物落在所要求的发明的范围内。

本发明中利用的其他5-脂氧合酶抑制剂包括马索罗酚、替尼达普、flobufen、氯萘帕林、他戈利嗪、Abbott A-121798、AbbottA-76745、Abbott A-78773、Abbott A-79175、Abbott ABT 761、Dainippon AL-3264、Bayer Bay-x-1005、Biofor BF-389、布那司特、Cytomed CMI-392、Takeda CV-6504、磷酸依那扎群、Leo DenmarkETH-615、盐酸氟卓斯汀、Merck Frosst L-663536、MerckleML-3000、3M Pharmaceuticals R-840、利洛吡司、Schering PloughSCH-40120、替泊沙林、林那司特(TMK-688)、Zeneca ZD-2138、Bristol-Myers Squibb BU-4601A、咔唑霉素C、lagunamycin、Wellcome BW-70C、Ciba-Geigy CGS-26529、Warner-Lambert CI1004、Warner-Lambert PD-136005、Warner-Lambert PD-145246、Eisai E-3040、Fujirebio F-1322、Fujisawa FR-110302、Merck FrosstL-699333、Merck Frosst L-739010、Lilly LY-269415、LillyLY-178002、Hoechst  Roussel  P-8892、SmithKline  BeechamSB-202235、American Home Products WAY-121520、American HomeProducts WAY-125007、Zeneca ZD-7717、Zeneca ZM-216800、Zeneca ZM-230487、1，2-二氢-n-(2-噻唑基)-1-氧代吡咯并(3，2，1-kl)吩噻嗪-1-甲酰胺、Abbott A-65260、Abbott A-69412、Abbott-63162、American Home Products AHR-5333、Bayer Bay-q-1531、BoehringerIngelheim BI-L-357、Boehringer Ingelheim BI-L-93BS、BoehringerIngelheim BIL 226XX、Bristol-Myers Squibb BMY-30094、咔唑霉素B、Wellcome BW-B218C、Chauvin CBS-1114、Ciba-GeigyCGS-21595、Ciba-Geigy CGS-22745、Ciba-Geigy CGS-23885、Ciba-Geigy CGS 24891、Ciba-Geigy CGS-8515、Chiesi CHF-1909、Warner-Lambert CI-986、Warner-Lambert CI 987、去甲中国蓟醇(cirsiliol)、多西苯醌、Eisai E-5110、Eisai E-6080、乙诺司特、epocarbazolin-A、依普伐芬、依凡达明、Fisons FPL 62064、ZenecaICI-211965、Zeneca ICI-216800、Kyowa Hakko KF-8940、Merck &Co L-651392、Merck & Co L-651896、Merck & Co L-652343、Merck& Co L-656224、Merck & Co L-670630、Merck & Co L-674636、Lilly LY-233569、，Merck & Co MK-591、Merck & Co L-655240、nitrosoxacin-A、Ono ONO-5349、Ono ONO-LP-219、OnoONO-LP-269、Warner-Lambert PD-127443、Purdue FrederickPF-5901、Rhone-Poulenc Rorer Rev-5367、Rhone-Poulenc RorerRG-5901-A、Rhone-Poulenc Rorer RG-6866、Roussel-UclafRU-46057、Searle SC-41661A、Searle SC-45662、SandozSDZ-210-610、SmithKline Beecham SK&F-104351、SmithKlineBeecham SK&F-104493、SmithKline Beecham SK&F-105809、Synthelabo SL-81-0433、Teijin TEI-8005、Terumo TMK-777、TerumoTMK-781、Terumo TMK-789、Terumo TMK-919、TerumoTMK-992、Teikoku Hormone TZI-41127、American Home ProductsWAY-120739、American Home Products WY-47288、American HomeProducts WY-48252、American Home Products WY-50295、YoshitomiY-19432、4-{3-[4-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)苯硫基]}苯基-3，4，5，6-四氢-2H-吡喃-4-甲酰胺、七叶亭、菲尼酮和其衍生物、BI-L-239、5，8，11-二十碳三炔酸(ETI)、5，8，11，14-二十碳四炔酸(ETYA)、肉桂基-3，4-二羟基-α-氰基肉桂酸酯、姜黄素、esculeitin、棉子酚、咖啡酸、黄芩黄素、7，7-二甲基二十碳二烯酸(DEDA)、Ly311727、溴烯醇内酯、甲基花生四烯基氟代磷酸酯、甲基y-亚麻基氟代磷酸酯、油基氧乙基磷酸胆碱、AACOCF3、n-(对戊基肉桂酰基)邻氨基苯甲酸、麦帕克林、奎纳克林、阿的平、对溴苯甲酰甲基溴、马兜铃酸、皮质类固醇、Glaxo SmithKline 480848、Glaxo SmithKline 659032、Glaxo SmithKline 677116、BMS-181162、MJ33和MillenniumPharmaceuticals MLN977。

更优选的5-脂氧合酶抑制剂包括马索罗酚、替尼达普、齐留通、flobufen、氯萘帕林、他戈利嗪、Abbott A-121798、Abbott A-76745、Abbott A-78773、[(R)(+)N′-[[5-(4-氟苯氧基)呋喃-2-基]-1-甲基-2-丙炔基]-N-羟基脲(Abbott A-79175)，]Abbott A-79175、Abbott ABT 761、Dainippon AL-3264、Bayer Bay-x-1005、Biofor BF-389、布那司特、Cytomed CMI-392、Takeda CV-6504、Ciba-Geigy CGS-26529、磷酸依那扎群、Leo Denmark ETH-615、盐酸氟卓斯汀、Merck Frosst L663536、Merck Frosst L 699333、Merckle ML-3000、3M PharmaceuticalsR-840、利洛吡司、Schering Plough SCH 40120、替泊沙林、林那司特(TMK-688)、Zeneca ZD-7717、Zeneca ZM-216800、Zeneca ZM-230487、Zeneca ZD-2138；和NDGA(去甲二氢愈创木酸)。

进一步更优选的5-脂氧合酶抑制剂包括替尼达普、齐留通、flobufen、氯萘帕林、他戈利嗪、AA-861、Abbott A-121798、AbbottA-76745、Abbott A-78773、Abbott A-79175、Abbott ABT 761、Ciba-Geigy CGS-26529、Biofor BF-389、Cytomed CMI-392、LeoDenmark ETH-615、氯萘帕林、Merck Frosst L 699333、MerckleML-3000、3M Pharmaceuticals R-840、林那司特(TMK-688)、ZenecaZD-7717、Zeneca ZM-216800、Zeneca ZM-230487、Zeneca ZD-2138和NDGA(去甲二氢愈创木酸)。

在另一方面，本发明包括5-LO抑制剂和COX抑制剂及其用途。优选地，COX抑制剂是一种选择性COX-1抑制剂，也就是，抑制COX-1活性超过抑制COX-2活性。5-LO抑制剂和COX抑制剂的应用包括在给药方案中以一种相继的方式给药，这将会提供药物组合物的有益效果，以一种实质上同时的方式共同给予抑制剂，例如以一种具有固定比例的活性试剂的单个胶囊，或以对每种试剂多个，独立的胶囊，还有一种抑制两种酶的单个化合物。

COX抑制剂可选自塞来考昔；罗非考昔；美洛昔康；吡罗昔康；伐地考昔、帕瑞考昔、艾托考昔、CS-502、JTE-522；L-745，337；FR122047；NS398；选自包括阿斯匹林、布洛芬、茚甲新CAY 10404、双氯芬酸、酮洛芬、萘普生，酮咯酸、苯基丁氮酮、酮咯酸、舒林酸和其他物质的非选择性NSAID，或选自类固醇或皮质类固醇。选择性的抑制环加氧酶-2的化合物已在美国专利Nos.5,380,738、5,344,991、5,393,790、5,466,823、5,434,178、5,474,995、5,510,368和WO文献WO96/06840、WO96/03388、WO96/03387、WO95/15316、WO94/15932、WO94/27980、WO95/00501、WO94/13635、WO94/20480和WO94/26731和其他本领域技术人员已知的文献中描述。

选择性的COX-1抑制剂是本领域已知的。下面是优选的COX-1选择性NSAID列表：SC-560[Smith等人，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 95：13313-8(1998)]、FR122047[Dohi等人，European Journal of Pharmacology243：179-84(1993)]、戊酰水杨酸、阿斯匹林。阿斯匹林是一种在体内迅速失活的不可逆的环加氧酶抑制剂。阿斯匹林可以抑制COX-1和COX-2，预先用阿斯匹林处理可在COX-2表达之前或之中使所有预存在的COX-1失活。因此，任何表达的新的COX-2是有活性的，但所有“老的”COX-1或COX-2是失活的。

下面是相对于COX-2优先抑制COX-1的NASID的列表：右酮洛芬、Keterolac、氟比洛芬、舒洛芬。也可见[Warner等人，Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America96：7563-8(1999)]。

在另一实施方式中，本发明包括5-LO抑制剂和COX-2活化剂及其用途。COX-2活化剂也是本领域已知的。见[Tanabe和Tohnai，Prostaglandins & other Lipid Mediators 68-69：95-114(2002)]，其是涉及COX-2基因表达的调节的综述文章，作为下面所列的没有参考文献的化合物或治疗的参考文献。优选的COX-2活化剂包括超声治疗[Sena等人，Ultrasound in Medicine & Biology 31：703-8(2005)]、脉冲电磁场(PEMF)[Lohmann等人，Journal of Orthopaedic Research 21：326-34(2003)]、BMP2[Chikazu等人，Journal of Bone and Mineral Research17：1430-40(2002)]、PDGF、FGF和PTH和其类似物(PTHrP和特立帕肽(teraparatide))[Maciel等人，Journal of Rheumatology 24：2429-35(1997)]。其他的COX-2活化剂包括前列腺素和前列腺素受体激动剂[Rosch等人，Biochemical and Biophysical Research Communications338：1171-8(2005)]、PDGF(血小板衍生生长因子)、IL-1α(白介素1α)、IL-1β、TNF-α(肿瘤坏死因子α)、FGF(成纤维细胞生长因子)、TGF-β(转化生长因子β)、TGF-α、EGF(表皮生长因子)、TPA(十四酰佛波醇醋酸盐)。

另外，本发明包括一种组合，该组合包括治疗有效量的5-脂氧合酶抑制剂和环加氧酶-2抑制剂，例如，licofelone、Dupont Dup 697、Taisho NS-398、美洛昔康、氟舒胺、Glaxo SmithKline 406381、GlaxoSmithKline 644784或替泊沙林。

通过本发明方法对骨代谢的调节可通过在给药后相对于对照受试者检查骨强度和质量而确定。所述检查可利用成像技术(例如，X-射线、核磁共振成像、X-射线断层摄影、超声和声音传导)或压力测试原位进行，或通过标准组织学、放射摄影、机械或生化方法离体(exvivo)进行。骨密度和/或骨质量的调节可通过一个或多个参数的变化进行评价，所述参数例如是骨矿物质密度、骨强度、小梁的数目、骨大小和骨组织连通性。确定骨矿物质密度(BMD)的几种方法是本领域已知的。例如，BMD的测定可通过利用，例如，双能量X射线吸收测量法或定量计算机化断层摄影术等进行。类似地，提高的骨形成可利用本领域公知的方法确定。例如，骨形成速度(BFR)的动态测量可利用定量数字化形态测量法对四环素标记的来自腰椎和股骨远侧干骺端的松质骨进行(Ling等人，Endocrinology 140：5780-5788(1999))。可选地，可以评价骨形成标记，例如碱性磷酸酶活性、血清胶原肽水平或血清骨钙蛋白水平，以间接确定是否发生了提高的骨形成(Looker等人，Osteoporosis International 11：467-480(2000))。可测试调节花生四烯酸代谢或信号途径的化合物加速或增强骨折愈合和/或骨形成、促进骨形成以及防止骨损失的能力。这可在多种本领域技术人员公知的动物模型中进行测试，例如动物骨折模型、动物截骨术模型、动物颅骨环钻缺陷模型、动物骨质缺损模型、多种动物节段缺陷模型和骨延长模型、卵巢切除诱导的骨损失模型，等等。这些动物模型的应用已经很好地确定，并且被广泛的不同的观察所支持。例如，在包括大鼠在内的动物中的BMP2研究证实了BMP2刺激骨生成，并且BMP2现在在临床上用于人类的骨修复应用(商品名INFUSE)。有上百篇关于其用于动物的论文，关于人类的有几十篇；NSAID抑制大鼠中的骨折修复[Simon等人，Cyclooxygenase 2 function is essentialfor bone fracture healing.Journal of Bone and Mineral Research17：963-76(2002)]，并且NSAID的使用与人中很差的骨折愈合相关[Burd等人，Journal of Bone and Joint Surgery(British)85B：700-5(2003)]；Rubin等人(2001)，JBJS 83(2)：259-270引证的研究显示超声治疗加速大鼠(Azuma ref.)和人体中的骨折修复。FDA关于骨质疏松治疗的准则显示临床前研究需要利用2个种并且其中一个必须是切除了卵巢的大鼠模型。

通过本发明方法对骨代谢的调节可通过在相对于模拟治疗细胞改变了花生四烯酸代谢的处理后检查成骨细胞和/或软骨细胞的增殖、存活和分化而体外确定。细胞或器官外植体，例如新生啮齿动物颅顶或指骨，可利用抑制5-脂氧合酶活性、改变环加氧酶活性、影响白三烯或前列腺素受体功能的化合物以及本申请阐明的类似化合物进行处理。另外的处理方法可包括利用反义核酸、干扰RNA、其他核酸或蛋白质等。成骨细胞或软骨细胞增殖和存活可通过本领域公知的许多技术来测定，例如细胞计数，放射性标记的胸苷或溴脱氧尿苷向复制DNA中的掺入，台盼蓝排除，和对经历细胞凋亡的细胞内的DNA的末端脱氧核糖核苷转移酶末端标记。成骨细胞和/或软骨细胞的分化可通过本领域公知的许多技术来测定，包括通过von Kossa或茜素红方法染色矿化节结的形成来确定成骨细胞或软骨细胞培养物矿化，软骨细胞的阿辛蓝染色来测定蛋白聚糖基质的精制，基因表达分析来测定成骨细胞和软骨细胞分化标记物例如I型、II型和X型胶原，骨钙蛋白，和利用基于蛋白质或核酸的测试方法的聚集蛋白聚糖，碱性磷酸酶活性的测试，和通过例如酶联免疫测定(EIA)的定量方法对RANKL、OPG、VEGF、骨形态发生蛋白和其他生长因子的测定。

5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)

FLAP是一种18-KD的膜结合多肽，其特异性结合花生四烯酸并且通过作为花生四烯酸转移蛋白起作用而活化5-LO。FLAP基因大于31kb并且由五个小的外显子和四个大的外显子组成(外显子1为GenBank 182657，Genbank M60470，外显子2为Genbank M63259，外显子3为Genbank M63260，外显子4为Genbank M63261，外显子5为Genbank M6322)。

核被膜是5-LO和FLAP作用以代谢花生四烯酸的细胞内部位，并且嗜中性粒细胞和单核细胞的离子载体活化导致5-LO从不能沉积的部位迁移到核被膜。FLAP功能抑制剂防止了5-LO从细胞溶质迁移到膜并且抑制5-LO活化。因此，FLAP抑制剂是抗炎性候选药物。

抑制FLAP的药物(MK866)或缺乏FLAP的小鼠降低白三烯的合成。因此，在本发明的一个方面，在调节花生四烯酸代谢或信号途径因此加速和/或增强骨折愈合和骨形成的方法中使用FLAP抑制剂例如BAYx 1005、MK-886和MK-0591。

反义治疗

术语“反义核酸”指与5-LO或FLAP-编码DNA和RNA的碱基序列互补的，或与那些编码花生四烯酸代谢或信号途径中的其他蛋白质的碱基序列互补的寡核苷酸。反义寡核苷酸可以是修饰的或未修饰的RNA、DNA或混合的聚合体寡核苷酸，并且，当导入到靶细胞中时，特异性地与它们的靶核酸结合，并且干扰转录、RNA加工、转运和/或翻译。用寡核苷酸靶向双链(ds)DNA导致三螺旋形成；靶向RNA导致双螺旋形成。

反义构建体可设计为与基因的启动子和其他控制区、外显子、内含子或外显子-内含子边界结合。反义RNA构建体，或编码所述反义RNA的DNA，可用于抑制宿主细胞内的基因转录或翻译或两者，无论在体外还是在体内，例如在宿主动物包括人类受试者内。包含“互补核苷酸”的核酸序列是根据标准Watson-Crick互补原则能够碱基配对的核酸序列，其中鸟嘌呤与胞嘧啶配对，在DNA中腺嘌呤与胸腺嘧啶配对(A:T)，或在RNA中腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)。

虽然所有的或部分的基因序列可用于上下文的反义构建体中，但是优选利用任何17个碱基长度的序列确定唯一的靶序列。虽然更短的寡聚体更容易在产生并增加体内可及性，但是决定杂交特异性还有许多其他因素。选择反义寡核苷酸以使得与它的互补目标的结合亲和性和序列特异性足够作为治疗剂应用。因此，可以使用8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或更多碱基对的寡核苷酸。仅仅通过在体外测试构建体以确定内源基因的功能是否被影响，或具有互补序列的相关基因的表达是否被影响，可以容易地确定给出的反义核酸对于靶向相应的宿主细胞是否是有效的。

干扰RNA

干扰RNA(RNAi)片断，特别是双链(ds)RNAi，可用于调节花生四烯酸代谢或信号途径。小的干扰RNA(siRNA)一般是19-25个核苷酸长的RNA分子，其干扰基因的表达。与使用RNAi在秀丽隐杆线虫(C.elegans)、果蝇、植物和人类中沉默化基因相关的方法在本领域是已知的(Fire等人，Nature 391：806-811(1998)；Sharp，P.A.RNA interference 2001.Genes Dev.15：485-490(2001)；Tuschl，T.Chem.Biochem.2：239-245(2001)；WO0129058；和WO9932619)。

应用RNAi的核苷酸序列包括至少大约15到50个碱基对的那些序列。所述序列可以是双链体，任选地在5’端和/或3’端具有突出端，其中双链体的一条链包含至少15个连续碱基的核酸序列，其具有花生四烯酸代谢或信号途径之内的核酸分子的核酸序列。如果期望，每条链的长度可以更长，例如19、20、21、22、23、24、25或30个核苷酸或可达此处所述的任一分子的全长。单链突出端可以是，例如1、2、3、4、5或10个核苷酸长度，并且可以在3’端存在、5’端存在、或同时在3’和5’端存在。所述片段可容易地通过化学合成方法直接合成片段而制备，通过应用核酸扩增技术而制备，或通过将选择的序列导入到用于重组生产的重组载体中而制备。

特别地，核苷酸序列或RNAi可以是与5-LO或FLAP-编码DNA和RNA的碱基序列互补的，或与编码花生四烯酸代谢或信号途径的其他蛋白质的碱基序列互补的寡核苷酸。寡核苷酸可以是修饰的或未修饰的RNA、DNA或混合聚合体寡核苷酸，并且，当导入靶细胞内时，特异性地与它们的靶核酸结合，并且干扰转录、RNA加工、转运和/或翻译。

其他试剂

在本发明的另一方面，可给受试者施用附加的药剂或药物。附加的药剂可包含一种或多种有效调节钙稳态平衡、调节软骨形成、调节骨生成、调节骨重塑、调节疼痛、调节炎症、或具有抗生素活性的活性剂。附加活性剂可以是，但不限于，雌激素、IGF、胰岛素、骨形态发生蛋白、和其他生长因子、护骨蛋白(OPG)、降钙素，二膦酸盐、维生素D₃或其类似物、抑制素、adrogen、氟化盐、甲状旁腺激素或其类似物、增强血管生成的药剂例如血管表皮生长因子(VEGF)、改变骨代谢中涉及的天然存在的激素调节剂的转录调节的药剂、维生素、矿物质补充物、营养补充物，和其组合。附加药剂还可以是抗生素例如庆大霉素、环丙沙星、万古霉素和/或其他抗生素。附加活性剂可以在施用本发明的5-脂氧合酶抑制剂之前、同时或之后给受试者施用。抗炎药物，包括但不限于非甾体抗炎药物和皮质类固醇，P38激酶抑制剂，和抗病毒药物，包括但不限于利巴韦林、阿糖腺苷、阿昔洛韦和更昔洛韦，也可以与本发明的组合物组合。抗生素化合物，包括但不限于庆大霉素、替考拉宁、托普霉素和万古霉素，也可与本发明的组合物组合。

III.药物制剂和给药方式

此处描述的方法利用包含上述分子和一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体和任选的其他治疗性或预防性成分的药物组合物。所述赋形剂包括例如水、盐水、甘油、聚乙二醇、透明质酸、乙醇、环糊精、改性环糊精(即，磺丁醚环糊精)等液体。用于非液体制剂的合适的赋形剂对于本领域技术人员来说也是已知的。药学上可接受的盐可用于本发明的组合物中，包括，例如，无机酸盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐例如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。关于药学上可接受的赋形剂和盐的详细讨论可见Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Edition(Easton，Pennsylvania：Mack Publishing Company，1990)。

另外，所述载体中也可以存在辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、生物缓冲物质、表面活性剂等。生物缓冲液实质上可以为任何药理学上可接受的，并且给制剂提供期望的pH，即，生理学上可接受范围内的pH的溶液。缓冲溶液的例子包括盐水、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、Hank’s缓冲液等等。

取决于预期的给药方式，药物组合物可以是固体、半固体或液体剂型，例如，片剂、栓剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、液体、悬浮液、乳膏、软膏剂、洗剂等，优选为适合单次施用精确剂量的单元剂型。组合物将包含与药学上可接受的载体组合的有效量的所选药物，并且另外可包含其他药剂、佐剂、稀释液、缓冲液等。

本发明包括一种药物组合物，其包含本发明的化合物，包括异构体，异构体的外消旋或非外消旋混合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，还包含一种或多种药学上可接受的载体，和任选的其他治疗性和/或预防性成分。

通常，本发明的化合物将作为药物制剂施用，包括那些适于口服(包括口腔和舌下)、直肠、鼻、局部、肺部、阴道或肠胃外(包括肌肉内、动脉内、鞘内、皮下和静脉内)给药的药物制剂，其为适于通过吸入或吹入给药的形式，或适于在骨形成部位给药的形式。优选的给药方式是利用方便的每天剂量方案口服或静脉内给药，其可根据病患程度进行调整。

用于在骨形成部位给药的制剂包括吸附到如下材料上或包封在其中：聚交酯和/或聚半乳糖酐聚合物、棕榈酸、藻酸盐、石膏、硫酸钙、磷酸钙、硫酸钙和磷酸钙的混合物、羟磷灰石、胶原或其他细胞外基质材料、骨蜡(例如来自CP Medical，Inc.，Ethicon，Inc.，UnitesStates Surgical Corp.，或Ceremed)、Orthocon骨油灰(一种硬脂酸钙、醋酸微生素E和烯化氧共聚物的混合物)或其他可用于该目的的材料或化合物。给药可通过直接放置在骨形成部位或通过用或不用载体将本发明活性化合物沉积到假体或手术植入装置的表面上来实现。

给受试者施用药物有效量或治疗有效量的组合物。精确的有效量随受试者不同而改变，依赖于物种、年龄、受试者大小和健康、被治疗的疾病的情况和程度、治疗医师的建议、和为给药而选择的治疗或治疗组合。因此，对于给定的情况，有效量可以通过常规试验确定。对于本发明而言，治疗量通常为大约0.05mg/kg到大约40mg/kg体重，更优选大约0.5mg/kg到大约20mg/kg，至少给药一次。在更大的哺乳动物中，提示的每天剂量可以从大约1mg到4800mg，每天一次或更多次，更优选为大约10mg到1200mg。可以根据需要多次给受试者给药，以减轻和/或缓解所述疾病的体征、症状或病因，或产生任何其他期望的生物系统的改变。治疗所述疾病的领域的普通技术人员不需要过多的试验，依靠个人知识和本申请的公开内容就能够确定本发明的化合物对于一种给定疾病的治疗有效量。当实施本发明的方法时，开始的人用剂量可能需要根据大鼠剂量数据来估测。所述估测方法是本领域公知的。见FDA出版物“Guidance for Industry：Estimating theMaximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics inAdult Healthy Volunteers”2005年7月出版(Federal Register Document5-14456)可于www.fda.gov/Cder/guidance/5541fnl.pdf在线获得。为了获得等效的人用剂量，通常将以mg/kg表示的大鼠剂量除以6.2。

当期望时，制剂可用适合于活性成分持续或控制释放给药的肠溶衣进行制备。

药剂制剂优选为单元剂型。在所述剂型中，制剂再分为包含适量的活性成分的单元剂量。单元剂型可以是包装的制剂，含有离散量的制剂的包装体，例如在小瓶或安瓿中包装的片剂、胶囊和粉末。而且，单元剂型也可以是胶囊、片剂、扁囊剂、或锭剂，或可以是任何包装形式的适量的上述物质。

IV.实验

下面是实施本发明的特定实施方式的例子。提供这些例子仅仅为了说明目的，不意图以任何方式限制本发明的范围。

已经努力确保使用的数字的精确性(例如，量、温度等等)，但是一些试验误差和偏差应该当然是允许的。

实施例1

5-LO敲除小鼠

缺乏5-脂氧合酶(Alox5-/-或5-LO-/-)的敲除小鼠购自JacksonLaboratory，Bar Harbor，Maine。即将发生的股骨骨折用倒插入股管中的骨髓内的线稳定化。用三点弯曲装置产生骨折。股骨骨折的愈合通过组织形态测定术、放射照相术和扭转机械测试进行测量或评价。证实了5-LO-/-小鼠与相同遗传背景和年龄的野生型小鼠(C57BL/6)相比，其骨折愈合具有统计学显著的、定量的加速和增强。在10-12周龄的雌性小鼠中产生了闭合性中骨干骨折。在骨折4周和12周后，骨折愈合通过X-射线评价(图3)，并且通过扭转机械测试进行评价(图4和表2)。愈合4或12周后，切下5LO-/-和野生型(WT)小鼠的骨折的股骨，并利用MTS伺服液压控制测试机器和界面20Nm转矩负载单元机械测试扭转断裂。在测试之前和之后测量骨折的股骨尺寸。由骨痂尺寸和转矩相对于角位移的曲线计算出转矩峰值、刚度、最大剪应力和剪切模量。5-LO-/-的所有机械参数在愈合4周后比野生型小鼠高50-120％。对来自正常和5-LO-/-小鼠的分时间段的骨折样本进行组织形态测定分析，显示5-LO-/-小鼠中的软骨面积很早达到峰值，并且到达较高的程度(图5和表3)。而且，在骨折后7和10天，显著更多的新骨(矿化组织)出现在5-LO-/-骨折骨痂中。数据证实5LO-KO小鼠中骨折愈合加速和增强。

表2.相对于骨折时间(Fx)，相同遗传背景和年龄的5-LO-/-和野生型小鼠的骨折股骨扭转机械测试数据概要

表3.相对于骨折时间，相同遗传背景和年龄的5-LO-/-和野生型小鼠的骨折骨痂组织形态测定分析概要

21天

0±0

0±0

1.000

77.26±6.26

75.72±2.55

0.624

系列X-射线(图3)显示5LO-/-小鼠中的骨折愈合比野生型小鼠(C57BL/6)加速。更具体来说，5LO-/-小鼠的10天的骨折显示处于与野生型小鼠14天骨折类似的阶段，14天5LO-/-骨折类似于21天野生型骨折，1个月的5LO-/-骨折类似于3个月的野生型骨折。机械测试数据定量地显示出愈合4周后5-LO-/-骨折骨痂的结构和材料特性在统计学上显著好于对照，转矩峰值提高50％，刚度提高75％，最大剪应力提高75％，剪切模量提高超过100％。而且，5LO-/-小鼠的4周机械测试参数类似于12周的野生型小鼠，这支持了图3的X-射线数据，并且证实了5LO-/-小鼠中的骨折愈合加速并增强。愈合12周之后，野生型骨折骨痂的刚度和剪切模量追上5-LO-/-骨折骨痂。对5-LO-/-和野生型小鼠的分时间段骨折骨痂样本的组织形态测定支持了机械和放射照相方法的结果(图5和表2)。骨痂软骨面积在5-LO-/-小鼠中在骨折7天之后达到峰值，但在野生型小鼠中直到第10天才达到峰值。在第7天在5LO-/-骨痂中几乎比野生型小鼠存在多4倍的软骨。同时，与野生型小鼠相比，第7天在5-LO-/-小鼠中也出现多几乎两倍的新骨(矿化组织)形成，第10天具有多30％的新骨。这些数据与5-LO-/-小鼠比正常小鼠骨折愈合发生的更快并且产生具有增强的结构和材料特性的机械性更强的骨折骨痂是一致的。

实施例2

COX-2敲除小鼠

在COX-2基因靶向缺失的小鼠中测试了骨折愈合。在COX-2敲除的、COX-1敲除的和野生型小鼠(未显示)的右后肢产生了闭合性中骨干股骨骨折。骨折愈合通过X-射线和组织学(图6)并通过机械测试(未显示)进行评价。数据显示骨折愈合在COX-2敲除小鼠中显著削弱，但在COX-1敲除的或野生型小鼠中不是这样。愈合14天后的X-射线显示了在COX-1敲除小鼠中具有大的矿化骨折骨痂(图6)，而在COX-2敲除小鼠中有很少或没有明显的矿化的骨痂。组织学检查证实了X-射线的发现，COX-2敲除骨痂具有显著量的软骨，但没有明显的新骨。扭转机械测试数据显示骨折骨痂结构和材料特性比COX-1敲除的或野生型小鼠在统计学上显著更差。与实施例1、实施例3和实施例4的试验结果结合起来，证明了如何根据本发明的方法调节花生四烯酸代谢或信号传导，以影响骨形成。

实施例3

用一种5-脂氧合酶抑制剂对大鼠的治疗

对Sprague-Dawley大鼠(3月龄)进行了如本领域所描述的标准闭合性股骨骨折操作(Simon等人Journal of Bone and MineralResearch，17(6)：963-976(2002)；Bonnarens和Einhorn，Production of astandard closed fracture in laboratory animal bone.Journal ofOrthopaedic Research，2：97-101(1984))。将发生的骨折用骨髓内不锈钢钉稳定。骨折后的开始4小时，大鼠用在1％的甲基纤维素中的30mg/kg的NDGA(去甲二氢愈创木酸)处理(5-脂氧合酶抑制剂处理组)或仅仅用载体(1％甲基纤维素)处理。手术后一天以及直到骨折后第14天，实验大鼠持续用2剂NDGA(30mg/kg)处理，第一剂在8-10AM，然后8-10小时后再施用另一剂NDGA。对照大鼠类似地处理但仅仅用载体(1％甲基纤维素)处理。骨折三周后，杀死大鼠，收获骨折的股骨，利用Packard Faxitron和Kodak MinR2000乳房X射线照相胶片对骨折的股骨进行高分辨率放射照相。每个处理组(对照组和5-脂氧合酶(5-LO)抑制剂处理组)的两张代表性的X光相片显示于图7中。

X光照片显示3周之后5-LO抑制剂处理大鼠的骨折的股骨与新骨连接起来。相反，在对照大鼠中形成了成形良好的、矿化的骨折骨痂，但是骨折部位仍然没有与新骨连接。在大鼠C中，骨折与新骨在骨折骨痂的中间(顶端)和侧面(底端)连接。在大鼠D中，骨折与新骨在侧面(底端)连接并且显示出在中间与新骨连接的迹象。在对照大鼠(大鼠A和B)中没有明显的新骨连接。因此该数据证实了5-LO抑制剂治疗可加速年轻的正常大鼠的骨折愈合过程。

实施例4

用5-脂氧合酶抑制剂对大鼠的治疗

对Sprague-Dawley大鼠(3月龄)进行了如本领域所描述的标准闭合性股骨骨折操作(Simon等人Journal of Bone and MineralResearch，17(6)：963-976(2002)；Bonnarens和Einhorn，Production of astandard closed fracture in laboratory animal bone.Journal ofOrthopaedic Research，2：97-101(1984))。将发生的骨折用骨髓内不锈钢钉稳定。骨折后的开始4小时，大鼠用载体(1％甲基纤维素)或悬浮在1％甲基纤维素中的5-LO抑制剂处理。抑制剂A(NDGA)以30mg/kg施用，抑制剂B(AA-861)以5mg/kg施用。手术之后一天以及直到骨折后第21天，实验大鼠持续用2剂抑制剂(A或B)处理，第一剂在8-10AM之间，然后在8-10小时后再施用另一剂。对照大鼠类似地处理，但仅仅用载体(1％甲基纤维素)处理。骨折三周后将大鼠麻醉，利用Packard Faxitron和Kodak MinR2000乳房X射线照相胶片对骨折的股骨进行高分辨率X光照相(图8A，8B，8C)。骨折后五周杀死大鼠，切下股骨，通过扭转机械测试检验结构机械性能(图8D)。

放射线照片显示愈合3周后，5-LO抑制剂处理的大鼠中骨折出现连接，但在载体处理的大鼠中没有出现。

应用扭转机械测试测量愈合5周后每个股骨保持的转矩峰值。数据显示抑制剂A(NDGA)处理大鼠和抑制剂B处理大鼠的股骨具有比载体处理大鼠高22％和53％的转矩峰值(图8D)。另外，所有来自抑制剂A或B处理的大鼠的股骨作为骨整体测试断裂，而在载体处理的大鼠的股骨中13％(15中的2个)作为非整体测试断裂，没有明显的骨连接。

这些实验观察证实了5-LO抑制治疗可加速(使骨连接更快)并且增强(更好的机械性能)骨折愈合。

实施例5

利用小分子化合物、RNAi和反义化合物的离体处理方法

利用促进离体骨生成的方法，例如，帮助顽固性骨折的愈合，由外伤或骨节段的病理性切除引起的节段性缺陷的愈合，或者用于关节固定术。在这些例子中，前体骨细胞从受试者中分离或从适当的供体中分离，利用标准方法离体培养。细胞生长在或接种到适合的支架上，所述支架代表缺失骨的节段或可塑造为配合缺失的节段或与骨的末端并置。导入细胞，利用适当的细胞培养条件或诱导因子，例如骨形态发生蛋白-2(BMP-2)，离体形成骨。一旦细胞开始精制新的骨基质，即可将构建体植入病人中以实现骨生成和促进愈合。这一系列事件一般被称为增强骨生成的组织工程方法。

5-脂氧合酶(5-LO)的抑制可用于促进离体骨形成进行组织工程应用。这通过单独利用5-LO或FLAP的小分子抑制剂或与公知的诱导剂例如BMP-2组合应用促进离体骨生成来实现。

第二种方法利用RNAi技术抑制5-LO活性并且促进离体骨生成。其实现方法是通过利用商业上可获得的转染试剂如TransIT-TKO或jetSI用siRNA序列库转染培养的前体骨骼细胞。用5-LO或FLAP特异的3种siRNA的混合物(每种siRNA 50-200pmol)转染大约1百万个细胞。或者，使用靶向于5-LO和FLAP的siRNA库。作为对照，用开发用来抑制(knock-down)增强的绿色荧光蛋白(EGFP)的商业上可获得的siRNAs类似地转染细胞。通过western印迹分析证实5-LO或FLAP的抑制，并对结果进行定量，确定5-LO和/或FLAP的表达降低超过80％。

培养处理的前体骨骼细胞，并且利用例如适当的阿辛蓝或茜素红结合的检测或特定基质蛋白的检测，评价作为软骨或骨基质的细胞外基质产生的骨生成。根据通过茜素红结合检测的增强的钙化基质沉积，5-LO或FLAP的抑制促进了骨生成。这表明抑制5-LO活性的RNAi或反义方法可用于为组织工程目的促进离体骨生成。

用于5-LO的siRNA对的库可选自例如，库-A(5’-AAC TGG GCGAGA TCC AGC TGG-3’(SEQ ID NO：9)，5’-AAG CTC CCG GTG ACCACG GAG-3’(SEQ ID NO：10)，5’-AAG GAA GCC ATG GCC CGATTC-3’)(SEQ ID NO：11)，库-B(5’-AAT CGA GAA GCG CAA GTACTG-3’(SEQ ID NO：12)，5’-AAG GAG TGG ACT TTG TTC TGA-3’(SEQ ID NO：13)，5’-AAC TTC GGC CAG TAC GAC TGG-3’)(SEQ IDNO：14)，或库-C(5’-AAG TTG GCC CGA GAT GAC CAA-3’(SEQ IDNO：15)，5’-AAC ACA TCT GGT GTC TGA GGT-3’(SEQ ID NO：16)，5’-AAC CAT GCG AGC CCC GCC ACC-3’)(SEQ ID NO：17)。用于FLAP的siRNA对的库可选自例如，库-D(5’-AAG CAA ACA TGGATC AAG AAA-3’(SEQ ID NO：18)，5’-AAG TTC CTG CTG CGT TTGCTG-3’(SEQ ID NO：19)，5’-AAT TCA GCT CTT GAG AGC ATT-3’)(SEQ ID NO：20)，库-E(5’-AAT GGA TTC TTT GCC CAT AAA-3’(SEQ ID NO：21)，5’-AAG TAC TTT GTC GGT TAC CTA-3’(SEQ IDNO：22)，5’-AAT CTA TTG GCC ATC TGG GCT-3’)(SEQ ID NO：23)，或库-F(5’-AAC CAG AAC TGT GTA GAT GCG-3’(SEQ ID NO：24)，5’-AAG TGA CTT TGA AAA CTA CAT-3’(SEQ ID NO：25)，5’-AATGAT GTC ATG TCA GCT CCG-3’)(SEQ ID NO：26)。为了简短，仅仅显示每个siRNA对的有义链。本领域公知siRNA对是双链小RNA，其在有义链具有5’-AA突出端，在反义链具有5’-UU突出端。本领域也公知主链的化学修饰对于稳定或提高siRNA分子的吸收是有利的。Pirollo KF等人，(2003)，Rait A，Sleer LS，Chang EH，“Antisensetherapeutics：from theory to clinical practice，”Pharmacol Ther.99(1)：55-77。具有有利的主链化学修饰的寡核苷酸的制备属于普通技术人员的技术水平范围，所述主链修饰的化合物(以及非主链修饰的化合物)的应用在本发明的范围内。

本领域技术人员将认识到除了直接将siRNA转染到细胞内以外，还可发展表达这些或类似序列的表达载体，和通过转染传递到细胞的表达载体，病毒介导的递送，或递送DNA分子到细胞中的方法。表达载体表达siRNA，导致5-LO、FLAP或两者被持续抑制，并因此促进骨生成。

本领域技术人员也将认识到可以利用抑制5-LO或FLAP表达的其他策略在前体骨骼细胞中促进相同的骨生成效果。所述技术包括利用反义物。

示例性的5-脂氧合酶反义序列包括，例如，5’-GCA GGT GCT TCTCGC TGC AGC C-3’(SEQ ID NO：27)，5’-GCC AGT ACT TGC GCTTCT CG-3’(SEQ ID NO：28)，5’-CCA TCG ATA TTG TTT TTG CC-3’(SEQ ID NO：29)，5’-GGA GCT TCT CGG GCA GCT CTG TGC-3’(SEQ ID NO：30)，5’-CCA GGT TCT TAT ACA GCA AGC-3’(SEQ IDNO：31)，5’-CCA GCA GCT TGA AAA TGG GGT GC-3’(SEQ ID NO：32)，5’-GCC CCG GGC CTT GAT GGC C-3’(SEQ ID NO：33)，5’-CCACGC CCT TGG CAG TCG G-3’(SEQ ID NO：34)，和5’-GCG GAATCG GGC CAT GGC TTC C-3’(SEQ ID NO：35).

示例性的FLAP反义序列包括，例如，5’-GTT CCG GTC CTCTGG AAG CTC C-3’(SEQ ID NO：36)，5’-CGC AGA CCA GAG CACAGC G-3’(SEQ ID NO：37)，5’-GCA AAC GCA GCA GGA AC-3’(SEQ ID NO：38)，5’-CGT TTC CCA AAT ATG TAG CC-3’(SEQ IDNO：39)，5’-GTT TTC AAA GTC ACT TCC G-3’(SEQ ID NO：40)，5’-GGT TAA CTC AAG CTG TGA AGC-3’(SEQ ID NO：41)，5’-GGAGCT GAC ATG ACA TC-3’(SEQ ID NO：42)，和5’-GGC CAC GGTCAT GTT CAA GG-3’(SEQ ID NO：43).

因此，公开了促进骨生成以加速或增强骨折愈合、治疗骨质缺损和增强骨形成的新方法。虽然已经详细描述了本发明的优选的实施方式，但是应当理解可以在不偏离所附权利要求限定的本发明的精神和范围的条件下进行显而易见的变化。

Claims (23)

1.一种促进骨生成以治疗有此需要的哺乳动物受试者的方法，包括：给所述受试者施用药物有效量的降低5-脂氧合酶活性的化合物，其中所述脂氧合酶活性的降低促进骨生成以治疗选自骨折、骨质缺损和通过诱导骨形成而治疗之疾病的疾病。

2.权利要求1的方法，其中所述疾病是骨折。

3.权利要求2的方法，其中所述骨折是非骨质疏松性骨折、骨质疏松性骨折、与先天性疾病相关的骨折、与获得性疾病相关的骨折、或截骨术骨折。

4.权利要求3的方法，其中所述骨折是非骨质疏松性骨折。

5.权利要求3的方法，其中所述骨折是骨质疏松性骨折。

6.权利要求3的方法，其中所述骨折是截骨术骨折。

7.权利要求1的方法，其中所述疾病是通过诱导骨形成而治疗的疾病。

8.权利要求7的方法，其中所述疾病是通过脊柱融合术或关节固定术治疗的疾病。

9.权利要求1的方法，其中所述疾病是骨质缺损。

10.权利要求1的方法，其中所述施用是体内施用。

11.权利要求1的方法，其中所述施用是离体施用。

12.权利要求1的方法，其中所述化合物通过抑制5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)而降低5-脂氧合酶活性。

13.权利要求1的方法，其中所述化合物包括一种小分子。

14.权利要求13的方法，其中所述小分子选自3-[1-(4-氯苄基)-3-叔-丁基-硫基-5-异丙基吲哚-2-基]-2，2-二甲基丙酸(MK886)；3-(1-(4-氯苄基)-3-(1-丁基-硫基)-5-(喹啉-2-基-甲氧基)-吲哚-2-基)-2，2-二甲基丙酸)(MK-591)；去甲二氢愈创木酸(NDGA)；2-(12-羟基十二碳-5，10-二炔基)-3，5，6-三甲基-1，4-苯醌(AA861)；(N-(1-苯并(b)噻吩-2-基乙基)-N-羟基脲)(齐留通)；马索罗酚；替尼达普；flobufen；氯萘帕林；他戈利嗪；AA-861；Abbott A-121798；Abbott A-76745；AbbottA-78773；[(R)(+)N′-[[5-(4-氟苯氧基)呋喃-2-基]-1-甲基-2-丙炔基]-N-羟基脲(Abbott A-79175)；Abbott ABT 761；Dainippon AL-3264；BayerBay-x-1005；Biofor BF-389；布那司特；Cytomed CMI-392；TakedaCV-6504；磷酸依那扎群；Leo Denmark ETH-615；盐酸氟卓斯汀；Merck Frosst L-663536；Merckle ML-3000；3M Pharmaceuticals R-840；利洛吡司；Schering Plough SCH-40120；替泊沙林；林那司特(TMK-688)；Zeneca ZD-2138；Bristol-Myers Squibb BU-4601A；咔唑霉素C；lagunamycin；Wellcome BW-70C；Ciba-Geigy CGS-26529；Warner-Lambert CI 1004；Warner-Lambert PD-136005；Warner-LambertPD-145246；Elsai E-3040；Fujirebio F-1322；Fujisawa FR-110302；Merck Frosst L-699333；Merck Frosst L-739010；Lilly LY-269415；LillyLY-178002；Hoechst Roussel P-8892；SmithKline Beecham SB-202235；American Home Products WAY-121520；American Home ProductsWAY-125007；Zeneca ZD-7717；Zeneca ZM-216800；ZenecaZM-230487；1，2-二氢-n-(2-噻唑基)-1-氧代吡咯并(3，2，1-kl)吩噻嗪-1-甲酰胺；Abbott A-65260；Abbott A-69412；Abbott-63162；AmericanHome Products AHR-5333；Bayer Bay-q-1531；Boehringer IngelheimBI-L-357；Boehringer Ingelheim BI-L-93BS；Boehringer IngelheimBIL 226XX；Bristol-Myers Squibb BMY-30094；咔唑霉素B；Wellcome BW-B218C；Chauvin CBS-1114；Ciba-Geigy CGS-21595；Ciba-Geigy CGS-22745；Ciba-Geigy CGS-23885；Ciba-Geigy CGS24891；Ciba-Geigy CGS-8515；Chiesi CHF-1909；Warner-LambertCI-986；Warner-Lambert CI 987；去甲中国蓟醇；多西苯醌；EisaiE-5110；Eisai E-6080；乙诺司特；epocarbazolin-A；依普伐芬；依凡达明；Fisons FPL 62064；Zeneca ICI-211965；ZenecaICI-216800；Kyowa Hakko KF-8940；Merck & Co L-651392；Merck& Co L-651896；Merck & Co L-652343；Merck & Co L-656224；Merck & Co L-670630；Merck & Co L-674636；Lilly LY-233569；Merck & Co MK-591；Merck & Co L-655240；nitrosoxacin-A；OnoONO-5349；Ono ONO-LP-219；Ono ONO-LP-269；Warner-LambertPD-127443；Purdue Frederick PF-5901；Rhone-Poulenc RorerRev-5367；Rhone-Poulenc Rorer RG-5901-A；Rhone-Poulenc RorerRG-6866；Roussel-Uclaf RU-46057；Searle SC-41661A；SearleSC-45662；Sandoz SDZ-210-610；SmithKline BeechamSK&F-104351；SmithKline Beecham SK&F-104493；SmithKlineBeecham SK&F-105809；Synthelabo SL-81-0433；Teijin TEI-8005；Terumo TMK-777；Terumo TMK-781；Terumo TMK-789；TerumoTMK-919；Terumo TMK-992；Teikoku Hormone TZI-41127；American Home Products WAY-120739；American Home ProductsWY-47288；American Home Products WY-48252；American HomeProducts WY-50295；Yoshitomi Y-19432；4-{3-[4-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)苯硫基]}苯基-3，4，5，6-四氢-2H-吡喃-4-甲酰胺；七叶亭；菲尼酮；BI-L-239；5，8，11-二十碳三炔酸(ETI)；5，8，11，14-二十碳四炔酸(ETYA)；肉桂基-3，4-二羟基-α-氰基肉桂酸酯；姜黄素；esculeitin；棉子酚；咖啡酸；黄芩黄素；7，7-二甲基二十碳二烯酸(DEDA)；Ly311727；溴烯醇内酯；甲基花生四烯酰基氟代磷酸酯；甲基-亚麻基氟代磷酸酯；油基氧乙基磷酸胆碱；AACOCF3；n-(对戊基肉桂酰基)邻氨基苯甲酸；麦帕克林；奎纳克林；阿的平；对溴苯甲酰甲基溴；马兜铃酸；皮质类固醇；Glaxo SmithKline 480848；GlaxoSmithKline 659032；Glaxo SmithKline 677116；BMS-181162；MJ33；和Millennium Pharmaceuticals MLN977。

15.权利要求14的方法，其中所述小分子选自马索罗酚；替尼达普；(N-(1-苯并(b)噻吩-2-基乙基)-N-羟基脲)(齐留通)；flobufen；氯萘帕林；他戈利嗪；Abbott A-121798；Abbott A-76745；AbbottA-78773；[(R)(+)N′-[[5-(4-氟苯氧基)呋喃-2-基]-1-甲基-2-丙炔基]-N-羟基脲(Abbott A-79175)；Abbott ABT 761；Dainippon AL-3264；BayerBay-x-1005；Biofor BF-389；布那司特；Cytomed CMI-392；TakedaCV-6504；Ciba-Geigy CGS-26529；磷酸依那扎群；Leo DenmarkETH-615；盐酸氟卓斯汀；Merck Frosst L 663536；Merck FrosstL-699333；Merckle ML-3000；3M Pharmaceuticals R-840；利洛吡司；Schering Plough SCH-40120；替泊沙林；林那司特(TMK-688)；ZenecaZD-7717；Zeneca ZM-216800；Zeneca ZM-230487；Zeneca ZD-2138；和NDGA(去甲二氢愈创木酸)。

16.权利要求15的方法，其中所述小分子选自替尼达普；齐留通；flobufen；氯萘帕林；他戈利嗪；AA-861；Abbott A-121798；AbbottA-76745；Abbott A-78773；[(R)(+)N′-[[5-(4-氟苯氧基)呋喃-2-基]-1-甲基-2-丙炔基]-N-羟基脲(Abbott A-79175)；Abbott ABT 761；Ciba-Geigy CGS-26529；Biofor BF-389；Cytomed CMI-392；LeoDenmark ETH-615；Merck Frosst L 699333；Merckle ML-3000；3MPharmaceuticals R-840；林那司特(TMK-688)；Zeneca ZD-7717；ZenecaZM-216800；Zeneca ZM-230487；Zeneca ZD-2138；和NDGA(去甲二氢愈创木酸)。

17.权利要求11的方法，其中所述化合物包括一种核酸，该核酸包含选自下组的序列：5’-AAC TGG GCG AGA TCC AGC TGG-3’，5’-AAG CTC CCG GTG ACC ACG GAG-3’，5’-AAG GAA GCC ATGGCC CGA TTC-3’，5’-AAT CGA GAA GCG CAA GTA CTG-3’，5’-AAG GAG TGG ACT TTG TTC TGA-3’，5’-AAC TTC GGC CAGTAC GAC TGG-3’，5’-AAG TTG GCC CGA GAT GAC CAA-3’，5’-AAC ACA TCT GGT GTC TGA GGT-3’，5’-AAC CAT GCG AGCCCC GCC ACC-3’，5’-AAG CAA ACA TGG ATC AAG AAA-3’，5’-AAG TTC CTG CTG CGT TTG CTG-3’，5’-AAT TCA GCT CTTGAG AGC ATT-3’，5’-AAT GGA TTC TTT GCC CAT AAA-3’，5’-AAGTAC TTT GTC GGT TAC CTA-3’，5’-AAT CTA TTG GCC ATC TGGGCT-3’，5’-AAC CAG AAC TGT GTA GAT GCG-3’5’-AAG TGA CTTTGA AAA CTA CAT-3’，和5’-AAT GAT GTC ATG TCA GCT CCG-3’。

18.权利要求11的方法，其中所述化合物包括一种核酸，该核酸包含选自下组的序列：5’-GCA GGT GCT TCT CGC TGC AGC C-3’，5’-GCC AGT ACT TGC GCT TCT CG-3’，5’-CCA TCG ATA TTG TTTTTG CC-3’，5’-GGA GCT TCT CGG GCA GCT CTG TGC-3’，5’-CCAGGT TCT TAT ACA GCA AGC-3’，5’-CCA GCA GCT TGA AAA TGGGGT GC-3’，5’-GCC CCG GGC CTT GAT GGC C-3’，5’-CCA CGCCCT TGG CAG TCG G-3’，5’-GCG GAA TCG GGC CAT GGC TTCC-3’，5’-GTT CCG GTC CTC TGG AAG CTC C-3’，5’-CGC AGA CCAGAG CAC AGC G-3’，5’-GCA AAC GCA GCA GGA AC-3’，5’-CGTTTC CCA AAT ATG TAG CC-3’，5’-GTT TTC AAA GTC ACT TCCG-3’，5’-GGT TAA CTC AAG CTG TGA AGC-3’，5’-GGA GCT GACATG ACA TC-3’，和5’-GGC CAC GGT CAT GTT CAA GG-3’。

19.权利要求1的方法，进一步包括给所述受试者施用药物有效量的降低COX-1活性的化合物。

20.权利要求19的方法，其中所述化合物选自SC-560、FR122047、戊酰水杨酸、阿斯匹林、右酮洛芬、Keterolac、氟比洛芬和舒洛芬。

21.权利要求1的方法，进一步包括给所述受试者施用药物有效量的提高COX-2活性的化合物。

22.权利要求21的方法，其中所述化合物选自前列腺素E2、布他前列素、硫前列酮、CP-536，745-01、CP-043，305-02、CP-044，519-02、CP432、ONO-4819、CP-533，536、前列腺素F_2α、比马前列素、氯前列醇、拉坦前列素、tafluprost、骨形态发生蛋白-2(BMP2)、血小板衍生生长因子(PDGF)、白介素-1α、白介素-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、甲状旁腺激素(PTH)、甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)和特立帕肽。

23.权利要求1的方法，包括以足以提高所述受试者中COX-2活性的量给所述受试者施用超声治疗或将所述受试者暴露于脉冲电磁场中。

Images