CN100410388C

CN100410388C - 一种鉴定增加骨矿物质密度的化合物的方法

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Publication number: CN100410388C
Application number: CNB2006101000659A
Authority: CN
Inventors: J·D·阿拉德; R·F·克莱因; G·A·佩尔茨
Original assignee: GOVERNMENT OF UNITED STATES; F Hoffmann La Roche AG; Oregon Health Science University
Current assignee: GOVERNMENT OF UNITED STATES; F Hoffmann La Roche AG; Oregon Health Science University
Priority date: 2002-02-08
Filing date: 2003-02-03
Publication date: 2008-08-13
Anticipated expiration: 2023-02-03
Also published as: EP1634618B1; EP1666883A1; US20060079488A1; MXPA04007611A; AU2003206822A1; JP2005531498A; CN1896270A; CN1936023A; KR100653017B1; BR0307522A; WO2003066048A2; CA2474431A1; RU2004127131A; EP1634618A1; RU2358728C2; KR100589819B1; US20030175680A1; WO2003066048A3; ES2299923T3; KR20040111353A

Abstract

公开了治疗和预防骨损失和/或增加骨形成的方法。该方法利用15-脂肪氧化酶抑制剂。这些分子可以单独或与抑制骨再吸收的试剂或调节从骨再吸收钙或增加骨累积的另外的试剂结合传递。本发明另外提供了诊断骨损失的易感性的方法。

Description

一种鉴定增加骨矿物质密度的化合物的方法

本发明通常涉及15-脂肪氧化酶抑制剂以及它们在治疗和预防骨损失中的应用。特别地，本发明涉及15-脂肪氧化酶抑制剂减少骨损失和/或增加净骨形成的应用。

脂肪氧化酶是在植物和动物中发现的含非血红素铁的酶，催化某些多不饱和脂肪酸如脂类和脂蛋白的氧合。已知几种不同的脂肪氧化酶，每种具有特征性的氧化作用。哺乳动物脂肪氧化酶由在被氧合的花生四烯酸中的位置来命名。酶5-脂肪氧化酶将花生四烯酸转变为5-氢过氧化二十四烯酸(5-HPETE)。这是产生5-羟二十四烯酸(5-HETE)和白三烯(LTs)的代谢途径中的第一步。类似地，12-和15-脂肪氧化酶分别将花生四烯酸转变为12-和15-HPETE。12-HPETE的生物化学还原产生12-HETE，而15-HETE是称为脂毒素的化合物类的前体。

生物作用的不同排列与脂肪氧化酶活性的产物相关，并且很多作为介质涉及各种疾病状态。C4和D4 LT是人支气管平滑肌的有效收缩剂；在类风湿性关节炎患者的滑膜液中发现的LTB4和5-HETE是炎性细胞如多形核白细胞的有效趋化因子(Green和Lambeth，Tetrahedron，39，1687(1983))；在牛皮癣患者的表皮组织中已发现高水平的12-HETE；已经表明脂毒素刺激中性白细胞释放溶酶体酶和过氧化物离子。因此，脂肪氧化酶在哮喘、变态反应、关节炎、牛皮癣和炎症的介质的生物合成中起重要作用，这些酶的抑制剂阻断这些疾病状态所包含的生物化学途径。

人15-脂肪氧化酶(15-LO)催化由花生四烯酸形成15-S-羟二十四烯酸(15-S-HETE) (Kuhn和Borngraber，Lipoxygenases and Their Metabolites，Plenum Press，纽约，(1999))。在小鼠中，15-S-HETE的合成由12/15-脂肪氧化酶(Alox15)进行，它是人15-LO的小鼠同系物。小鼠12/15-LO将花生四烯酸以3∶1比例转变为12(S)-羟二十四烯和15-S-HETE，并可以另外将亚油酸转变为13-羟十八碳二烯酸(13-HODE)。

以前15-脂肪氧化酶已经包含在几种疾病的发病机理中，所述疾病包括动脉粥样硬化(Harats等Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.，2100-2105，(2000))，哮喘(Shannon等，Am.Rev.Respir.Dis.，147，1024-1028，(1993))，癌症(Shureiqi等，JNCI，92，1136-1142，(2000))，和肾小球性肾炎(Montero和Badr，Exp.Neph.，8，14-19(2000))。已经鉴定出很多种类的化合物抑制15-脂肪氧化酶，包括酚类、异羟肟酸类和炔属脂肪酸类(综述于Kuhn和Borngraber，Lipoxygenases and Their Metabolites，Plenum Press，纽约，(1999))。这些试剂的抑制活性范围有变化。例如，已表明去甲二氢愈创木酸是5-和15-脂肪氧化酶的抑制剂，已表明萘异羟肟酸抑制5-，12-和15-脂肪氧化酶(美国专利4,605,669)，和已经报道苯并芴15-脂肪氧化酶抑制剂PD146176对15-脂肪氧化酶相对特异(Sendobry等，Br.J. Pharm.，120，1199-1206，(1997))。15-脂肪氧化酶参与动脉粥样硬化的证据来自对靶缺失Alox15(Alox15-/-)的小鼠的研究。这些Alox15剔除小鼠最初显示出具有较小的表型差异，包括5-LO活性增加(Sun和Funk，J. Biol.Chem.，271，24055-24062，(1996))。然而，Alox15的破坏大大减少了apoE缺陷(apoE-/-)的动脉粥样硬化倾向小鼠的动脉粥样硬化损害(Cyrus等，J. Clin Invest.，103，1597-1604，(1999))。

尽管5-LO已经包含在几种疾病的发病机理中，但是小鼠或人15-脂肪氧化酶的生物学作用尚未明确确定，15-脂肪氧化酶抑制剂的人临床效用也没有确立。尤其，以前也没有发现15-脂肪氧化酶抑制剂治疗人骨质疏松症和/或骨关节炎的效用。

骨质疏松症是由成熟骨中骨矿物质密度降低引起的并导致微小创伤后的骨折。该疾病很普遍并且具有巨大的经济影响。最常见的骨折发生在脊椎、桡骨远端和髋部。估计三分之一的年龄65岁以上的女性人群会有部分由骨质疏松症引起的脊椎骨折。而且，每三位女性中大约有一位和每六位男性中有一位可能因为年龄过大发生髋部骨折。

已经鉴定了骨损失的两个不同阶段。一个是缓慢、年龄相关的过程，两性都发生并且在大约35岁开始。这个阶段在两性中具有相似比例并导致类似量的皮质和松质(海绵或网格样)骨损失。皮质骨主要在附肢骨骼，而松质骨集中在中轴骨骼，尤其是脊椎，以及长骨末端。已知年龄相关骨损失引起的骨质疏松症是II型骨质疏松症。

另一类型的骨损失是加速的，见于绝经后女性和由雌激素不足引起。这个阶段引起不成比例的松质骨损失。已知由于雌激素减少引起的骨质疏松症是I型骨质疏松症。I型骨质疏松症的主要临床表现是脊椎、髋部和前臂骨折。这些表现的骨骼部位包含大量脊柱骨。I型骨质疏松症的骨更新通常高。骨再吸收增加，但是补偿性骨形成不足。骨质疏松症也与使用皮质类固醇、固定术或长期卧床休息、酒精中毒、糖尿病、性腺毒性化疗、高泌乳素血症、神经性厌食症、原发和继发闭经、移植性免疫抑制和卵巢切除术有关。

认为骨质疏松症中骨损失的机制包括骨骼自身更新过程失衡。这个过程术语称为骨质重建。它发生在一系列分散的活动囊(pocket)中。这些囊自发出现在给定骨表面上的骨基质内作为骨再吸收的部位。破骨细胞(骨溶解或再吸收细胞)负责一部分大小通常恒定的骨再吸收。这个再吸收过程之后成骨细胞(骨形成细胞)出现，它们接着用新骨填充破骨细胞留下的腔隙。

在健康成年受试者中，破骨和成骨作用使得骨形成和骨再吸收处于平衡。然而，在骨质疏松症中，发生骨质重建失衡，导致骨以比其损失速度慢的速度被替换。尽管这种失衡在某种程度上随他们衰老而发生在多数个体中，但是在卵巢切除术后，绝经后骨质疏松症中，或在医源性情况中如由使用皮质类固醇或免疫抑制剂造成的那些情况中，它严重得多并且发生在较小年龄。

已提出各种方法来增加罹患骨质疏松症的人的骨质量，包括给予雄激素、氟化盐和甲状旁腺激素和改进形式的甲状旁腺激素。也提出双磷酸盐、降钙素、钙、1，25-二羟维生素D₃和/或雌激素，单独或组合，可以有效保持现存的骨质量。

本发明基于15-脂肪氧化酶抑制剂能够增加骨形成和/或增加骨增积和增加骨折愈合的发现。这些分子可单独或与抑制骨再吸收和/或增加骨形成的另外试剂，尤其是合成代谢试剂组合递送。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及减少受试者的骨损失的方法。该方法包括给受试者施予药物有效量的15-脂肪氧化酶抑制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及增加骨矿物质密度的方法，它包括给受试者施予有效量的药物可接受15-脂肪氧化酶抑制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及诊断受试者骨损失易感性的方法，该方法包括检测人染色体17上的多态性，尤其是检测15-脂肪氧化酶基因中的多态性。

仍在另一个实施方案中，本发明涉及筛选减少骨损失或增加骨矿物质密度的化合物的方法，其通过使人间充质干细胞接触15-脂肪氧化酶抑制剂并确定细胞分化为参与骨形成的细胞。

参考下列详细说明书和附图，本发明的这些和其它发明将变得明显。此外，这里列出了各种参考文献，它们更详细地描述了某些方法或组合物，因此其全部内容并入作为参考。

除非另外指出，本发明的实施将采用本领域技术内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。文献中充分解释了这种技术。见如T. E.Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company，1993)；A.L. Lehninger，Biochemistry(WorthPublishers，Inc.，current addition)；Sambrook，等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan主编，Academic Press，Inc.)；Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton，Pennsylvania：Mack Publishing Company，1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)A和B卷(1992)。

这里引用的所有出版物、专利和专利申请，无论上述还是下述，因此其全部内容并入作为参考。

在描述本发明时，将采用下列术语，并意欲如下所示定义。

“骨损失”是指骨形成与骨再吸收的比例失衡导致患者比期望的骨要少。骨损失可以由骨质疏松症、骨切开术、牙周炎或修复术松弛引起。骨损失也可以由继发性骨质疏松症引起，包括糖皮质激素诱发的骨质疏松症、甲状腺功能亢进诱发的骨质疏松症、固定术诱发的骨质疏松症、肝素诱发的骨质疏松症或免疫抑制诱发的骨质疏松症。可以例如使用下述骨矿物质密度测定术监测骨损失。

术语“有效量”或“药用有效量”是指无毒但足够提供期望生物学结果的试剂的量。那个结果可以减少和/或减轻迹象、症状或病因，或任何其它期望的生物学系统改变。例如，治疗应用“有效量”是提供骨折修复的临床愈合速度明显增加；骨质疏松症中骨损失逆转；软骨缺陷或紊乱逆转、预防或延迟骨质疏松症开始、刺激和/或增加骨折不愈合和内脱位骨质疏松症中的骨形成；增加和/或加速骨长入假体装置；和牙齿缺陷修复所需的包含这里的活性化合物的组合物的量。任何个体病例的适当“有效”量可以由本领域普通技术人员使用常规实验确定。

“增加骨增积”是指给予本发明15-脂肪氧化酶的受试者的骨累积增加超过没有给予15-脂肪氧化酶抑制剂的可比较的受试者的骨累积。这种增加骨增积这里典型地通过测定骨矿物质密度(BMD)来确定。例如，使用动物模型可以确定骨增积，如卵巢切除的小鼠、狗等等。检测的化合物给予该动物，测定I型或II型骨质疏松症通常减少的骨中的骨矿物质密度(BMD)，如附肢和/或中轴骨骼的骨，尤其是包括脊椎的脊柱，以及长骨远端，如股骨、桡骨中段和桡骨远端。确定BMD的几种方法是本领域已知的。例如，可以使用双能量X-射线吸光分析或定量计算的X线断层照相术等等进行BMD测定。(见实施例)。类似地，可以使用本领域熟知的方法确定骨形成增加。例如，可以在来自腰椎和远端股骨干骺端的四环素标记的松质骨上使用定量数字化形态测定法(见如Ling等，Endocrinology(1999)140：5780-5788)进行骨形成速度(BFR)的动力学测定。可供选择地，可以估计骨形成标志，如碱性磷酸酶活性和血清骨钙素水平来间接确定是否发生了骨形成增加(见Looker等，Osteoporosis International(2000)11(6)：467-480)。

“骨形成增加”是指给予本发明15-脂肪氧化酶抑制剂的受试者中骨形成的量增加超过没有给予15-脂肪氧化酶抑制剂的受试者中骨形成速度。这里使用如定量数字化形态测定法，以及通过如上所述的骨形成的其它标志确定这种骨形成增加。

“15-脂肪氧化酶抑制剂”是指以小于1μM，优选低于100nM的IC50抑制15-脂肪氧化酶的化合物。可以用常规方法确定IC50。一个特定方法是比色法，其中推测的抑制剂与15-脂肪氧化酶预温育大约10分钟，随后添加亚油酸底物另外10分钟。在pH 5的氯化血红素存在下，通过将氢过氧化脂类的还原和N-苯甲酰基-无色美蓝偶合来定量产物13-HPODE。

氧化亚甲蓝的吸光度与15-脂肪氧化酶形成的13-HPODE的量成正比，并可以在抑制剂存在和缺乏下测定。这是终点试验，在″ASpectrophotometric Microtiter-Based Assay for the Detection of HydroperoxyDerivatives of Linoleic Acid″，Analytical Biochemistry，201，375-380(1992)；Bruce J.Auerbach，John S.Kiely和Joseph A.Cornicelli中更详细描述。其它测定包括通过分光光度测定234nm下偶合二烯形成来确定起始酶反应速度的那些。

这里使用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”可以互换使用，意思是指骨损失症状发展延迟和/或预期将发展或发展这种症状的严重性降低。该术语进一步包括预防另外的症状，改善或预防症状之下的代谢原因，和/或促进骨生长。

“药物可接受”或“药理学可接受”是指不是生物性的或不期望有的，即该物质可以给予个体，不引起任何不期望的生物学作用或不以有害方式与任何其中所含的组合物成分相互作用。

“生理pH”或“生理范围中的pH”是指在大约7.2至8.0，包括7.2和8.0的范围中包含的pH，更典型地在大约7.2至7.6，包括7.2和7.6的范围中包含的pH。

这里使用的术语“受试者”包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物类的任何成员：人、非人灵长目如黑猩猩，和其它类人猿和猴类；农畜如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜如兔子、狗和猫；实验动物包括啮齿动物，如大鼠，小鼠和豚鼠等等。非哺乳动物的实例包括但不限于鸟、鱼等等。该术语不指示特定的年龄或性别。

这里使用的“多态性”是指在人群中出现两个或更多遗传学确定的可替换序列或等位基因。多态性标记或位点是发生趋异的位点。优选的标记具有至少两个等位基因，每个以大于1％，更优选大于10％或20％人群的频率发生。多态性可以包括一个或更多碱基改变、插入、重复或缺失。多态性位点可以小如一个碱基对。多态性标记包括限制性片段长度多态性、可变量的串联重复(VNTR′s)、高变区、微卫星、二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、简单序列重复和插入元件。

单核苷酸多态性(SNP)发生在单一核苷酸占据的一个多态性位点，它是等位基因序列之间变异的位点。该位点通常在等位基因高度保守序列(如在人群中低于1/100或1/1000成员有变化的序列)之前和之后。单核苷酸多态性通常由于在多态性位点一个核苷酸置换另一个产生。转换是一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶取代。易位是一个嘌呤被一个嘧啶取代或反之亦然。单核苷酸多态性也可以由相对于参照等位基因核苷酸缺失或核苷酸插入产生。

这里使用的术语“前体细胞”是指未完全分化或指定分化途径，和通常不表现如同成熟、完全分化细胞的标记或功能的细胞。

这里使用的术语“间质细胞”或“间充质干细胞”是指能够分裂很多次，和其后代将产生骨骼组织，包括软骨、骨、腱、韧带、骨髓基质和结缔组织的多潜能祖细胞(见A.Caplan J.Orthop.Res.(1991)9：641-50)。

这里使用的术语“成骨细胞”包括成骨细胞和成骨细胞前体细胞。

这里使用的“数量性状位点”(QTL)是指表型测定，如骨矿物质密度，它连续分布并可以用多基因确定。QTL是染色体上的一个位点，其等位基因影响数量性状。

本发明中使用的化合物是抑制或降低15-脂肪氧化酶活性的化合物。在本文中，抑制和降低酶活性是指相对于其中酶、细胞或受试者没有用检测化合物处理的对照实验，测定的活性水平较低。在特定实施方案中，测定活性的抑制或降低是至少降低或抑制10％。本领域技术人员将领会特定应用可以优选测定活性降低或抑制至少20％，50％，75％，90％或100％或10％和100％之间的任何整数。典型地，本发明中使用的15-脂肪氧化酶抑制剂将具有低于1μM的IC50，优选低于100nM。

本发明部分基于15-脂肪氧化酶是骨质量的重要调节剂的发现。尤其是，小鼠中100个微卫星标记的基因组扫描鉴定到染色体1，2，4和11上骨损失紊乱的易感性位点。基因表达的差异，尤其是染色体11上编码的基因，鉴定到编码15-脂肪氧化酶的基因表达的实质差异，因此将15-脂肪氧化酶的表达与较低的骨矿物质密度联系起来。

骨质量峰值是骨质疏松性骨折风险的主要决定因素。家族和双胞胎研究表明遗传因素调节骨矿物质密度(BMD)(综述于Stewart和Ralston，J.Endocr.，(2000)166：235-245)。这里发明人利用小鼠遗传模型来鉴定控制BMD的位点。一个两步方法用于鉴定调节骨矿物质密度的基因组区域。最初，计算方法和微卫星标记用于扫描动物单核苷酸多态性(SNP)数据库，预知有助于获得和维持骨骼质量的染色体区域(实施例1)。随后，动物模型用于鉴定和验证有助于获得和维持骨骼质量的基因中的突变(实施例2)和用于表明15-脂肪氧化酶基因的破坏引起BMD增加(实施例4)，由此鉴定15-脂肪氧化酶是参与调节骨质量的基因。

抑制15-脂肪氧化酶活性和预防骨再吸收或促进骨形成的化合物为努力治疗骨质疏松症提供了重要的益处。抑制15-脂肪氧化酶活性的化合物可以用在治疗骨质疏松症或骨关节炎的方法中，其是通过抑制破骨骨再吸收或通过刺激成骨细胞分化和刺激新骨形成。实施例3表明15-脂肪氧化酶抑制剂体外促进人间充质干细胞分化为成骨细胞的能力。实施例4表明15-脂肪氧化酶基因的完全破坏在体内导致BMD增加。实施例5表明在体内模型中15-脂肪氧化酶抑制剂促进骨形成的能力。

根据本发明，15-脂肪氧化酶抑制剂可以用于制备减少哺乳动物受试者骨损失的包含有效量的所述15-脂肪氧化酶抑制剂的药物。因此，本发明提供了减少哺乳动物受试者骨损失的方法，该方法包括给受试者施予有效量的15-脂肪氧化酶抑制剂。优选，骨损失与骨质疏松症、骨关节炎、Paget′s疾病或牙周病有关。更优选，骨损失与骨质疏松症有关。

对此更多，根据本发明，15-脂肪氧化酶抑制剂可以用于制备增加哺乳动物骨矿物质密度的包含有效量的所述15-脂肪氧化酶抑制剂的药物。因此，本发明也提供了增加哺乳动物骨矿物质密度的方法，通过给哺乳动物施予有效量的15-脂肪氧化酶抑制剂。

根据本发明，15-脂肪氧化酶抑制剂可以用于制备治疗哺乳动物骨质疏松症的包含有效量的所述15-脂肪氧化酶抑制剂的药物。因此，本发明提供了治疗哺乳动物骨质疏松症的方法，通过给哺乳动物施予有效量的15-脂肪氧化酶抑制剂。

此外，15-脂肪氧化酶抑制剂可以用于制备促进人间充质干细胞分化为成骨细胞的包含有效量的所述15-脂肪氧化酶抑制剂的药物，来增加所述人的成骨细胞。因此，本发明提供了促进人间充质干细胞分化为成骨细胞的方法，包括给该人施予有效量的15-脂肪氧化酶抑制剂来增加所述人的成骨细胞。优选，15-脂肪氧化酶抑制剂具有低于1μM的IC50。

用15-脂肪氧化酶抑制剂进行的治疗可以用于治愈骨折和骨切开，包括愈合性和不愈合性骨折。本发明方法可治疗的各种骨折包括创伤性和骨质疏松性骨折，如髋部、股骨颈、腕、脊椎、脊柱、肋骨、胸骨、喉和气管、桡骨/尺骨、胫骨、髌骨、锁骨、骨盆、肱骨、小腿、手指和脚趾、面部和踝骨折。这里公开的方法可以促进愈合速度以及促进否则保持不愈合骨折的骨折愈合。鉴定为处于骨折风险的患者的预防性治疗也可以降低那个患者的骨折风险。

因此，15-脂肪氧化酶抑制剂可以用于制备降低哺乳动物骨折发生率的包含有效量的所述15-脂肪氧化酶抑制剂的药物。因此，本发明提供了降低哺乳动物骨折发生率的方法，包括给哺乳动物施予有效量的15-脂肪氧化酶抑制剂。

此外，15-脂肪氧化酶抑制剂可以用于制备治愈哺乳动物骨折的包含有效量的所述15-脂肪氧化酶抑制剂的药物。因此，本发明也提供了治愈哺乳动物骨折的方法，包括给哺乳动物施予有效量的15-脂肪氧化酶抑制剂。

优选，以上描述的方法和用途的哺乳动物是人。更优选，以上描述的15-脂肪氧化酶抑制剂具有低于1μM的IC50。

已知几种15-脂肪氧化酶抑制剂，它们可以在主题方法中发现用途。该抑制剂包括合成的有机分子，植物提取物和其它天然产物，和抗15-脂肪氧化酶的抗体。Cornicelli JA，Trivedi BK.15-lipoxygenase and itsinhibition：a novel therapeutic target for vascular disease.[综述][113篇参考文献].Current Pharmaceutical Design 1999；5(1)：11-20(描述了各种咖啡酸衍生物、炔丙基醚、儿茶酚和苯并硫代吡喃吲哚(benzothiopyranoindoles))；Cornicelli JA.15-lipoxygenase inhibitors as antiatherosclerotic agents.IDrugs1998；1(2)：206-213；Fleischer R，Frohberg P，Buge A，Nuhn P，Wiese M.QSAR analysis of substituted 2-phenylhydrazonoacetamides acting asinhibitors of 15-lipoxygenase.Quant Struct-ActRelat 2000；19(2)：162-172；Kuhn H.Inhibitors of 12/15-lipoxygenase are potential anti-atheroscleroticdrugs.Curr Opin Anti-Inflammatory Immunomodulatory Invest Drugs 1999；1(3)：227-237；Mogul R，Johansen E，Holman TR.Oleyl sulfate revealsallosteric inhibition of soybean lipoxygenase-1 and human 15-lipoxygenase.Biochemistry 2000；39(16)：4801-4807；Sexton K，Roark WH，Sorenson R，Cornicelli J，Sekerke C，Welch K.Thiourea inhibitors of 15-lipoxygenase.Abstracts of Papers American Chemical Society 1999；218(1-2)：MEDI0；TaitBD，Dyer RD，Auerbach BJ，Bornemeier D，Guilds-Zamarka L，Oxender M等Catechol based inhibitors of 15-lipoxygenase.Bioorganic & MedicinalChemistry Letters 1996；6卷(1)：93-96；Moreau RA，Agnew J，Hicks KB，Powell MJ.Modulation of lipoxygenase activity by bacterial hopanoids.Journal of Natural Products 1997；60卷(4)：397-398；219th National Meetingof the American Chemical Society(2000)，Poster BIOL-15.作者：E-N-Jonsson和T-R-Holman.University of California，Santa Cruz，CA(描述了从海绵中分离的15-脂肪氧化酶抑制剂)；和Lyckander IM，Malterud KE.Lipophilic flavonoids from Orthosiphon spicatus as inhibitors of15-lipoxygenase.Acta Pharm Nord 1992；4(3)：159-166。此外，Conner等的美国专利6,268,387中的是15-脂肪氧化酶抑制剂硫脲和苯甲酰胺化合物(如3-氨基-N-(3，4-二氯苯基)-4-甲氧基-苯甲酰胺化合物3代表)，以及2-苯基-苯并[d]异硒唑-3-酮(ebselen)，6，11-二氢-5-硫杂-11-吖-苯并[a]氟(这里术语称为化合物2)和3-(2-辛-1-炔-苯基)-丙烯酸化合物4代表的苯基炔化合物在这里描述的方法中也有用。WO01/96298(并入作为参考)中公开的化合物也有效，包括化合物6，[[5-(5，6-二氟-1H-吲哚-2-基)-2-甲氧苯基]氨基]磺酰基]-氨基甲酸-异丁酯。

另外的15-脂肪氧化酶抑制剂包括下面所示的那些；

1)

在222nd National Meeting of the American Chemical Society，芝加哥，伊利诺州，USA，26-308月，2001.墙报，MEDI 270中描述。

2)PD148104

在218th ACS(New Orleans)，1999，MEDI 200中描述。

3)来自Parke Davis(现在的Pfizer)的PD146176

4)WO 92/1682中描述的A 78773(Abbott)。

5)QA-208-199(Novartis)

，在6th Int Conf Prostaglandins(佛罗伦萨)，1986，328中描述。

本发明的相关方面涉及增加骨形成的15-脂肪氧化酶抑制剂和其它活性剂如二膦酸盐、雌激素、SERMS(选择性雌激素受体调节剂)、降钙素或合成代谢治疗的联合治疗。二膦酸盐的实例包括阿仑膦酸盐，伊班膦酸盐，帕米膦酸盐，依羟乙磷酸盐和利塞膦酸盐。SERMS的实例包括雷洛昔芬，二氢雷洛昔芬和拉索昔芬。降钙素包括人和鲑鱼降钙素。合成代谢制剂包括甲状旁腺激素(PTH)，例如hPTH(1-34)，PTH(1-84)和甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)及其类似物。“Mono-and Bicyclic Analogs of ParathyroidHormone-Related Protein.1.Synthesis and Biological Studies，”MichaelChorev等Biochemistry，36：3293-3299(1997)和“Cyclic analogs of PTHand PTHrP，”WO 96/40193和美国专利5,589,452和WO 97/07815描述了PTHrP的特定类似物。其它活性剂可以在15-脂肪氧化酶抑制剂之前或之后并行给予，和可以通过不同的传递方法给予。优选，首先给予15-脂肪氧化酶抑制剂。给药时期可以是任何长度，但是典型的范围从六至二十四个月。这个治疗接着跟随用抗再吸收剂治疗，如二膦酸盐、SERM、降钙素或激素替代疗法。

因此，优选，15-脂肪氧化酶抑制剂可以如上文所述使用，包括另外的活性剂。因此，上文描述的方法优选包括另外的活性剂。更优选，用途或方法中包括的所述活性剂可有效调节从骨再吸收钙。更优选，所述活性剂选自由雌激素、降钙素、二膦酸盐和IGF组成的组。

在优选实施方案中，上文描述的用途和方法中的15-脂肪氧化酶抑制剂选自合成有机分子、天然产物和抗15-脂肪氧化酶抑制剂的抗体组成的组。在更优选实施方案中，15-脂肪氧化酶抑制剂选自3-(2-壬-1-炔基苯基)-丙酸，6，11-二氢-5-硫杂-11-吖-苯并[a]芴，3-氨基N-(3，4-二氯苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺，反-3-(2-辛-1-炔基-苯基)-丙烯酸和[[[5-(5，6-二氟-1H-吲哚-2-基)-2-甲氧苯基]氨基]磺酰基]-氨基甲酸-异丁酯组成的组。

在一个实施方案中，本发明的方法包括给予治疗有效量的反义寡核苷酸，它具有能够与编码15-脂肪氧化酶的基因组DNA或mRNA分子的任何序列特异性结合的序列，使得阻止15-脂肪氧化酶mRNA的转录和翻译。“反义”是指含有核酸序列的成分，该核酸序列与特殊核酸序列的“有意义”链互补。一旦被导入细胞，该互补核苷酸结合细胞产生的内源序列形成双螺旋和阻断转录或翻译。见例如Agrawal，S.主编(1996)Antisense Therapeutics，Humana Press Inc.，Totawa NJ；Alama等(1997)Pharmacol.Res.36：171-178；Crooke，S.T.(1997)Adv.Pharmacol.40：1-49；和Lavrosky等(1997)Biochem.Mol.Med.62(1)：11-22。反义序列可以是任何核酸材料，包括DNA、RNA或任何核酸模拟物或类似物。见例如Rossi等(1991)Antisense Res.Dev.1：285-288；Pardridge等(1995)Proc.Nat.Acad.Sci.92：5592-5596；Nielsen和Haaima(1997)Chem.Soc.Rev.96：73-78；和Lee等(1998)Biochemistry 37：900-1010。反义序列的传递可以用各种方法完成，如通过使用重组载体细胞内传递。

大约15至25个核酸碱基的反义寡核苷酸是典型优选的，因为它们容易合成并且能够产生期望的抑制作用。反义寡核苷酸的分子类似物也可以用于这个目的并且可能具有另外的优点如在制药产品有益的稳定性、分布或毒性有限。此外，化学反应基团，如连铁二乙胺基四乙酸(EDTA-Fe)可以与反义寡核苷酸连接，导致杂交部位RNA的切割。反义方法抑制基因体外翻译的这些和其它用途是本领域熟知的。见例如Marcus-Sakura(1988)Anal.Biochem.172：289。

尽管很多这里描述和已知很多15-脂肪氧化酶抑制剂，但是应该理解很多其它的可以用于主题方法。这里描述的方法意欲包括目前已知的15-脂肪氧化酶抑制剂的用途以及随后发现的那些。这里描述的测定和本领域技术人员已知的那些能够容易鉴定和开发有效预防或治疗骨损失的其它15-脂肪氧化酶抑制剂。

如实施例表明，在染色体11，对应于15-脂肪氧化酶基因的等位基因位置中发现基因异常或等位基因。因此，15-脂肪氧化酶的抑制和诱导在各种情况下有应用。可能通过抑制细胞内15-脂肪氧化酶，可以减少骨更新和因此增加骨矿物质密度和骨质量。因此，15-脂肪氧化酶的抑制可以用于治疗或预防骨过度再吸收，如骨质疏松症和骨关节炎中发生的骨过度再吸收的方法。

本发明的15-脂肪氧化酶抑制剂也可以用于刺激骨形成细胞或它们的前体的生长，或诱导骨形成细胞前体的分化，在体外或非体内。更特别地，15-脂肪氧化酶抑制剂可有效刺激含骨髓间充质细胞的细胞群，由此增加那个细胞群中成骨细胞的数量。在优选方法中，在用15-脂肪氧化酶抑制剂处理前或后，从该细胞群取出造血细胞。通过实施这种方法，可以扩充成骨细胞。扩充的成骨细胞可以输注(或再输注)到需要它的脊椎动物受试者。例如，受试者自己的间充质干细胞可以体外接触本发明的化合物，所得成骨细胞可以输注或导向受试者内的期望部位，在那里可发生成骨细胞的更多增生和/或分化，没有免疫排斥。备选地，暴露于15-脂肪氧化酶抑制剂的细胞群可以使人胎儿的成骨细胞或成骨细胞永生。如果这种细胞输注或植入到脊椎动物受试者，免疫保护这些非自身的细胞，或免疫抑制(优选局部)受体来增强移植和骨或软骨修复是有益的。

治疗的有效性可以接着监测上文所述的方法和用途在受试者中的功效的方法，包括测定受试者中15-脂肪氧化酶的水平，其在本发明中也已提供。

可以使用鉴定也可以预防骨损失和/或促进骨形成的15-脂肪氧化酶抑制剂种类的几种方法。一种用于鉴定抑制15-脂肪氧化酶活性的化合物的方法包括在15-脂肪氧化酶活性相容的缓冲液中使细胞、组织或优选细胞提取物或含15-脂肪氧化酶的其它制剂接触几种已知浓度的检测化合物。用酶产物的定量测定每种浓度的检测化合物的15-脂肪氧化酶活性水平并使用标准技术测定该化合物的IC₅₀(观察到样品制剂观察到的活性降至其起初或对照值的一半时检测化合物的浓度)。确定本发明化合物抑制15-脂肪氧化酶的浓度的其它方法是本领域技术人员已知的并且基于这里公开的内容将很明显可以使用。可以用于鉴定15-脂肪氧化酶抑制剂的特殊测定包括美国专利6,268,387B1和5,958,950(兔网状细胞测定)和美国专利4,623,661(RBL-1细胞中放射性标记的花生四烯酸)描述的那些。

例如，一旦配体结构被确定，通常可以发现拮抗剂。基于使用生理反应性细胞的高度自动测定方法的发展，现在已经可能进行潜在配体类似物的检测。尤其是，通过使用这里描述的筛选技术将发现新的激动剂和拮抗剂。

在另一个方法中，基于趋化因子分子形状的结构研究的理性药物设计，其它效应器或类似物，或受体可以用于鉴定三维结构与15-脂肪氧化酶的活性部位互补的化合物。用各种技术包括分子机械计算法、分子动力学计算法、约束分子动力学计算法，其中NMR光谱学确定约束、距离几何学，其中用NMR光谱学部分确定距离矩阵、X线衍射，或中子衍射技术来确定这些化合物。所有这些技术的情况下，可以在已知与15-脂肪氧化酶相互作用的任何配体存在或缺乏下确定结构。

这种计算机程序包括但不限于AMBER(得自加利福尼亚大学，旧金山)，CHARMM(Chemistry at HARvard Molecular Mechanics，得自哈佛大学)，MM2，SYBYL(Trypos Inc.)，CHEMX(Chemical Design)，MACROMODEL，GRID(Molecular Discovery Ltd)，和Insight II(Accelry1)。这种程序预期对确定两个分子之间的相互作用有效，这两个分子是分离的，或被溶剂分子如水分子包围的，或使用逼近溶剂化相互作用分子的作用的计算。可以通过手工，视觉检查，或使用产生大量可能方向的其它计算机程序确定两者的相对方向。计算机程序的实例包括但不限于DOCK和AutoDOCK。使用该计算机程序检测每个方向互补性的程度。因此，可以设计能够抑制15-脂肪氧化酶的新化合物。

鉴定可以抑制15-脂肪氧化酶的化合物的另一种方法包括使用技术如UV/VIS光谱学、旋光测定术、CD或ORD光谱学、IR或Raman光谱学、NMR光谱学、荧光光谱学、HPLC、凝胶电泳、毛细管凝胶电泳、渗析、折射法、电导分析法、原子力显微镜检查、极谱法、dielectometry、量热法、溶解度、EPR或质谱分析术。这些方法的应用可以是直接的，其中直接测定化合物与15-脂肪氧化酶的相互作用，或可以是间接的，其中具有有效光谱性能的特定试剂用作其它化合物结合15-脂肪氧化酶的能力的探针；例如，通过转移或通过荧光淬火。

因此，本发明提供了鉴定增加骨矿物质密度的化合物的方法，该方法包括化合物接触15-脂肪氧化酶并确定该化合物是否抑制15-脂肪氧化酶的活性。优选，所述方法进一步包括在证明该化合物对骨形成作用的功能性试验中检测化合物。更优选，该功能性试验包括使化合物接触人间充质干细胞并确定细胞分化为骨形成细胞。在另一个更优选实施方案中，功能性试验包括将该化合物给予非人动物并测定骨形成的指数。在最优选实施方案中，测定的指数是骨矿物质密度。在另一个最优选实施方案中，该指数是骨的生物力学参数。

在另一个最优选实施方案中，该功能性试验包括使该化合物接触人间充质干细胞并确定细胞分化为骨形成细胞，其中确定细胞分化包括进行碱性磷酸酶试验、钙试验、总DNA制备试验或它们的组合。

在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定增加骨矿物质密度的化合物的方法，该方法包括使15-脂肪氧化酶抑制剂接触人间充质干细胞并确定细胞分化为骨形成细胞。优选，确定细胞分化包括进行碱性磷酸酶试验、钙试验、总DNA制备试验或它们的组合。

可以随后测定由此鉴定或设计的15-脂肪氧化酶抑制剂预防骨损失和/或促进骨形成的能力。在一个实施方案中，使用上面讨论的基于计算机的方法。在另一种方法中，检测该化合物调节骨损失的已知靶的能力，例如，雌激素受体、肿瘤坏死因子受体、整合蛋白受体等等。仍在另一种方法中，检测该化合物将干细胞分化为骨细胞的能力。

这里描述的方法使用药物组合物，其包含上述分子和一种或多种药物可接受载体，和任选其它治疗和/或预防成分。这种载体包括液体如水、盐水、甘油、聚乙二醇、透明质酸、乙醇等。非液体制剂的合适载体对本领域技术人员也是已知的。药物可接受盐可以用于本发明的组合物，并且包括，例如，无机酸盐如盐酸盐、氢溴化物、磷酸盐、硫酸盐等等；和有机酸盐如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等。在Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版(Easton，Pennsylvania：Mack PublishingCompany，1990)中可得到药物可接受赋形剂和盐的充分讨论。

另外，辅助物质，如湿润或乳化剂，生物缓冲物质，表面活性剂等等可以存在于这种载体中。生物缓冲液几乎可以是药理学可接受和提供具有期望pH，即生理可接受范围内的pH的制剂的任何溶液。缓冲液的实例包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、Tris缓冲盐水、Hank’s缓冲盐水等等。

根据期望的给药方式，药物组合物可以是固体、半固体或液体剂形，例如，片剂、栓剂、丸剂、胶囊、散剂、液体、混悬剂、乳膏、软膏、洗剂或类似，优选以适合精确剂量单一给药的单位剂量形式。该化合物将包括有效量所选药物与药物可接受载体，和另外，可以包括其它药物制剂、佐剂、稀释剂、缓冲液等。

对于固体组合物，常规无毒固体载体包括例如制药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、邻磺酰苯甲酰亚胺钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等等。可以例如通过溶解、分散等这里描述的活性化合物和任选含药物佐剂的赋形剂，例如，水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等等，由此形成溶液或悬液来制备可给药的液体药物组合物。如果需要，待给予的药物组合物也可以含少量无毒辅助物质如湿润或乳化剂，pH缓冲剂等等，例如，醋酸钠、单月硅酸脱水山梨醇、醋酸钠三乙醇胺、油酸三乙醇胺等。制备这种剂量形式的实际方法是已知的，或对本领域技术人员将很明显；例如，见上面引用的Remington’s Pharmaceutical Sciences。

对于口服给药，该组合物将通常采用片剂、胶囊、软凝胶胶囊形式或可以是水性或非水性溶液、混悬剂或糖浆。片剂和胶囊是优选的口服给药形式。口服使用的片剂和胶囊将通常包括一种或多种普遍使用的载体如乳糖和玉米淀粉。也可以典型添加润滑剂，如硬脂酸镁。当使用液体悬液时，该活性试剂可以与乳化和悬浮剂组合。如果需要，也可以添加调味剂、着色剂和/或甜味剂。并入这里的口服制剂的其它任选成分包括但不限于防腐剂、悬浮剂、增稠剂等等。

肠胃外制剂可以制备成常规形式，如液体溶液或混悬剂，适合增溶的固体形式或注射前液体中的混悬剂，或如乳剂。优选，使用适当载体、分散剂或湿润剂和悬浮剂，根据本发明已知技术配制无菌注射混悬剂。无菌注射制剂也可以是无菌注射液或无毒肠胃外可接受稀释剂或溶剂的悬液。可以使用的可接受载体和溶剂是水、Ringer’s溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌、固定油、脂肪酯或多元醇常规可采用作为溶剂或悬浮介质。此外，肠胃外给药可以包括使用缓释或持续释放系统，使得维持剂量恒定水平。

可供选择地，本发明的药物组合物可以以直肠给药的栓剂形式给予。这些可以通过该试剂与室温下是固体但在直肠温度下是液体并因此将在直肠中溶解而释放药物的合适的无刺激赋形剂混合来制备。这种物质包括可可黄油、蜂蜡和聚乙二醇。

本发明的药物组合物也可以通过鼻气雾剂或吸入剂给予。可以根据药物制剂领域的熟知技术制备这种组合物并可以制备成盐水中的溶液，使用苯甲基醇或其它合适的防腐剂，吸收促进剂来增加生物利用度，推进剂如碳氟化合物或氮，和/或其它常规增溶或分散剂。

局部药物传递的优选制剂是软膏和乳膏。软膏是典型地基于凡士林或其它凡士林衍生物的半固体制剂。如本领域已知，含有所选活性剂的乳膏是粘液或半固体乳剂，水包油或油包水。乳膏基础是可洗涤水，并含有油相、乳化剂和含水相。油相，有时也称作“内”相，通常包括凡士林和脂肪醇如十六烷基或硬脂酰醇；尽管不是必须，含水相通常体积超过油相，并通常含有湿润剂。乳膏制剂中的乳化剂通常是非离子、阴离子、阳离子或两性表面活性剂。本领域技术人员会领会，待使用的具体软膏或乳膏基质是提供最佳药物传递的那些。如具有其它载体或媒介物(vehicle)，软膏基质应该是惰性、稳定、无刺激和不致敏的。

口腔给药的制剂包括片剂、锭剂、凝胶等等。可供选择地，如本领域技术人员所知可以使用经粘膜传递系统实行口腔给药。也可以通过皮肤或粘膜组织传递本发明的化合物，使用常规经皮药物传递系统即经皮“贴片”，其中该试剂典型地包含在作为药物传递装置固定在身体表面的层状结构内。在这种结构中，药物组合物典型地包含在层或“贮库”中，在背衬层之下。层状装置可以含有单一贮库，或它可以含有多个贮库。在一个实施方案中，该贮库含有作为药物传递期间将该系统固定到皮肤的药物可接受接触粘合物质的聚合基质。合适的皮肤接触粘合物质实例包括但不限于聚乙烯、聚硅氧烷、聚异丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨酯等等。可供选择地，含药物的贮库和皮肤接触粘合剂作为分开的不同的层存在，粘合剂位于贮库之下，在这种情况下，贮库可以是上述的聚合基质，或它可以是液体或凝胶贮库，或可以采用一些其它形式。在这些层压品中的背衬层，它作为该装置的上表面，起着层状结构的基本结构元件的作用并给装置提供更多柔韧性。选择作为背衬层的物质应该基本上不渗透存在的活性剂和任何其它物质。

药物或治疗有效量的组合物将传递给受试者。对不同的受试者精确的有效量会变化，其依赖于物种、年龄、受试者的大小和健康、被治疗情况的性质和程度、治疗医师的推荐和所选择给予的疗法和疗法组合。因此，给定情况的有效量可以用常规实验确定。为了本发明的目的，通常治疗量将在至少一个剂量中大约0.05mg/kg至大约40mg/kg体重的范围内，更优选大约05mg/kg至大约20mg/kg体重。在更大哺乳动物中，指示的日剂量可以从大约1mg至100mg，每天一次或多次，更优选在大约10mg至50mg的范围内。可以给予该受试者如降低和/或减轻迹象、症状或疑似紊乱原因，或产生其它任何生物系统期望改变所需剂量一样多的剂量。

可以使用上述任何制剂，或通过使用重组表达载体，用或不用载体病毒或颗粒，来完成多核苷酸的传递，如传递15-脂肪氧化酶反义寡核苷酸。这种方法是本领域熟知的，见如美国专利6,214,804；6,147,055；5,703,055；5,589,466；5,580,859；Slater等(1998)J.Allergy Clin.Immunol.102：469-475。例如，可以使用各种病毒载体，包括逆转录病毒和腺伴随病毒载体完成多核苷酸序列的传递。见如Miller A.D.(1990)Blood 76：271；和Uckert和Walther(1994)Pharmacol.Ther.63：323-347。可以利用来进行反义基因治疗的载体包括但不限于腺病毒、疱疹病毒、牛痘，或优选，RNA病毒如逆转录病毒。可用于将多核苷酸序列传递到靶细胞的其它基因传递机制包括胶体分散体和脂质体衍生系统、人工病毒被膜，和本领域技术人员可利用的其它系统。见例如Rossi，J.J.(1995)Br.Med.Bull.51：217-225；Morris等(1997)Nucl.Acids Res.25：2730-2736；和Boado等(1998)J.Pharm.Sci.87：1308-1315。例如，传递系统可以使用高分子复合物，微胶囊，微球体，珠和基于脂类的系统，包括水包油乳剂，胶束，混合胶束和脂质体。

如上讨论，药物制剂可以含有一种或多种有效调节钙体内平衡的活性剂。另外的活性剂可以是但不限于雌激素、降钙素、二膦酸盐(阿仑膦酸盐，residronate，唑来膦酸盐和伊班膦酸盐)、维生素D3或其类似物、雄激素、氟化盐、甲状旁腺激素或其类似物，或IGF，改变骨代谢中包含的天然存在的激素调节剂的调节的物质，及其组合。这个另外的活性剂可以在给予本发明的15-脂肪氧化酶抑制剂之前、与之并行或之后给予受试者。

本发明的另一个方面基于15-脂肪氧化酶基因多态性和骨矿物质密度之间的相关性的发现，其中某些多态性的存在与骨矿物质密度降低有关。该发现的另一方面是基因型与骨质疏松症的易感性有关。本发明有优点，因为通过筛选该基因型的存在，可能鉴定出可能具有这个遗传易感性的个体。因此，本发明另一方面提供了治疗的方法，包括筛选个体对骨损失的易感性和，如果鉴定到易感性，治疗该个体来延迟或降低或预防骨损失。

根据本发明的针对和预防方法，检测野生型15-脂肪氧化酶位点中的编码和非编码区中的改变，包括缺失、插入和点突变。因此，在小鼠中，例如，优选检测染色体11上的改变，而在人，检测染色体17上的改变。此外，可以通过检测野生型15-脂肪氧化酶位点并证实在15-脂肪氧化酶位点缺乏骨损失紊乱的易感性来实施该方法。这种突变可以存在于具有或不具有骨损失症状的个体中。此外，与那些不携带的相比，携带15-脂肪氧化酶位点突变的有症状个体的药物反应或预后可能有差异。

因此，本发明的一个方面提供了一种诊断方法，包括确定15-脂肪氧化酶基因的基因型。典型地，该方法确定了个体的15-脂肪氧化酶基因多态性是纯合还是杂合。典型地，通过体外分析个体细胞确定那个个体在15-脂肪氧化酶位点的基因型来实施本发明的方法。

有效的诊断技术包括但不限于微阵列分析、荧光原位杂交(FISH)、直接DNA测序、PFGE分析、Southern印迹分析、单链构象分析(SSCA)、RNA酶保护试验、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)分析、点印迹分析和PCR-SSCP，如本领域熟知。

通过检测受试者，如人患者的任何组织15-脂肪氧化酶基因的突变可以确定骨损失疾病的易感性。例如，遗传了种系15-脂肪氧化酶突变的一个人将倾向于发展骨损失疾病。通过测定该人身体的任何组织的DNA可以确定此。最简单地，可以抽取血液和从血液细胞中提取DNA。此外，通过检测胎儿细胞、胎盘细胞或羊膜细胞的15-脂肪氧化酶基因突变可以完成产前诊断。可以用这里讨论的任何方法检测野生型15-脂肪氧化酶等位基因的改变，无论是例如通过点突变或缺失。

存在可以用于检测DNA序列变异的几种方法。直接DNA测序，手工测序或自动荧光测序可以检测序列变异。另一种方法是单链构象多态性试验(SSCA)，其中对SSCA凝胶上移动迁移率的片段进行测序来确定DNA序列变异的精确性质。基于两条互补DNA链之间错配检测的其它方法包括夹板(clamped)变性凝胶电泳(CDGE)、异双螺旋分析(HA)和化学错配切割(CMC)。一旦已知突变，可以利用等位基因特异性检测方法如等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交来快速筛选大量其它样品的那个相同突变(见如Saiki等，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 86：6230-6234(1989))。

可以使用本领域熟知技术，通过15-脂肪氧化酶等位基因的分子克隆和测序该等位基因来完成点突变的检测。可供选择地，使用已知技术，可以从组织的基因组DNA制剂直接扩增基因序列。接着可以确定扩增序列的DNA序列。单链构象分析(SSCA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE或CDGE)、RNA酶保护试验、等位基因同源性寡核苷酸(ASOs)、等位基因特异性PCR或单核苷酸延伸试验可以证实等位基因的存在，如本领域熟知。

在优选方法中，使用微芯片技术鉴定等位基因。在这个技术中，成千不同的寡核苷酸探针或基因可以被合成(McGall等的美国专利5,412,087)或在硅或玻璃芯片上点成阵列(Shalon等的美国专利6,110,426)。待分析的核酸通常被荧光标记或与芯片上的探针杂交。其它标记包括³²P和生物素。也可以使用这些微阵列研究核酸-蛋白相互作用。使用这个技术，鉴定15-脂肪氧化酶基因中突变的存在。

改变的(或突变型)15-脂肪氧化酶基因的存在与骨损失疾病的风险增加有关。为了检测15-脂肪氧化酶基因突变，制备生物样品并分析正分析的15-脂肪氧化酶等位基因序列和野生型15-脂肪氧化酶等位基因之间的差异。接着可测序突变等位基因来鉴定特定突变等位基因的特异突变。15-脂肪氧化酶基因的突变，特别是小鼠的染色体11和人的染色体17上，接着用于本发明的诊断和预防方法。

因此，本发明也提供了诊断受试者骨损失的易感性的方法，该方法包括检测人染色体17上的多态性，其中该多态性是骨损失易感性的标志。在优选实施方案中，该检测包括基因分型。在更优选实施方案中，基因分型由微卫星标记或一个或多个单核苷酸多态性组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了诊断受试者对骨损失的易感性的方法，该方法包括检测受试者15-脂肪氧化酶的多态性。本发明提供了15-脂肪氧化酶抑制剂用作治疗活性物质预防骨损失。它也提供了上文描述的方法所鉴定的化合物。此外，提供了一种药物组合物，尤其是用于预防骨损失的，包含上文描述的化合物和载体。也提供了包含至少一种与骨损失相关的检测15-脂肪氧化酶多态性的寡核苷酸的诊断对骨损失的易感性的试剂盒。

最后，也要求保护基本上如这里描述的化合物、方法、应用、组合物和试剂盒，特别是根据前述实施例。

图1描述了混合的DNA样品基于SNP的基因分型与单个DNA样品微卫星基因分型检测与骨矿物质密度相关的多态性的比较。使用z-检验计算每个等位基因-频率差异的显著性，并作为LOD分值对所有染色体来绘图。虚线表示LOD分值3.3，它设定作为基因组-野生型限制性的阈值。

图2显示了使用整个肾RNA定量小鼠肾中Alox15的基因表达，其中使用微阵列分析基因表达。

图3显示了对体外给予增加浓度的IL-4应答的小鼠原代成骨细胞中Alox15基因表达的定量。

图4显示了鉴定的小鼠中Alox15基因的单核苷酸多态性(SNPs)的位置。

图5显示了相对于只有溶剂(DMSO)的对照，对15-脂肪氧化酶抑制剂化合物1或化合物2应答的人间充质干细胞(hMSC)中碱性磷酸酶活性的定量。

图6显示了用化合物3或化合物2作为15-脂肪氧化酶抑制剂和DMSO或1，25-维生素D3作为对照，hMSC中碱性磷酸酶活性的定量。

图7显示了用化合物3或化合物2作为15-脂肪氧化酶抑制剂和DMSO或1，25-维生素D3作为对照，hMSC的总钙含量的定量。

图8显示了相对于仅(DMSO)对照溶剂，与5-LO抑制剂齐留通，AA-861，和Rev-5901培养9天的hMSC中碱性磷酸酶活性的定量。缺乏反应是与15-脂肪氧化酶抑制剂见到的作用相比。

图9显示了相对于仅(DMSO)或1，25-维生素D3的溶剂对照，与5-LO抑制剂齐留通，AA-861，和Rev-5901培养16天的hMSC中总钙含量的定量。缺乏反应是与15-脂肪氧化酶抑制剂见到的作用相比。

下面是实施本发明的具体实施方案的实施例。提供这些实施例仅仅为了说明目的，并不想以任何方式限制本发明的范围。

化合物1：3-(2-壬-1-炔基苯基)-丙酸，美国专利5,972,980中描述。

化合物2：6，11-二氢-5-硫杂-11-吖-苯并[a]芴，WO97/12613中描述。

化合物3：3-氨基-N-(3，4-二氯苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺，WO099/32433中描述。

化合物4：反-3-(2-辛-1-炔基-苯基)-丙烯酸，在美国专利4,713,486中描述。

化合物5：齐留通，美国专利4,873,259中描述。

化合物6：[[[5-(5，6-二氟-1H-吲哚-2-基)-2-甲氧苯基]氨基]磺酰基]-氨基甲酸-异丁酯，WO01/96298中描述。

已努力确保有关使用数字(如数量、温度等)的精确性，但是当然应当允许一些实验误差和偏差。

实施例1

SNP基因分型模型

微卫星(也称作简单串联重复多态性，或简单序列长度多态性)构成发展最快的遗传标记种类。它们包括简单序列串联重复(二、三、四个核苷酸重复)的小阵列，它显示了高度的长度多态性，因此提供了高水平信息。PCR衍生技术对稍超过5,000个微卫星进行的简单分型已经在人基因组中排序(Dib等，Nature 380：152(1996))。

通常依据Grupe等(2001)Science 292：1915-1918描述的方法。为了鉴定调节BMD的遗传因子，对16周龄的C57BL/6xDBA/2杂种(Jackson Labs，Bar Harbor，Maine)的1000个F2后代实施基因组扫描。F2后代显示出BMD的无性别关联的正态分布(Grupe等，Science，292，1915-1918，(2001))。通过100个微卫星标记对单个DNA样品进行基因分型，最高(n＝145)和最低(n＝149)BMD的表型极端(顶和底15％)F2后代接受与BMD相关的全基因组扫描。此外，来自高和低F2后代的等量DNA用于形成两个混合库。使用等位基因特异性动态PCR方法测定mSNP数据库中发现的109个SNP的混合样品中的等位基因频率。对每个标记的两个极端之间等位基因-频率的差异进行打分。如果一个标记与BMD没有关系，两个极端的其期望频率是50％。使用z-检验计算每个等位基因-频率差异的显著性并作为LOD分值绘图(图1)。用微卫星和SNP基因分型方法发现四个区域的显著性关系(LOD分值＞3.3)，位于染色体1，2，4和11。

这样，使用SNP基因分型方法，鉴定了引起BMD的候选基因。

实施例2

动物模型

为了鉴定染色体11上鉴定区域内调节BMD的基因，使用微阵列分析DBA/2，C57BL6/J(Jackson Labs，Bar Harbor，Maine)和同系小鼠品系(D2.B6chr11，得自Oregon Health Sciences University)之间基因表达差异。D2.B6chr11同系小鼠含有移入DBA2/J背景的从cM20至cM50的C57BL/6J染色体11间隔。含有来自小鼠基因组的基因的微阵列与得自整个肾、培养的原代成骨细胞和原代软骨细胞的标记cRNA杂交。与得自单个DBA/2J，C57BL/6J，和B6.D2chr11和同系小鼠的cRNA进行杂交。实施mRNA(2x poly(A)+)分离、cRNA合成和杂交。成对比较DBA/2J和C57BL/6小鼠，和成对比较DBA/2J和B6.D2chr11同系小鼠来估计差异表达。

选择在染色体11上间隔(cM20-cM50)内编码的差异表达基因进一步描述其特性。所检测的两品系之间的单一基因(在染色体11上cM40的Alox15)基本上差异表达(图2)。DBA/2J品系与D2.B6chr11和C57BL/6小鼠相比，具有高水平的Alox15表达并且相对于另两个品系也具有降低的BMD。因此，DBA/2J小鼠中Alox15表达升高有助于骨矿物质密度降低。

使用实时PCR估计成骨细胞中差异Alox15mRNA表达。从DBA/2J，C57BL/6J，和D2.B6chr11小鼠制备细胞(图3)。用DnaseI处理总RNA以除去污染的基因组DNA。RNA在65℃加热10分钟以灭活DnaseI。所有PCR反应在100μl体积中实施。使用rTh DNA聚合酶(2单位)(Perkin Elmer)在含5×EX缓冲液，Mn(OAc)(3mM)，溴化乙锭(1μg/ul)，dNTPs(200μM)，正向引物(200nM)和反向引物(200nM)的反应混合物中，RNA(100ng)进行RT PCR。样品在60℃温育30分钟产生cDNA。这之后是60个循环(95℃，20秒；58℃，20秒)的PCR，接着在72℃温育20分钟。每个循环的荧光与产生产物的量有关并使用动力热循环仪测定和使用提供的软件(Germer和Higuchi，Genome Research，9，72-78，(1999))分析。除了肾之外，与C57BL/6J小鼠相比，来自DBA/2J小鼠的成骨细胞也产生了Alox15 mRNA基础水平升高。来自C57BL/6小鼠的成骨细胞中IL-4以相对于DBA/2小鼠更大程度地诱导Alox15 RNA(图3)。

为了鉴定Alox15表达的株特异性差异的分子学基础，使用本领域已知方法来自DBA/2J和C57BL6/J小鼠基因组DNA的Alox15基因对进行测序。鉴定到区分两株的十四个DNA序列多态性(图4和下表1图示)。15LO的Ensembl基因命名为ENSMUSG00000018924。Seq ID No.1给出了包含小鼠基因组的70929619至70937482位置的基因序列。在小鼠基因组序列的70938498位置的表1的第一个SNP位于Seq ID No.2列出的Genbank登记号U04332序列的541位置。

表1：与C57BL/6J小鼠相比在DBA/2J中鉴定的Alox15 SNP

小鼠基因组核苷酸变化内含子/外 A.A.位置

中SNP的位 C57BL/6J DBA2/J 显子

置(bp)

70938498 C_G 5’非翻译区

推定TATA

盒的～1kb

上游

70937181 A_G 内含子1

70936977 T_C 内含子1

70936975 A_T 内含子1

70936918 C_T 内含子1

70936336 T_C 外显子2 62/Phe(TTT)-Phe(TTC)

70936248 G_A 外显子2 91/Ser(TCG)-Ser(TCA)

70936136 G-A 内含子2

70935775 G_A 内含子3

70935765 C_T 内含子3

70931174 A_G 内含子10

70930258 A_G 内含子13

70930156 C_T 外显子14 616/Pro(CCA)-Ser(TCA)

70930151 C_T 外显子14 617/Asn(AAC)-Asn(AAT)

70929999 DBA/2J中T缺失 3’非翻译区

的第11个

碱基

实施例3

15-脂肪氧化酶抑制剂增加骨形成的能力

为了确定15-脂肪氧化酶抑制剂刺激骨形成和骨增积的能力，在体外检测15-LO抑制剂促进干细胞分化为骨形成细胞(成骨细胞)的能力。尤其是，通过测定成骨细胞分化的两个标志-细胞碱性磷酸酶活性和培养钙含量来确定用文献步骤制备的三种抑制剂-化合物1(3-(2-壬-1-炔基苯基)-丙酸、化合物2(6，11-二氢-5-硫杂-11-吖-苯并[a]芴)、化合物3(3-氨基-N-(3，4-二氯苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺)促进人干细胞分化为成骨细胞的能力。

通常，在12孔胶原包被培养板中，以1ml培养基(Clonetics目录号PT-4105加成骨细胞诱导剂(100nM Dex，0.05mM L-抗坏血酸-2-磷酸盐，10mM β-甘油磷酸)每平方厘米3100个细胞培养人间充质干细胞(hMSC，Poietics #PT-2501，BioWhittaker)。三种15-LO抑制剂逐个添加到每个的培养基中，除了对照孔中添加0.1％DMSO(阴性对照)或1nM 1，25-维生素D3(阳性对照)以外。抑制剂浓度如下：化合物1以3和30μM；化合物2以0.1，0.2，0.3，或1.0μM和化合物以3，10，或30μM。制备每个剂量水平的四至八个独立复制培养物。在实验最末，刮擦孔到合适培养基中收集培养的细胞进一步分析碱性磷酸酶(Sigma kit#104-LL)或细胞钙(Sigma kit#587-M)。收集进行碱性磷酸酶评定的培养物用刮擦细胞收集并重悬于250μl Tris缓冲的0.1％Triton X-100中，接着新鲜或冻融后检测。刮擦待检测总钙含量的分开培养物并重悬于250μl 0.5M HCL中。这些实验的结果标准化为总细胞DNA，因此标准化了细胞增殖的差异。同时收集那些培养物进行碱性磷酸酶和钙检测，刮擦细胞收集分开的复制培养物并重悬于250μl Hank’s平衡盐溶液中，用DNA(DNeasy Tissue Kit，Qiagen目录号69506)估计细胞数量。

成骨细胞体外分化的定量

对于碱性磷酸酶活性的定量，抑制剂制备于0.1％DMSO中并在第1天和其后每隔2-3天添加到培养物中添加14-16天。实施三个不同组实验。

在第一个实验组，化合物1或化合物2(0.2μM或1μM)用作抑制剂，溶剂(DMSO)作为阴性对照，并制备每个剂量水平的四个分开复制培养物。板培养14天。图5绘制了碱性磷酸酶的被DNA标准化的活性。

第二个实验组包括化合物3(3，10和30μM)或化合物2(0.1，0.3，1.0μM)作为15-LO抑制剂的八个复制培养物。在第1天或第11天添加抑制剂。DMSO用作成骨细胞分化诱导的阴性对照，和1，25-维生素D3作为阳性对照。图6和图7中分别绘制了碱性磷酸酶和钙含量的标准化活性。化合物2在第1天添加最有效，化合物3在第11天添加最有效。

作为15-LO抑制干细胞体外分化为成骨细胞的诱导的特异性的对照，第三组实验研究了认识到对5-LO酶，而不是15-LO酶更特异的标准脂肪氧化酶抑制剂的八个复制物。每隔2-3天新鲜制备齐留通(1，10，50uM，在Roche as制备)化合物5，AA-861(1，10，50uM，Sigma #A3711)和Rev-5901(15uM，Sigma #R5523)并在人成骨细胞前体细胞中检测。发现在第9天5-LO抑制剂缺乏诱导碱性磷酸酶活性的能力或在培养后16天缺乏诱导培养钙沉积的能力，如分别见图8和9。

在hMSC培养物被刺激分化为成骨细胞的中，成骨细胞分化标志-碱性磷酸酶活性和培养钙含量的定量结果证明添加特异性15-脂肪氧化酶抑制剂促进人骨形成细胞的体外分化。

此外，使用同系试验测定15-脂肪氧化酶抑制剂刺激骨形成和骨增积的能力，其中测定骨髓前体细胞的同系潜力。用15-脂肪氧化酶抑制剂处理成骨细胞和破骨细胞。在一种方法中，在体外温育细胞和抑制剂。在另一种方法中，给哺乳动物施予抑制剂，分离骨髓前体接着铺板。对于两个方法，测定这些骨髓细胞得到的集落形成单位。如果它们可显示出增加骨髓成骨细胞同系潜力或降低骨髓破骨细胞的同系潜力，人们可以筛选具有增加骨矿物质密度潜力的化合物。

实施例4

15-脂肪氧化酶基因的破坏导致股骨骨矿物质密度增加

最初，15-LO缺陷小鼠显示出具有较小表型变化，但是在小鼠模型中，随后表明这些小鼠被保护不受动脉粥样硬化损害(Sun和Funk，J.Biol.Chem.，271，24055-24062，(1996)；Cyrus等，J. Clin.Invest.，103，1597-1604，(1999))。而且，在15-LO缺陷小鼠中没有测到BMD。为了检测15-LO基因破坏对骨矿物质密度的作用，将15-LO“剔除”(15-LO-KO)小鼠与其双亲小鼠比较关于骨矿物质密度。用双能量X线吸光分析(DEXA)确定骨矿物质测定。用Lunar PIXImus光密度计(LunarCorp.，Madison，WI)实施所有研究。在完成了获得成年骨质量的4月龄麻醉小鼠上实施整个身体光密度分析。球形窗口定义为整个身体图像减去颅盖、下颌骨和牙齿。死亡后，小心取出右股骨并在DEXA扫描前清除粘附组织。15-LO-KO和C57BL/6双亲小鼠之间的整个身体骨矿物质密度没有显著性变化(49.8+/-0.6mg/cm²vs.49.5+/-0.4mg/cm²)。然而重要地，与C57BL/6双亲品系相比，15-LO剔除小鼠的股骨BMD显著增加(54.0+/-1.2mg/cm²vs.49.7+/-0.7mg/cm²)。这些结果证明15-LO的破坏导致股骨骨矿物质密度增加。

实施例5

15-脂肪氧化酶抑制剂促进体内骨形成

通过测定骨质疏松症小鼠模型中抑制剂改善骨参数的能力估计15-脂肪氧化酶抑制剂促进体内骨形成的能力。C57BL/6小鼠中白介素4转基因由Lck基因启动子(Lck-IL4)的组成型表达导致模拟骨质疏松症的严重骨表型。(Lewis等，Proc.Natl.Acad.Sci.，90，11618-22，(1993))，这些小鼠用于证明用15-LO抑制剂处理对骨质量的作用。

表2显示了使用的四个实验组。在断奶时，野生型C57BL/6或转基因Lck-IL4小鼠在它们的食物中每天接受150mg/kg剂量的化合物2PD146176，进行84天(饮食5001：23％蛋白，10％脂肪，0.95％钙和0.67％磷；PMI Feeds，Inc.，St.Louis，MO)。允许小鼠达到每日食物摄入的一半，以大约12小时间隔每天两次，并每天监测饮食摄入。水随意获得。对照组接受相同饮食，没有化合物2。实验过程中，所有组每天很好地等量消耗食物。

表2

表2.用于体内抑制研究的实验组。断奶后(大约28天)，给小鼠喂含或不含15-LO抑制剂(化合物2)的食物84天。组中F，雌性和M，雄性动物等量出现。

表3显示了IL4过表达和15-LO抑制对整个身体参数-股骨BMD和几何学和股骨生物力学的作用。IL4过表达导致整个身体BMD、体重和血细胞比容显著降低和体重脂肪百分比增加。与野生型C57BL/6小鼠相比，IL4过表达也减少股骨BMD、皮质面积、惯性力矩和皮质厚度。Lck-IL4小鼠的骨髓面积增加与血细胞比容降低有关并且与已报道的贫血相关。另外，IL4过表达对股骨生物力学有显著作用，包括降低衰竭负荷、骨僵硬度和骨强度(表3)。喂给15-LO抑制剂(化合物2)的小鼠显示对整个身体和股骨的有害作用的部分逆转(表3)。相对于携带Lck-IL4转基因的对照小鼠，药物治疗的小鼠的整个身体BMD、血细胞比容、股骨BMD和皮质厚度显著增加。重要地，15-LO抑制剂处理的小鼠的股骨生物力学，包括衰竭负荷、僵硬度和强度明显增加。这与骨质疏松症特别相关，因为骨强度和衰竭负荷水平是接近发生骨折的患者的重要决定因素。总之，该结果表明15-LO的抑制在体内导致骨质疏松症动物模型中更高的BMD和更高的骨强度。

表3

表3.IL4过表达和15-LO对整个身体和股骨骨参数的作用。测定携带Lck-IL4转基因导致与C57BL/6对照相比IL4过表达的小鼠的整个身体和股骨骨参数。也测定与未处理的Lck-IL4对照相比喂给15-LO抑制剂化合物2的Lck-IL4小鼠的这些参数。NC，组间没有变化。ns，P值没有显著性。

动物

体内实验中使用的所有小鼠在源自The Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)的祖先的Portland VA Veterinary Medical Unit同等条件下饲养。饲养的小鼠保持从得自The Jackson Laboratory的祖先至多三代。断奶时，小鼠以12小时白天/黑夜循环(6:00AM-6:00PM)，在21±2℃分组居住(每个笼子9-10只动物)。所有步骤被VA Institutional Animal Care and UseCommittee认可并根据National Institutes of Health的研究动物的护理和使用指导实施。

骨测光密度术

双能量X线吸光分析(DEXA)确定骨矿物质测定。用Lunar PIXImus光密度计(Lunar Corp.，Madison，WI)进行所有研究。在完成了获得成年骨质量的4月龄麻醉小鼠上实施整个身体光密度分析。球形窗口定义为整个身体图像减去颅盖、下颌骨和牙齿。死亡后，小心取出右股骨并在DEXA扫描前清除粘附组织。

样品加工

CO₂吸入安乐杀死成年小鼠(16周龄)并称重至最接近0.1gm。在死亡后立即获得心脏血液提取物并保留整个身体的小部分进行血小板比容检测。立即收集腰椎和两根股骨，浸透磷酸盐合成盐水的无菌纱布包裹，并冷冻保存在低于大约-20℃进行随后分析。

股骨干几何学

使用便携式X线微型断层照相仪(Model 1074，Skyscan，Antwerp，Belgium)确定股骨中骨干的横截面几何参数。以40秒间隔进行扫描，分析位于股骨中点的层的总面积(FCSA)、皮质面积(CtAr)和髓管面积(MaAr)。此外，使用数字图像皮质区域含的象素，计算前后面从横截面的质心至外部纤维的半径，弯曲面中惯性力矩面(Ixx)和平均皮质厚度(Ct Th)。

生物力学研究

在高分辨率材料检测装置(Instron Model 4442，Canton，MA)上检测股骨在三点弯曲度的衰竭。使用软件系统确定衰竭负荷和僵硬度。接着使用前面确定的横截面尺度计算弯曲强度。

数据分析

使用JMP软件包(SAS Institute)，采用双因素方差分析(ANOVA)分析所有数据。

实施例6

15-脂肪氧化酶抑制剂增加体内骨形成的能力

为了确定15-脂肪氧化酶抑制剂刺激骨形成和骨增积的能力，如WO0196298所述制备化合物6-[[5-(5，6-二氟-1H-吲哚-2-基)-2-甲氧苯基]氨基]磺酰基]-氨基甲酸-异丁酯并用标准雌激素不足大鼠OVX骨质减少试验检测。

切除三月龄大鼠的卵巢(Ovx)并经口管饲法给予1mg/kg/天的化合物6或0.1μg/kg/天的1，25-二羟维生素D3(阳性对照，表中缩写为Vit.D)，卵巢切除术后2周开始一天一次，持续7周。该剂量增加到2mg/kg/天并持续到11周。对照组，假组(sham)(没有切除卵巢的大鼠)和Ovx仅接受载体。使用QDR-4500骨光密度计(Hologic，Walthan，MA)高分辨率软件包确定脊柱和右髋的骨矿物质密度。将动物置于仰卧位进行扫描使得右股骨与躯干垂直和胫骨与股骨垂直。下表4给出了对于化合物的髋部和脊柱的骨矿物质密度(g矿物质/cm²)。用15-LO抑制剂处理的动物在＞3周显示脊柱BMD增加和在＞7周股骨远端BMD增加。表4显示了结果。

表4

括号中的值是在同一时间点对OVX对照的p值。Nd＝没有数据

实施例7

对实验室小鼠的降低15-脂肪氧化酶表达的基因操作导致骨质量和强度提高

为了检测15-脂肪氧化酶表达和骨发育之间的关系，从两个祖先品系-购自The Jackson Laboratory (Bar Harbor，ME)的B6.129S2-Alox15^tmIFun(Alox15剔除或15LOKO)和DBA/2(D2)组成遗传学杂合F₂群。B6.129S2-Alox15^tmIFun(15LOKO)小鼠是Alox15定向突变的纯合体且因此不能表达花生四烯酸盐15-脂肪氧化酶。相比之下，D2小鼠表现出高水平的Alox15。从Jackson Laboratory双亲系当地繁育15LOKO-D2 F₁小鼠并杂交产生共292只15LOKO-D2 F₂小鼠。断奶时，小鼠分组居住(每个笼子2-5只)并用随意摄水和实验室啮齿动物食物(饮食5001：23％蛋白，10％脂肪，0.95％钙和0.67％磷；PMI Feeds，Inc.，St.Louis，MO)在21±2℃，以12小时白天/黑夜循环(早六点至晚六点)维持。

所有小鼠在完成了获得成年骨质量的4月龄(28)时进行研究。用人腰椎羟基磷灰石模型每天校准的光束Hologic QDR 1500光密度计(Hologic，Waltham，MA)进行骨矿物质测定。使用制造商友情提供的小鼠整个身体软件(3.2版)(Hologic，Waltham，MA)实施分析。对麻醉小鼠实施光密度分析。在检测前晚停止食物(以消除未消化的啮齿动物食物对骨矿物质密度估计的影响)，异氟烷吸入来麻醉小鼠。动物称重至最接近0.1gm，接着进行骨密度扫描。CO₂吸入安乐杀死小鼠，无菌取出脾脏和股骨，接着立即冷冻进行随后分析。所有步骤被VA Institutional Animal Care and UseCommittee认可并根据National Institutes of Health的研究动物的护理和使用指导实施。

用台式x线微型断层照像扫描仪(SkyScan Model 1074，Aartselaar，Belgium)测定股骨结构(中干皮质骨面积和皮质厚度)。用高分辨率材料装置(Model 4442，Instron Corp.，Canton，MA)检测左股骨的三点弯曲度。连接伸长计(Model 2630-113，Instron Corp.)和系统软件(用于Windows 95的SeriesIX，Instron Corp.)用于以0.5％/秒的弯曲速度转移驱动器直到发生衰竭。记录负荷和转移(使用伸长计测定)数据并使用系统软件确定衰竭负荷(F)和僵硬度(k，由负荷的线性部分对转移曲线计算)。

使用盐析方法从各个小鼠的脾脏分离基因组DNA。对小鼠进行基因分型，采用设计产生野生型(266bp)和突变体(172bp)Alox15基因的不同大小产物的由The Jackson Laboratory(http://aretha.jax. org/pub-cgi/protocols/proto-cols.sh？objtype＝protocol& protocol id＝304)建议的聚合酶链式反应(PCR)方案。在Perkin-Elmer 9700热循环仪(Branchburg，New Jersey)上实施扩增。在4％琼脂糖凝胶上分离PCR产物并用溴化乙锭染色使其可见。

15LOKO-D2 F₂群由大约相等数量的雄性(n＝141)和雌性(n＝151)小鼠组成，如下表5所示，Alox15基因型频率符合Hardy-Weinberg原则，期望70(24％)剔除(无15-LO等位基因)纯合小鼠，153(52％)杂合(来自D2的单一15-LO等位基因)小鼠，和69(24％)纯合D2(来自D2的两个15-LO等位基因)小鼠。尽管，在体重上没有差异，但是Alox15剔除的纯合F₂小鼠表现出比D2纯合或杂合小鼠明显高的整个身体BMD(由ANOVA得到p＝0.006)。而且，Alox15剔除的纯合F₂小鼠显示出股骨干皮质骨(皮质面积和皮质厚度)量增加和如衰竭负荷和僵硬度尺度增加证明的结构能力明显提高(表6)。

表5 15LO基因型与15LOKO-D2 F₂群体种的BMD有关

15LO D2等位基因的数量 ANOVA

0 1 2 P值

小鼠数量 69 127 70

体重，g 28.2±0.61 27.5±0.43 29.2±0.64 NS

BMD，g/cm² 66.1±0.33 64.9±0.25 65.0±0.31 P＝0.006

表6 15LO D2等位基因的数量

0 1 2 P值

小鼠数量 15 15 15

体重，g 23.3±0.54 23.9±0.45 23.7±0.40 NS

BMD，g/cm² 65.6±0.46 64.8±0.95 63.4±0.65 P＝0.005

Ct Ar，mm2 0.76±0.03 0.78±0.03 0.70±0.02 P＝0.046

Ct Th，mm2 0.193±0.005 0.200±0.006 0.176±0.004 P＝0.006

衰竭负荷，N 20.5±0.8 20.3±0.8 18.0±0.6 P＝0.013

僵硬度， 126.5±4.6 108.7±5.1 110.3±3.3 P＝0.004

N/mm

(BMD＝全身BMD；Ct Ar＝股骨干皮质面积；Ct Th＝股骨干皮质厚度)

因此，公开了治疗或预防骨损失，增加骨矿物质密度，和增加骨形成和增积的新方法。尽管已经详细地描述了本发明的优选实施方案，但是应该理解可以不背离本发明的精神和所附权利要求限定的范围进行明显的变化。

IA062058序列表

<110>霍夫曼-拉罗奇AG

<120>治疗和预防骨损失的方法

<130>Case 21150

<150>US60/355255

<151>2002-02-08

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>7864

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>Ensembl基因ENSMUSG00000018924

<222>(1)..(7864)

<223>

<220>

<221>小鼠基因组中位置70929619

<222>(1)..(1)

<223>

<220>

<221>小鼠基因组中位置70937482

<222>(7864)..(7864)

<223>

<400>1

tctttgcaac attttattta aaataattag gtccctgttc ttttctatca ctagcccaaa 60

acatctttta ttgttgctat tagactctat taaggcttga gatctatttg attcatagac 120

gatgtgtaac aatgtatatt atcacccttt tgtgttcccg gggtgctttt cccaagcatg 180

gctattattt accctatggg gaaggaaaag cagaaaggat gaatgaaaag tggcactctg 240

ggtaacgcat ccaaagcaaa atgtgttcac tacagcagac tatggaaagc gggctcttgg 300

aaaagggttc cacactggca gagggcgggg ctcaagcaca gggatgcact tgagtggtct 360

tgattaaata acaaatcgag aggggggatg gtcatatggc cacgctgttt tctaccaggc 420

tgggccgcag gtactcataa ggtatgtcca agctcttgtt acgaatctca atttccttat 480

ccaaggcagc cagctcctct ctgaacttct tcagcacagc tttggcctca gggtttggga 540

agtgttcctc tgaatgctgg cccaggggca cctggaaggc aggtgggaaa acagcctaag 600

cctgtgacct ccgccagttt tggggtgcag agtttcctct ggaccctgaa tgattgattg 660

actctcacca taacagcctg gcgtctgccc aggagccaaa cgacatttat ctggagagta 720

gactgattag gattgggcag cgtcgccatc agcttctcca tcgtcgcgtc cttggtttta 780

ggtggtggca gccgcatggt gcagggtgca ttaggaaccc agtagaacca atccagctgg 840

agagacagtg atctagggtc aaggctcgcc cttggccccc atgctcacat tcccctcccc 900

cactgtactc cccaaattcc cagctgcctc cctctgggaa gtacctggcc aagatggatg 960

gaagagtgct gcgcagtgca tgtgaagatg cacatggtga tgaagtggca agcctgagcc 1020

cgggactgga gggaggtggg gaagcctacg agaggtgtga acggttagcg tgtgacgtca 1080

ccagaaccac tagacgggag gcctggagag gagagggaga ggcgagaagg acctcccagg 1140

accttgtgta agctggtatg agagcgggga tggtgaggga cgagaggagc cctggcacct 1200

atgtcataca taccccatcc ccaaggctca gggatcattg tcaaagggat gacagaaaaa 1260

acttttgaga gttttcatga agatttaaat gcttctggga gagtccatgg aagcacagag 1320

ggttctggag acgtctcaga actcaggtct tagttctcag gccagggatt cttattacct 1380

ctgtcctggg caccttgcaa cccaatctca gtgatctctt gacaccagct ctgcagttca 1440

tagtcatcct gaacagcttg gtcggtcttg tagtagagat cgaacattcc caccacgtac 1500

ctgtcaccaa agggtcaggg caagctgagg ccctctgctc cctgctccat gtggctgagt 1560

catagtgtcc acacccaacc aagccaagga acagacctcc tattctcctg gtcttctcca 1620

cccacaccgg cacacaaacc cgtcctgcgg ctctgttgac ctcaccgatt catgacttgc 1680

cagagctgca gggcatcttt agcatagaag caagtgtcaa tatccaggag tcctcgctca 1740

gccaagtcat cagggggaca caatgagctg taggtcagga aggctccagc ttgcttgaga 1800

agatccaggt ggcctcctcc acctgtgctc atcacctaaa ggaccaaggg caggtggttt 1860

tcactctaat caagctgccc tgaagggaga ggacagagtg aacctagagc ccacttctat 1920

ccccatacct tgtcaaaaaa gcctctctct gagatcaggt cgctcctggc ccggacattg 1980

atttccatgg tgtagagtag gtgaggaact agaagctagg agaagaaaag ggatgggtaa 2040

gtcagaagga ctctatgaca ggtccctgta gcaagcaggt ttgacaaggg agaagcgaag 2100

ctcactccaa gggaaaacgt ggccgtgagg ctctgtggcc ctcgattctg ataagtgctg 2160

gttttctgcc tgactggggc cacaagagtc aaatcactgc cttctgacaa tctctttcat 2220

tccctgtgtt gtcttttcaa cagtctttct tgatcaccca aaagaaactc acatggcact 2280

gttgtgattc tctaagatct caccacagcc aacatgtcga gtataatcac tactggggtt 2340

tctgttgtta tttttgtttt gctttgtttg tttttttttt cctcttactg gagataaaaa 2400

aaaaatcccc caaaactaga tgttaacaca ggcatctaga ctaggtctgt gtagagacat 2460

ccaataccaa tttcgatgga tgaactcttt gctctgattg actagagtaa accaggtcac 2520

tcttgttgct ctaggtcatc gtttcagaac tccccaaaga ctgctgtaag gaatccgttg 2580

tgtaatttgc atggtcccct ctttaagtca cgtgcaccta ctctggtact gtatgtatat 2640

ctatgttctg tacataagat tagaatcttt acaccctttg ctgaggaatc acctgtatat 2700

gcccccttgg ggattagtgc cattgctgac aatgtagagg acagcaggtc acactccctt 2760

tctctctccg ttgttcatct catctcttct catcatcctg aaccctgcct gagatgccac 2820

tgagagaccg tctcagaggc aagagtgtgt agcaagccaa gagatgtaga cagaacaaaa 2880

aaaaacacaa aaaacaaaaa acaaacaaac aaaaaaaaac cgaataaggt gttaccttaa 2940

aaacagggtg cacggaaggc aggcacctca tggtggccac agcaaagacc tcagccacca 3000

agtgtcccct cagaagatga gcctgtagct catgaagctg taagtctgag cttcggaccc 3060

agcatttggc caggagccag tccattgggg gatccaaggg cgtgaaaatc ggcggtgggg 3120

tagacccagt tttgggcagt tcgagctgga gtaaaacaac agtgtgaaga aagggctgga 3180

tggagatctt cgtggcaacg gctcagcgat ccctacttcc tccatcccac acgtgtgcag 3240

ccatcttggg ctctctctca tctttcaaca tcacctctcc acaaagatct gaggctctgg 3300

gtttcaacta atagaggatt ttgtatgtgt ccccattact tcaaaactgg caggaccaaa 3360

gcctacctgg gtgcctaccc ctctgcactt gccctgtgtc tgaagaaacc tgcctgagtc 3420

ccacttttcc tgactccact ccaggccagt agattctccc tctgctctcc ctcctctcca 3480

gctccatggc tacttactac tcacggagag cccaccatcc cctgaaacct tagcaacccg 3540

gcatcagtaa gccccggcta tccattctaa cactgactct ggagaggagc tgctcacgct 3600

gcgcctccag caagccacag aaatctcctg gctcctccac ctcagcctct tcacctaaag 3660

tatctttctc tggggacaga tcccacccat cctcccgaca ctgctcccag gatcccccct 3720

gaactggctc tgtccttggc attggagctt atacatgccg attagtctgt ctctccagta 3780

aagccacaaa acccttaaag tcaaagcctg cccgtgtcct cctctagtgc ctcctcggta 3840

ccttagggca acgccactgt gggggaaacg ggagagaact tgaaccacag gctcggcgga 3900

ggaggccacc ctggggtaca acccctggtc ctctcacctg gatggctata ggcaagagtt 3960

gcccatcggg ctgcagcttc agcatgacga ggggggcagc caggtactgc tgactacaaa 4020

ggatgacatt ggccttgatc ccatccagaa ggaagaaatc cgcttcaaac agagtgcctt 4080

tctgcatagg gagagaaatc aagggcttct gtcagcatgg tcttctccca ccctgagtgc 4140

ccgacaagga gacaagaaag aagagagacg acctgtctcc atcagccacc tggcagtgtt 4200

tgtcctctac ctcatcaaag tctcctcatt cttcttcctt tttttcttct tactttttta 4260

ttgcatttgt ttgtttgctg ggtgggtgtg tatgttcgtg tatatgcata tatgtggaca 4320

catgtttgcc atgacatcgg gtgatgatca gaagacaacg tatgggaagt agctccctcc 4380

ttttaccaca caggtcccag ggatcaacta agattgttat gcttggcagc aggtagctct 4440

acctggcgtt accacaccta accttatatg ctccgtctaa attactccag attacaggaa 4500

aggaaaccga aagggtttcc cagaatcagg gtatcttggc aatcgggagc caaggaatac 4560

cccaaagtca caccatgcaa caaacctcac acatgagatt tattggggtg acagaacggc 4620

ggtggcctct gaacaggaac agagaaagca gcgagctgag tggaggggcg ggcttttaca 4680

gggtctttgg agcatgtgca gccagcgagt ggagcatgcg cagtgagcta gtgaaacagt 4740

acagagagcc tagaagtatt gcttgactgt gaaccttgaa taataggggt ggagatttcc 4800

aagtcccgag ttcagggaca gaccaggggc agggtgattt tccactggtc tattacccta 4860

aagaaacaga tcagagaaat gagatagtgc acttaaaatc acccagcaaa accaggattt 4920

agatgcaagt ctatctggcc ccatgaatct tgtcattgtc ccagcttggt tcctaattag 4980

ccccagccct gccttggatt ctctcaccct gtacctctct ggacccatgg cctccaggac 5040

aacgtcacat ctctactggc caccccaata aggctcctct cttcaaccat atactcctct 5100

cctgtgctgg gaaagccacg gtactacatt tttctacatc agtctaggat ttgtctggat 5160

cctctcttga caaccagcag gaattcacag taaatctgag cacagtacac ccaacaccca 5220

gtacacccaa cacccagtac acccaacacc cagtacaccc aacacccagt acacccaaca 5280

cccagtacac ccaacaccca gtacacccaa cacccagtac acccagtaca cccaacaccg 5340

gctcctgcct ccacttccct gcttggcctt cctggtgctt tgatgcccat accttgagct 5400

cctcatccag ctgggcctgt agcttctcca tccccggagg gaataccagg cgggcaggga 5460

gacaagtaga ccgcttcagc accatggggt tagcaccatt gagaaactgg tacccaaaga 5520

aagcatcctc tttccaggag tttcgaaccc gctctaggga taggaggagg acgtgtctaa 5580

gatccaactt cctggtcctt ccaacaccca ccaaaacatc cctacttgac ccagactacc 5640

agagatgtca gacaaaagcc tctgacccac ccaccctcaa cccggctttc tcgatctcct 5700

tgcattggga agagttttgg ggtaagagta atttgggggt aggtgtactt accagccatc 5760

ttggtgtggc cactcttgaa aacatagttg aagtcatcta ggcttttcca gcaggtcaca 5820

gtgtttttag ggaagttaat aacggtgtcc attgtccttc agggaagaat ggggcaaagg 5880

atgtgacagt tatacttaga accaaacatt acagccaaag gtaccataga cgagaccagc 5940

acacacccac cctcaagccg ggcactcttg ccctcacccc agaacctgtg aagcttcaaa 6000

ttcaagtctt ttgtcctctc gaaatcgctg gtctacaggg aggtcagaga tactggtcgc 6060

cgccacgttc aggattgtgc catccttcca gttgccccac ctgagggcag aagtgacatc 6120

aggcacgggc actgcagagg cagctcgcca tgggtcccct gggtcagcct cacctgtaca 6180

gactcctcct ttcttccagt tcctcctccc tgtggttcct gaacaggcct tgagagtctt 6240

caaccacggt gcagcctaga agccgaggag ggagacactc tggatgtctt ctgtgagctt 6300

ctctaccccc ttccagctgg ctgtacctct tcaggcagcc ctggctgtcc tctgtgcatg 6360

catcttcatg tccctccctg aagcctccgt gacatctggg ccagcttcag ctactctttc 6420

tttgacaact catttaaaac accaaacaaa cagcccagct tccaggctcc agctcccaca 6480

cgctgcctcc ccttcctcac acaactgagg ctccgttccc cctatgcctc ttcacacaca 6540

cacaccccac ccctctgctc accagtgccc tcagggaggt tcaggatgct ggtgccctga 6600

acccatcggt aacaggggaa cgtgtactcc gatccctggt ctccggggcc cttcacagaa 6660

atccagttgc agaaccaggc gtcctctttg agataatgcc atttctgcac tctcacaaac 6720

agcagtggcc caaggtattc tgacacatcc accttgaatt ctgcctcctg cagataagca 6780

caggggcgca gaatggggtg ctcaggctga gttctgcttc cactgggcca caggaaaagt 6840

gatgaaaaga ggctccatga caccactcag ggttgtcacc tcaaccaaga gtgagagggt 6900

taaggatgga cgatggacga tgggaaagta cactccttcc tccccggggg gtggggggag 6960

gactagagga aggggaattc tggaaactct gccagaggcc cagtgaggaa cgggtcaaat 7020

gggagacccc actaaggcag agaacccatg ggaattccat ttggcctgag ccagggtttc 7080

tacaggatgg tctccaggga gaaacctgga tttggagagg cggggttggt gagagagaat 7140

gaaatcagag aagacacgag gcagagtcca tggagagcgt agaggctgaa aggaccagcg 7200

ccttcatgaa gctagggccc ccagcgcctt catgaagcta gggcccagag agccgtgggg 7260

actgggagcc aaacaggacc aggtcccgag ggaccgagag taagccagag gcttggcagt 7320

tcgtagggaa gaagctggag acactgggag gctttatcag gcagactgtt ctacagtagg 7380

aacgagagaa gatggtaaat cttaagcttt aaaaaattag agacattcgg gcagctgaca 7440

ctgctgatac tggcactact actgtaccgc agagttctgt gaagtgaggg acgcacagaa 7500

atatcccact caatgaggcc aggaggcagc aactgttact gagcgctcac cgaatgcctc 7560

tgtgcaccct ttccgctttc cgaggctgtg agctccttcc tcagagttca ggggccacgc 7620

atcagggttc ctagggattt ctttgacttt gcccccgccc ccgcccccag cccctcaccc 7680

tgccgcctcc cgggacagcc agagctctgc gcagctcacc gagttccgac agggtcggaa 7740

cagcttcccg agagatgcct ccccatgctg tccgatcaac cacaggtaga cctcgttgtt 7800

ggagcccgcg tacacggagt ccccggtgga gacgcggatg cggtagacac ccatcttgca 7860

gatg 7864

<210>2

<211>1557

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>小鼠白细胞型12-脂肪氧化酶基因

<222>(1)..(1557)

<223>2003年1月7日GenBank登记号U04332

<220>

<221>SNP

<222>(541)..(541)

<223>

<400>2

gtgaaggtaa aaatcacaag cttggtacct cctgttgaaa tagttgtgat gcccattagc 60

aagcaggaca ggataggaac gtttaagaag aatagggcac atttgtgtca ccatggcatt 120

tctgtttgat tcgggagcag agagccttgc atttacagaa acagaacaat tcaggttagc 180

gaacgttcca gtaagtacca tacgtgcctg agagtaatgc tgacctcagt tccaccggcg 240

gtcgggtcag ggcttagcaa atatgtgatt cttatttcaa tggaaggggt gtgttagctt 300

ggggatgtgc acagaactga ctcatagtgg agattgccat tcaccagaca cattttcatt 360

gtctttgttt aattcagttt ataacactcc atgccagaat ggcaccaaag gtcattttat 420

tactcttatt agtcacatgg actgagagtc tttgtggtcc catgtctccc tagaggaagg 480

atgtatgtac agttgcattc agctcagtgg gttccaggtg tagcaacagt taacaataaa 540

cgaataagcc ctgctggatg cggtcttggc ctaggaggcg ctcctgtgag ccggtgatac 600

tgacacaagg atgatcaggg tccagcatta gccaggcatc agcagaagcg cttctggggt 660

aggcggtaga agctggttgt ctctgggtgg ggtgtagaag gcacttcact gagaagctag 720

agtctcctca ggatttggaa ggatgagtag ggtggacccc gagtacatga ttcttcagca 780

aataacatgg agtctttggt ggtggctctg gggagcaagg ggcttcagca ggagtgcagt 840

gtggggaagg gagaaaatca ggtttccgag ggctttgaag gccaggtaat ttcgggtttt 900

attatgcaga catcgggaga tatctggatg ctttgaaact cacagggatg agcccagagc 960

ctgcctcagg atgggcaaag tgtacagagc tggtagaatt aatcgggtgg ctaaaatgtg 1020

ccgcctttaa atgctgcaca gcacctgcar ccttaagatt atccctgggc atgggaaaac 1080

ccatctgtga tgcgcgcact ggagagtgga tgtatgtgcg tgtgagagtg tgtgtgtgtg 1140

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgagagag agagagagag agagagagag agagagagag 1200

agagagagag agagtgagcg cgcgtggagg aaggtgtgac gggggcagaa gggactggac 1260

cagatgttga ttctttcttg catgttttct tttcaaatcc ccatctactt ctccctcctg 1320

ttctcctctc accaagatga tttttgagag ttcagctttg cccagagccc cgcctttttt 1380

gggctggaac gaggccccca gcaagtgctg ggggccccag taagtgacag aggcggggtt 1440

aattgccacc tacagctcaa ccctaaacta gacttctgaa ggggcggggc ctcggctttc 1500

ttatttagcc cgtctacccc tcttgattct cagaagggag aaaacttcat ctgcaag 1557

Claims

1. 一种鉴定增加骨矿物质密度的化合物的方法，该方法包括使化合物接触15-脂肪氧化酶并确定该化合物是否抑制15-脂肪氧化酶活性，并且在证明该化合物对骨形成的作用的功能性试验中检测该化合物，其中所述功能性试验包括使化合物接触人间充质干细胞并确定细胞分化为骨形成细胞，其中抑制15-脂肪氧化酶活性并诱导细胞分化为骨形成细胞的化合物是增加骨矿物质密度的化合物。

2. 权利要求1的方法，其中确定细胞分化包括进行碱性磷酸酶试验、钙试验、总DNA制备试验，或其组合。

3. 一种鉴定增加骨矿物质密度的化合物的方法，该方法包括使化合物接触15-脂肪氧化酶并确定该化合物是否抑制15-脂肪氧化酶活性，并且在证明该化合物对骨形成的作用的功能性试验中检测该化合物，其中所述功能性试验包括将该化合物给予非人类动物并测定骨形成的指数。

4. 权利要求3的方法，其中所述测定的指数是骨矿物质密度。

5. 权利要求4的方法，其中所述指数是骨的生物力学参数。

6. 一种鉴定增加骨矿物质密度的化合物的方法，该方法包括使15-脂肪氧化酶抑制剂接触人间充质干细胞并确定细胞分化为骨形成细胞，其中诱导细胞分化为骨形成细胞的15-脂肪氧化酶抑制剂是增加骨矿物质密度的化合物。

7. 权利要求6的方法，其中确定细胞分化包括进行碱性磷酸酶试验、钙试验、总DNA制备试验，或其组合。