ES2299923T3 - Metodo para identificar compuestos que incrementan la densidad mineral de los huesos. - Google Patents

Metodo para identificar compuestos que incrementan la densidad mineral de los huesos. Download PDF

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Abstract

Un método para identificar compuestos que incrementen densidad mineral ósea, el método comprende poner en contacto un compuesto con la 15-lipoxigenasa y determinar si el compuesto inhibe la actividad de la 15-lipoxigenasa.

Description

Método para identificar compuestos que incrementan la densidad mineral de los huesos.
La invención se refiere a un método para identificar compuestos que incrementan la densidad mineral en los
huesos.
Los lipoxigenasas son enzimas que contienen hierro no hemoencontradas en plantas y animales que catalizan la oxigenación de ciertos ácidos grasos poliinsaturados, tales como lípidos y lipoproteínas. Se conocen varias enzimas lipoxigenasa diferentes, cada una con una acción de oxidación característica. Las lipoxigenasas de mamífero son llamadas así por la posición del ácido araquidónico que oxigenan. La enzima 5-lipoxigenasa convierte ácido araquidónico en ácido 5-hidroperoxieicosatetraenoico (5-HPETE). Esta es la primera etapa de la vía metabólica que produce ácido 5-hidroxieicosatetraenoico (5-HETE) y los leucotrienos (LTs). En forma similar, la 12- y la 15-lipoxigenasa convierten ácido araquidónico en 12- y 15-HPETE, respectivamente. La reducción bioquímica de 12-HPETE lleva a 12-HETE, mientras que el 15-HETE es el precursor de la clase de compuestos conocidos como lipoxinas.
Una disposición diversa de efectos biológicos están asociados con los productos de la actividad de liposigenasa, y muchos están implicados como mediadores en varios estados de enfermedad. Los LTs C4 y D4 son potentes constrictores de músculo liso bronquial humano; los LTB4 y 5-HETE, encontrados en el fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide, son potentes factores quimiotácticos para células inflamatorias tales como leucocitos polimorfo-nucleares (Green y Lambeth, Tetrahedron, 39, 1687 1983)); el 12-HETE se ha encontrado a altos niveles en el tejido epidérmico de pacientes con psoriasis, las lipoxinas han mostrado estimular la liberación de enzima lisosómica y ión de superóxido de neutrófilos. De esta manera, las enzimas lipoxigenasa desempeñan un papel importante en la biosíntesis de mediadores de asma, alergia, artritis, psoriasis e inflamación, y los inhibidores de estas enzimas interrumpe la vía bioquímica implicada en estos estados de enfermedad.
Las 15-lipoxigenasa humana (15-LO) cataliza la formación de ácido 15-S-hidroxieicosatetraenoico (15-S-HETE) a partir de ácido araquidónico (Jun y Borngraber, Lipoxigenases and Their Metabolites, Plenum Press, Nueva York (1999)). En ratones, la síntesis del 15-S-HETE es llevada a cabo por la 12/15-lipoxigenasa (Alox15), la cual es el homólogo murino de 15-LO humana. La 12/15-LO murina convierte el ácido araquidónico en ácido (12(S)-hidroxieicosatetraenoico y 15-S-HETE en una relación 3:1, y puede convertir además ácido linoleico en ácido 13-hidroxioctadecadienoico (13-HODE).
La 15-lipoxigenasa se ha considerado implicada anteriormente en la patogénesis de varias enfermedades, incluyendo ateroesclerosis (Harats et al., Arterioscler, Thromb. Vasc. Biol. 2100-2105, (2000)), asma (Shannon et al., Am. Rev. Respir. Dis., 147, 1024-1028 (1993)), cáncer (Shureiqi et al. JNCI, 92, 1136-1142, (2000)) y glomerulonefritis (Montero y Badr, Exp. Neph., 8, 14-19 (2000)). Se ha identificado un gran número de clases de compuestos que inhiben la 15-lipoxigenasa, incluyendo fenoles, ácidos hidroxámicos y ácidos grasos acetilénicos (revisado en Kuhn y Borngraber, Lipoxigenases and Their Metabolites, Plenum Press, Nueva York (1999)). El espectro de actividades inhibitorias varía para estos agentes. Por ejemplo, el ácido nordihidroguayarético ha mostrado ser un inhibidor de 5- y 15-lipoxigenasa, los ácidos naftil-hidroxámicos han mostrado inhibir 5-, 12- y 15-lipoxigenasa (patente de E.U.A. No. 4,605,669) y un inhibidor benzofluoreno de la 15-lipoxigenasa, PD146176, se ha publicado, indicando que es relativamente específico de la enzima 15-lipoxigenasa (Sendobry et al., Br. J. Pharm., 120, 1199-1206, (1997)). La evidencia de la implicación de 15-lipoxigenasa en aterosclerosis ha provenido de estudios con ratones con una supresión dirigida de Alox15 (Alox15-/-). Estos ratones suprimidos (Knockout) en Alox15 inicialmente mostraron tener diferencias fenotípicas menores incluyendo actividad 5-LO incrementada (Sun y Funk, J. Biol. Chem., 271 24055-24062 (1996). Sin embargo, la rotura de la Alox15 disminuyó ampliamente las lesiones ateroscleróticas de ratones propensos a aterosclerosis deficientes en apoE (apoE-/-) (Cyrus et al., J. Clin. Invest., 103, 1597-1604, (1999)).
Aunque la 5-LO ha estado implicada en la patogénesis de varias enfermedades, la función biológica de la 15-lipoxigenasa murina o humana no ha sido determinada con certidumbre, ni se ha establecido una utilidad clínica humana para inhibidores de la 15-lipoxigenasa. En particular, la utilidad de inhibidores de 15-lipoxigenasa para el tratamiento de osteoporosis y/u osteoartritis humanas no se había descubierto anteriormente.
La osteoporosis es causada por una reducción en la densidad mineral en hueso maduro y da como resultado fracturas después de trauma mínimo. La enfermedad se ha expandido ampliamente y tiene un tremendo impacto económico. Las fracturas más comunes ocurren en las vértebras, el radio distal y la cadena. Se estima que un tercio de la población femenina de más de 65 años sufrirá fracturas vertebrales, causadas en parte por osteoporosis. Más aún, es probable que ocurran fracturas de cadena en aproximadamente una de cada tres mujeres y en uno de cada seis hombres de ancianidad extrema.
Se han identificado dos fases distintas de pérdida ósea. Una es un proceso lento y relacionado con la edad que ocurre en ambos géneros y comienza aproximadamente a los 35 años. Esta fase tiene una velocidad similar en ambos géneros y da como resultado pérdidas de cantidades similares de hueso cortical y canceloso (esponjoso o tipo reticulado. El hueso cortical predomina en el esqueleto apendicular mientras que el hueso canceloso se concentra en el esqueleto axial, particularmente las vértebras, así como en los extremos de huesos largos. La osteoporosis causada por pérdida ósea relacionada con la edad se conoce como osteoporosis de tipo II.
El otro tipo de pérdida ósea es acelerado, observado en mujeres postmenopáusicas y es causado por la deficiencia de estrógenos. Esta fase da como resultado una pérdida desproporcionada de hueso canceloso. La osteoporosis debida al agotamiento de estrógenos se conoce como osteoporosis de tipo I. Las principales manifestaciones clínicas de la osteoporosis tipo I son fracturas vertebrales, de cadena y antebrazo. Los sitios esqueléticos de estas manifestaciones contienen grandes cantidades de hueso trabecular. La producción de hueso es normalmente alta en osteoporosis tipo I. La resorción de hueso es incrementada pero existe una formación de hueso compensatoria inadecuada. La osteoporosis también ha estado relacionada con el uso de corti-costeroides, inmovilización o reposo en cama prolongado, alcoholismo, diabetes, quimioterapia gonadotóxica, hiper-prolactinemia, anorexia nerviosa, amenorrea primaria y secundaria, inmunosupresión por trasplante y ooforectomía.
El mecanismo mediante el cual se pierde el hueso en la osteoporosis se cree que incluye un desequilibrio en el proceso mediante el cual el esqueleto se renueva a sí mismo. Este proceso ha sido llamado remodelación ósea. Ocurre en una serie de cavidades discretas de actividad. Estas cavidades aparecen espontáneamente dentro de la matriz sobre una superficie de hueso dada como un sitio de resorción de hueso. Los osteoclastos (células de disolución o resorción de hueso) son responsables de la resorción de una porción de hueso de dimensión generalmente constante. Este proceso de resorción va seguido por la aparición de osteoblastos (células formadoras de hueso) las cuales rellenan después la cavidad dejada por los osteoclastos con hueso nuevo.
En un sujeto adulto sano, los osteoclastos y osteoblastos funcionan de tal manera que la formación de hueso y la resorción de hueso estén equilibradas. Sin embargo, en la osteoporosis se desarrolla un desequilibrio en el proceso de remodelación ósea que da como resultado que el hueso sea reemplazado a una velocidad más lenta de la que se pierde. Aunque este desequilibrio ocurre hasta cierto punto en la mayoría de los individuos el envejecer, es mucho más severo y ocurre a una edad más joven en osteoporosis postmenopáusica, después de ooforectomía, o en situaciones iatrogénicas tales como aquellas que resultan del uso de corticosteroides o inmunosupresores.
Se han sugerido varios enfoques para incrementar la masa ósea en humanos afectados de osteoporosis, incluyendo la administración de andrógenos, sales fluoruro y hormona paratiroide y versiones modificadas de hormona paratiroide. También se ha sugerido que los bisfosfonatos, calcitonina, calcio, 1,25-dihidroxi-vitamina D_{3} y/o estrógenos, solos o en combinación, podrían ser útiles para conservar la masa ósea existente.
La presente invención se basa en el descubrimiento de que los inhibidores de 15-lipoxigenasa son capaces de incrementar la formación de hueso neta y/o mejorar la acreción ósea e incrementar la curación de fracturas. Estas moléculas pueden ser suministradas solas o en combinación con agentes adicionales que inhiban la resorción ósea y/o incrementen la formación de hueso, particularmente agentes anabólicos.
La invención está dirigida a un método de identificación de compuestos para incrementar la densidad mineral ósea. El método consiste en poner en contacto un compuesto con la 15-lipoxigenasa y determinar si el compuesto inhibe la actividad de la 15-lipoxigenasa.
Estos y otros aspectos de la presente invención se harán evidentes después de la referencia a la siguiente descripción detallada y las figuras anexas.
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología, dentro de la capacidad de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg, Adavanced Organic Chemistry, 3ª edición (Plenum Press), vols. A y B (1992).
Para describir la presente invención se emplearán los siguientes términos, y están diseñados para ser definidos como se indica abajo.
Por "pérdida ósea" se intenta decir un desequilibrio en la relación de formación de hueso a resorción ósea que da como resultado menos hueso que el deseable en un paciente. La pérdida ósea puede ser el resultado de osteoporosis, osteotomía, periodontitis o aflojamiento prostético. La pérdida ósea también puede ser el resultado de osteoporosis secundaria la cual incluye osteoporosis inducida por glucocorticoides, osteoporosis inducida por hipertiroidismo, osteoporosis inducida por inmovilización, osteoporosis inducida por heparina u osteoporosis inducida por inmuno-supresores. El seguimiento de la pérdida ósea puede realizarse, por ejemplo, usando mediciones de densidad mineral ósea descritos abajo.
Por "acreción ósea incrementada" se intenta decir que la acumulación de hueso en un sujeto al que se le administran los inhibidores de 15-lipoxigenasa de la invención es mayor que la acumulación de hueso en un sujeto comparable al que no se le administra un inhibidor de 15-lipoxigenasa. Esta acreción ósea incrementada se determina típicamente en la presente al medir la densidad mineral ósea (BMD). Por ejemplo, la acreción ósea puede determinarse usando un modelo de animal, tal como un ratón, perro ovariectomizado, y similar. Al animal se le administra el compuesto de prueba y se mide la densidad mineral ósea (BMD) en los huesos que están normalmente agotados en osteoporosis tipo I y tipo II, tales como huesos de esqueleto apendicular y/o axial, particularmente la espina dorsal que incluye las vértebras, así como los extremos de huesos largos, tales como el fémur, radio medio y radio distal. Se conocen en la técnica varios métodos para determinar la BMD. Por ejemplo, mediciones de BMD pueden hacerse usando absorciometría de rayos X por energía o tomografía computada cuantitativa y similares (Véanse los ejemplos). En forma similar, una formación ósea incrementada puede determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las mediciones dinámicas de la velocidad de formación ósea (BFR) pueden llevarse a cabo en hueso canceloso marcado con tetraciclina de la espina lumbar y metáfisis de fémur distal usando morfometría digitalizada cuantitativa (véase, por ejemplo, Ling et al., Endocrinology (1999) 140:5780-5788). Como alternativa, marcadores de formación de hueso, tales como actividad de fosfatasa alcalina y niveles de osteocalcina en suero pueden establecerse para determinar indirectamente si ha ocurrido una formación de hueso incrementada (véase Looker et al., Osteoporosis International (2000) 11(6): 467-480).
Por "formación de hueso incrementada" se intenta decir que la cantidad de formación de hueso en un sujeto al que se le administren los inhibidores de 15-lipoxigenasa de la invención es incrementada sobre la velocidad de formación ósea en un sujeto al que no se le administre un inhibidor de 15-lipoxigenasa. Esta formación ósea incrementada se determina en la presente usando, por ejemplo, morfometría digitalizada cuantitativa, así como mediante otros marcadores de la formación de hueso, como los descritos abajo.
Por "inhibidor de 15-lipoxigenasa" se intenta decir un compuesto que inhibe 15-lipoxigenasa con una IC50 de menos de 1 \muM, de preferencia menos de 100 nM. Las IC50's pueden determinarse mediante métodos estándares. Un método particular es un ensayo colorimétrico en el cual el inhibidor putativo es preincubado con la enzima 15-lipoxigenasa durante aproximadamente 10 minutos seguido por la adición de sustrato de ácido linoleico durante 10 minutos adicionales. El producto, 13-HPODE, es cuantificado al copular la reducción del lípido hidroxiperoxilado a la oxidación en azul de N-benzoil-leucometileno en presencia de hemina a pH 5. La absorbancia del azul de metileno oxidado es directamente proporcional a la cantidad de 13-HPODE formado por la 15-lipoxigenasa, y se puede medir en presencia y ausencia de inhibidor. Este es un ensayo de punto final descrito en más detalle en "A Spectrophotometric Microtiter-Based Assay for the Detection of Hydroperoxy Derivatives of Linoleic Acid", Analytical Biochemistry, 201, 375-380 (1992); Bruce J. Auerbach, John S. Kiely y Joseph A. Cornicelli. Otros ensayos incluyen aquellos en los que la velocidad de reacción de enzima inicial se mide espectrofotométricamente al medir la formación de dienos conjugados a 234 nm.
Según se usa en la presente, el término "célula precursora" se refiere a una célula que no es completamente diferenciada o comprometida con una vía de diferenciación, y que generalmente no expresa marcadores o funciona como una célula madura y completamente diferenciada.
Según se usa en la presente, el término "células mesenquimáticas" o "células madre mesenquimáticas" se refiere a células progenitoras pluripotenciales que son capaces de dividirse muchas veces, y cuya progenie dará origen a tejidos esqueléticos, incluyendo cartílago, hueso, tendón, ligamento, estroma de médula y tejido conjuntivo (véase A. Caplan, J. Orthop. Res. (1991) 9:641-50).
Según se usa en la presente, el término células osteogénicas incluye osteoblastos y células precursoras de osteoblastos.
Los compuestos usados en la presente invención son aquellos que inhiben o reducen la actividad de 15-lipoxigenasa. En este contexto, la inhibición y reducción de la actividad enzimática se refiere a un nivel más bajo de actividad medida en relación a un experimento de control en el cual la enzima, célula o sujeto no es tratado con un compuesto de prueba. En modalidades particulares,, la inhibición o reducción en la actividad medida es al menos una reducción del 10% de inhibición. Una persona de capacidad en la técnica apreciará que la inhibición o reducción de la actividad medida de al menos 20%, 50%, 75%, 90% ó 100% o cualquier entero entre 10% y 100%, puede preferirse para aplicaciones particulares.- Típicamente, los inhibidores de 15-lipoxigenasa usados en esta invención tendrán IC50's de menos de 1 \muM, de preferencia menos de 100 mM.
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la 15-lipoxigenasa es un importante modulador de la pérdida ósea. En particular, un barrido de genoma de 100 marcadores de microsatélite en ratones llevó a la identificación de locus de susceptibilidad a trastorno de pérdida ósea en los cromosomas 1, 2, 4 y 11. Las diferencias en expresión génica, especialmente para genes codificados en el cromosoma 11, identificaron diferencias sustanciales en la expresión de un gen que codifica para 15-lipoxigenasa, de esta manera ligando la expresión de 15-lipoxigenasa a una densidad mineral ósea reducida.
Los compuestos que inhiben la actividad de 15-lipoxigenasa y previenen la resorción ósea o promueven la formación de hueso proporcionan importantes beneficios a esfuerzos para tratar osteoporosis. Los compuestos que inhiben la actividad de 15-lipoxigenasa se pueden usar en un método para tratar osteoporosis u osteoartritis mediante la inhibición de la resorción ósea osteoclástica o mediante la estimulación de la diferenciación de osteoblastos y la promoción de nueva formación de hueso. El ejemplo 1 muestra la capacidad de los inhibidores de 15-lipoxigenasa para promover la diferenciación de células madre mesenquimáticas humanas en osteoblastos in vitro. El ejemplo 2 muestra la capacidad de los inhibidores de 15-lipoxigenasa para promover la formación ósea en un modelo
in vivo.
Se pueden emplear varios métodos para identificar clases de inhibidores de 15-lipoxigenasa que también pueden prevenir la pérdida ósea y/o promover la formación de hueso. Un método usado para identificar compuestos que inhiben la actividad de 15-lipoxigenasa incluye poner células, tejidos o de preferencia un extracto celular u otra preparación que contenga 15-lipoxigenasa en contacto con varias concentraciones conocidas de un compuesto de prueba en un regulador de pH compatible con la actividad de 15-lipoxigenasa. El nivel de actividad de 15-lipoxigenasa para cada concentración de compuesto de prueba se mide mediante la cuantificación del producto enzimático y la IC50 (la concentración del compuesto de prueba a la cual se observa que la actividad ósea observada para una preparación de muestra cae a la mitad de su valor original o un valor de control) para el compuesto se determina usando técnicas estándares. Otros métodos para determinar la concentración inhibitoria de un compuesto de la invención contra 15-lioxigenasa se conocen por un experto en la técnica y pueden emplearse, como será aparente con base en la presente descripción. Los ensayos específicos que pueden usarse para identificar inhibidores de 15-lipoxigenasa incluyen aquellos descritos en la patente de E.U.A. nº 6.268.387B y 5.958.950 (ensayo con reticulocitos de conejo) y patente de E.U.A. nº 4.623.661 (ácido araquidónico marcado radiactivamente en células RBL-1).
Por ejemplo, los antagonistas pueden encontrarse normalmente una vez que un ligando haya sido definido estructuralmente. La prueba de análogos de ligando potenciales es ahora posible después del desarrollo de métodos de ensayo altamente automatizados usando células que responden fisiológicamente. En particular, nuevos agonistas y antagonistas serán descubiertos mediante el uso de técnicas de exploración descritas en la presente.
En otro método, el diseño racional de fármacos, con base en estudios estructurales de las formas moleculares de las quimiocinas, otros efectores o análogos, o los receptores, se pueden usar para identificar compuestos cuya estructura tridimensional sea complementaria a la del sitio activo de 15-lipoxigenasa. Estos compuestos pueden determinarse mediante una variedad de técnicas que incluyen cálculos de mecánica molecular, cálculos de dinámica molecular, cálculos de dinámica molecular restringida en los cuales las restricciones son determinadas mediante espectroscopia de RMN, geometría de distancia en la cual la matriz de distancia es determinada parcialmente por espectroscopia de RMN, difracción de rayos X, o técnicas de difracción de neutrones. En el caso de todas estas técnicas, la estructura puede determinarse en presencia o ausencia de cualquier ligando que se conozca interactúe con 15-lipoxigenasa.
Estos programas de computadora incluyen pero no están limitados a AMBER (disponible de la Universidad de California, San Francisco), CHARMM (Chemistry at Harvard Molecular Mechanics, disponible de Harvard University), MM2, SYBYL (Trypos Inc.), CHEMX (Chemical Design), MACROMODEL, GRID (Molecular Discovery Ltd) y Insight II (Accelryl). Estos programas se contemplan como útiles para la determinación de la interacción química entre dos moléculas, ya sea aisladas, o rodeadas por moléculas de solvente, tales como moléculas de agua, o usando cálculos que aproximen el efecto de solvatar las moléculas que interactúan. La orientación relativa de las dos puede determinarse manualmente, mediante inspección visual, o mediante el uso de otros programas de computadora que generen un gran número de orientaciones posibles. Ejemplos de programas de computadora incluyen pero no están limitados a DOCK y AutoDOCK. Cada orientación se puede probar para verificar su grado de complementariedad usando los programas de computadora. De esta manera, se pueden diseñar compuestos nuevos que sean capaces de inhibir 15-lipoxigenasa.
Otro método para identificar compuestos que puedan inhibir 15-lipoxigenasa incluye el uso de técnicas tales como espectroscopia UV/VIS, polarimetría, espectroscopia CD u ORD, espectroscopia IR o de Raman, espectroscopia de RMN, espectroscopia por fluorescencia, HPLC, electroforesis en gel, electroforesis en gel capilar, diálisis, refractometría, conductometría, microscopia de fuerza atómica, polarografía, dielectometría, calorimetría, solubilidad, EPR u espectroscopia de masas. La aplicación de estos métodos puede ser directa, en la cual la interacción del compuesto con 15-lipoxigenasa se mida directamente, o puede ser indirecta, en la cual un agente particular que tenga una propiedad espectroscópica útil se use como una sonda para verificar la capacidad de otros compuestos para unirse a 15-lipoxigenasa; por ejemplo, mediante desplazamiento o mediante enfriamiento rápido por fluorescencia.
En consecuencia, la presente invención proporciona un método para identificar compuestos que incrementan la densidad mineral ósea, el método comprende poner en contacto un compuesto con 15-lipoxigenasa y determinar si ese compuesto inhibe la actividad de 15-lipoxigenasa. De preferencia, el método comprende además probar el compuesto en un ensayo funcional que demuestre un efecto del compuesto en la formación de hueso. Más preferiblemente, el ensayo funcional comprende poner en contacto el compuesto con células madre mesenquimáticas humanas y determinar la diferenciación celular en células formadoras de hueso. En otra modalidad más preferida, el ensayo funcional comprende administrar el compuesto a un animal no humano y medir un índice de formación de hueso. En una modalidad que se prefiere más, el índice medido en la densidad mineral ósea. En otra modalidad preferida, el índice es un parámetro biomecánico de hueso.
En otra modalidad que se prefiere más, el ensayo funcional comprende poner en contacto el compuesto con células madre mesenquimáticas humanas y determinar la diferenciación celular en células formadoras de hueso, en donde la determinación de la diferenciación celular comprende llevar a cabo un ensayo de fosfatasa alcalina, un ensayo de calcio, un ensayo de preparación de ADN total o combinaciones de los mismos.
Los inhibidores de 15-lipoxigenasa identificados o diseñados de esta manera se pueden probar posteriormente para verificar su capacidad para evitar la pérdida ósea y/o promover la formación de hueso. En una modalidad se usan los métodos a base de computadora descritos arriba. En otro método, los compuestos se prueban para verificar su capacidad para modular objetivos conocidos de pérdida ósea, tales como, por ejemplo, receptores de estrógeno, receptor de factor de necrosis tumoral, receptor de integrina y similares. En otro método más, los compuestos se prueban para verificar su capacidad para diferenciar células madre en células óseas.
La figura 1 muestra la cuantificación de la actividad de fosfatasa alcalina en células madre mesenquimáticas humanas (hMSC) en respuesta a inhibidores de 15-lipoxigenasa Compuesto 1 o Compuesto 2 en relación al control de solvente únicamente (DMSO).
La figura 2 muestra la cuantificación de la actividad de fosfatasa alcalina en hMSC con Compuesto 3 o Compuesto 2 como inhibidores de 15-lipoxigenasa y DMSO o con 1,25-vitamina D_{3} como los controles.
La figura 3 muestra la cuantificación del contenido de calcio total de hMSC con Compuesto 3 o Compuesto 2 como inhibidores de 15-lipoxigenasa y DMSO o 1,25-vitamina D_{3} como los controles.
La figura 4 muestra la cuantificación de actividad de fosfatasa alcalina en hMSC cultivadas durante 9 días con los inhibidores de 5-LO Zilueton, AA-861 y Rev-5901 en relación a un control que sólo tenía solvente (DMSO). La falta de una respuesta contrasta con los efectos observados con los inhibidores de 15-lipoxigenasa.
La figura 5 muestra la cuantificación del contenido de calcio total de hMSC cultivadas durante 16 días con inhibidores de 5-LO Zileuton, AA-861 y Rev-5901 en relación a un control que sólo tiene un solvente (DMSO) o 1,25-vitamina D_{3}. La falta de una respuesta contrasta con los efectos observados con los inhibidores de 15-lipoxigenasa.
A continuación se muestran ejemplos de modalidades específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen únicamente por motivos ilustrativos, y no están diseñados para limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.
1
2
El Compuesto 1, ácido 3-(2-non-1-inilfenil)-propiónico, se describe en la patente de E.U.A. nº 5.972.980.
El Compuesto 2, 6,11-dihidro-5-tia-11-aza-benzo[a] fluoreno, se describe en WO 97/12613.
El Compuesto 3, 3-amino-N-(3,4-diclorofenil)-4-metoxi-benzamida, se describe en WO 99/32433.
El Compuesto 4, ácido 4,trans-3-(2-oct-1-inil-fenil)-acrílico se describe en la patente de E.U.A. nº 4.73.486.
El Compuesto 5, Zilueton, se describe en la patente de E.U.A. nº 4.873.259.
El Compuesto 6, éster isobutílico de ácido [[[5-(5,6-diflúor-1H-indol-2-il)-2-metoxifenil]-amino]-sulfonil]-carbámico, se describe en WO 01/96298.
Se han hecho esfuerzos por asegurar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero cierto error y desviación experimental debe, por supuesto, permitirse.
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Ejemplo 1
Capacidad de los inhibidores de 15-lipoxigenasa para incrementar la formación de hueso
Para determinar la capacidad de los inhibidores de 15-lipoxigenasa para estimular la formación de hueso y la acreción ósea, la capacidad de los inhibidores de 15-LO para promover medidas de diferenciación de células madre en células formadoras de hueso (osteoblastos) fue probada in vitro. En particular, la capacidad de tres inhibidores, Compuesto 1 (ácido 3-(2-non-1-inilfenil)-propiónico), Compuesto 2 (6,11-dihidro-5-tia-11-aza-benzo[a]fluoreno) y Compuesto 3 (3-amino-N-(3,4-diclorofenil)-4-metoxi-benzamida), preparados usando procedimientos de la literatura, para promover la diferenciación de células madre mesenquimáticas humanas en osteoblastos fue determinada al medir dos marcadores de diferenciación de osteoblastos, actividad de fosfatasa alcalina celular y contenido de calcio en cultivo.
En general, células madre mesenquimáticas humanas (hMSC, Poietics #PT-2501, BioWhittaker) se cultivaron en placas de cultivo recubiertas con colágeno de 12 pocillos a 3100 células por cm cuadrado en 1 ml de medio de cultivo (Clonetics cat#PT-4105 más inductores de osteoblastos (100 nM Dex, 0,5 mM de 2-fosfato de ácido L-ascórbico, 10 mM de beta-glicerolfosfato). Los tres inhibidores de la 15-LO fueron añadidos individualmente a cada uno de los cultivos, excepto por los pocillos de control a los cuales se les añadió 0,1% de DMSO (control negativo) o 1 nM de 1,25-vitamina D_{3} (control positivo). Las concentraciones de los inhibidores fueron las siguientes: Compuesto 1 a 3 y 30 \muM; Compuesto 2 a 0,1, 0,2, 0,3 ó 1,0 \muM y Compuesto 3 a 3, 10 ó 30 \muM. Cuatro a ocho cultivos replicados independientes se prepararon a cada nivel de dosis. Al final de los experimentos, las células cultivadas se cosecharon al raspar los pocillos en el medio adecuado para el análisis adicional ya sea de fosfatasa alcalina (Sigma equipo #104-LL), o calcio celular (Sigma equipo #587-M). Los cultivos cosechados para la determinación de fosfatasa alcalina fueron cosechados mediante el rayado de las células y la resuspensión en 250 \muL de Triton X-100 al 0,1% de pH regulado con Tris, y luego se ensayaron ya sea frescos o después de congelación-descongelación. Los cultivos separados a ser ensayados para contenido de calcio total fueron rayados y resuspendidos en 250 \mul de HCl 0,5 M. Los resultados de estos ensayos fueron normalizados a ADN celular total, normalizando de esta manera cuatro diferencias en la proliferación celular. Al mismo tiempo que los cultivos fueron cosechados para fosfatasa alcalina y calcio, se cosecharon cultivos replicados por separado al rayar las células y resuspenderlas en 250 \mul de solución salina equilibrada de Hank, y el número celular se evaluó mediante ADN (DNeasy Tissue Kit, Qiagen cat#69506).
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Cuantificación de la diferenciación de osteoblastos in vitro
Para la cuantificación de la actividad de fosfatasa alcalina, los inhibidores se prepararon en 0,1% de DMSO y se añadieron a los cultivos en el día 1 y cada 2-3 días posteriormente durante 14-16 días. Se llevaron a cabo tres conjuntos diferentes de experimentos.
En el primer conjunto experimental, Compuesto 1 o Compuesto 2 (0,2 \muM o 1 \muM) se usaron como inhibidores con el solvente (DMSO) como el control negativo, y cuatro cultivos replicados independientes se prepararon a cada nivel de dosis. Las placas se cultivaron durante 14 días. La actividad normalizada por ADN de fosfatasa alcalina se grafica en la figura 5.
El segundo conjunto experimental comprendía ocho cultivos por replicado con Compuesto 3 (3, 10 y 30 \muM) o Compuesto 2 (0,1, 0,3, 1,0 \muM) como los inhibidores de la 15-LO. Se añadieron inhibidores ya sea el día 1 o día 11. Se usó DMSO como el control negativo, y 1,25-vitamina D3 como el control positivo para la inducción de la diferenciación de osteoblastos. La actividad normalizada de fosfatasa alcalina y el contenido de calcio se grafica en las figuras 6 y 7, respectivamente. El Compuesto 2 fue más efectivo cuando se añadió el día 1, y el Compuesto 3 fue más efectivo cuando se añadió el día 11.
Como un control para la especificidad de inhibición de 15-LO para la inducción de la diferenciación de osteoblastos de células madre in vitro, el tercer conjunto de experimentos estudió ocho réplicas de inhibidores de lipoxigenasa estándares reconocidas como más específicas para la enzima 5-LO, en lugar de la enzima 15-LO. Zileuton (1, 10, 50 uM, preparado en Roche como) Compuesto 5, AA-861 (1, 10, 50 nM, Sigma#A3711) y Rev-5901 (15 uM,
Sigma#R5523) se prepararon frescos cada 2-3 días y se probaron en las células precursoras de osteoblastos humanos. Se encontró que los inhibidores de 5-LO carecían de la capacidad para inducir actividad de fosfatasa alcalina el día 9 o deposición de calcio en cultivo después de 16 días de cultivo, como se observa en las figuras 8 y 9, respectiva-
mente.
Los resultados de la cuantificación de los marcadores de diferenciación de osteoblastos, tanto actividad de fosfatasa alcalina como contenido de calcio en cultivo, en cultivos de hMSC estimulados para diferenciarse en osteoblastos demuestran que la adición de inhibidores de 15-lioxigenasa específicos promueve la diferenciación de las células formadoras de hueso humana in vitro.
Además, la capacidad de inhibidores de 15-lipoxigenasa para estimular la formación de hueso y acreción ósea se mide por el uso de ensayos clonogénicos en los que el potencial clonogénico de las células precursoras de médula ósea es medido. Las células de osteoblasto y osteoclasto se trataron con inhibidores de 15-lipoxigenasa. En un método, las células y los inhibidores se incuban in vitro. En otro método, al mamífero se le administra el inhibidor, los precursores de médula ósea se aíslan y luego se plaquean. Para ambos métodos, se miden las unidades formadoras de colonia derivadas de estas células de médula. Se puede tamizar para compuestos con el potencial de incrementar densidad mineral ósea si pueden mostrar incrementar el potencial clonogénico de osteoblastos de la médula o disminuir el potencial clonogénico de osteoclastos de la médula.
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Ejemplo 2
Los inhibidores de 15-lipoxigenasa promueven la formación de hueso in vivo
La capacidad de los inhibidores de 15-lipoxigenasa para promover la formación de hueso in vivo se evaluó al medir la capacidad de los inhibidores para mejorar parámetros óseos en un modelo de ratón con osteoporosis. La expresión constitutiva de un transgen de interleucina-4 del promotor del gen Lck (Lck-IL4) en ratones C57BL/6 da como resultado una severa osteoporosis de simulación de fenotipo óseo, (Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 11618-22, (1993)) y estos ratones e usaron para demostrar el efecto del tratamiento con los inhibidores de 15-LO en la masa ósea.
Los cuatro grupos experimentales usados se muestran en la tabla 2. En el momento del destete, ratones C57BL/6 tipo silvestre o Lck-IL4 transgénicos recibieron 150 mg/Kg bid diariamente del Compuesto 2 PD146176 en su alimento durante 84 días (Dieta 5001: 23% de proteína, 10% de grasa, 0,95% de calcio y 0,67% de fósforo; PMI Feeds, Inc., St. Louis, MO). Se permitió a los ratones tener acceso a la mitad de la ingesta alimenticia diaria dos veces al día a intervalos de aproximadamente 12 horas y la ingesta dietética se monitoreó diariamente. El agua estuvo disponible ad libitum. Los grupos de control recibieron la misma dieta sin Compuesto 2. Todos los grupos consumieron alimento igualmente bien durante el curso del experimento.
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TABLA 2
3
Tabla 2: Grupos experimentales usados para estudios de inhibidor in vivo. Después del destete (aproximadamente 28 días), a los ratones se les dio alimento con o sin inhibidor de 15-LO (Compuesto 2) durante 84 días. Los animales F, hembra y M, macho están representados por igual en los grupos.
Los efectos de la sobreexpresión de IL4 y la inhibición de 15-LO en parámetros de cuerpo entero, BMD femoral y geometría, así como biomecánica femoral se muestran en la tabla 3. La sobreexpresión de IL4 da como resultado una disminución significativa en la BMD de cuerpo entero, peso corporal y hematocrito, y un incremento en grasa corporal porcentual. La sobreexpresión de IL4 también redujo BMD femoral, área cortical, momento de inercia y espesor cortical en comparación con ratones C57BL/6 tipo silvestre. El incremento en el área de la médula en ratones Lck/IL4 se correlaciona con el hematocrito disminuido y anemia asociada que se han reportado. Además, la sobreexpresión de IL4 tuvo un efecto significativo en la biomecánica femoral, incluyendo carga a la falla disminuida, rigidez de hueso y resistencia de los huesos (tabla 3). Los ratones alimentados con el inhibidor de 15-LO (Compuesto 2) mostraron la reversión parcial de los efectos dañinos en cuerpo entero y hueso femoral (tabla 3). Los ratones tratados con fármaco tuvieron un incremento significativo en BMD de cuerpo entero, hematocrito, BMD femoral y espesor cortical en relación con los ratones de control que portaban el transgen Lck-IL4. De manera importante, los ratones tratados con inhibidor de la 15-LO tuvieron un incremento significativo en la biomecánica femoral, incluyendo carga a la falla, rigidez y resistencia. Esto es particularmente relevante para la osteoporosis toda vez que el nivel de resistencia ósea y carga a la falla son determinantes significativos en pacientes que desarrollan fracturas. En resumen, los resultados indican que la inhibición de 15-LO in vivo lleva a una BMD más alta y a una resistencia ósea más alta en un modelo de osteoporosis en animales.
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TABLA 3
4
5 
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La tabla 3 muestra los efectos de la sobreexpresión de IL4 e inhibidor de 15-LO en parámetros de sangre entera y hueso femoral. Los parámetros de sangre entera y hueso femoral se midieron en ratones que portaban el transgen Lck-IL4 que lleva a la sobreexpresión de IL4 en comparación con los controles de C57BL/6. Estos parámetros también se midieron en ratones Lcl-IL4 a los que se les alimentó el inhibidor de 15-LO Compuesto 2 en comparación con los controles de Lcl-IL4 no tratados. NC, Sin Cambios entre grupos. ns, el valor p no fue significativo.
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Animales
Todos los ratones usados en los experimentos in vivo fueron criados bajo condiciones idénticas en la Unidad Médica Veterinaria de Pórtland VA a partir de una existencia obtenida originalmente de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Los ratones de crianza se mantuvieron durante no más de tres generaciones de la existencia obtenida de The Jackson Laboratory. En el momento del destete los ratones fueron alojados por grupos (9-10 animales por jaula) en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (6:00 AM a 6:00 PM) a 21 \pm 2ºC. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de VA y se llevaron a cabo de acuerdo con los lineamientos de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales en investigación.
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Densitometría ósea
Las mediciones de minerales óseos se determinaron mediante absorciometría de rayos X de energía doble (DEXA). Todos los estudios se llevaron a cabo con un densitómetro Lunar PIXImus (Lunar Corp., Madison, WI). Análisis densitométricos de cuerpo entero se llevaron a cabo en ratones anestesiados que tenían cuatro meses de edad cuando la adquisición de la masa ósea adulta es completa. La ventana global fue definida como la imagen de cuerpo entero menos el calvario, mandíbula y dientes. Después del sacrificio, se removieron cuidadosamente los fémures derechos y se limpiaron de tejido adherente antes del barrido por DEXA.
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Procesamiento de las muestras
Ratones adultos (16 semanas de edad) fueron eutanizados mediante inhalación de CO_{2} y pesados hasta el 0,1 gramo más cercano. Se obtuvieron muestras de sangre cardiaca inmediatamente después del sacrificio y una alícuota pequeña de sangre entera se reservó para la determinación del hematocrito. Vértebras lumbares y ambos fémures fueron cosechados inmediatamente, envueltos en una gasa estéril impregnada con solución salina regulada en pH con fosfato y almacenados congelados al menos de aproximadamente -20ºC para análisis posteriores.
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Geometría de la diáfisis femoral
Los parámetros geométricos transversales de la diáfisis media de los fémures se determinaron usando microtomógrafo de rayos X portátil (Modelo 1074, Skyscan, Amberes, Bélgica). Se hicieron barridos a intervalos de 40 mm, y un corte localizado en el punto medio del fémur se analizó para área total (FCSA), área cortical (Ct Ar) y área de canal medular (Ma Ar). Además, usando los pixeles contenidos en la región cortical en la imagen digital, el radio del centroide del corte transversal a la fibra exterior en el plano anterior-posterior, el momento de inercia del área (Ixx) en el plano de flexión y el espesor cortical promedio (Ct Th) fueron calculados.
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Estudios biomecánicos
El fémur se probó hasta la falla en flexión de tres puntos sobre un aparato de prueba de materiales de alta resolución (Instron Modelo 4442, Canton, MA). La carga a la falla y rigidez se determinaron usando software de sistema. La resistencia a la flexión se calculó después usando las mediciones de área transversal determinadas anteriormente.
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Análisis de Datos
Todos los datos fueron analizados mediante un análisis de dos vías de variación (ANOVA) usando el paquete de software JMP (SAS Institute).
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Ejemplo 3
Capacidad de un inhibidor de 15-lipoxigenasa para incrementar la formación de hueso in vivo
Para determinar la capacidad de los inhibidores de 15-lipoxigenasa para estimular la formación de hueso y la acreción ósea, éster isobutílico de ácido [[[5-(5,6-diflúor-1H-indol-2il)-2-metoxifenil]-amino]-sulfonil]-carbámico, Compuesto 6, se preparó como se describe en WO 0196298 y se probó en el ensayo de ostopenia OVX de rata por deficiencia de estrógenos estándar.
Ratas de tres meses de edad fueron ovariectomizadas (Ovx) y se les administró 1 mg/Kg/día de Compuesto 6 ó 0,1 \mug/Kg/día de 1,25-dihidroxi-vitamina D_{3} (control positivo, abreviado Vit. D en la tabla) mediante alimentación oral una vez al día iniciando dos semanas después de la ovariectomía y continuando durante siete semanas. La dosis fue incrementada a 2 mg/Kg/día y se continuó hasta las 11 semanas. Los grupos de control, tanto simulado (ratas que no fueron ovariectomizadas) como Ovx, recibieron sólo vehículos. La densidad mineral ósea de la espina y cadera derecha se determinó usando el paquete de Software y Alta Resolución en un densitómetro óseo QDR-4500 (Halogic, Walthan, MA). Los animales fueron explorados al colocarlos en una posición supina de tal manera que el fémur derecho fuera perpendicular al cuerpo principal y la tibia fuera perpendicular al fémur. La densidad mineral ósea (g de mineral/cm^{2}) para los compuestos en la cadera y espina se dan en la tabla 4 abajo. Los animales tratados con el inhibidor de 15-LO mostraron BMD incrementada en la espina a > 3 semanas y en el fémur proximal a > 7 semanas. Los resultados se muestran en la tabla 4.
TABLA 4
6
Los valores en paréntesis son valores p frente al OVX en el mismo punto de tiempo. nd = sin datos.

Claims (7)

1. Un método para identificar compuestos que incrementen densidad mineral ósea, el método comprende poner en contacto un compuesto con la 15-lipoxigenasa y determinar si el compuesto inhibe la actividad de la 15-lipoxigenasa.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1 que comprende además probar el compuesto en un ensayo funcional que demuestre un efecto del compuesto en la formación de hueso.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, en el que el ensayo funcional comprende poner en contacto el compuesto con células madre mesenquimáticas humanas que no sean de origen embrionario humano y determinar la diferenciación celular en células formadoras de hueso.
4. El método de conformidad con la reivindicación 2, en el que el ensayo funcional consiste en administrar el compuesto a un animal no humano y medir un índice de formación de hueso.
5. El método de conformidad con la reivindicación 4 en el que el índice medido es densidad mineral ósea.
6. El método de conformidad con la reivindicación 4, en el que el índice es un parámetro biomecánico de hueso.
7. El método de conformidad con la reivindicación 3, en el que determinar la diferenciación celular comprende llevar a cabo un ensayo de fosfatasa alcalina, un ensayo de calcio, un ensayo de preparación de ADN total o combinaciones de los mismos.
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