KR20060029705A - 골 손실의 치료 및 예방 방법 - Google Patents

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로버트 프레더릭 클레인
게리 알렌 펠쯔
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에프. 호프만-라 로슈 아게
더 거번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠
오레곤 헬스 사이언시즈 유니버시티
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Abstract

골 손실을 치료 및 예방하고/하거나 골 형성을 향상시키는 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 15-리폭시게나제 억제제를 사용한다. 이들 분자는 단독으로 전달되거나, 또는 골 재흡수를 억제하는 약제 또는 골로부터의 칼슘 재흡수를 조절하거나 골 축적을 향상시키는 추가의 약제와 조합되어 전달될 수 있다. 본 발명은 또한 골 손실의 소인을 진단하는 방법을 제공한다.

Description

골 손실의 치료 및 예방 방법{METHOD OF TREATING AND PREVENTING BONE LOSS}
도 1은 골 무기질 밀도와 관련된 다형성을 검출하기 위한, 통합된(pooled) DNA 샘플의 SNP-기초 지노타이핑과 개별적인 DNA 샘플의 마이크로새틸라이트 지노타이핑의 비교를 도시한다. 각 대립유전자 빈도 차이의 유의성을 z-시험을 사용하여 계산하고 모든 염색체에 대해 LOD로서 도표화하였다. 점선은 게놈 전체의 유의성에 대한 문턱값으로서 설정된 3.3의 LOC 스코어를 나타낸다.
도 2는 전체 신장 RNA를 사용한 마우스 신장내 Alox15 유전자 발현의 정량화를 도시하고, 여기서 유전자 발현은 마이크로어레이를 사용하여 분석되었다.
도 3은 시험관내에서 투여된 IL-4의 농도 증가에 따른 마우스 1차 조골세포내 Alox15 유전자 발현의 정량화를 도시한다.
도 4는 마우스의 Alox15 유전자에서 동정된 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 위치를 도시한다.
도 5는 용매 단독(DMSO)의 대조군과 비교한, 15-리폭시게나제 억제제인 화합물 1 또는 화합물 2에 따른 인간 간엽 간세포(hMSC)내 알칼리성 포스파타제 활성의 정량화를 도시한다.
도 6은 15-리폭시게나제 억제제인 화합물 3 또는 화합물 2 및 대조군인 DMSO 또는 1,25-비타민 D3에 따른 hMSC내 알칼리성 포스파타제 활성의 정량화를 도시한다.
도 7은 15-리폭시게나제 억제제인 화합물 3 또는 화합물 2 및 대조군인 DMSO 또는 1,25-비타민 D3에 따른 hMSC의 총 칼슘 함량 정량화를 도시한다.
도 8은 용매 단독(DMSO)의 대조군과 비교한, 5-LO 억제제인 질류톤(Zileuton), AA-861 및 Rev-5901과 함께 9일 동안 배양된 hMSC내 알칼리성 포스파타제 활성의 정량화를 도시한다. 반응의 결여는 15-리폭시게나제 억제제에서 관찰된 효과와 대조적이다.
도 9는 용매 단독(DMSO) 또는 1,25-비타민 D3 대조군과 비교한, 5-LO 억제제인 질류톤, AA-861 및 Rev-5901과 함께 16일 동안 배양된 hMSC의 총 칼슘 함량 정량화를 도시한다. 반응의 결여는 15-리폭시게나제 억제제에서 관찰된 효과와 대조적이다.
본 발명은 일반적으로 15-리폭시게나제 억제제, 및 골 손실의 치료 및 예방에서의 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 골 손실을 감소시키고/ 시키거나 순(純)골 형성을 증가시키기 위한 15-리폭시게나제 억제제의 용도에 관한 것이다.
리폭시게나제는 식물 및 동물에서 발견된 비헴(nonheme)의 철 함유 효소로, 지질 및 지단백질과 같은 특정한 다불포화 지방산의 산소화를 촉매한다. 특징적인 산화 작용을 각각 갖는 몇 가지의 상이한 리폭시게나제 효소가 공지되어 있다. 포유동물의 리폭시게나제는 산소화되는 아라키돈산내의 위치에 의해 명명된다. 효소 5-리폭시게나제는 아라키돈산을 5-하이드로퍼옥시에이코사테트라엔산(5-HPETE)으로 전환시킨다. 이는 5-하이드록시에이코사테트라엔산(5-HETE) 및 류코트리엔(LT)을 생성하는 대사 경로의 제 1 단계이다. 유사하게, 12- 및 15-리폭시게나제는 아라키돈산을 각각 12- 및 15-HPETE로 전환시킨다. 12-HPETE의 생화학적 환원은 15-HETE를 유도하는 한편, 15-HETE는 리폭신으로 공지된 화합물류의 전구체이다.
다양한 일련의 생물학적 효과는 리폭시게나제 활성을 갖는 생성물과 관련되어 있고, 그 중 많은 것은 다양한 질환 상태에서 매개인자로서 관계하고 있다. C4 및 D4 LT는 인간 기관지 평활근의 강력한 수축인자이고, 류마티스성 관절염 환자의 활액에서 발견된 LTB4 및 5-HETE는 다핵형성 백혈구와 같은 염증성 세포에 대한 강력한 화학주성 인자이며(문헌[Green and Lambeth, Tetrahedron, 39, 1687 (1983)]), 12-HETE는 건선 환자의 상피 조직에서 높은 농도로 발견되었고, 리폭신은 호중구로부터의 리소좀 효소 및 초과산화물 이온의 방출을 자극하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 리폭시게나제 효소는 천식, 알러지, 관절염, 건선 및 염증 매개인자의 생합성에서 중요한 역할을 하고, 이들 효소의 억제제는 상기 질환 상태에 관련된 생화학적 경로를 방해한다.
인간의 15-리폭시게나제(15-LO)는 아라키돈산으로부터의 15-S-하이드록시에이코사테트라엔산(15-S-HETE)의 형성을 촉매한다(문헌[Kuhn and Borngraber, Lipoxygenases and Their Metabolites, Plenum Press, New York, (1999)]). 마우스에서, 15-S-HETE의 합성은 인간 15-LO의 쥐 상동체인 12/15-리폭시게나제(Alox15)에 의해 수행된다. 쥐의 12/15-LO는 아라키돈산을 3:1 비율의 12(S)-하이드록시에이코사테트라엔산 및 15-S-HETE로 전환시키고, 추가로 리놀레산을 13-하이드록시옥타데카디엔산(13-HODE)으로 전환시킬 수 있다.
15-리폭시게나제는 이전에 동맥경화증(문헌[Harats et al., Arterioscler . Thromb. Vasc. Biol., 2100-2105, (2000)]), 천식(문헌[Shannon et al., Am . Rev . Respir. Dis., 147, 1024-1028, (1993)]), 암(문헌[Shureiqi et al., JNCI, 92, 1136-1142, (2000)]) 및 사구체신염(문헌[Montero and Badr, Exp . Neph., 8, 14-19 (2000)])을 비롯한 몇몇 질환의 병인론에 관련되어 왔다. 페놀, 하이드록삼산 및 아세틸렌성 지방산을 비롯하여, 15-리폭시게나제를 억제하는 다수의 화합물류가 동정되어 왔다(문헌[Kuhn and Borngraber, Lipoxygenases and Their Metabolites, Plenum Press, New York, (1999)]에서 재검토됨). 이들 약제에 대한 억제 활성의 범위는 다양하다. 예컨대, 노르다이하이드로구아이아레트산은 5- 및 15-리폭시게나제의 억제제인 것으로 밝혀졌고, 나프틸하이드록삼산은 5-, 12- 및 15-리폭시게나제를 억제하는 것으로 밝혀졌으며(미국 특허 제 4,605,669 호), 벤조플루오렌 15-리폭시게나제 억제제인 PD146176은 15-리폭시게나제 효소에 비교적 선택적인 것 으로 보고되었다(문헌[Sendobry et al., Br . J. Pharm., 120, 1199-1206, (1997)]. 15-리폭시게나제가 동맥경화증에 관련되어 있다는 증거는 목적하는 Alox15 결실(Alox15 -/-)을 갖는 마우스를 사용한 연구로부터 나왔다. 초기에 이러한 Alox15 녹아웃(knockout) 마우스는 5-LO 활성의 증가를 비롯하여 표현형에 작은 차이를 갖는 것으로 밝혀졌다(문헌[Sun and Funk, J. Biol . Chem., 271, 24055-24062, (1996)]). 그러나, Alox15의 파괴는 apoE 결핍(apoE -/-) 동맥경화증에 걸리기 쉬운 마우스에서 동맥경화증 병변을 크게 감소시켰다(문헌[Cyrus, et al., J. Clin Invest., 103, 1597-1604, (1999)]).
5-LO가 몇몇 질환의 병인론에 관계되어 왔지만, 쥐 또는 인간 15-리폭시게나제의 생물학적 기능은 확실히 결정되지 않았고 15-리폭시게나제 억제제의 인간에 대한 임상적 유용성도 확립되지 않았다. 특히, 인간의 골다공증 및/또는 골관절염 치료를 위한 15-리폭시게나제 억제제의 유용성은 이전에 발견된 바 없다.
골다공증은 성숙한 골의 골 무기질 밀도 감소에 기인하고, 최소의 외상 후에도 골절을 초래한다. 이 질환은 널리 퍼져 있고, 경제적으로 막대한 영향을 미친다. 가장 통상적인 골절은 척추, 원위 요골 및 고관절부에서 일어난다. 65세 이상 여성 인구의 1/3(추정치)은 골다공증에 부분적으로 기인하는 척추 골절을 입게 될 것이다. 또한, 고관절부 골절은 극심한 노령에 의해 대략 여성 3명마다 한 명 그리고 남성 6명마다 한 명에서 발생할 것이다.
골 손실의 독특한 2가지 양상이 확인되었다. 하나는 남성과 여성 모두에서 발생하고 약 35세에 시작되는, 연령과 관련된 느린 과정이다. 이 양상은 남성과 여성에서 유사한 비율을 갖고, 유사한 양의 피질 및 해면질(스폰지 또는 격자상) 골의 손실을 초래한다. 피질 골은 충수 골격에서 우세한 반면, 해면질 골은 축상 골격, 특히 척추 뿐만 아니라 긴 골의 단부에 집중되어 있다. 연령과 관련된 골 손실에 기인하는 골다공증은 II형 골다공증으로 공지되어 있다.
골 손실의 다른 유형은 폐경기 이후의 여성에서 가속화되고 관찰되며 에스트로겐 결핍에 기인한다. 이 양상은 해면질 골의 불균형적인 손실을 초래한다. 에스트로겐 감소로 인한 골다공증은 I형 골다공증으로 공지되어 있다. I형 골다공증의 주된 임상적 징후는 척추, 고관절부 및 전완 골절이다. 이들 징후의 골격 부위는 다량의 소주(小柱) 골을 함유한다. 골 전환(turnover)은 일반적으로 I형 골다공증에서 높다. 골 재흡수가 증가하지만, 부적절한 상보적인 골 형성이 존재한다. 골다공증은 또한 코르티코스테로이드 사용, 고정화 또는 장기간에 걸친 침대 휴식, 알콜중독, 당뇨병, 성선독성 화학요법, 프롤락틴과다증, 신경성 식욕부진증, 1차 및 2차 무월경, 이식조직 면역억제, 및 난소절제술과도 관련이 있어 왔다.
골다공증에서 골이 손실되는 메카니즘은 골격이 그 자체를 새것으로 만드는 과정의 불균형을 포함하는 것으로 여겨진다. 상기 과정은 골 리모델링(remodeling)으로 불려 왔다. 이는 일련의 불연속적인 활성 포켓에서 일어난다. 이들 포켓은 골 재흡수 부위로서 소정의 골 표면상의 골 기질내에서 자발적으로 나타난다. 파골세포(골 용해 또는 재흡수 세포)는 일반적으로 일정한 치수를 갖는 골 일부분의 재흡수에 관여한다. 이러한 재흡수 과정 이후에 조골세포(골 형성 세포)가 나타나고, 이어서 이는 파골세포가 남긴 공간을 새로운 골로 다시 채운다.
건강한 성인 대상에서, 파골세포 및 조골세포는 골 형성 및 골 재흡수가 균형잡히도록 하는 작용을 한다. 그러나, 골다공증에서는 골 리모델링 과정에 불균형이 생기고, 이러한 불균형은 골이 손실되는 속도보다 느린 속도로 골을 대체시킨다. 이러한 불균형은 나이를 먹음에 따라 대부분의 개체에서 다소 발생하지만, 폐경기후 골다공증에서, 난소절제술 후, 또는 의원성 상황(예컨대, 코르티코스테로이드 또는 면역억제제의 사용으로부터 초래되는 상황)에서는 훨씬 더 심각하고 보다 적은 연령에서 발생한다.
안드로겐, 플루오라이드 염, 및 부갑상선 호르몬 및 부갑상선 호르몬의 개질물 투여를 비롯하여, 골다공증으로 고생하는 인간에서 골 질량을 증가시키기 위한 다양한 접근법이 제안되어 왔다. 또한, 비스포스포네이트, 칼시토닌, 칼슘, 1,25-다이하이드록시 비타민 D3 및/또는 에스트로겐이 단독으로 또는 조합되어 기존의 골 질량을 보존시키는데 유용할 수 있는 것으로 제안되어 왔다.
본 발명은 15-리폭시게나제 억제제가 순골 형성을 증가시키고/시키거나 골 유착(accretion)을 향상시키고 골절 치유를 향상시킬 수 있다는 발견에 기초하고 있다. 이들 분자는 단독으로 전달되거나, 또는 골 재흡수를 억제하고/하거나 골 형성을 향상시키는 추가의 약제, 특히 동화작용제와 조합되어 전달될 수 있다.
따라서, 한 실시태양에서, 본 발명은 대상의 골 손실을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 약학적 효과량의 15-리폭시게나제 억제제를 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 효과량의 약학적으로 허용가능한 15-리폭시게나제 억제제를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 골 무기질 밀도를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 인간의 17번 염색체상의 다형성(polymorphism)을 검출하는, 특히 15-리폭시게나제 유전자내의 다형성을 검출하는 것을 포함하는, 대상에서 골 손실의 소인(predisposition)을 진단하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 15-리폭시게나제 억제제를 인간의 간엽 간세포(mesenchymal stem cell)와 접촉시키고, 골 형성에 관련된 세포로의 세포 분화를 측정함으로써, 골 손실을 감소시키거나 골 무기질 밀도를 증가시키기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 및 기타 양태는 하기의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조하면 명백해질 것이다. 또한, 다양한 참조문헌이 본원에 기재되어 있는데, 이는 특정한 방법 또는 조성물을 보다 상세히 기술하고 있고, 따라서 그 전체가 참고로 인용된다.
본 발명의 실시에서는, 달리 지적하지 않는 한, 당해 분야의 기술내에 있는 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기법 및 약리학의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예컨대, 문헌[T.E. Creighton, Proteins : Structures and Molecular Properties(W.H. Freeman and Company, 1993)], [A.L. Lehninger, Biochemistry(Worth Publishers, Inc., current addition)], [Sambrook, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual(2nd Edition, 1989)], [Methods In Enzymology(S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)], [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)], 및 [Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry 3rd Ed.(Plenum Press) Vols A and B(1992)]를 참조한다.
본원에 언급된 상기 또는 하기의 모든 공개, 특허 및 특허 출원은 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.
본 발명을 기술할 때 하기 용어가 사용될 것이며, 이는 하기에 나타낸 바와 같이 정의하고자 한다.
"골 손실"은 환자에서 바람직한 골보다 골을 더 적게 하는, 골 형성 대 골 재흡수 비율의 불균형을 의미한다. 골 손실은 골다공증, 절골술, 치근막염, 또는 보철의 느슨해짐으로부터 초래될 수 있다. 골 손실은 또한 글루코코르티코이드 유도 골다공증, 갑상선기능항진증 유도 골다공증, 고정화 유도 골다공증, 헤파린 유도 골다공증 또는 면역억제제 유도 골다공증을 포함하는 2차 골다공증으로부터 초래될 수도 있다. 골 손실은, 예컨대 후술되는 골 무기질 밀도 측정법을 사용하여 모니터링될 수 있다.
"효과량" 또는 "약학적 효과량"이라는 용어는 비독성이지만 목적하는 생물학적 결과를 제공하기에 충분한 약제의 양을 지칭한다. 그 결과는 질환의 징후, 증상 또는 원인의 감소 및/또는 완화이거나, 또는 생물학적 계의 임의의 다른 목적하는 변화일 수 있다. 예컨대, 치료적 용도를 위한 "효과량"은 골절 회복; 골다공증에서 골 손실의 반전; 연골 결함 또는 장애의 반전; 골다공증 개시의 예방 또는 지연; 골절 비결합부에서의 골 형성 및 신연형탈구(distraction) 골 형성의 자극 및/또는 증대; 보철 장치내로의 골 성장의 증가 및/또는 가속화; 및 치아 결함의 회복에서 치유 속도의 임상적으로 유의적인 증가를 제공하기 위해 본원에서 필요한, 활성 화합물을 포함하는 조성물의 양이다. 임의의 개체의 경우에 적절한 "효과"량은 당해 분야의 숙련자에 의해 통상적인 실험을 사용하여 결정될 수 있다.
"증가된 골 유착"이라는 용어는 본 발명의 15-리폭시게나제 억제제를 투여한 대상에서의 골 축적이 15-리폭시게나제를 투여하지 않은 필적하는 대상에서의 골 축적보다 증가됨을 의미한다. 본원에서 이러한 증가된 골 유착은 전형적으로 골 무기질 밀도(BMD)를 측정함으로써 측정된다. 예컨대, 골 유착은 난소가 절제된 마우스, 개 등과 같은 동물 모델을 사용하여 측정될 수 있다. 상기 동물에게 시험 화합물을 투여하고, I형 또는 II형 골다공증에서 통상적으로 감소되는 골(예컨대, 충수 및/또는 축상 골격의 골, 특히 척추를 비롯한 척주) 뿐만 아니라 긴 골(예컨대, 대퇴골, 중간 요골 및 원위 요골)의 단부에서 골 무기질 밀도(BMD)를 측정한다. BMD를 측정하기 위한 몇몇 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 예컨대, BMD 측정은 이중 에너지 X선 흡광계 또는 정량적 컴퓨터 단층촬영 등을 이용하여 수행 될 수 있다(실시예 참조). 유사하게, 증가된 골 형성은 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예컨대, 골 형성 속도(BFR)의 동적 측정은 정량적 디지털화 형태측정법을 사용하여 요부 척주 및 원위 대퇴골 골간단(metaphysis)으로부터의 테트라사이클린 표지된 해면질 골에서 수행될 수 있다(예컨대, 문헌[Ling et al., Endocrinology(1999) 140:5780-5788] 참조). 또한, 골 형성 마커, 예컨대 알칼리성 포스파타제 활성 및 혈청중 오스테오칼신 농도를 평가하여 증가된 골 형성이 일어났는지 여부를 간접적으로 결정할 수 있다(문헌[Looker et al., Osteoporosis International(2000) 11(6):467-480)] 참조).
"증가된 골 형성"은 본 발명의 15-리폭시게나제 억제제를 투여한 대상에서의 골 형성량이 15-리폭시게나제 억제제를 투여하지 않은 대상에서의 골 형성 속도보다 증가됨을 의미한다. 본원에서 이러한 향상된 골 형성은, 예컨대 정량적 디지털화 형태측정법을 사용하여 측정될 뿐만 아니라 상기한 바와 같은 기타의 골 형성 마커에 의해 측정된다.
"15-리폭시게나제 억제제"는 15-리폭시게나제를 1μM 미만, 바람직하게는 100nM 미만의 IC50으로 억제하는 화합물을 의미한다. IC50은 표준 방법에 의해 측정될 수 있다. 하나의 특정한 방법은 추정적 억제제를 15-리폭시게나제 효소와 함께 약 10분 동안 예비 항온처리한 후, 리놀레산 기질을 추가의 10분 동안 첨가하는 비색 분석법이다. 생성물인 13-HPODE는 pH 5에서 헤민의 존재하에 하이드로퍼옥실화 지질의 환원을 N-벤조일-류코메틸렌 블루상의 산화와 연계시킴으로써 정량화된다. 산화된 메틸렌 블루의 흡광도는 15-리폭시게나제에 의해 형성된 13-HPODE의 양에 정비례하고, 억제제의 존재 및 부재하에 측정될 수 있다. 이는 문헌["A Spectrophotometric Microtiter-Based Assay for the Detection of Hydroperoxy Derivatives of Linoleic Acid", Analytical Biochemistry, 201, 375-380(1992); Bruce J. Auerbach, John S. Kiely and Joseph A. Cornicelli]에 보다 상세히 기술된 종점 분석법이다. 기타 분석법으로는 234nm에서 공액 디엔의 형성을 측정함으로써 초기의 효소 반응 속도를 분광광도법으로 측정하는 분석법을 포함한다.
본원에서 사용되는 "치료한다" 또는 "치료"라는 용어는 혼용되어 사용되고, 골 손실 증상 진전의 연기 및/또는 진전되거나 진전될 것으로 예상되는 상기 증상의 심각성 감소를 의미한다. 상기 용어는 추가의 증상을 예방하고 증상의 기초가 되는 대사적 원인을 경감시키거나 예방하고/하거나 골 성장을 조장함을 추가로 포함한다.
"약학적으로 허용가능한" 또는 "약리학적으로 하용가능한"이라는 용어는 생물학적으로 또는 다른 방면에서 바람직한 물질, 즉 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하거나 투여 물질이 함유된 조성물의 성분 중 임의의 것과 해로운 방식으로 상호작용함이 없이 개체에 투여될 수 있는 물질을 의미한다.
"생리학적 pH" 또는 "생리학적 범위의 pH"는 약 7.2 내지 8.0 범위, 보다 전형적으로는 약 7.2 내지 7.6 범위의 pH를 의미한다.
본원에서 사용되는 "대상"이라는 용어는 포유동물 및 포유동물 이외의 동물을 포함한다. 포유동물의 예로는 포유류의 임의의 구성원, 즉 인간, 인간 이외의 영장류, 예컨대 침팬지 및 기타 유인원과 원숭이 종; 농장 동물, 예컨대 소, 말, 양, 염소, 돼지; 집 동물, 예컨대 토끼, 개 및 고양이; 설치류를 비롯한 실험실 동물, 예컨대 마우스 및 기니아 피그 등을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 포유동물 이외의 동물의 예로는 조류, 어류 등을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 상기 용어는 특정한 연령 또는 성을 나타내지는 않는다.
본원에서 사용되는 "다형성"이라는 용어는 한 집단에서 유전학적으로 결정된 2개 이상의 대체 서열 또는 대립유전자가 발생함을 지칭한다. 다형성 마커 또는 부위는 분기가 발생하는 좌(locus)이다. 바람직한 마커는 선택된 집단의 1%보다 큰 빈도, 보다 바람직하게는 10 또는 20%보다 큰 빈도로 각각 발생하는 2개 이상의 대립유전자를 갖는다. 다형성은 하나 이상의 염기 변화, 즉 삽입, 반복 또는 결실을 포함할 수 있다. 다형성 좌는 염기쌍 1개 정도로 작을 수 있다. 다형성 마커로는 제한 단편 길이의 다형성, 가변적인 수의 직렬적인 반복물(VNTR; variable number of tandem repeat), 과다가변적(hypervariable) 영역, 미니새틸라이트(minisatellite), 디뉴클레오티드 반복물, 트리뉴클레오티드 반복물, 테트라뉴클레오티드 반복물, 단순한 서열 반복물, 및 삽입 요소를 포함한다.
단일 뉴클레오티드 다형성(SNP; single nucleotide polymorphism)은 단일 뉴클레오티드가 점유하는 다형성 부위에서 발생하고, 이 부위는 대립유전자 서열 사이의 변이 부위이다. 상기 부위는 일반적으로 대립유전자의 고도로 보존된 서열(예컨대, 집단의 1/100 또는 1/1000 구성원 미만에서 변화되는 서열)이 선행 및 후행된다. 단일 뉴클레오티드 다형성은 일반적으로 다형성 부위에서 하나의 뉴클레 오티드가 다른 하나의 뉴클레오티드로 치환됨으로 인해 발생한다. 변이는 하나의 퓨린이 다른 하나의 퓨린으로 치환되거나 하나의 피리미딘이 다른 하나의 피리미딘으로 치환되는 것이다. 트랜스버전(transversion)은 퓨린이 피리미딘으로 치환되거나 피리미딘이 퓨린으로 치환되는 것이다. 단일 뉴클레오티드 다형성은 또한 기준 대립유전자에 대한 뉴클레오티드 결실 또는 뉴클레오티드 삽입으로 인해 발생할 수도 있다.
본원에서 사용되는 "전구체 세포"라는 용어는 충분히 분화되거나 분화 경로에 회부되지 않고, 일반적으로 마커를 발현하거나 충분히 분화된 성숙 세포로서 작용하지 않는 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "간엽 세포" 또는 간엽 간세포"라는 용어는 여러번 분화될 수 있고 자손이 연골, 골, 건, 인대, 골수 기질 및 연결 조직을 비롯한 골격 조직을 생성하게 되는 다능성 선조 세포를 지칭한다(문헌[A. Caplan J. Orthop. Res.(1991) 9:641-50] 참조).
본원에서 사용되는 "골원성(osteogenic) 세포"라는 용어는 조골세포 및 조골세포의 전구체 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 "정량적 특징 좌(QTL; Quantitative Trait Locus)라는 용어는 연속적으로 분포되고 다수의 유전자에 의해 측정될 수 있는, 골 무기질 밀도와 같은 표현형의 척도를 지칭한다. QTL은 대립유전자가 정량적 특징에 영향을 미치는 염색체상의 부위이다.
본 발명에서 사용되는 화합물은 15-리폭시게나제의 활성을 억제하거나 감소 시키는 화합물이다. 이와 관련하여, 효소 활성의 억제 및 감소는 효소, 세포 또는 대상을 시험 화합물로 처리하지 않은 대조 실험군에 비해 측정 활성의 수준이 낮음을 지칭한다. 특정한 실시태양에서, 측정 활성의 억제 또는 감소는 10% 이상의 감소 또는 억제이다. 당해 분야의 숙련자는 특정한 용도에는 적어도 20%, 50%, 75%, 90% 또는 100%, 또는 10%와 100% 사이의 임의의 정수의 측정 활성 감소 또는 억제가 바람직할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 전형적으로, 본 발명에서 사용되는 15-리폭시게나제 억제제는 IC50이 1μM 미만, 바람직하게는 100nM 미만이다.
본 발명은 15-리폭시게나제가 골 질량의 중요한 조절인자라는 발견에 부분적으로 기초하고 있다. 특히, 마우스에서 100 마이크로새틸라이트(microsatellite) 마커의 게놈 스캔에 의해 1, 2, 4 및 11번 염색체상의 골 손실 장애에 감수성인 좌가 동정되었다. 특히 11번 염색체상의 암호화된 유전자에 대한 유전자 발현에서의 차이는 15-리폭시게나제를 암호화하는 유전자 발현에서의 실질적인 차이를 확인시켜줌으로써 15-리폭시게나제의 발현을 골 무기질 밀도의 저하와 연계시켜주었다.
최대 골 질량은 골다공증에 의한 골절 위험의 주요 결정인자이다. 가족 및 쌍둥이 연구로 유전 인자가 골 무기질 밀도(BMD)를 조절함이 밝혀졌다(문헌[Stewart and Ralston, J. Endocr., (2000) 166:235-245)]에서 재검토됨). 여기서 발명자들은 BMD를 제어하는 좌를 동정하기 위해 쥐 유전 모델을 사용하였다. 2단계 방법을 사용하여 골 무기질 밀도를 조절하는 게놈 영역을 동정하였다. 초기에, 계산 방법 및 마이크로새틸라이트 마커를 사용하여 동물의 단일 뉴클레오티드 다형 성(SNP) 데이터베이스를 스캔하고, 골격 질량의 획득 및 유지에 기여한 염색체 영역을 예측하였다(실시예 1). 계속해서, 동물 모델을 사용하여 골격 질량의 획득 및 유지에 기여하는 유전자내의 돌연변이를 동정 및 확인하고(실시예 2), 15-리폭시게나제 유전자의 파괴가 BMD의 증가를 야기함을 증명하고(실시예 4), 이로써 15-리폭시게나제를 골 질량의 조절에 관련된 유전자로서 동정하였다.
15-리폭시게나제 활성을 억제하고 골 재흡수를 방지하거나 골 형성을 촉진시키는 화합물은 골다공증을 치료할 때 중요한 이점 내지 결과를 제공한다. 15-리폭시게나제를 억제하는 화합물은 파골세포의 골 재흡수 억제에 의해 또는 조골세포 분화의 자극 및 새로운 골 형성의 촉진에 의해 골다공증 또는 골관절염을 치료하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 실시예 3은 시험관내에서 인간의 간엽 간세포의 조골세포로의 분화를 촉진시키는 15-리폭시게나제 억제제의 능력을 증명한다. 실시예 4는 생체내의 15-리폭시게나제 유전자의 총체적인 파괴가 BMD의 증가를 가져옴을 증명한다. 실시예 5는 생체내 모델에서 골 형성을 촉진시키는 15-리폭시게나제 억제제의 능력을 증명한다.
본 발명에 따르면, 15-리폭시게나제 억제제는 효과량의 상기 15-리폭시게나제 억제제를 포함하는, 포유동물에서의 골 손실 감소용 약제를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 효과량의 15-리폭시게나제 억제제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 골 손실을 감소시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 골 손실은 골다공증, 골관절염, 파제트병(Paget's disease) 또는 치주질환과 관련된 것이다. 보다 바람직하게는, 골 손실은 골다공증과 관련된 것이 다.
상기에 더하여, 본 발명에 따르면, 15-리폭시게나제 억제제는 효과량의 상기 15-리폭시게나제 억제제를 포함하는, 포유동물에서의 골 무기질 밀도 증가용 약제를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 효과량의 15-리폭시게나제 억제제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 골 무기질 밀도를 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 15-리폭시게나제 억제제는 효과량의 상기 15-리폭시게나제 억제제를 포함하는, 포유동물에서의 골다공증 치료용 약제를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 효과량의 15-리폭시게나제 억제제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 골다공증을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 15-리폭시게나제 억제제는 인간의 조골세포를 증가시키는데 효과적인 양의 상기 15-리폭시게나제 억제제를 포함하는, 인간의 간엽 간세포의 조골세포로의 분화 촉진용 약제를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 인간의 조골세포를 증가시키는데 효과적인 양의 15-리폭시게나제 억제제를 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간의 간엽 간세포의 조골세포로의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 15-리폭시게나제 억제제는 IC50이 1μM 미만이다.
15-리폭시게나제 억제제에 의한 치료는 유합(union) 골절 및 유합결여(nonunion) 골절을 비롯한 골 골절 및 절골술을 치유하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 치료할 수 있는 골절의 유형으로는 외상성 및 골다공증성 골절 둘 다를 포함하는데, 예컨대 고관절부, 대퇴골경, 수관절, 척추, 척주, 늑골, 흉골, 후두 및 기관, 요골/척골, 경골, 슬개골, 쇄골, 골반, 상박골, 하지, 손가락 및 발가락, 얼굴, 및 발목의 골절을 포함한다. 유합결여 골절로서 남아 있을 골절의 유합 촉진 및 치유 속도 둘 다가 본원에 개시된 방법에 의해 촉진될 수 있다. 골절 위험이 있는 것으로 확인된 환자의 예방적 치료도 또한 상기 환자의 골절 위험을 감소시킬 수 있다.
따라서, 15-리폭시게나제 억제제는 효과량의 상기 15-리폭시게나제 억제제를 포함하는, 포유동물에서의 골절 발생률 감소용 약제를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 효과량의 15-리폭시게나제 억제제를 포유동물에게 투여함으로써 포유동물에서 골절 발생률을 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 15-리폭시게나제 억제제는 효과량의 상기 15-리폭시게나제 억제제를 포함하는, 포유동물에서의 골절 치유용 약제를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 효과량의 15-리폭시게나제 억제제를 포유동물에게 투여함으로써 포유동물에서 골절을 치유하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 기술된 방법 및 용도의 포유동물은 인간이다. 보다 바람직하게는, 상기 기술된 15-리폭시게나제 억제제는 IC50이 1μM 미만이다.
본 발명의 방법과 함께 사용할 수 있는 몇몇 15-리폭시게나제 억제제가 공지되어 있다. 그 억제제로는 합성 유기 분자, 식물 추출물 및 기타의 천연 생성물, 및 15-리폭시게나제에 대한 항체를 포함한다. 대표적인 비한정적 예는 문헌 [Cornicelli JA, Trivedi BK. 15-lipoxygenase and its inhibition: a novel therapeutic target for vascular disease. [Review][113 refs]. Current Pharmaceutical Design 1999; 5(1):11-20](다양한 카페산 유도체, 프로파길 에테르, 카테콜 및 벤조티오피라노인돌을 기술함), [Cornicelli JA. 15-lipoxygenase inhibitors as antiatherosclerotic agents. IDrugs 1998; 1(2):206-213], [Fleischer R, Frohberg P, Buge A, Nuhn P, Wiese M. QSAR analysis of substituted 2-phenylhydrazonoacetamides acting as inhibitors of 15-lipoxygenase. Quant Struct - Act Relat 2000; 19(2):162-172], [Kuhn H. Inhibitors of 12/15-lipoxygenase are potential anti-atherosclerotic drugs. Curr Opin Anti - Inflammatory Immunomodulatory Invest Drugs 1999; 1(3):227-237], [Mogul R, Johansen E, Holman TR. Oleyl sulfate reveals allosteric inhibition of soybean lipoxygenase-1 and human 15-lipoxygenase. Biochemistry 2000; 39(16):4801-4807], [Sexton K, Roark WH, Sorenson R, Cornicelli J, Sekerke C, Welch K. Thiourea inhibitors of 15-lipoxygenase. Abstracts of Papers American Chemical Society 1999; 218(1-2):MEDI0], [Tait BD, Dyer RD, Auerbach BJ, Bornemeier D, Guilds-Zamarka L, Oxender M et al. Catechol based inhibitors of 15-lipoxygenase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Vol 1996; 6(1):93-96], [Moreau RA, Agnew J, Hicks KB, Powell MJ. Modulation of lipoxygenase activity by bacterial hopanoids. Journal of Natural Products Vol 1997; 60(4):397-398], [219 th National Meeting of the American Chemical Society(2000), Poster BIOL -15. Authors: E-N-Jonsson and T-R-Holman. University of California, Santa Cruz, CA](쥐 해면에서 분리된 15-리폭시게나제 억제제를 기술함), 및 [Lyckander IM, Malterud KE. Lipophilic flavonoids from Orthosiphon spicatus as inhibitors of 15-lipoxygenase. Acta Pharm Nord 1992; 4(3):159-166]에 기술되어 있다. 또한, 15-리폭시게나제 억제제인 코너(Conner) 등에게 허여된 미국 특허 제 6,268,387 호의 티오우레아 및 벤즈아미드(예컨대, 3-아미노-N-(3,4-다이클로로페닐)-4-메톡시-벤즈아미드(화합물 3)로 대표됨) 뿐만 아니라, 2-페닐-벤조[d]아이소셀렌아졸-3-온(에브셀렌), 6,11-다이하이드로-5-티아-11-아자-벤조[a]플루오렌(본원에서 화합물 2로 명명됨) 및 페닐 아세틸렌성 화합물(3-(2-옥트-1-인일-페닐)-아크릴산(화합물 4)으로 대표됨)도 또한 본원에 기술된 방법에 유용하다. 화합물 6, 즉 [[[5-(5,6-다이플루오로-1H-인돌-2-일)-2-메톡시페닐]아미노]설포닐]-카밤산-아이소부틸 에스터를 비롯한, WO 01/96298(참고로 인용됨)에 개시된 화합물도 또한 유용하다.
추가의 15-리폭시게나제 억제제로는 하기에 나타낸 것들을 포함한다.
1) 문헌[222nd National Meeting of the American Chemical Society, Chicago, Illinois, USA, 26-30 August, 2001. Poster, MEDI 270]에 기술된
Figure 112006021208531-PAT00001
.
2) 문헌[218th ACS(New Orleans), 1999, MEDI 200]에 기술된 PD 148104
Figure 112006021208531-PAT00002
.
3) 파케 데이비스(Parke Davis)(현재는 화이자(Pfizer))로부터의 PD 146176.
4) WO 92/1682에 기술된 A 78773(애보트(Abbott)).
5) 문헌[6th Int Conf Prostaglandins(Florence), 1986, 328]에 기술된 QA-208-199(노바티스(Novartis))
Figure 112006021208531-PAT00003
.
본 발명의 관련 양태는 증가된 골 형성을 위한 15-리폭시게나제 억제제와 기타 활성제, 예컨대 비스포스포네이트, 에스트로겐, SERM(selective estrogen receptor modulator; 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자), 칼시토닌 또는 동화작용 치료제의 복합 치료법에 관한 것이다. 비스포스포네이트의 예로는 알렌드로네이트, 이반드로네이트, 파미드로네이트, 에티드로네이트 및 리세드로네이트를 포함한다. SERM의 예로는 랄록시펜, 다이하이드로랄록시펜 및 라소폭시펜을 포함한다. 칼시토닌으로는 인간 및 연어 칼시토닌을 포함한다. 대사작용제로는 부갑상선 호르몬(PTH), 예컨대 hPTH(1-34), PTH(1-84), 및 부갑상선 호르몬 관련 단백질(PTHrP) 및 그의 유사체를 포함한다. PTHrP의 특정한 유사체는 문헌["Mono- and Bicyclic Analogs of Parathyroid Hormone-Related Protein. 1. Synthesis and BiologicalStudies", Michael Chorev et al. Biochemistry, 36:3293-3299(1997) and "Cyclic analogs of PTH and PTHrP"], WO 96/40193, 미국 특허 제 5,589,452 호 및 WO 97/07815에 기술되어 있다. 기타 활성제는 15-리폭시게나제 억제제와 동 시에, 이전에 또는 이후에 투여될 수 있고, 상이한 전달 방법에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, 15-리폭시게나제 억제제가 먼저 투여된다. 상기 투여의 기간은 임의의 길이일 수 있지만, 전형적으로는 6 내지 24개월의 범위이다. 이어서, 상기 치료 후에 항흡수제, 예컨대 비스포스포네이트, SERM, 칼시토닌 또는 호르몬 대체 요법에 의해 치료된다.
따라서, 15-리폭시게나제 억제제는 추가의 활성제를 포함하여 상기 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 따라서, 상기 기술된 방법은 바람직하게는 추가의 활성제를 포함한다. 보다 바람직하게는, 용도 또는 방법에 포함되는 상기 활성제는 골로부터의 칼슘 재흡수를 조절하는데 효과적이다. 가장 바람직하게는, 상기 활성제는 에스트로겐, 칼시토닌, 비스포스포네이트 및 IGF(Insulin-like Growth Factor; 인슐린-양 성장 인자)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시태양에서, 상기 기술된 용도 및 방법의 15-리폭시게나제 억제제는 합성 유기 분자, 천연 생성물, 및 15-리폭시게나제에 대한 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직한 실시태양에서, 15-리폭시게나제 억제제는 3-(2-논-1-인일페닐)-프로피온산, 6,11-다이하이드로-5-티아-11-아자-벤조[a]플루오렌, 3-아미노-N-(3,4-다이클로로페닐)-4-메톡시벤즈아미드, 트랜스-3-(2-옥트-1-인일-페닐)-아크릴산 및 [[[5-(5,6-다이플루오로-1H-인돌-2-일)-2-메톡시페닐]아미노]설포닐]-카밤산-아이소부틸 에스터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 15-리폭시게나제를 암호화하는 게놈 DNA 또는 mRNA 분자의 임의의 서열에 특이적으로 결합하여 15-리폭시게나제 mRNA의 전 사 또는 번역을 방지할 수 있는 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 치료적 효과량으로 투여하는 것을 포함한다. "안티센스"는 특정한 핵산 서열의 "센스" 가닥에 상보적인 핵산 서열을 함유하는 조성물을 의미한다. 세포에 도입되면, 상보적인 뉴클레오티드는 세포에 의해 생성된 내인성 서열과 결합하여 듀플렉스(duplex)를 형성하고 전사 또는 번역을 차단한다. 예컨대, 문헌[Agrawal, S., ed.(1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ], [Alama et al.(1997) Pharmacol . Res . 36:171-178], [Crooke, S.T.(1997) Adv . Pharmacol . 40:1-49] 및 [Lavrosky et al.(1997) Biochem . Mol . Med . 62(1):11-22]를 참조한다. 안티센스 서열은 DNA, RNA, 또는 임의의 핵산 의사체 또는 유사체를 비롯한 임의의 핵산 물질일 수 있다. 예컨대, 문헌[Rossi et al.(1991) Antisense Res . Dev. 1:285-288], [Pardridge et al.(1995) Proc . Nat . Acad . Sci . 92:5592-5596], [Nielsen and Haaima(1997) Chem . Soc . Rev . 96:73-78] 및 [Lee et al.(1998) Biochemistry 37:900-1010]을 참조한다. 안티센스 서열의 전달은 다양한 방식으로, 예컨대 재조합 벡터를 사용한 세포내 전달을 통해 수행될 수 있다.
약 15 내지 25 핵산 염기의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 용이하게 합성되고 목적하는 억제 효과를 나타낼 수 있기 때문에 전형적으로 바람직하다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 분자 유사체도 또한 상기 목적을 위해 사용될 수 있고, 이는 약학 제품에 유리한 안정성, 분포성 또는 제한된 독성과 같은 부가된 이점을 가질 수 있다. 또한, 철 결합된 에틸렌다이아민-테트라아세트산(EDTA-Fe)과 같은 화학 반응성 기를 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착시켜 하이브리드화 부위에서 RNA를 분해시킬 수 있다. 유전자의 시험관내 번역을 억제하기 위한 안티센스 방법의 상기 및 기타 용도는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예컨대, 문헌[Marcus-Sakura(1988) Anal . Biochem . 172:289]를 참조한다.
다수의 15-리폭시게나제 억제제가 본원에 기술되고 공지되어 있지만, 다른 많은 15-리폭시게나제 억제제도 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 것으로 이해한다. 본원에 기술된 방법은 현재 공지된 15-리폭시게나제 억제제 뿐만 아니라 이후에 발견되는 것들의 사용도 포함하고자 한다. 본원에 기술된 분석법 및 당해 분야의 숙련자에게 공지된 분석법에 의해, 골 손실을 예방하거나 치료하는데 유용한 기타의 15-리폭시게나제 억제제를 쉽게 동정하고 개발할 수 있다.
실시예에 제시된 바와 같이, 11번 염색체에서 유전적 이상 또는 대립유전자가 발견되었고, 상기 대립유전자의 위치는 15-리폭시게나제에 대한 유전자에 상응하였다. 따라서, 15-리폭시게나제의 억제 또는 유도는 다양한 상황에서 용도를 갖는다. 15-리폭시게나제를 세포내에서 억제함으로써, 골 전환을 감소시켜 골 무기질 밀도 및 골의 질을 증가시키는 것이 가능하다. 따라서, 15-리폭시게나제의 억제는, 예컨대 골다공증 및 골관절염에서 발생하는 골의 과다한 재흡수를 치료하거나 예방하기 위한 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 15-리폭시게나제 억제제는 또한 시험관내 또는 생체외에서 골 형성 세포 또는 그의 전구체의 성장을 자극하거나 골 형성 세포 전구체의 분화를 유도하는데 사용될 수도 있다. 보다 구체적으로, 15-리폭시게나제 억제제는 골수 간엽 세포를 함유하는 세포 집단을 자극하여 그 세포 집단에서 골원성 세포의 수를 증가시키는데 유용하다. 바람직한 방법에서는, 15-리폭시게나제 억제제로 처리하기 전 또는 후에 조혈 세포를 세포 집단으로부터 제거한다. 이러한 방법의 실시를 통해, 골원성 세포가 확대될 수 있다. 확대된 골원성 세포는 이의 주입(또는 재주입)이 필요한 대상의 척추내로 주입(또는 재주입)될 수 있다. 예컨대, 대상 자신의 간엽 간세포를 생체외에서 본 발명의 화합물에 노출시킬 수 있고, 생성된 골원성 세포는 대상내의 목적하는 부위(면역거부 없이 골원성 세포의 추가의 증식 및/또는 분화가 일어날 수 있는 부위)에 주입되거나 보내질 수 있다. 또한, 15-리폭시게나제 억제제에 노출된 세포 집단은 사망하지 않은 인간 태아의 조골세포 또는 골원성 세포일 수도 있다. 이러한 세포가 대상의 척추에 주입되거나 이식되는 경우, 이들 비자기 세포를 면역보호하거나 피이식물을 면역억제하여(바람직하게는 국소적으로) 이식 및 골 또는 연골 복원을 향상시킬 수도 있다.
치료의 효율성은 대상에서 15-리폭시게나제의 양을 측정하는 것을 포함하는, 대상에서 상기 기술된 용도 및 방법의 효능을 모니터링하는 방법에 의해 추적될 수 있고, 이 방법도 또한 본 발명에 의해 제공된다.
골 손실을 예방하고/하거나 골 형성을 촉진시킬 수도 있는 15-리폭시게나제 억제제류를 동정하기 위한 몇몇 방법이 사용될 수 있다. 15-리폭시게나제 활성을 억제하는 화합물을 동정하는데 사용되는 하나의 방법은 15-리폭시게나제를 함유하는 세포, 조직, 또는 바람직하게는 세포 추출물 또는 기타 제제를 15-리폭시게나제 활성과 상용성인 완충액중에서 몇몇 기지 농도의 시험 화합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 시험 화합물의 각 농도에 대한 15-리폭시게나제 활성의 양을 효소 생성 물의 정량화에 의해 측정하고, 화합물에 대한 IC50(샘플 제제에 대해 관찰된 활성이 그의 최초 또는 대조 값의 절반이 되는 것으로 관찰될 때의 시험 화합물 농도)을 표준 기법을 사용하여 측정한다. 15-리폭시게나제에 대한 본 발명 화합물의 억제 농도를 측정하기 위한 다른 방법은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있고, 본원의 개시내용에 기초하여 명백해지는 바와 같이 사용될 수 있다. 15-리폭시게나제 억제제를 동정하는데 사용될 수 있는 특정한 분석법으로는 미국 특허 제 6,268,387B1 호 및 제 5,958,950 호(토끼 망상적혈구 분석법), 및 미국 특허 제 4,623,661 호(RBL-1 세포내의 방사선표지된 아라키돈산)에 기술된 것을 포함한다.
예컨대, 리간드가 구조적으로 정의되었다면 길항제가 통상적으로 발견될 수 있다. 생리학적으로 반응성인 세포를 사용하는 고도로 자동화된 분석 방법을 개발하면, 잠재적인 리간드 유사체의 시험이 가능하다. 특히, 본원에 기술된 스크리닝 기법을 사용함으로써 새로운 작용제 및 길항제가 발견될 것이다.
또 다른 방법에서는, 케모킨, 기타 작동물질(effector) 또는 유사체, 또는 수용체의 분자 형상에 관한 구조적 연구에 기초한 합리적 약물 설계를 이용하여, 3차원 구조가 15-리폭시게나제의 활성 부위의 3차원 구조에 상보적인 화합물을 동정할 수 있다. 이들 화합물은 분자 역학 계산, 분자 동력학 계산, 구속물질(constraint)을 NMR 분광법에 의해 결정하는 구속된 분자 동력학 계산, 거리 행렬을 NMR 분광법에 의해 부분적으로 결정하는 거리 기하학, X선 회절법, 또는 중성자 회절 기법을 비롯한 다양한 기법에 의해 측정될 수 있다. 이들 모든 기법의 경우 에, 구조는 15-리폭시게나제와 상호작용하는 것으로 공지된 임의의 리간드의 존재 또는 부재하에 측정될 수 있다.
상기 컴퓨터 프로그램으로는 AMBER(미국 샌프란시스코 소재의 유니버시티 오브 캘리포니아(University of California)로부터 입수가능), CHARMM(Chemistry at HARvard Molecular Mechanics, 하버드 유니버시티(Harvard University)로부터 입수가능), MM2, SYBYL(트라이포스 인코포레이션(Trypos Inc.)), CHEMX(케미칼 디자인(Chemical Design)), MACROMODEL, GRID(몰레큘러 디스커버리 리미티드(Molecular Discovery Ltd.)) 및 Insight II(액셀릴(Accelryl))를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 상기 프로그램은 물 분자와 같은 용매 분자로 둘러싸이거나 분리된 두 분자 사이의 화학적 상호작용을 측정하는데 유용하거나, 상호작용 분자를 용매화하는 효과에 접근하는 계산을 사용하는 것으로 고려된다. 두 분자의 상대적 배향은 수동으로 결정되거나 육안 검사로 결정되거나 또는 다수의 가능한 배향을 생성하는 다른 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 컴퓨터 프로그램의 예로는 DOCK 및 AutoDOCK을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 각 배향은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 그의 상보성 정도가 검사될 수 있다. 이렇게 하여, 15-리폭시게나제를 억제할 수 있는 신규 화합물이 설계될 수 있다.
15-리폭시게나제를 억제할 수 있는 화합물을 동정하기 위한 또 다른 방법은 UV/VIS 분광법, 편광법, CD 또는 ORD 분광법, IR 또는 라만(Raman) 분광법, NMR 분광법, 형광 분광법, HPLC, 겔 전기영동, 모세관 겔 전기영동, 투석, 굴절률측정법, 전도성측정법, 원자력 현미경, 폴라로그래피(polarography), 다이일렉트로메트리 (dielectometry), 열량측정법, 용해도, EBR 또는 질량 분광법과 같은 기법의 사용을 포함한다. 이들 방법의 적용은 직접적일 수 있거나(15-리폭시게나제와 화합물의 상호작용이 직접 측정됨), 간접적일 수 있다(유용한 분광 특성을 갖는 특정한 약제가, 예컨대 치환 또는 형광 소광에 의해 15-리폭시게나제에 결합하는 기타 화합물의 능력에 대한 프로브로서 사용됨).
따라서, 본 발명은 화합물을 15-리폭시게나제와 접촉시키고, 화합물의 15-리폭시게나제 활성 억제 여부를 결정하는 것을 포함하는, 골 무기질 밀도를 증가시키는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 골 형성에 대한 화합물의 효과를 입증하는 기능적 검정법으로 화합물을 시험하는 것을 추가로 포함한다. 보다 바람직하게는, 기능적 검정법은 화합물을 인간의 간엽 간세포와 접촉시키고, 골 형성 세포로의 세포 분화를 측정하는 것을 포함한다. 또 다른 보다 바람직한 실시태양에서, 기능적 검정법은 화합물을 인간 이외의 동물에게 투여하고, 골 형성 지수를 측정하는 것을 포함한다. 가장 바람직한 실시태양에서, 측정되는 지수는 골 무기질 밀도이다. 또 다른 가장 바람직한 실시태양에서, 상기 지수는 골의 생체역학적 파라미터이다.
또 다른 가장 바람직한 실시태양에서, 기능적 검정법은 화합물을 인간의 간엽 간세포와 접촉시키고, 골 형성 세포로의 세포 분화를 측정하는 것을 포함하고, 이 때 세포 분화의 측정은 알칼리성 포스파타제 분석, 칼슘 분석, 전체 DNA 제조 분석 또는 이들의 조합법을 수행하는 것을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 15-리폭시게나제 억제제를 인간의 간엽 간 세포와 접촉시키고, 골 형성 세포로의 세포 분화를 측정하는 것을 포함하는, 골 무기질 밀도를 증가시키는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 세포 분화의 측정은 알칼리성 포스파타제 분석, 칼슘 분석, 전체 DNA 제조 분석 또는 이들의 조합법을 수행하는 것을 포함한다.
계속해서, 이렇게 동정되거나 설계된 15-리폭시게나제 억제제는 골 손실을 억제하고/하거나 골 형성을 촉진시키는 능력에 대해 시험할 수 있다. 한 실시태양에서는, 상기에서 논의한 컴퓨터에 기초한 방법이 사용된다. 또 다른 방법에서는, 화합물을, 골 손실에 대한 공지된 표적, 예컨대 에스트로겐 수용체, 종양 괴사 인자 수용체, 인테그린 수용체 등을 조절하는 능력에 대해 시험한다. 또 다른 방법에서는, 화합물을, 간세포를 골 세포로 분화시키는 능력에 대해 시험한다.
본원에 기술된 방법은 상기 기술된 분자를 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및 선택적으로 다른 치료 및/또는 예방 성분과 함께 포함하는 약학 조성물을 사용한다. 상기 담체로는 물, 염수, 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜, 하이알루론산, 에탄올 등과 같은 액체를 포함한다. 비액체 제형에 적합한 담체도 또한 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 본 발명에 사용될 수 있고, 예컨대 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등과 같은 무기산염; 및 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염, 벤조산염 등과 같은 유기산염을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 부형제 및 염에 관한 자세한 논의는 문헌[Remington's Pharmaceutiual Sciences, 18th Edition(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)]에서 입수할 수 있다.
또한, 습윤 또는 유화제, 생물학적 완충 물질, 계면활성제 등과 같은 보조 물질이 상기 담체내에 존재할 수도 있다. 실질적으로 생물학적 완충제는 약학적으로 허용가능하고 목적하는 pH, 즉 생리학적으로 허용가능한 범위의 pH를 갖는 제형을 제공하는 임의의 용액일 수 있다. 완충 용액의 예로는 염수, 인산염 완충 염수, 트리스(Tris) 완충 염수, 행크(Hank) 완충 염수 등을 포함한다.
의도된 투여 방식에 따라, 약학 조성물은 고체, 반고체 또는 액체 투여 형태, 예컨대 정제, 좌약, 환제, 캡슐, 분말, 액체, 현탁액, 크림, 연고, 로션 등의 형태일 수 있고, 바람직하게는 정확한 투여량의 1회 투여에 적합한 단위 투여 형태일 수 있다. 상기 조성물은 효과량의 선택된 약물을 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 포함할 것이며, 기타 약제, 보조제, 희석제, 완충제 등을 포함할 수도 있다.
고체 조성물의 경우, 통상적인 비독성 고체 담체로는 예컨대 약학 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 탈크, 셀룰로즈, 글루코즈, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 약학적으로 투여가능한 액체 조성물은 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 활성 화합물 및 선택적인 약학 보조제를 부형제, 예컨대 물, 염수, 수성 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등에, 예컨대 용해시키거나 분산시켜 용액 또는 현탁액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 필요에 따라, 투여될 약학 조성물은 또한 미량의 비독성 보조 물질, 예컨대 습윤 또는 유화제, pH 완충제 등, 예컨대 아세트산나트륨, 소비탄 모노라우레이트, 트라이에탄올아민 나트륨 아세테이트, 트라이에탄올아민 올레에이트 등을 함유할 수 있다. 상기 투여 형태를 제조 하는 실제 방법은 공지되어 있거나 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이다(예컨대, 상기 언급한 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences] 참조).
경구 투여의 경우, 조성물은 일반적으로 정제, 캡슐 또는 소프트겔 캡슐의 형태를 취하거나 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 또는 시럽일 수 있다. 바람직한 경구 투여 형태는 정제 및 캡슐이다. 경구용의 정제 및 캡슐은 일반적으로 1종 이상의 통상적으로 사용되는 담체, 예컨대 락토즈 및 옥수수 전분을 포함할 것이다. 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제도 또한 전형적으로 첨가된다. 액체 현탁액이 사용되는 경우, 활성제는 유화 및 현탁제와 조합될 수 있다. 필요에 따라, 향료, 착색제 및/또는 감미료도 또한 첨가될 수 있다. 본원에서 경구 제형에 혼입하기 위한 다른 선택적인 성분으로는 보존제, 현탁제, 증점제 등을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
비경구 제형은 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전에 액체에 현탁시키거나 가용화시키기에 적합한 고체 형태로서, 또는 유화액으로서 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 주사용 멸균 현탁액은 적합한 담체, 분산 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 당해 분야에 공지된 기법에 따라 제형화된다. 주사용 멸균 제형은 또한 비경구적으로 허용가능한 비독성 희석제 또는 용매중의 주사용 멸균 용액 또는 현탁액일 수도 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매에는 물, 링거(Ringer) 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정유, 지방산 에스터 또는 폴리올이 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 또한, 비경구 투여는 일정한 수준의 투여량이 유지되도록 서방성 또는 지속 방출 시스템의 사 용을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 직장 투여를 위한 좌약의 형태로 투여될 수도 있다. 이들은 실온에서는 고체이지만 직장 온도에서는 액체이어서 직장내에서 용융되어 약물을 방출하게 되는 적합한 비자극성 부형제와 약제를 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이러한 물질로는 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수도 있다. 이러한 조성물은 약학 제형의 분야에서 널리 공지된 기법에 따라 제조되고, 벤질 알콜 또는 기타의 적합한 보존제, 생체이용률을 향상시키는 흡수 촉진제, 추진제(예컨대, 플루오로카본 또는 질소), 및/또는 기타의 통상적인 가용화 또는 분산제를 사용하여 염수중의 용액으로서 제조될 수도 있다.
국소적인 약물 전달에 바람직한 제형은 연고 및 크림이다. 연고는 전형적으로 바셀린 또는 기타의 바셀린 유도체를 기재로 하는 반고체 제제이다. 선택된 활성제를 함유하는 크림은 당해 분야에 공지된 바와 같이 점성의 액체 또는 반고체 유화액(수중유 또는 유중수)이다. 크림 베이스는 물로 세척가능하고, 오일상, 유화제 및 수성상을 함유한다. 때때로 "내부상"으로로 불리는 오일상은 일반적으로 바셀린 및 지방 알콜(예컨대, 아세틸 또는 스테아릴 알콜)로 이루어지고, 수성상은 반드시 그런 것은 아니지만 통상적으로 부피에 있어서 오일상보다 크며, 일반적으로 습윤제를 함유한다. 크림 제형내의 유화제는 일반적으로 비이온성, 음이온성, 양이온성 또는 양쪽성 계면활성제이다. 사용되는 특정한 연고 또는 크림 베이스 는, 당해 분야의 숙련자가 알 수 있는 바와 같이, 최적의 약물 전달을 제공하게 되는 베이스이다. 다른 담체 또는 비히클과 마찬가지로, 연고 베이스는 불활성이고 안정하고 비자극성이며 비감작성이어야 한다.
구강 투여용 제형으로는 정제, 로젠지, 겔 등을 포함한다. 또한, 구강 투여는 당해 분야의 숙련자에게 공지된 바와 같은 경점막 전달 시스템을 사용하여 수행될 수도 있다. 본 발명의 화합물은 또한 통상적인 경피 약물 전달 시스템, 즉 신체 표면에 고정될 약물 전달 장치로서 작용하는 적층 구조물내에 약제가 전형적으로 함유되는 경피 "패치"를 사용하여 피부 또는 점막 조직을 통해 전달될 수도 있다. 상기 구조물에서, 약물 조성물은 전형적으로 상부 배면층 아래에 놓인 층 또는 "저장소"에 함유된다. 적층 장치는 단일 저장소를 함유할 수도 있고 다수의 저장소를 함유할 수도 있다. 한 실시태양에서, 저장소는 약물 전달 동안 상기 시스템을 피부에 고정시키는 작용을 하는 약학적으로 허용가능한 접촉 접착제 물질의 중합체 매트릭스를 포함한다. 적합한 피부 접촉 접착제 물질의 예로는 폴리에틸렌, 폴리실록산, 폴리아이소부틸렌, 폴리아크릴레이트, 폴리우레탄 등을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 약물 함유 저장소 및 피부 접촉 접착제는 분리된 별개의 층으로서 존재하고, 접착제는 저장소 아래에 놓이며, 이 경우 저장소는 상기한 바와 같은 중합체 매트릭스이거나, 액체 또는 겔 저장소이거나, 또는 어떤 다른 형태를 취할 수 있다. 장치의 상부 표면으로서 작용하는, 이들 적층물내의 배면층은 적층 구조물의 주요 구조적 요소로서 기능하고 장치에 그 가요성의 많은 부분을 제공한다. 배면층을 위해 선택된 물질은 활성제 및 존재하는 임의의 다 른 물질에 대해 실질적으로 불투과성이어야 한다.
약학적 또는 치료적 효과량의 조성물이 대상에게 전달될 것이다. 정확한 효과량은 대상에 따라 달라질 것이며, 종, 연령, 대상의 크기 및 건강, 치료되는 질병의 성질 및 정도, 치료 의사의 권장, 및 투여를 위해 선택된 치료제 또는 치료제의 조합에 좌우될 것이다. 따라서, 주어진 상황에 효과적인 양은 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 일반적으로 치료적 양은 약 0.05 내지 약 40mg/kg 체중, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 약 20 mg/kg 체중의 범위(1회 이상 투여시)일 것이다. 보다 큰 포유동물에서, 지시되는 일일 투여량은 약 1 내지 100mg(1일 1회 이상), 보다 바람직하게는 약 10 내지 50mg의 범위이다. 대상은 당해 질병의 징후, 증상 또는 원인을 감소 및/또는 완화시키거나 생물학적 계의 임의의 다른 목적하는 변화를 가져오는데 필요한 만큼 많은 투여량으로서 투여될 수 있다.
예컨대 15-리폭시게나제 안티센스 올리고뉴클레오티드를 전달하기 위한 폴리뉴클레오티드의 전달은 상기한 제형 중 임의의 것을 사용하여 달성되거나, 보균 바이러스 또는 입자를 함유하거나 함유하지 않는 재조합 발현 벡터를 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예컨대, 미국 특허 제 6,214,804 호, 제 6,147,055 호, 제 5,703,055 호, 제 5,589,466 호, 제 5,580,859 호 및 문헌[Slater et al.(1998) J. Allergy Clin . Immunol . 102:469-475]를 참조한다. 예컨대, 폴리뉴클레오티드 서열의 전달은 레트로바이러스 및 아데노-결합된 바이러스 벡터를 비롯한 다양한 바이러스성 벡터를 사용하여 달성될 수 있다. 예컨대, 문헌[Miller A. D.(1990) Blood 76:271] 및 [Uckert and Walther(1994) Pharmacol . Ther . 63:323-347]을 참조한다. 안티센스 유전자 치료법에 이용될 수 있는 벡터로는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 또는 바람직하게는 RNA 바이러스(예컨대, 레트로바이러스)를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드 서열을 표적 세포에 전달하기 위해 사용될 수 있는 다른 유전자 전달 메카니즘으로는 콜로이드성 분산액 및 리포솜-유도 시스템, 인공 바이러스 엔벨로프(envelope), 및 당해 분야의 숙련자에게 입수가능한 다른 시스템을 포함한다. 예컨대, 문헌[Rossi, J.J.(1995) Br . Med . Bull . 51:217-225], [Morris et al.(1997) Nucl . Acids Res . 25:2730-2736] 및 [Boado et al.(1998) J. Pharm. Sci . 87:1308-1315]를 참조한다. 예컨대, 전달 시스템은 거대분자 착체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 지질계 시스템(수중유 유화액, 미셀(micell), 혼합 미셀 및 리포솜을 포함함)을 사용할 수 있다.
상기 논의한 바와 같이, 약학 제형은 칼슘 항상성을 효과적으로 조절하는 1종 이상의 활성제를 함유할 수 있다. 추가의 활성제는 에스트로겐, 칼시토닌, 비스포스포네이트(예컨대, 알렌드로네이트, 레시드로네이트, 졸렌드로네이트 및 이반드로네이트), 비타민 D3 또는 그의 유사체, 안드로겐, 플루오라이드 염, 부갑상선 호르몬 또는 그의 유사체, IGF, 골 대사에 관련된 천연발생 호르몬 조절인자의 전사 조절을 변경시키는 약제, 및 이들의 조합일 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 추가의 활성제는 본 발명의 15-리폭시게나제 억제제의 투여 이전에, 동시에 또는 이후에 대상에게 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 15-리폭시게나제 유전자내의 다형성과 골 무기질 밀도의 상관관계를 발견한 것에 기초하고 있는데, 즉 특정한 다형성의 존재는 골 무기질 밀도의 감소와 상관관계가 있다. 상기 발견의 추가의 양태는 유전자형이 골다공증의 소인과 상관관계가 있다는 것이다. 본 발명은 유전자형의 존재에 대해 스크리닝함으로써 이러한 유전적 소인을 가질 것 같은 개체를 동정할 수 있다는 점에서 유리하다. 따라서, 본 발명의 추가의 양태는 개체를 골 손실의 소인에 대해 스크리닝하고, 소인이 동정되면 개체를 치료하여 골 손실을 지연 또는 감소시키거나 예방하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 진단 및 예후 방법에 따르면, 야생형 15-리폭시게나제 좌의, 코딩 및 비코딩 영역내의 결실, 삽입 및 점돌연변이를 비롯한 변화를 검출한다. 따라서, 예컨대 마우스에서는 11번 염색체상의 변화를 검출하는 것이 바람직한 반면, 인간에서는 17번 염색체상의 변화를 검출한다. 또한, 상기 방법은 야생형 15-리폭시게나제 좌를 검출하고, 15-리폭시게나제 좌에 골 손실 장애의 소인이 없음을 확인함으로써 수행될 수 있다. 상기 돌연변이는 골 손실의 증상이 있는 개체 또는 없는 개체에 존재할 수 있다. 또한, 15-리폭시게나제 좌에 돌연변이를 갖는 증상이 있는 개체는 그렇지 않은 개체와 비교할 때 약물 반응 또는 예후에 차이가 있을 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 양태는 15-리폭시게나제 유전자의 유전자형을 결정하는 것을 포함하는 진단 방법을 제공한다. 전형적으로, 상기 방법은 개체가 15-리 폭시게나제 유전자 다형성에 대해 동형접합성인지 이형접합성인지 여부를 결정한다. 전형적으로는, 본 발명의 상기 방법을 개체 세포의 시험관내 분석에 의해 수행하여 15-리폭시게나제 유전자 좌에 있는 상기 개체의 유전자형을 결정한다.
유용한 진단 기법으로는 당해 분야에 널리 공지된 바와 같은, 마이크로어레이 분석, 형광성 원위치 하이브리드화(FISH; fluorescent in situ hybridization), 직접적 DNA 스크리닝, PFGE 분석, 써던 블롯 분석, 단일가닥 구조 분석(SSCA; single stranded conformation analysis), RNase 보호 분석, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드(ASO) 분석, 도트 블롯 분석 및 PCR-SSCP를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
골 손실 질환의 소인은 인간 환자와 같은 대상의 임의의 조직을 15-리폭시게나제 유전자의 돌연변이에 대해 시험함으로써 확인될 수 있다. 예컨대, 젬라인(germline) 15-리폭시게나제 돌연변이가 유전된 사람은 골 손실 질환을 발병시키기 쉬울 것이다. 이는 사람 신체의 임의의 조직으로부터 얻은 DNA를 시험함으로써 측정될 수 있다. 가장 간단하게는, 혈액을 뽑아서 혈액 세포로부터 DNA를 추출할 수 있다. 또한, 산전 진단은 태아 세포, 태반 세포 또는 양막 세포를 15-리폭시게나제 유전자의 돌연변이에 대해 시험함으로써 수행될 수 있다. 예컨대 점돌연변이에 의한 것이든 결실에 의한 것이든 야생형 15-리폭시게나제 대립유전자의 변화는 본원에 논의된 수단 중 임의의 것에 의해 검출될 수 있다.
DNA 서열 변이를 검출하는데 사용될 수 있는 방법은 몇 가지가 있다. 직접적 DNA 서열화(수동 서열화 또는 자동화 형광 서열화)는 서열 변이를 검출할 수 있 다. 또 다른 접근법은 단일가닥 구조 다형성 검정법(SSCA; single-stranded conformation polymorphism assay)인데, 여기서는 SSCA 겔상의 전위된 이동성을 갖는 단편을 서열화하여 DNA 서열 변이의 정확한 특징을 결정한다. 2개의 상보적 DNA 가닥 사이의 부정합 검출에 기초한 다른 접근법으로는 클램핑된 변성화 겔 전기영동(CDGE; clamped denaturing gel electrophoresis), 헤테로듀플렉스 분석(HA; heteroduplex analysis) 및 화학적 부정합 분할(CMC; chemical mismatch cleavage)을 포함한다. 일단 돌연변이가 공지되면, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드(ASO) 하이브리드화와 같은 대립유전자 특이적 검출법을 이용하여 다수의 다른 샘플을 동일한 돌연변이에 대해 신속히 스크리닝할 수 있다(예컨대, 문헌[Saiki et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 86:6230-6234(1989)] 참조).
점돌연변이의 검출은 당해 분야에 널리 공지된 기법을 사용하여 15-리폭시게나제 대립유전자(들)의 분자 클로닝 및 대립유전자(들)의 서열화에 의해 달성될 수 있다. 또한, 유전자 서열은 공지된 기법을 사용하여 조직으로부터의 게놈 DNA 제조로부터 직접 증폭될 수 있다. 이어서, 증폭된 서열의 DNA 서열을 결정할 수 있다. 대립유전자의 존재는 당해 분야에 널리 공지된 바와 같은, 단일가닥 구조 분석(SSCA), 변성화 구배 겔 전기영동(DGGE 또는 CDGE), RNase 보호 분석, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드(ASO), 대립유전자 특이적 PCR, 또는 단일 뉴클레오티드 연장 분석에 의해 확인될 수 있다.
바람직한 방법에서는, 대립유전자가 마이크로칩 기술을 사용하여 동정된다. 상기 기법에서는, 수천개의 별개의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 유전자가 합성 되거나(맥갈(Mcgall) 등의 미국 특허 제 5,412,087 호), 실리콘 또는 유리 칩상에 배열물로서 스폿팅될 수 있다(샬론(Shalon) 등의 미국 특허 제 6,110,426 호). 분석할 핵산은 일반적으로 형광 표지되고 칩상의 프로브에 하이브리드화된다. 다른 표지로는 32P 및 바이오틴을 포함한다. 또한, 이들 마이크로에레이를 사용하여 핵산-단백질 상호작용을 연구하는 것도 가능하다. 이러한 기법을 사용하여, 15-리폭시게나제 유전자내의 돌연변이 존재를 동정한다.
변화된(또는 돌연변이) 15-리폭시게나제 유전자의 존재는 골 손실 질환의 위험성 증가와 상관관계가 있다. 15-리폭시게나제 유전자 돌연변이를 검출하기 위해, 생물학적 샘플을 제조하고, 분석되는 15-리폭시게나제 대립유전자의 서열과 야생형 15-리폭시게나제 대립유전자의 서열 사이의 차이에 대해 분석한다. 이어서, 돌연변이 대립유전자를 서열화하여 특정한 돌연변이 대립유전자의 특이적 돌연변이를 동정할 수 있다. 이어서, 특히 마우스의 경우 11번 염색체, 인간의 경우 17번 염색체상의 15-리폭시게나제 유전자의 돌연변이를 본 발명의 진단 및 예후 방법에 사용한다.
따라서, 본 발명은 또한 골 손실의 소인을 나타내는 인간의 17번 염색체상의 다형성을 검출하는 것을 포함하는, 대상에서 골 손실의 소인을 진단하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 검출은 지노타이핑을 포함한다. 보다 바람직한 실시태양에서, 상기 지노타이핑은 마이크로새틸라이트 마커 또는 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성으로 이루어진다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 대상의 15-리폭시게나제 유전자내의 다형성을 검출하는 것을 포함하는, 대상에서 골 손실의 소인을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 골 손실을 예방하는 치료 활성 물질로서 사용하기 위한 15-리폭시게나제 억제제를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 기술된 방법에 의해 동정된 화합물을 제공한다. 또한, 상기 기술된 화합물 및 담체를 포함하는, 특히 골 손실을 예방하기 위한 약학 조성물이 제공된다. 또한, 골 손실과 관련된 15-리폭시게나제 유전자내의 다형성을 검출하기 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 골 손실의 소인을 진단하기 위한 키트도 제공된다.
최종적으로, 특히 후술하는 실시예와 관련하여 실질적으로 본원에 기술된 바와 같은 화합물, 방법, 용도, 조성물 및 키트도 또한 특허청구된다.
[실시예]
이하는 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 실시태양의 예이다.
본 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 어떤 식으로든 본 발명의 범주를 한정하고자 하는 것은 아니다.
Figure 112006021208531-PAT00004
Figure 112006021208531-PAT00005
화합물 1, 즉 3-(2-논-1-인일페닐)-프로피온산은 미국 특허 제 5,972,980 호에 기술되어 있다.
화합물 2, 즉 6,11-다이하이드로-5-티아-11-아자-벤조[a]플루오렌은 W0 97/12613에 기술되어 있다.
화합물 3, 즉 3-아미노-N-(3,4-다이클로로페닐)-4-메톡시벤즈아미드는 W0 99/32433에 기술되어 있다.
화합물 4, 즉 트랜스-3-(2-옥트-1-인일-페닐)-아크릴산은 미국 특허 제 4,713,486 호에 기술되어 있다.
화합물 5, 즉 질류톤은 미국 특허 제 4,873,259 호에 기술되어 있다.
화합물 6, 즉 [[[5-(5,6-다이플루오로-1H-인돌-2-일)-2-메톡시페닐]아미노]설포닐]-카밤산-아이소부틸 에스터는 WO 01/96298에 기술되어 있다.
사용된 수치(예컨대, 양, 온도 등)에 대해 정확성을 확보하고자 노력하였지만, 약간의 실험 오차 및 편차가 허용되어야 함은 물론이다.
실시예 1
SNP 지노타이핑 모델
마이크로새틸라이트(단순한 직렬 반복 다형성 또는 단순한 서열 길이 다형성으로도 불림)는 유전 마커의 가장 진보된 카테고리를 구성한다. 이들은 고도의 긴 다형성을 나타냄으로써 높은 수준의 정보를 제공하는 단순 서열의 직렬 반복물(디-, 트리-, 테트라-뉴클레오티드 반복물)의 작은 배열을 포함한다. PCR-유도 기술에 의해 용이하게 타이핑되는 5,000개보다 약간 더 많은 마이크로새틸라이트가 인간 게놈을 따라 배열된 바 있다(문헌[Dib et al., Nature 380:152(1996)]).
일반적으로, 문헌[Grupe et al.(2001) Science 292:1915-1918]에 기술된 방법에 따랐다. BMD를 조절하는 유전 인자를 동정하기 위해, 16주령의 C57BL/6 x DBA/2 이종교배물의 1000 F2 자손(미국 메인주 바 하버 소재의 잭슨 레보러토리즈(Jackson Labs))에 대해 게놈 스캔을 수행하였다. 상기 F2 자손은 BMD가 성별과 무관하게 정상적으로 분포되었다(문헌[Grupe et al., Science, 292, 1915-1918, (2001)]). 최고(n=145) 및 최저(n=149) BMD(상하 15%)를 갖는 표현형적으로 극단의 F2 자손을, 개별적인 DNA 샘플을 100 마이크로새틸라이트 마커에 의해 지노타이핑함으로써 BMD와의 관련성에 대해 전체 게놈 스캔을 실시하였다. 또한, 고 및 저 BMD F2 자손으로부터의 동량의 DNA를 사용하여 2개의 통합물을 형성하였다. 통합된 샘플내의 대립유전자 빈도를, 대립유전자 특이적인 동적 PCR 방법을 사용하여 mSNP 데이터베이스에서 발견된 109 SNP에 대해 측정하였다. 각 마커에 대한 두 극단물 사이의 대립유전자 빈도 차이에 스코어를 매겼다. 마커가 BMD와의 관련성을 갖지 않는 경우, 그의 예상 빈도는 두 극단물 모두에 대해 50%이다. 각 대립유전자 빈도 차이의 유의성을 z-시험을 사용하여 계산하고 LOD 스코어로서 도표화하였 다(도 1). 유의적인 관련성(LDO 스코어 3.3 초과)은 마이크로새틸라이트 및 SNP 지노타이핑 방법에 의해, 1, 2, 4 및 11번 염색체상에 위치한 4개 영역에서 발견되었다.
따라서, SNP 지노타이핑 방법을 사용하여, BMD에 관여하는 후보 유전자가 동정되었다.
실시예 2
동물 모델
BMD를 조절하는 11번 염색체상의 동정된 영역내에 있는 유전자를 동정하기 위해, DBA/2, C57BL6/J(미국 메인주 바 하버 소재의 잭슨 레보러토리즈) 및 컨지닉(congenic) 마우스 계통(D2.B6chr11, 오레곤 헬스 사이언시즈 유니버시티(Oregon Health Sciences University)로부터 입수됨) 사이의 게놈 발현 차이를 마이크로어레이를 이용하여 분석하였다. D2.B6chr11 컨지닉 마우스는 DBA2/J 백그라운드에 유전자 침투된 cM20부터 cM50까지 C57BL/6J의 11번 염색체 구간을 가졌다. 마우스 게놈으로부터의 유전자를 함유하는 마이크로어레이를, 전체 신장, 배양된 1차 조골세포 및 1차 연골세포로부터 수득된 표지된 cRNA와 하이브리드화하였다. 하이브리드화는 개별적인 DBA/2J, C57BL/6J 및 B6.D2chr11 컨지닉 마우스로부터 수득된 cRNA를 사용하여 수행하였다. mRNA(2 x poly(A)+) 분리, cRNA 합성 및 하이브리드화를 수행하였다. DBA/2J 및 C57BL/6 마우스의 한쌍을 비교하고 DBA/2J 및 B6.D2chr11 컨지닉 마우스의 한쌍을 비교하여 차별적인 발현을 평가하였다.
11번 염색체상의 구간(cM20-cM50)내에서 암호화된, 차별적으로 발현된 유전 자를 추가의 특성화를 위해 선택하였다. 하나의 유전자(11번 염색체상의 cM40에 있는 Alox15)는 실험한 2개의 계통 사이에서 실질적으로 차별적으로 발현되었다(도 2). DBA/2J 계통은 D2.B6chr11 및 C57BL/6J 마우스에 비해 Alox15 발현 수준이 높았고, 또한 다른 두 계통에 비해 BMD가 감소되었다. 따라서, DBA/2J 마우스내의 높은 Alox15 발현은 골 무기질 밀도 저하의 원인이 되었다.
조골세포내의 차별적인 Alox15 mRNA 발현을 실시간 PCR을 사용하여 평가하였다. 상기 세포는 DBA/2J, C57BL/6J 및 D2.B6chr11 마우스로부터 제조하였다(도 3). 전체 RNA를 드나셀(Dnasel)로 처리하여 오염성 게놈 DNA를 제거하였다. 상기 RNA를 65℃에서 10분 동안 가열하여 드나셀을 불활성화시켰다. PCR 반응은 모두 100㎕의 부피에서 수행하였다. RNA(100ng)에 대해, 5X EZ 완충액, Mn(OAc)(3mM), 브롬화에티듐(1㎍/ul), dNTPs(200μM), 포워드(forward) 프라이머(200nM) 및 리버스(reverse) 프라이머(200nM)를 함유하는 반응 혼합물중에서 rTh DNA 중합효소(2유닛)(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 실시간 PCR을 실시하였다. 샘플을 60℃에서 30분 동안 항온처리함으로써 cDNA를 생성하였다. 그 후, 60 사이클(95℃, 20초; 58℃, 20초) 동안 PCR을 수행하고, 이어서 72℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 각 사이클에서의 형광을 발생된 생성물의 양과 관련시키고, 동적 써모사이클러를 사용하여 측정하고, 제공된 소프트웨어를 사용하여 분석한다(문헌[Germer and Higuchi, Genome Research, 9, 72-78, (1999)]). 신장 이외에, DBA/2J 마우스로부터의 조골세포도 또한 C57BL/6J 마우스에 비해 높은 기본 수준의 Alox15 mRNA를 생성하였다. Alox15 RNA는 DBA/2 마우스에 비해 C57BL/6으로부터의 조골세포에서 더 높은 정도로 IL에 의해 유도되었다(도 3).
Alox15 발현의 계통 특이적 차이에 대한 분자적 근거를 확인하기 위해, DBA/2J 및 C57BL6/J 마우스로부터의 Alox15 유전자에 대한 게놈 DNA를 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 서열화하였다. 2개의 계통을 구별해주는 14개의 DNA 서열 다형성이 동정되었다(도 4 및 하기 표 1에 도식화됨). 15LO에 대한 Ensembl 유전자 명칭은 ENSMUSG00000018924이다. 마우스 유전자의 70929619 내지 70937482번 위치를 포함하는 유전자 서열을 서열번호 1에 나타낸다. 표 1에서 첫 번째 SNP, 즉 마우스 게놈 서열의 70938498번 위치는 서열번호 2에 열거된 진뱅크(Genbank) 수탁번호 U04332 서열의 541번 위치에 놓인다.
Figure 112006021208531-PAT00006
실시예 3
골 형성을 증가시키는 15- 리폭시게나제 억제제의 능력
골 형성 및 골 유착을 자극하는 15-리폭시게나제 억제제의 능력을 측정하기 위해, 골 형성 세포(조골세포)로의 간세포 분화의 척도를 촉진시키는 15-LO 억제제의 능력을 시험관내에서 시험하였다. 특히, 문헌 방법을 사용하여 제조된 3가지 억제제, 즉 화합물 1(3-(2-논-1-인일페닐)-프로피온산), 화합물 2(6,11-다이하이드로-5-티아-11-아자-벤조[a]플루오렌) 및 화합물 3(3-아미노-N-(3,4-다이클로로페닐)-4-메톡시벤즈아미드)의, 인간 간엽 간세포의 조골세포로의 분화를 촉진시키는 능력을, 조골세포 분화의 두 마커, 세포상 알칼리성 포스파타제 활성 및 배양물중 캄슘 함량을 측정함으로써 측정하였다.
일반적으로, 인간 간엽 간세포(hMSC, 포이에틱스(Poietics) #PT-2501, 바이오화이택커(BioWhittaker))를 콜라겐 코팅된 12웰 배양 플레이트에서 1ml의 배양 배지(클로네틱스(Clonetics) cat#PT-4105 및 조골세포 유도물질(100nM Dex, 0.05mM L-아스코브산-2-포스페이트, 10mM β-글리세롤포스페이트))중 세포 3100개/㎠로 배양하였다. 상기 3가지의 15-LO 억제제를 각 배양물에 개별적으로 첨가하되, 단 대조군 웰에는 0.1% DMSO(음성 대조군) 또는 1nM의 1,25-비타민 D3(양성 대조군)을 첨가하였다. 억제제의 농도는 화합물 1이 3 및 30μM, 화합물 2가 0.1, 0.2, 0.3 또는 1.0μM, 화합물 3이 3, 10 또는 30μM이었다. 4 내지 8개의 독립적인 복제 배양물을 각각의 투여량 수준에서 제조하였다. 실험 말기에, 알칼리성 포스파타제(시그마(Sigma) kit#104-LL) 또는 세포 칼슘(시그마 kit#587-M)의 추가 분석을 위해, 웰을 적당한 배지내로 긁어냄으로써 배양된 세포를 수거하였다. 알칼리성 포스파타제 측정을 위해 수거된 배양물은, 세포를 긁어내고 250μL의 트리스 완충된 0.1% 트리톤(Triton) X-100에 재현탁시킴으로써 수거한 후, 그대로 분석하거나 동결-해동 후 분석하였다. 총 칼슘 함량에 대해 분석할 별도의 배양물을 긁어내고 250μL의 0.5M HCl에 재현탁시켰다. 이들 분석의 결과를 전체 세포 DNA에 대해 표준화함으로써 세포 증식의 차이에 대해 표준화하였다. 배양물을 알칼리성 포스파타제 및 칼슘 분석을 위해 수거함과 동시에, 세포를 긁어내고 이를 250μL의 행크 평형 염 용액에 재현탁시킴으로써 별도의 복제 배양물을 수거하고, 세포수를 DNA(디엔이지 티슈 키트(DNeasy Tissue Kit), 퀴아겐(Qiagen) cat#69506)에 의해 평가하였다.
시험관내 조골세포 분화의 정량화
알칼리성 포스파타제 활성의 정량화를 위해, 억제제를 0.1% DMSO중에서 제조하고, 1일째 및 14 내지 16일 후 2-3일 마다 배양물에 첨가하였다. 상이한 3세트의 실험을 수행하였다.
제 1 실험 세트에서는, 용매(DMSO)를 음성 대조군으로 사용하면서 화합물 1 또는 화합물 2(0.2μM 또는 1μM)를 억제제로서 사용하고, 4개의 독립된 복제 배양물을 각 투여량 수준에서 제조하였다. 플레이트를 14일 동안 배양하였다. 알칼리성 포스파타제의 DNA 표준화된 활성을 도 5에 도표화하였다.
제 2 실험 세트는 15-LO 억제제로서 화합물 3(3, 10 및 30μM) 또는 화합물 2(0.1, 0.3 및 1.0μM)를 함유하는 8개의 복제 배양물로 이루어졌다. 억제제를 1일째 또는 11일째에 첨가하였다. DMSO를 조골세포 분화 유도에 대한 음성 대조군으로서 사용하고 1,25-비타민 D3을 양성 대조군으로서 사용하였다. 표준화된 알칼리성 포스파타제의 활성 및 칼슘 함량을 각각 도 6 및 7에 도표화하였다. 화합물 2는 1일째에 첨가되었을 때 가장 효과적이었고, 화합물 3은 11일째에 첨가되었을 때 가장 효과적이었다.
시험관내 간세포의 조골세포 분화 유도에 대한 15-LO 특이성에 관한 대조군으로서, 15-LO 효소보다는 5-LO 효소에 더 특이적인 것으로 확인된 표준 리폭시게나제 억제제의 8개 복제물로 이루어진 제 3 실험 세트를 연구하였다. 질류톤(1, 10 및 50μM, 화합물 5로서 로슈(Roche)에서 제조됨), AA-861(1, 10 및 50μM, 시그마 #A3711) 및 Rev-5901(15μM, 시그마 #R5523)을 2-3일마다 새로 제조하여 인간 조골세포 전구체 세포에서 시험하였다. 5-LO 억제제는, 각각 도 8 및 9에 도시된 바와 같이, 9일째에 알칼리성 포스파타제 활성을 유도하는 능력이 결여되거나 16일 배양 후에 배양물중 칼슘 침착이 결여되는 것으로 발견되었다.
조골세포로 분화하도록 자극된 hMSC 배양물내의, 조골세포 분화 마커인 알칼리성 포스파타제 활성 및 배양물중 칼슘 함량 둘 다의 정량화로부터 수득된 결과는 특이적 15-리폭시게나제 억제제의 첨가가 시험관내에서 인간의 골 형성 세포 분화를 촉진시킴을 증명해준다.
또한, 골 형성 및 골 유착을 자극하는 15-리폭시게나제 억제제의 능력은 골수 전구체 세포의 클론원성 포텐셜을 측정하는 클론원성 분석을 사용하여 측정한다. 조골세포 및 파골세포를 15-리폭시게나제 억제제로 처리한다. 한 방법에서는, 세포 및 억제제를 시험관내에서 항온처리한다. 또 다른 방법에서는, 포유동물에게 억제제를 투여하고, 골수 전구체를 분리한 후, 플레이팅한다. 두 방법 모두에서, 상기 골수 세포로부터 유래된 단위체를 형성하는 콜로니를 측정한다. 골수의 조골세포 클론원성 포텐셜을 증가시키거나 골수의 파골세포 클론원성 포텐셜을 감소시키는 것으로 밝혀질 수 있다면, 골 무기질 밀도를 증가시키는 잠재력을 갖는 화합물을 스크리닝할 수 있다.
실시예 4
15- 리폭시게나제 유전자의 파괴는 대퇴골의 골 무기질 밀도를 증가시켰다
초기에, 15-LO 결핍 마우스는 표현형에 작은 변화를 갖는 것으로 증명되었지만, 이후에 이들 마우스는 마우스 모델에서 동맥경화증 병변으로부터 부분적으로 보호되는 것으로 밝혀졌다(문헌[Sun and Funk, J. Biol . Chem ., 271, 24055-24062, (1996)], [Cyrus et al., J. Clin . Invest ., 103, 1597-1604, (1999)]). 또한, 15-LO 결핍 마우스에서는 BMD가 측정되지 않았다. 골 무기질 밀도에 대한 15-LO의 유전적 파괴의 효과를 실험하기 위해, 15-LO "녹아웃"(15-LO-KO) 마우스를 골 무기질 밀도에 관해 모 마우스와 비교하였다. 골 무기질 측정값은 이중 에너지 X선 흡광계(DEXA)에 의해 측정하였다. 모든 연구는 루너(Lunar) PIXImus 밀도계(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 루너 코포레이션(Lunar Corp.))에 의해 수행하였다. 성체 골 질량의 획득이 완료된 4개월령의 마취된 마우스에 대해 전신 밀도측정 분석을 수행하였다. 글로벌 윈도우(global window)는 전신 이미지에서 두개관, 하악골 및 치아를 뺀 것으로서 정의하였다. 희생시킨 후, 오른쪽 대퇴골을 조심스럽게 제거하고 DEXA 스캐닝 전에 부착 조직을 세정해냈다. 15-LO-KO와 C57BL/6 모 마우스 사이에 전신의 골 무기질 밀도가 유의적으로 변화되지는 않았다(49.8±0.6mg/㎠ 대 49.5±0.4mg/㎠). 그러나, 중요하게도 대퇴골 BMD는 C57BL/6 모 계통에 비해 15-LO 녹아웃 마우스에서 유의적으로 증가되었다(54.0±1.2mg/㎠ 대 49.7±0.7mg/㎠). 이들 결과는 15-LO의 파괴가 대퇴골의 골 무기질 밀도 증가를 가져옴을 증명한다.
실시예 5
15- 리폭시게나제 억제제는 생체내에서 골 형성을 촉진시킨다
생체내에서 골 형성을 촉진시키는 15-리폭시게나제 억제제의 능력은 골다공증의 마우스 모델에서 골 파라미터를 개선시키는 상기 억제제의 능력을 측정함으로써 평가하였다. C57BL/6 마우스에서 Lck 유전자 프로모터(Lck-IL4)로부터의 인터루킨-4 트랜스진(transgene)을 구조적으로 발현시키면, 골다공증과 유사한 심각한 골 표현형이 생성되는데(문헌[Lewis et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 90, 11618-22, (1993)]), 골 질량에 대한 15-LO 억제제에 의한 처리의 효과를 증명하기 위해 이들 마우스를 사용하였다.
사용된 4개의 실험군을 하기 표 2에 나타내었다. 젖을 떼었을 때, 야생형 C57BL/6 또는 트랜스제닉 Lck-IL4 마우스에게 음식물에 들어 있는 화합물 2 PD 146176을 84일 동안 매일 하루에 두 번씩 150mg/kg 투여하였다(규정식 5001: 단백질 23%, 지방 10%, 칼슘 0.95% 및 인 0.67%; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 PMI 피드스 인코포레이션(PMI Feeds, Inc.)). 마우스를 약 12시간 간격으로 매일 2회 일일 음식물 섭취량의 절반에 접근하도록 하고, 규정식 흡수율을 매일 모니터링하였다. 물은 임의로 먹을 수 있게 하였다. 대조군에는 화합물 2를 함유하지 않은 동일한 규정식을 주었다. 모든 군은 실험 과정 동안 음식물을 상당히 균등하게 소비하였다.
Figure 112006021208531-PAT00007
전신 파라미터, 대퇴골 BMD 및 기하구조, 및 대퇴골 생체역학에 대한 IL4 과발현 및 15-LO 억제의 효과를 표 3에 나타내었다. IL4의 과발현은 전신 BMD, 체중 및 헤마토크리트의 감소와 체지방%의 증가를 초래하였다. IL4의 과발현은 또한 야생형 C57BL/6 마우스에 비해 대퇴골 BMD, 피질 면적, 관성 모멘트 및 피질 두께를 감소시켰다. Lck-IL4 마우스에서 골수 면적의 증가는 헤마토크리트 감소, 및 보고되어 온 관련 빈혈과 상관관계가 있다. 또한, IL4 과발현은 파괴 하중, 골 강연도 및 골 강도의 감소를 비롯하여 대퇴골 생체역학에 유의적인 영향을 미쳤다(표 3). 15-LO 억제제(화합물 2)를 먹인 마우스는 전신 및 대퇴골에 미치는 해로운 영향이 부분적으로 반전되었다(표 3). 약물 처치된 마우스는 Lck-IL4 트랜스진을 갖는 대조군 마우스에 비해 전신 BMD, 헤마토크리트, 대퇴골 BMD 및 피질 두께의 유의적인 증가가 있었다. 중요하게도, IL-50 억제제로 처치된 마우스는 파괴 하중, 강연도 및 강도를 비롯하여 대퇴골 생체역학의 유의적인 증가가 있었다. 골 강도 및 파괴 하중의 수준은 골절 발병이 계속되는 환자에서 유의적인 결정인자인 점에서 이는 골다공증에 특히 적절하다. 요약하면, 상기 결과로부터 시험관내 15-LO의 억제가 골다공증의 동물 모델에서 보다 높은 BMD 및 보다 높은 골 강도를 유도함을 알 수 있다.
Figure 112006021208531-PAT00008
동물
생체내 실험에 사용된 모든 마우스는 잭슨 래보러토리(미국 메인주 바 하버)로부터 최초로 구입한 혈통으로부터 포틀랜드 VA 베터러너리 메디칼 유니트(Portland VA Veterinary Medical Unit)에서 동일한 조건하에 번식시켰다. 번식 마우스를 잭슨 래보러토리로부터 구입한 혈통으로부터 3세대 이하 동안 유지시켰다. 젖을 떼었을 때, 마우스를 21±2℃에서 12시간의 명암 사이클(오전 6:00부터 오후 6:00까지)로 군으로(우리 당 9 또는 10마리) 길렀다. 모든 절차는 VA 인스티튜셔널 애니멀 캐어 앤드 유스 컴미티(VA Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었고, 연구중의 동물 보호 및 사용에 관한 내셔널 인스티튜트스 오브 헬쓰(National Institutes of Health)의 지침에 따라 수행되었다.
골밀도측정법
골 무기질 측정값은 이중 X선 흡광계(DEXA)를 사용하여 측정하였다. 모든 연구는 루너 PIXImus 밀도계(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 루너 코포레이션)에 의해 수행하였다. 성체 골 질량의 획득이 완료된 4개월령의 마취된 마우스에 대해 전신 밀도측정 분석을 수행하였다. 글로벌 윈도우는 전신 이미지에서 두개관, 하악골 및 치아를 뺀 것으로서 정의하였다. 희생시킨 후, 오른쪽 대퇴골을 조심스럽게 제거하고 DEXA 스캐닝 전에 부착 조직을 세정해냈다.
시험편 가공
성체 마우스(16주령)를 CO2 흡입에 의해 마취하고, 가장 가까운 0.1mg까지 체중을 쟀다. 희생 직후에 심장 혈액을 뽑고, 전혈의 소량 분취액을 헤마토크리트 측정을 위해 저장하였다. 요부 척추 및 양쪽 대퇴골을 즉시 수거하고 인산염 완충 염수에 적신 멸균 거즈에 싸서 후속 분석을 위해 약 -20℃에서 동결 보관하였다.
대퇴골간의 기하구조
대퇴골의 중간 골간의 단면 기하구조 파라미터는 휴대용 X선 마이크로토모그래프(microtomograph)(모델 1074, 벨기에 안트웹 소재의 스카이스캔(Skyscan))를 사용하여 측정하였다. 스캔은 40mm 간격으로 하고, 대퇴골의 중간지점에 위치한 박편을 총 면적(FCSA), 피질 면적(Ct Ar) 및 수관 면적(Ma Ar)에 대해 분석하였다. 또한, 디지털 이미지의 피질 영역에 함유된 픽셀을 사용하여, 단면의 중심으로부터 정면-후면의 외부 섬유까지의 반지름, 굴곡면에서의 지역적 관성 모멘트(Ixx) 및 평균 피질 두께(Ct Th)를 계산하였다.
*생체역학적 연구
대퇴골을 고해상도의 재료 시험 장치(인스트론(Instron) 모델 4442, 미국 매사추세츠주 캔톤)상에서 3점 굴곡시의 파괴에 대해 시험하였다. 파괴 하중 및 강연도를 시스템 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 이어서, 이전에 측정된 단면적 측정값을 사용하여 굴곡 강도를 계산하였다.
데이터 분석
모든 데이터는 JMP 소프트웨어 패키지(SAS 인스티튜트(SAS Institute))를 사용하여 이원 분산 분석법(ANOVA)에 의해 분석하였다.
실시예 6
생체내에서 골 형성을 증가시키는 15- 리폭시게나제 억제제의 능력
골 형성 및 골 유착을 자극하는 15-리폭시게나제 억제제의 능력을 측정하기 위해, [[[5-(5,6-다이플루오로-1H-인돌-2-일)-2-메톡시페닐]아미노]설포닐]-카밤산-아이소부틸 에스터, 즉 화합물 6을 W0 01/96298에 기술된 바와 같이 제조하고, 표준 에스트로겐 결핍 래트 OVX 골감소증 분석으로 시험하였다.
3개월령의 래트의 난소를 절제하고(Ovx), 1mg/kg/일의 화합물 6 또는 0.1㎍/kg/일의 1,25-다이하드록시 비타민 D3(양성 대조군, 표에서는 Vit. D로 약기함)을 난소절제술 후 2주에 시작하여 7주 동안 계속 1일 1회씩 경구 가바즈(oral gavage)에 의해 투여한다. 투여량을 2mg/kg/일로 증가시키고, 이를 11주까지 계속하였다. 모의(sham)(난소절제되지 않은 래트) 대조군 및 Ovx 대조군에게는 비히클만을 투여하였다. QDR-4500 골 밀도계(홀로직(Hologic), 미국 매사추세츠주 왈탄)상에서 고해상도 소프트웨어 패키지를 사용하여 척주 및 오른쪽 고관절부의 골 무기질 밀도를 측정하였다. 동물들을 오른쪽 대퇴골이 주 몸체에 수직하고 경골이 대퇴골에 수직하도록 반듯이 드러누운 자세로 놓고 스캔하였다. 화합물들에 대한 고관절부 및 척주의 골 무기질 밀도(무기질 g/㎠)를 하기 표 4에 나타내었다. 15-LO 억제제로 처치된 동물은 3주가 넘었을 때 척주에서, 그리고 7주가 넘었을 때 근위 대퇴골에서 증가된 BMD를 나타내었다. 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
Figure 112006021208531-PAT00009
실시예 7
실험실 마우스에서 15- 리폭시게나제 발현을 감소시키는 유전조작은 골 질량 및 강도를 개선시킨다
15-리폭시게나제 발현과 골 발달 사이의 관계를 조사하기 위해, 유전적으로 이종인 F2 집단을 2개의 선조 계통, 즉 잭슨 래보러토리(미국 메인주 바 하버)로부터 구입한 B6.129S2-Alox15 tmlFun (Alox15 녹아웃 또는 15LOKO) 및 DBA/2(D2)로부터 구성하였다. B6.129S2-Alox15 tmlFun (15LOKO) 마우스는 Alox15에서의 목적하는 돌연변이에 대해 동형접합성이고, 따라서 아라키돈산염 15-리폭시게나제를 발현시킬 수 없다. 이와 달리, D2 마우스는 높은 양의 Alox15를 나타낸다. 15LOKO-D2 F1 마우스를 잭슨 래보러토리의 모 주(line)로부터 국부적으로 번식시키고 이종교배시켜 총 292마리의 15LOKO-D2 F2 마우스를 생성하였다. 젖을 떼었을 때, 마우스를 군으로(우리당 2 내지 5마리) 기르고, 21±2℃에서 12시간의 명암 사이클(오전 6:00부터 오후 6:00까지)로 임의로 물 및 실험실 설치류용 음식(규정식 5001: 단백질 23%, 지방 10%, 칼슘 0.95% 및 인 0.67%; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 PMI 피드스 인코포레이션)과 함께 유지하였다.
모든 마우스를 성체 골 질량의 획득이 완료된 4개월령에 연구하였다(28). 골 무기질 측정은 인간 요부 척주의 하이드록시아파타이트 모형으로 매일 보정된 펜실 빔 홀로직 QDR 1500 밀도계(미국 매사추세츠주 왈탐 소재의 홀로직)를 사용하여 측정하였다. 분석은 제조업자(미국 매사추세츠주 왈탐 소재의 홀로직)가 친절하게 제공해준 마우스 전신 소프트웨어(3.2 버전)를 사용하여 수행하였다. 밀도측정 분석은 마취된 마우스에 대해 수행하였다. 실험 전날 밤에는 음식물을 주지 않고(소화되지 않은 설치류 음식이 골 무기질 밀도 평가에 미치는 혼동되는 영향을 없애기 위해), 마우스를 아이소플루란 흡입에 의해 마취하였다. 동물의 체중을 가장 가까운 0.1gm까지 잰 후, 골 밀도 스캔을 하였다. 마우스를 CO2 흡입에 의해 마취하고, 비장 및 대퇴골을 무균 제거한 후, 후속 분석을 위해 즉시 동결시켰다. 모든 절차는 VA 인스티튜셔널 애니멀 캐어 앤드 유스 컴미티에 의해 승인되었고, 연구중의 동물 보호 및 사용에 관한 내셔널 인스티튜트스 오브 헬쓰의 지침에 따라 수행되었다.
대퇴골 구조(중간 골간의 피질 골 면적 및 피질 두께)를 데스크탑 X선 마이크로토모그래픽 스캐너(스카이스캔 모델 1074, 벨기에 아트셀라)로 측정하였다. 왼쪽 대퇴골을 고해상도의 재료 시험 장치(모델 4442, 미국 매사추세츠주 캔톤 소재의 인스트론 코포레이션)상에서 3점 굴곡시의 파괴에 대해 시험하였다. 신장계(모델 2630-113, 인스트론 코포레이션)를 부착시키고, 시스템 소프트웨어(윈도우 95의 시리즈 IX, 인스트론 코포레이션)를 사용하여, 파괴가 발생할 때까지 0.5%/초의 변형 속도로 작동기를 이동시켰다. 하중 및 이동(신장계를 사용하여 측정됨) 데이터를 기록하고, 파괴 하중(F) 및 강연도(k, 하중 대 이동 곡선의 선형 부분으로부터 계산됨)를 시스템 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.
염석 방법을 사용하여 게놈 DNA를 개별적인 마우스 비장으로부터 분리하였다. 야생형(266 염기쌍) 및 돌연변이체(172 염기쌍) Alox15 유전자에 대해 상이한 크기의 산물을 생성하도록 설계된, 잭슨 레보러토리가 제안한 중합효소 연쇄 반응(PCR) 프로토콜(http://aretha.jax.org/pub-cgi/protocols/protocols.sh?objtype=protocol&protocol id =304)로 게놈 DNA를 지노타이핑하였다. 증폭을 퍼킨 엘머(Perkin-Elmer) 9700 써모사이클러(미국 뉴저지주 브랜치버그)에서 수행하였다. PCR 산물을 4% 아가로즈 겔상에서 분리하고, 브롬화에티듐 염색으로 가시화하였다.
15LOKO-D2 F2 집단은 대략 동일한 수의 수컷(n=141) 및 암컷(n=151) 마우스로 구성되고, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 Alox15 유전자형 빈도가 하디-웨인버그 프린시플(Hardy-Weinberg Principle) 기대값과 일치하였는데, 즉 동형접합성 녹아웃(15-LO 대립유전자 없음) 마우스 70마리(24%), 이형접합성(D2로부터의 15-LO 대립유전자 1개) 마우스 153마리(52%) 및 동형접합성 D2(D2로부터의 15-LO 대립유전자 2개) 마우스 69마리(24%)였다. 체중에는 차이가 없었지만, Alox15 녹아웃에 대해 동형접합성인 F2 마우스는 D2 동형접합성 또는 이형접합성 마우스의 전신 BMD보다 유의적으로 높은 전신 BMD를 나타내었다(ANOVA에 의한 p=0.006). 또한, Alox15 녹아웃에 대해 동형접합성인 F2 마우스는 대퇴골간 피질 골의 양(피질 면적 및 피질 두께)이 증가되었고, 증가된 파괴 하중 및 강연도 척도에 의해 증명된 바와 같이 구조적 적격성이 유의적으로 개선되었다(표 6).
Figure 112006021208531-PAT00010
Figure 112006021208531-PAT00011
이와 같이, 골 손실을 치료 또는 예방하고, 골 무기질 밀도를 증가시키고, 골 형성 및 유착을 향상시키는 신규한 방법이 개시되어 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양을 어느 정도 상세히 기술하였지만, 첨부된 청구의 범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않고 명백한 변화가 이루어질 수 있음을 이해한다.
본 발명에 따르면, 인간의 17번 염색체상의 다형성(polymorphism)을 검출하기 위한, 특히 15-리폭시게나제 유전자내의 다형성을 검출하기 위한 1종 이상의 올 리고뉴클레오티드를 포함하는, 대상에서 골 손실의 소인(predisposition)을 진단하기 위한 키트가 제공된다. 본 발명은 15-리폭시게나제와 관련된 골다공증, 파제트병(Paget's disease) 또는 치주질환과 같은 골 손실의 감소, 골 무기질 밀도의 증가, 골절 발생률의 감소, 및 골절의 치유에 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Method of treating and preventing bone loss <130> Case 21150 <150> US60/355255 <151> 2002-02-08 <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 7864 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> Ensembl gene ENSMUSG00000018924 <222> (1)..(7864) <223> <220> <221> position 70929619 in mouse genome <222> (1)..(1) <223> <220> <221> position 70937482 in mouse genome <222> (7864)..(7864) <223> <400> 1 tctttgcaac attttattta aaataattag gtccctgttc ttttctatca ctagcccaaa 60 acatctttta ttgttgctat tagactctat taaggcttga gatctatttg attcatagac 120 gatgtgtaac aatgtatatt atcacccttt tgtgttcccg gggtgctttt cccaagcatg 180 gctattattt accctatggg gaaggaaaag cagaaaggat gaatgaaaag tggcactctg 240 ggtaacgcat ccaaagcaaa atgtgttcac tacagcagac tatggaaagc gggctcttgg 300 aaaagggttc cacactggca gagggcgggg ctcaagcaca gggatgcact tgagtggtct 360 tgattaaata acaaatcgag aggggggatg gtcatatggc cacgctgttt tctaccaggc 420 tgggccgcag gtactcataa ggtatgtcca agctcttgtt acgaatctca atttccttat 480 ccaaggcagc cagctcctct ctgaacttct tcagcacagc tttggcctca gggtttggga 540 agtgttcctc tgaatgctgg cccaggggca cctggaaggc aggtgggaaa acagcctaag 600 cctgtgacct ccgccagttt tggggtgcag agtttcctct ggaccctgaa tgattgattg 660 actctcacca taacagcctg gcgtctgccc aggagccaaa cgacatttat ctggagagta 720 gactgattag gattgggcag cgtcgccatc agcttctcca tcgtcgcgtc cttggtttta 780 ggtggtggca gccgcatggt gcagggtgca ttaggaaccc agtagaacca atccagctgg 840 agagacagtg atctagggtc aaggctcgcc cttggccccc atgctcacat tcccctcccc 900 cactgtactc cccaaattcc cagctgcctc cctctgggaa gtacctggcc aagatggatg 960 gaagagtgct gcgcagtgca tgtgaagatg cacatggtga tgaagtggca agcctgagcc 1020 cgggactgga gggaggtggg gaagcctacg agaggtgtga acggttagcg tgtgacgtca 1080 ccagaaccac tagacgggag gcctggagag gagagggaga ggcgagaagg acctcccagg 1140 accttgtgta agctggtatg agagcgggga tggtgaggga cgagaggagc cctggcacct 1200 atgtcataca taccccatcc ccaaggctca gggatcattg tcaaagggat gacagaaaaa 1260 acttttgaga gttttcatga agatttaaat gcttctggga gagtccatgg aagcacagag 1320 ggttctggag acgtctcaga actcaggtct tagttctcag gccagggatt cttattacct 1380 ctgtcctggg caccttgcaa cccaatctca gtgatctctt gacaccagct ctgcagttca 1440 tagtcatcct gaacagcttg gtcggtcttg tagtagagat cgaacattcc caccacgtac 1500 ctgtcaccaa agggtcaggg caagctgagg ccctctgctc cctgctccat gtggctgagt 1560 catagtgtcc acacccaacc aagccaagga acagacctcc tattctcctg gtcttctcca 1620 cccacaccgg cacacaaacc cgtcctgcgg ctctgttgac ctcaccgatt catgacttgc 1680 cagagctgca gggcatcttt agcatagaag caagtgtcaa tatccaggag tcctcgctca 1740 gccaagtcat cagggggaca caatgagctg taggtcagga aggctccagc ttgcttgaga 1800 agatccaggt ggcctcctcc acctgtgctc atcacctaaa ggaccaaggg caggtggttt 1860 tcactctaat caagctgccc tgaagggaga ggacagagtg aacctagagc ccacttctat 1920 ccccatacct tgtcaaaaaa gcctctctct gagatcaggt cgctcctggc ccggacattg 1980 atttccatgg tgtagagtag gtgaggaact agaagctagg agaagaaaag ggatgggtaa 2040 gtcagaagga ctctatgaca ggtccctgta gcaagcaggt ttgacaaggg agaagcgaag 2100 ctcactccaa gggaaaacgt ggccgtgagg ctctgtggcc ctcgattctg ataagtgctg 2160 gttttctgcc tgactggggc cacaagagtc aaatcactgc cttctgacaa tctctttcat 2220 tccctgtgtt gtcttttcaa cagtctttct tgatcaccca aaagaaactc acatggcact 2280 gttgtgattc tctaagatct caccacagcc aacatgtcga gtataatcac tactggggtt 2340 tctgttgtta tttttgtttt gctttgtttg tttttttttt cctcttactg gagataaaaa 2400 aaaaatcccc caaaactaga tgttaacaca ggcatctaga ctaggtctgt gtagagacat 2460 ccaataccaa tttcgatgga tgaactcttt gctctgattg actagagtaa accaggtcac 2520 tcttgttgct ctaggtcatc gtttcagaac tccccaaaga ctgctgtaag gaatccgttg 2580 tgtaatttgc atggtcccct ctttaagtca cgtgcaccta ctctggtact gtatgtatat 2640 ctatgttctg tacataagat tagaatcttt acaccctttg ctgaggaatc acctgtatat 2700 gcccccttgg ggattagtgc cattgctgac aatgtagagg acagcaggtc acactccctt 2760 tctctctccg ttgttcatct catctcttct catcatcctg aaccctgcct gagatgccac 2820 tgagagaccg tctcagaggc aagagtgtgt agcaagccaa gagatgtaga cagaacaaaa 2880 aaaaacacaa aaaacaaaaa acaaacaaac aaaaaaaaac cgaataaggt gttaccttaa 2940 aaacagggtg cacggaaggc aggcacctca tggtggccac agcaaagacc tcagccacca 3000 agtgtcccct cagaagatga gcctgtagct catgaagctg taagtctgag cttcggaccc 3060 agcatttggc caggagccag tccattgggg gatccaaggg cgtgaaaatc ggcggtgggg 3120 tagacccagt tttgggcagt tcgagctgga gtaaaacaac agtgtgaaga aagggctgga 3180 tggagatctt cgtggcaacg gctcagcgat ccctacttcc tccatcccac acgtgtgcag 3240 ccatcttggg ctctctctca tctttcaaca tcacctctcc acaaagatct gaggctctgg 3300 gtttcaacta atagaggatt ttgtatgtgt ccccattact tcaaaactgg caggaccaaa 3360 gcctacctgg gtgcctaccc ctctgcactt gccctgtgtc tgaagaaacc tgcctgagtc 3420 ccacttttcc tgactccact ccaggccagt agattctccc tctgctctcc ctcctctcca 3480 gctccatggc tacttactac tcacggagag cccaccatcc cctgaaacct tagcaacccg 3540 gcatcagtaa gccccggcta tccattctaa cactgactct ggagaggagc tgctcacgct 3600 gcgcctccag caagccacag aaatctcctg gctcctccac ctcagcctct tcacctaaag 3660 tatctttctc tggggacaga tcccacccat cctcccgaca ctgctcccag gatcccccct 3720 gaactggctc tgtccttggc attggagctt atacatgccg attagtctgt ctctccagta 3780 aagccacaaa acccttaaag tcaaagcctg cccgtgtcct cctctagtgc ctcctcggta 3840 ccttagggca acgccactgt gggggaaacg ggagagaact tgaaccacag gctcggcgga 3900 ggaggccacc ctggggtaca acccctggtc ctctcacctg gatggctata ggcaagagtt 3960 gcccatcggg ctgcagcttc agcatgacga ggggggcagc caggtactgc tgactacaaa 4020 ggatgacatt ggccttgatc ccatccagaa ggaagaaatc cgcttcaaac agagtgcctt 4080 tctgcatagg gagagaaatc aagggcttct gtcagcatgg tcttctccca ccctgagtgc 4140 ccgacaagga gacaagaaag aagagagacg acctgtctcc atcagccacc tggcagtgtt 4200 tgtcctctac ctcatcaaag tctcctcatt cttcttcctt tttttcttct tactttttta 4260 ttgcatttgt ttgtttgctg ggtgggtgtg tatgttcgtg tatatgcata tatgtggaca 4320 catgtttgcc atgacatcgg gtgatgatca gaagacaacg tatgggaagt agctccctcc 4380 ttttaccaca caggtcccag ggatcaacta agattgttat gcttggcagc aggtagctct 4440 acctggcgtt accacaccta accttatatg ctccgtctaa attactccag attacaggaa 4500 aggaaaccga aagggtttcc cagaatcagg gtatcttggc aatcgggagc caaggaatac 4560 cccaaagtca caccatgcaa caaacctcac acatgagatt tattggggtg acagaacggc 4620 ggtggcctct gaacaggaac agagaaagca gcgagctgag tggaggggcg ggcttttaca 4680 gggtctttgg agcatgtgca gccagcgagt ggagcatgcg cagtgagcta gtgaaacagt 4740 acagagagcc tagaagtatt gcttgactgt gaaccttgaa taataggggt ggagatttcc 4800 aagtcccgag ttcagggaca gaccaggggc agggtgattt tccactggtc tattacccta 4860 aagaaacaga tcagagaaat gagatagtgc acttaaaatc acccagcaaa accaggattt 4920 agatgcaagt ctatctggcc ccatgaatct tgtcattgtc ccagcttggt tcctaattag 4980 ccccagccct gccttggatt ctctcaccct gtacctctct ggacccatgg cctccaggac 5040 aacgtcacat ctctactggc caccccaata aggctcctct cttcaaccat atactcctct 5100 cctgtgctgg gaaagccacg gtactacatt tttctacatc agtctaggat ttgtctggat 5160 cctctcttga caaccagcag gaattcacag taaatctgag cacagtacac ccaacaccca 5220 gtacacccaa cacccagtac acccaacacc cagtacaccc aacacccagt acacccaaca 5280 cccagtacac ccaacaccca gtacacccaa cacccagtac acccagtaca cccaacaccg 5340 gctcctgcct ccacttccct gcttggcctt cctggtgctt tgatgcccat accttgagct 5400 cctcatccag ctgggcctgt agcttctcca tccccggagg gaataccagg cgggcaggga 5460 gacaagtaga ccgcttcagc accatggggt tagcaccatt gagaaactgg tacccaaaga 5520 aagcatcctc tttccaggag tttcgaaccc gctctaggga taggaggagg acgtgtctaa 5580 gatccaactt cctggtcctt ccaacaccca ccaaaacatc cctacttgac ccagactacc 5640 agagatgtca gacaaaagcc tctgacccac ccaccctcaa cccggctttc tcgatctcct 5700 tgcattggga agagttttgg ggtaagagta atttgggggt aggtgtactt accagccatc 5760 ttggtgtggc cactcttgaa aacatagttg aagtcatcta ggcttttcca gcaggtcaca 5820 gtgtttttag ggaagttaat aacggtgtcc attgtccttc agggaagaat ggggcaaagg 5880 atgtgacagt tatacttaga accaaacatt acagccaaag gtaccataga cgagaccagc 5940 acacacccac cctcaagccg ggcactcttg ccctcacccc agaacctgtg aagcttcaaa 6000 ttcaagtctt ttgtcctctc gaaatcgctg gtctacaggg aggtcagaga tactggtcgc 6060 cgccacgttc aggattgtgc catccttcca gttgccccac ctgagggcag aagtgacatc 6120 aggcacgggc actgcagagg cagctcgcca tgggtcccct gggtcagcct cacctgtaca 6180 gactcctcct ttcttccagt tcctcctccc tgtggttcct gaacaggcct tgagagtctt 6240 caaccacggt gcagcctaga agccgaggag ggagacactc tggatgtctt ctgtgagctt 6300 ctctaccccc ttccagctgg ctgtacctct tcaggcagcc ctggctgtcc tctgtgcatg 6360 catcttcatg tccctccctg aagcctccgt gacatctggg ccagcttcag ctactctttc 6420 tttgacaact catttaaaac accaaacaaa cagcccagct tccaggctcc agctcccaca 6480 cgctgcctcc ccttcctcac acaactgagg ctccgttccc cctatgcctc ttcacacaca 6540 cacaccccac ccctctgctc accagtgccc tcagggaggt tcaggatgct ggtgccctga 6600 acccatcggt aacaggggaa cgtgtactcc gatccctggt ctccggggcc cttcacagaa 6660 atccagttgc agaaccaggc gtcctctttg agataatgcc atttctgcac tctcacaaac 6720 agcagtggcc caaggtattc tgacacatcc accttgaatt ctgcctcctg cagataagca 6780 caggggcgca gaatggggtg ctcaggctga gttctgcttc cactgggcca caggaaaagt 6840 gatgaaaaga ggctccatga caccactcag ggttgtcacc tcaaccaaga gtgagagggt 6900 taaggatgga cgatggacga tgggaaagta cactccttcc tccccggggg gtggggggag 6960 gactagagga aggggaattc tggaaactct gccagaggcc cagtgaggaa cgggtcaaat 7020 gggagacccc actaaggcag agaacccatg ggaattccat ttggcctgag ccagggtttc 7080 tacaggatgg tctccaggga gaaacctgga tttggagagg cggggttggt gagagagaat 7140 gaaatcagag aagacacgag gcagagtcca tggagagcgt agaggctgaa aggaccagcg 7200 ccttcatgaa gctagggccc ccagcgcctt catgaagcta gggcccagag agccgtgggg 7260 actgggagcc aaacaggacc aggtcccgag ggaccgagag taagccagag gcttggcagt 7320 tcgtagggaa gaagctggag acactgggag gctttatcag gcagactgtt ctacagtagg 7380 aacgagagaa gatggtaaat cttaagcttt aaaaaattag agacattcgg gcagctgaca 7440 ctgctgatac tggcactact actgtaccgc agagttctgt gaagtgaggg acgcacagaa 7500 atatcccact caatgaggcc aggaggcagc aactgttact gagcgctcac cgaatgcctc 7560 tgtgcaccct ttccgctttc cgaggctgtg agctccttcc tcagagttca ggggccacgc 7620 atcagggttc ctagggattt ctttgacttt gcccccgccc ccgcccccag cccctcaccc 7680 tgccgcctcc cgggacagcc agagctctgc gcagctcacc gagttccgac agggtcggaa 7740 cagcttcccg agagatgcct ccccatgctg tccgatcaac cacaggtaga cctcgttgtt 7800 ggagcccgcg tacacggagt ccccggtgga gacgcggatg cggtagacac ccatcttgca 7860 gatg 7864 <210> 2 <211> 1557 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> Mus musculus leukocyte-type 12-lipoxygenase gene <222> (1)..(1557) <223> GenBank accession no. U04332 as of 07 Jan 2003 <220> <221> SNP <222> (541)..(541) <223> <400> 2 gtgaaggtaa aaatcacaag cttggtacct cctgttgaaa tagttgtgat gcccattagc 60 aagcaggaca ggataggaac gtttaagaag aatagggcac atttgtgtca ccatggcatt 120 tctgtttgat tcgggagcag agagccttgc atttacagaa acagaacaat tcaggttagc 180 gaacgttcca gtaagtacca tacgtgcctg agagtaatgc tgacctcagt tccaccggcg 240 gtcgggtcag ggcttagcaa atatgtgatt cttatttcaa tggaaggggt gtgttagctt 300 ggggatgtgc acagaactga ctcatagtgg agattgccat tcaccagaca cattttcatt 360 gtctttgttt aattcagttt ataacactcc atgccagaat ggcaccaaag gtcattttat 420 tactcttatt agtcacatgg actgagagtc tttgtggtcc catgtctccc tagaggaagg 480 atgtatgtac agttgcattc agctcagtgg gttccaggtg tagcaacagt taacaataaa 540 cgaataagcc ctgctggatg cggtcttggc ctaggaggcg ctcctgtgag ccggtgatac 600 tgacacaagg atgatcaggg tccagcatta gccaggcatc agcagaagcg cttctggggt 660 aggcggtaga agctggttgt ctctgggtgg ggtgtagaag gcacttcact gagaagctag 720 agtctcctca ggatttggaa ggatgagtag ggtggacccc gagtacatga ttcttcagca 780 aataacatgg agtctttggt ggtggctctg gggagcaagg ggcttcagca ggagtgcagt 840 gtggggaagg gagaaaatca ggtttccgag ggctttgaag gccaggtaat ttcgggtttt 900 attatgcaga catcgggaga tatctggatg ctttgaaact cacagggatg agcccagagc 960 ctgcctcagg atgggcaaag tgtacagagc tggtagaatt aatcgggtgg ctaaaatgtg 1020 ccgcctttaa atgctgcaca gcacctgcar ccttaagatt atccctgggc atgggaaaac 1080 ccatctgtga tgcgcgcact ggagagtgga tgtatgtgcg tgtgagagtg tgtgtgtgtg 1140 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgagagag agagagagag agagagagag agagagagag 1200 agagagagag agagtgagcg cgcgtggagg aaggtgtgac gggggcagaa gggactggac 1260 cagatgttga ttctttcttg catgttttct tttcaaatcc ccatctactt ctccctcctg 1320 ttctcctctc accaagatga tttttgagag ttcagctttg cccagagccc cgcctttttt 1380 gggctggaac gaggccccca gcaagtgctg ggggccccag taagtgacag aggcggggtt 1440 aattgccacc tacagctcaa ccctaaacta gacttctgaa ggggcggggc ctcggctttc 1500 ttatttagcc cgtctacccc tcttgattct cagaagggag aaaacttcat ctgcaag 1557

Claims (4)

  1. 골 손실의 소인(predisposition)을 나타내는 인간의 17번 염색체상의 다형성(polymorphism)을 검출하기 위한 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 대상에서 골 손실의 소인을 진단하기 위한 키트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    검출이 지노타이핑(genotyping)을 포함하는 키트.
  3. 제 2 항에 있어서,
    지노타이핑이 마이크로새틸라이트(microsatellite) 마커 또는 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성인 키트.
  4. 골 손실과 관련된 15-리폭시게나제 유전자내의 다형성을 검출하기 위한 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 골 손실의 소인을 진단하기 위한 키트.
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