DE60319156T2 - Methode zur Identifizierung von Verbindungen, die die Knochenmineral-Dichte erhöhen - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Knochenmineraldichte erhöhen.
  • Lipoxygenasen sind Nichthäm-Eisen-enthaltende Enzyme, die in Pflanzen und Tieren zu finden sind und die Oxygenierung bestimmter mehrfach ungesättigter Fettsäuren, wie Lipide und Lipoproteine, katalysieren. Es sind viele unterschiedliche Lipoxygenaseenzyme bekannt, die alle über eine charakteristische Oxidationswirkung verfügen. Säuger-Lipoxygenasen sind nach der Position in Arachidonsäure, die oxygeniert ist, benannt. Das Enzym 5-Lipoxygenase wandelt Arachidonsäure in 5-Hydroperoxyeicosatetraensäure (5-HPETE) um. Dies ist der erste Schritt im Stoffwechselweg, der 5-Hydroxyeicosatetraensäure (5-HETE) und die Leukotriene (LTs) ergibt. Dem ähnlich wandeln 12- und 15-Lipoxygenase Arachidonsäure in 12- bzw. 15-HPETE um. Die biochemische Reduktion von 12-HPETE führt zu 12-HETE, während 15-HETE der Präkursor einer Klasse von Verbindungen, die als Lipoxine bekannt sind, ist.
  • Mit den Produkten der Lipoxygenaseaktivität ist eine diverse Reihe biologischer Wirkungen verbunden und viele sind als Mediatoren in verschiedene Krankheitszustände verwickelt. Die C4- und D4-LTs sind potente Konstriktoren des menschlichen Bronchienglattmuskels; LTB4 und 5-HETE, die in der Synovia von Patienten mit Rheumatoidarthritis zu finden sind, sind potente chemotaktische Faktoren für Entzündungszellen wie polymorphokernige Leukozyten (Green und Lambeth, Tetrahedron, 39, 1687 (1983)); 12-HETE ist in hohen Konzentrationen im Hautgewebe von Patienten mit Psoriasis gefunden worden; es ist gezeigt worden, daß Lipoxine die Freisetzung des Lysozyms und Superoxidions aus Neutrophilen stimulieren. Daher spielen Lipoxygenaseenzyme eine wichtige Rolle bei der Biosynthese von Mediatoren für Asthma, Allergie, Arthritis, Psoriasis und Entzündungen, und Inhibitoren dieser Enzyme unterbrechen den biochemischen Stoffwechselweg, der in diese Krankheitszustände involviert ist.
  • Humane 15-Lipoxygenase (15-LO) katalysiert die Bildung von 15-S-Hydroxyeicosatetraensäure (15-S-HETE) aus Arachidonsäure (Kuhn und Borngraber, Lipoxygenases and Their Metabolites, Plenum Press, New York, (1999)). In Mäusen wird die Synthese von 15-S-HETE durch 12/15-Lipoxygenase (Alox15), welches das Maushomologon des humanen 15-LO ist, durchgeführt. Maus-12/15-LO wandelt Arachidonsäure in 12(S)-Hydroxyeicosatetraensäure und 15-S-HETE in einem 3:1 Verhältnis um, und kann ferner Linolsäure in 13-Hydroxyoctadecadiensäure (13-HODE) umwandeln.
  • 15-Lipoxygenase war bisher in die Pathogenese mehrerer Krankheiten, einschließlich Atherosklerose (Harats et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 2100–2105, (2000)), Asthma (Shannon et al., Am. Rev. Respir. Dis., 147, 1024–1028, (1993)), Krebs (Shureiqi et al., JNCI, 92, 1136–1142, (2000)) und Glomerulonephritis (Montero und Badr, Exp. Neph., 8, 14–19 (2000)) verwickelt. Es sind viele Klassen von Verbindungen identifiziert worden, die 15-Lipoxygenase inhibieren, einschließlich Phenole, Hydroxaminsäuren und acetylenische Fettsäuren (zusammengestellt in Kuhn und Borngraber, Lipoxygenases and Their Metabolites, Plenum Press, New York, (1999)). Das Spektrum der Inhibierungsaktivitäten variiert bei diesen Mitteln. Beispielsweise ist gezeigt worden, daß Nordihydroguaiaretinsäure ein Inhibitor von 5- und 15-Lipoxygenase ist, Naphthylhydroxamsäuren 5-, 12- und 15-Lipoxygenase inhibieren ( US-Patent Nr. 4,605,669 ) und ein Benzofluoren-15-lipoxygenaseinhibitor, PD146176, ist als relativ spezifisch für das 15-Lipoxygenaseenzym berichtet worden (Sendobry et al., Br. J. Pharm., 120, 1199–1206, (1997)). Der Beweis, daß 15-Lipoxygenase in Atherosklerose involviert ist, stammt aus Studien mit Mäusen mit einer gezielten Deletion von Alox15 (Alox15 –/–). Diese Alox15-Knockout-Mäuse zeigten anfänglich nur geringe phänotypische Unterschiede, einschließlich erhöhte 5-LO-Aktivität (Sun und Funk, J. Biol. Chem., 271, 24055–24062, (1996)). Jedoch reduzierte die Spaltung von Alox15 stark atherosklerotische Läsionen in apoE-defizienten (apoE –/–) Atherosklerose-anfälligen Mäusen (Cyrus et al., J. Clin Invest., 103, 1597–1604, (1999)).
  • Obgleich 5-LO in die Pathogenese mehrerer Krankheiten verwickelt ist, ist die biologische Funktion von Maus- oder Human-15-Lipoxygenase weder mit Sicherheit bestimmt worden, noch ist ein humaner klinischer Nutzen für Inhibitoren von 15-Lipoxygenase anerkannt wor den. Insbesondere ist bisher der Nutzen von 15-Lipoxygenaseinhibitoren zur Behandlung humaner Osteoporose und/oder Osteoarthritis nicht entdeckt worden.
  • Osteoporose wird durch eine Verringerung der Knochenmineraldichte in einem ausgebildeten Knochen verursacht und führt bei der kleinsten Verletzung zu Frakturen. Die Krankheit ist weit verbreitet und hat gewaltige wirtschaftliche Auswirkungen. Die üblichsten Frakturen treten an den Wirbeln, dem distalen Radius und der Hüfte auf. Schätzungsweise wird ein Drittel der weiblichen Population über 65 Jahre Wirbelfrakturen, die zum Teil durch Osteoporose verursacht wurden, haben. Überdies treten Hüftfrakturen voraussichtlich bei etwa einer von drei Frauen und einem von sechs Männern in extrem hohem Alter auf.
  • Es sind zwei unterschiedliche Phasen von Knochenschwund identifiziert worden. Eine ist ein langsamer, altersbedingter Prozeß, der bei beiden Geschlechtern auftritt und mit einem Alter von etwa 35 beginnt. Diese Phase verläuft bei beiden Geschlechtern ähnlich schnell und führt zu Verlusten ähnlicher Mengen kortikalen und porösen (schwamm- oder gitterartigen) Knochens. Kortikalknochen dominiert im Gliedmaßenskelett, während Knochenspongiosa im Achsenskelett, insbesondere den Wirbeln, sowie in den Enden der Röhrenknochen konzentriert ist. Osteoporose, die durch einen altersbedingten Knochenschwund verursacht wird, ist als Typ II-Osteoporose bekannt.
  • Die andere Art des Knochenschwundes ist beschleunigt, tritt bei Frauen nach der Menopause auf und wird durch Östrogenmangel verursacht. Diese Phase führt zu einem unverhältnismäßigen Verlust von Knochenspongiosa. Osteoporose aufgrund von Östrogenverarmung ist als Typ-I-Osteoporose bekannt. Die klinischen Haupterscheinungen von Typ I-Osteoporose sind Wirbel-, Hüft- und Unterarmfrakturen. Die Skelettstellen dieser Erscheinungen enthalten große Mengen von Trabekelknochen. Bei einer Type I-Osteoporose ist der Knochenumsatz für gewöhnlich hoch. Die Knochenresorption ist erhöht, es gibt jedoch nur eine unangemessene ausgleichende Knochenbildung. Osteoporose ist auch mit der Verwendung von Kortikosteroid, Immobilisierung oder längerer Bettruhe, Alkoholismus, Diabetes, gonadotoxischer Chemotherapie, Hyperprolactinämie, Magersucht, primärer und sekundärer Amenorrhoe, Transplantat-Immunosuppression und Ovariektomie verbunden.
  • Es wird angenommen, daß der Mechanismus, durch den Knochen bei Osteoporose verloren geht, ein Ungleichgewicht in dem Prozeß, durch den das Skelett sich selbst erneuert, mit sich bringt. Dieser Prozeß wird als Knochennachbildung bezeichnet. Er findet in einer Reihe einzelner Aktivitätsherde statt. Diese Herde erscheinen spontan in der Knochenmatrix auf einer vorgegebenen Knochenoberfläche als eine Stelle der Knochenresorption. Osteoklasten (Zellen, die Knochen auflösen oder resorbieren) sind für die Resorption eines Teils von einem Knochen mit allgemein konstanten Ausmaßen verantwortlich. Nach dem Resorptionsprozeß erscheinen Osteoblasten (knochenbildende Zellen), die dann den von den Osteoklasten hinterlassenen Hohlraum mit neuem Knochen füllen.
  • Bei einem gesunden erwachsenen Patienten funktionieren Osteoklasten und Osteoblasten so, daß die Knochenbildung und die Knochenresorption ausgeglichen sind. Bei Osteoporose entwickelt sich jedoch ein Ungleichgewicht im Knochennachbildungsprozeß, was dazu führt, daß der Knochen langsamer ersetzt wird als er schwindet. Obgleich dieses Ungleichgewicht bei den meisten Individuen zu einem gewissen Grad auftritt, wenn sie altern, ist es bei Osteoporose nach der Menopause, nach einer Ovariektomie oder in iatrogenen Situationen wie denen, die aus der Verwendung von Kortikosteroiden oder Immunosuppressiva resultieren, schwerer und tritt in einem jüngeren Alter auf.
  • Zur Erhöhung der Knochenmasse bei Menschen, die von Osteoporose betroffen sind, sind verschiedene Ansätze vorgeschlagen worden, einschließlich der Verabreichung von Androgenen, Fluoridsalzen und Parathyroidhormonen und modifizierten Versionen des Parathyroidhormons. Zudem ist darauf hingewiesen worden, daß Bisphosphonate, Calcitonin, Calcium, 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 und/oder Östrogene allein oder in Kombination zur Konservierung der existierenden Knochenmasse dienen könnte.
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß Inhibitoren von 15-Lipoxygenase die Nettoknochenbildung erhöhen und/oder das Knochenzusammenwachsen und die Frakturheilung verstärken können. Diese Moleküle können allein oder in Kombination mit weiteren Mitteln, die die Knochenresorption erhöhen und/oder die Knochenbildung verstärken, insbesondere Anabolika, abgegeben werden.
  • Die Erfindung ist auf ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Knochenmineraldichte erhöhen, gerichtet. Das Verfahren umfaßt das Kontaktieren einer Verbindung mit 15-Lipoxygenase und das Bestimmen, ob die Verbindung 15-Lipoxygenaseaktivität inhibiert.
  • Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden ausführlichen Beschreibung und der anhängenden Figuren ersichtlich. Die Praxis der vorliegenden Erfindung wird, sofern nicht etwas anderes angegeben ist, die herkömmlichen Verfahren der Proteinchemie, Biochemie, rekombinanter DNA-Techniken und Pharmakologie nach dem Stand der Technik einsetzen. Solche Techniken sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Siehe z. B. T. E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993); A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., aktuelle Ergänzung); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual (2. Auflage, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan Hrsg., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry, 3. Aufl. (Plenum Press) Bd. A und B (1992).
  • In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Ausdrücke verwendet, die wie nachstehend angezeigt definiert sein sollen.
  • Unter „Knochenschwund" ist ein Ungleichgewicht im Verhältnis von Knochenbildung zu Knochenresorption zu verstehen, das zu weniger Knochen als gewünscht bei einem Patienten führt. Knochenschwund kann aus Osteoporose, Osteotomie, Periodontitis oder Prothesenlokkerung resultieren. Knochenschwund kann auch aus sekundärer Osteoporose resultieren, die Glucokortikoid-induzierte Osteoporose, durch Hyperthyreose induzierte Osteoporose, durch Immobilisierung induzierte Osteoporose, Heparin-induzierte Osteoporose oder durch Immunosuppression induzierte Osteoporose umfaßt. Knochenschwund kann beispielsweise unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Knochenmineraldichte-Messungen überwacht werden.
  • Unter „erhöhtem Knochenzusammenwachsen" ist zu verstehen, daß die Knochenakkumulation bei einem Patienten, dem die 15-Lipoxygenaseinhibitoren der Erfindung verabreicht wur den, gegenüber der Knochenakkumulation bei einem vergleichbaren Patienten, dem kein 15-Lipoxygenaseinhibitor verabreicht wurde, erhöht ist. Ein solch erhöhtes Knochenzusammenwachsen wird hierin typischerweise durch das Messen der Knochenmineraldichte (BMD) bestimmt. Beispielsweise kann das Knochenzusammenwachsen unter Verwendung eines Tiermodells, wie einer Maus, eines Hundes und dergleichen, denen die Eierstöcke entfernt wurden, bestimmt werden. Dem Tier wird die Testverbindung verabreicht und die Knochenmineraldichte (BMD) in Knochen, die normalerweise infolge von Typ I- oder Typ II-Osteoporose erschöpft sind, wie Knochen des Gliedmaßen- und/oder Achsenskeletts, insbesondere der Spina, einschließlich der Wirbel, sowie in den Enden von Röhrenknochen, wie dem Femur, mittleren Radius und distalen Radius, gemessen. In der Technik sind mehrere Verfahren zur Bestimmung der BMD bekannt. Beispielsweise können BMD-Messungen unter Verwendung von Dual-Spektren-Röntgen-Absorptiometrie oder quantitativer computergestützter Tomographie und dergleichen vorgenommen werden (siehe Beispiele). Dem ähnlich kann eine erhöhte Knochenbildung unter Verwendung von Verfahren, die in der Technik allgemein bekannt sind, bestimmt werden. Beispielsweise können dynamische Messungen der Knochenbildungsrate (BFR) an Tetracyclin-markierter Knochenspongiosa aus der Lumbalspina und distaler Femurmetaphyse unter Verwendung quantitativer digitalisierter Morphometrie (siehe z. B. Ling et al., Endocrinology (1999) 140: 5780–5788) vorgenommen werden. Alternativ können Knochenbildungsmarker wie alkalische Phosphataseaktivität und Serum-Osteokalzin-Konzentrationen zur indirekten Bestimmung, ob eine erhöhte Knochenbildung aufgetreten ist, beurteilt werden (siehe Looker et al., Osteoporosis International (2000) 11 (6): 467–480).
  • Unter „erhöhter Knochenbildung" ist zu verstehen, daß das Ausmaß der Knochenbildung bei einem Patienten, dem die 15-Lipoxygenaseinhibitoren der Erfindung verabreicht wurden, gegenüber der Knochenbildungsrate bei einem Patienten, dem kein 15-Lipoxygenaseinhibitor gegeben wurde, erhöht ist. Solch eine erhöhte Knochenbildung wird hierin beispielsweise unter Verwendung quantitativer digitalisierter Morphometrie sowie durch andere Marker der Knochenbildung wie oben beschrieben bestimmt.
  • Unter „Inhibitor von 15-Lipoxygenase" ist eine Verbindung zu verstehen, die 15-Lipoxygenase mit einem IC50 von weniger als 1 µM, bevorzugt weniger als 100 nM, inhibiert. Die IC50-Werte können durch Standardverfahren bestimmt werden. Ein spezielles Verfahren ist ein kolorimetrischer Assay, in dem der putative Inhibitor für etwa 10 Minuten mit dem 15-Lipoxygenaseenzym vorinkubiert wird, gefolgt von der Zugabe eines Linolsäuresubstrats für weitere 10 Minuten. Das Produkt, 13-HPODE, wird durch Kopplung der Reduktion des hydroperoxylierten Lipids mit der Oxidation an N-Benzoyl-leucomethylenblau in Gegenwart von Hämin bei einem pH von 5 quantifiziert. Das Absorptionsvermögen des oxidierten Methylenblau ist direkt proportional zur Menge von 13-HPODE, das durch die 15-Lipoxygenase gebildet wurde, und kann in Gegenwart und Abwesenheit eines Inhibitors gemessen werden. Dies ist ein Endpunktassay, der in „A Spectrophotometric Microtiter-Based Assay for the Detection of Hydroperoxy Derivatives of Linoleic Acid", Analytical Biochemistry, 201, 375–380 (1992); Bruce J. Auerbach, John S. Kiely und Joseph A. Cornicelli ausführlich beschrieben wird. Andere Assays umfassen die, in denen die anfängliche Enzymreaktionsrate spektrophotometrisch durch Messen der Bildung eines konjugierten Diens bei 234 nm gemessen wird.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Präkursorzelle" auf eine Zelle, die nicht vollständig differenziert oder einem Differenzierungsweg zugewiesen ist, und die im allgemeinen keine Marker exprimiert oder als eine reife, vollständig differenzierte Zelle agiert.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Mesenchymzellen" oder „Mesenchymstammzellen" auf pluripotente Präkursorzellen, die sich mehrmals teilen können und deren Nachkommen Skelettgewebe, einschließlich Knorpel, Knochen, Sehne, Ligament, Markstroma und Bindegewebe erzeugen wird (siehe A. Caplan J. Orthop. Res. (1991) 9: 641–50).
  • Wie hierin verwendet, umfaßt der Ausdruck „Knochenbildungszellen" Osteoblasten und Osteoblast-Präkursorzellen.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen sind die, die die Aktivität von 15-Lipoxygenase inhibieren oder reduzieren. In diesem Kontext bezieht sich Inhibierung und Reduktion der Enzymaktivität auf ein geringeres Niveau gemessener Aktivität, bezogen auf ein Kontrollexperiment, in dem das Enzym, die Zelle oder der Patient nicht mit der Testverbindung behandelt wurde. In besonderen Ausführungsformen ist die Inhibierung oder Reduktion der gemessenen Aktivität mindestens eine 10%ige Reduktion oder Inhibierung. Ein Fachmann wird erkennen, daß eine Reduktion oder Inhibierung der gemessenen Aktivität von mindestens 20%, 50%, 75%, 90% oder 100% oder einer ganzen Zahl zwischen 10% und 100% für bestimmte Anwendungen bevorzugt sein kann. Typischerweise werden die in dieser Erfindung verwendeten 15-Lipoxygenaseinhibitoren IC50-Werte von weniger als 1 µM, bevorzugt weniger als 100 nM, aufweisen.
  • Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung, daß 15-Lipoxygenase ein wichtiger Modulator der Knochenmasse ist. Genauer gesagt, führte das Genomabtasten von 100 Mikrosatellitenmarkern in Mäusen zur Identifizierung von Empfänglichkeitsstellen für Knochenschwund an den Chromosomen 1, 2, 4 und 11. Die Unterschiede bei der Genexpression, insbesondere für Gene, kodiert an Chromosom 11, identifizierten deutliche Unterschiede bei der Expression eines Gens, daß für 15-Lipoxygenase kodiert, wobei die Expression von 15-Lipoxygenase mit einer verringerten Knochenmineraldichte verbunden ist.
  • Verbindungen, die die 15-Lipoxygenaseaktivität inhibieren und die Knochenresorption verhindern oder die Knochenbildung fördern, liefern wichtige Vorteile hinsichtlich der Bemühungen bei der Behandlung von Osteoporose. Verbindungen, die die 15-Lipoxygenaseaktivität inhibieren, können in einem Verfahren zur Behandlung von Osteoporose oder Osteoarthritis durch die Inhibierung der osteoklastischen Knochenresorption oder durch Stimulierung der Osteoblastendifferenzierung und Förderung der Bildung neuen Knochens verwendet werden. Beispiel 1 zeigt die Fähigkeit von 15-Lipoxygenaseinhibitoren der Förderung der Differenzierung menschlicher Mesenchymstammzellen in Osteoblasten in vitro. Beispiel 2 zeigt die Fähigkeit von 15-Lipoxygenaseinhibitoren der Förderung der Knochenbildung in einem In-vivo-Modell.
  • Es können mehrere Verfahren zur Identifizierung von Klassen von 15-Lipoxygenaseinhibitoren, die auch Knochenschwund verhindern und/oder die Knochenbildung fördern, eingesetzt werden. Ein Verfahren, das zur Identifizierung von Verbindungen verwendet wird, die die 15-Lipoxygenaseaktivität inhibieren, umfaßt das Kontaktieren von Zellen, Geweben oder bevorzugt eines Zellextrakts oder eines anderen Präparats, das 15-Lipoxygenase enthält, mit mehreren bekannten Konzentrationen einer Testverbindung in einem Puffer, der mit der 15-Lipoxygenaseaktivität kompatibel ist. Das Niveau der 15-Lipoxygenaseaktivität für jede Konzentration der Testverbindung wird durch Quantifizierung des Enzymproduktes und des IC50 (die Konzentration der Testverbindung, bei der die beobachtete Aktivität für ein Proben präparat auf die Hälfte seines ursprünglichen oder eines Kontrollwertes abfällt) für die Verbindung unter Verwendung von Standardtechniken bestimmt. Andere Verfahren zur Bestimmung der inhibierenden Konzentration einer Verbindung der Erfindung gegen 15-Lipoxygenase sind einem Fachmann bekannt und können, basierend auf der Offenbarung hierin, eingesetzt werden. Spezielle Assays, die zur Identifizierung von 15-Lipoxygenaseinhibitoren verwendet werden können, umfassen die in US-Patent Nr. 6,268,387 B1 und 5,958,950 (Kaninchen-Retikulozyt-Assay) und US-Patent Nr. 4,623,661 (radioaktiv markierte Arachidonsäure in RBL-1-Zellen) beschriebenen.
  • Beispielsweise sind Antagonisten üblicherweise nach der strukturellen Definierung eines Liganden zu finden. Das Testen potentieller Ligandenanaloga ist nunmehr nach Entwicklung hoch automatisierter Assayverfahren unter Verwendung physiologisch reagierender Zellen möglich. Genauer gesagt, werden neue Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der hierin beschriebenen Screeningtechniken entdeckt werden.
  • In einem anderen Verfahren kann rationales Arzneimitteldesign, basierend auf Strukturstudien der molekularen Formen der Chemokine, anderer Effektoren oder Analoga oder den Rezeptoren zur Identifizierung von Verbindungen, deren dreidimensionale Struktur komplementär zu der der aktiven Stelle von 15-Lipoxygenase ist, verwendet werden. Diese Verbindungen können durch eine Vielzahl von Techniken, die molekulare Mechanikberechnungen, molekulare Dynamikberechnungen, eingeschränkte molekulare Dynamikberechnungen, bei denen die Beschränkungen durch NMR-Spektroskopie bestimmt werden, Distanzgeometrie, bei der die Distanzmatrix teilweise durch NMR-Spektroskopie bestimmt wird, Röntgenstrahlenbeugungs- oder Neutronenbeugungs-Techniken bestimmt werden. Bei all diesen Techniken kann die Struktur in Gegenwart oder Abwesenheit von Liganden, die bekanntermaßen mit 15-Lipoxygenase interagieren, bestimmt werden.
  • Solche Computerprogramme umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, AMBER (erhältlich von der University of California, San Francisco), CHARMM (Chemistry at HARvard Molecular Mechanics, erhältlich von der Harvard University), MM2, SYBYL (Trypos Inc.), CHEMX (Chemical Design), MACROMODEL, GRID (Molecular Discovery Ltd.) und Insight II (Accelryl). Solche Programme werden als für die Bestimmung der chemischen Interaktion zwischen zwei Molekülen, entweder isoliert oder von Lösungsmittelmolekülen wie Wassermolekülen umgeben, oder unter Verwendung von Berechnungen, die die Wirkung der Solvatisierung der interagierenden Moleküle annähern, nützlich betrachtet. Die relative Orientierung der beiden kann manuell, durch visuelle Inspektion oder durch die Verwendung anderer Computerprogramme, die eine große Anzahl möglicher Orientierungen erzeugen, bestimmt werden. Beispiele für Computerprogramme umfassen, sind aber nicht beschränkt auf DOCK und AutoDOCK. Jede Orientierung kann unter Verwendung der Computerprogramme auf ihren Komplementaritätsgrad getestet werden. So können neue Verbindungen gestaltet werden, die 15-Lipoxygenase inhibieren können.
  • Ein anderes Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die 15-Lipoxygenase inhibieren können, umfaßt die Verwendung von Techniken wie UV/VIS-Spektroskopie, Polarimetrie, CD- oder ORD-Spektroskopie, IR- oder Raman-Spektroskopie, NMR-Spektroskopie, Fluoreszenzspektroskopie, HPLC, Gelelektrophorese, Kapillargelelektrophorese, Dialyse, Refraktometrie, Konduktometrie, Rasterkraftmikroskopie, Polarographie, Dielektrometrie, Kalorimetrie, Löslichkeit, EPR- oder Massenspektroskopie. Die Anwendung dieser Verfahren kann direkt erfolgen, wobei die Interaktion der Verbindung mit 15-Lipoxygenase direkt gemessen wird, oder indirekt, wobei ein bestimmtes Mittel mit einer nützlichen spektroskopischen Eigenschaft als eine Sonde für die Fähigkeit anderer Verbindungen, 15-Lipoxygenase zu binden, verwendet wird; beispielsweise durch Verlagerung oder durch Fluoreszenzlöschung.
  • Demgemäß liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Knochenmineraldichte erhöhen, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer Verbindung mit 15-Lipoxygenase und das Bestimmen, ob die Verbindung die 15-Lipoxygenaseaktivität inhibiert, umfaßt. Bevorzugt umfaßt das Verfahren ferner das Testen der Verbindung in einem funktionellen Assay, der eine Wirkung der Verbindung auf die Knochenbildung demonstriert. Stärker bevorzugt umfaßt der funktionelle Assay das Kontaktieren der Verbindung mit menschlichen Mesenchymstammzellen und das Bestimmen der zellulären Differenzierung zu knochenbildenden Zellen. In einer weiteren, stärker bevorzugten Ausführungsform umfaßt der funktionelle Assay die Verabreichung der Verbindung an ein nichtmenschliches Lebewesen und das Messen eines Anzeichens für die Knochenbildung. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist das gemessene Anzeichen die Knochenmineraldichte. In einer weiteren am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist das Anzeichen ein biomechanischer Parameter des Knochens.
  • In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform umfaßt der funktionelle Assay das Kontaktieren der Verbindung mit menschlichen Mesenchymstammzellen und das Bestimmen der zellulären Differenzierung zu knochenbildenden Zellen, wobei das Bestimmen der zellulären Differenzierung die Durchführung eines alkalische Phosphatase-Assays, eines Calcium-Assays, eines Gesamt-DNA-Präparations-Assays oder Kombinationen davon umfaßt.
  • Die so identifizierten oder gestalteten 15-Lipoxygenaseinhibitoren können anschließend hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Knochenschwund zu verhindern und/oder die Knochenbildung zu fördern, getestet werden. In einer Ausführungsform werden die oben erörterten computerbasierenden Verfahren verwendet. In einem weiteren Verfahren werden die Verbindungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit, bekannte Targets für Knochenschwund wie beispielsweise Östrogenrezeptoren, den Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor, den Integrin-Rezeptor und dergleichen zu modulieren, getestet. In einem noch anderen Verfahren werden die Verbindungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Stammzellen zu Knochenzellen zu differenzieren, getestet.
  • 1 zeigt die Quantifizierung der alkalischen Phosphataseaktivität in menschlichen Mesenchymstammzellen (hMSC) in Reaktion auf die 15-Lipoxygenaseinhibitoren Verbindung 1 oder Verbindung 2, bezogen auf eine Kontrolle mit nur Lösungsmittel (DMSO).
  • 2 zeigt die Quantifizierung der alkalischen Phosphataseaktivität in hMSC mit Verbindung 3 oder Verbindung 2 als 15-Lipoxygenaseinhibitoren und DMSO oder 1,25-Vitamin D3 als Kontrollen.
  • 3 zeigt die Quantifizierung des Gesamtcalciumgehalts an hMSC mit Verbindung 3 oder Verbindung 2 als 15-Lipoxygenaseinhibitoren und DMSO oder 1,25-Vitamin D3 als Kontrollen.
  • 4 zeigt die Quantifizierung der alkalischen Phosphataseaktivität in hMSC, kultiviert für 9 Tage, mit den 5-LO-Inhibitoren Zileuton, AA-861 und Rev-5901, bezogen auf eine Kontrolle mit nur Lösungsmittel (DMSO). Der Mangel einer Reaktion steht im Gegensatz zu den Wirkungen, die mit den Inhibitoren von 15-Lipoxygenase zu sehen sind.
  • 5 zeigt die Quantifizierung der alkalischen Phosphataseaktivität in hMSC, kultiviert für 16 Tage, mit den 5-LO-Inhibitoren Zileuton, AA-861 und Rev-5901, bezogen auf Kontrollen mit nur Lösungsmittel (DMSO) oder 1,25-Vitamin D3. Der Mangel einer Reaktion steht im Gegensatz zu den Wirkungen, die mit den Inhibitoren von 15-Lipoxygenase zu sehen sind.
  • Nachstehend finden sich Beispiele spezieller Ausführungsformen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken.
  • Figure 00120001
  • Verbindung 1, 3-(2-Non-1-inylphenyl)-propionsäure, ist in US-Patent Nr. 5,972,980 beschrieben.
  • Verbindung 2, 6,11-Dihydro-5-thia-11-aza-benzo[a]fluoren, ist in WO 97/12613 beschrieben.
  • Verbindung 3, 3-Amino-N-(3,4-dichlorphenyl)-4-methoxybenzamid, ist in WO 99/32433 beschrieben.
  • Verbindung 4, trans-3-(2-Oct-1-inyl-phenyl)-acrylsäure, ist in US-Patent Nr. 4,713,486 beschrieben.
  • Verbindung 5, Zilueton, ist in US-Patent Nr. 4,873,259 beschrieben.
  • Verbindung 6, [[[5-(5,6-Difluor-1H-indol-2-yl)-2-methoxyphenyl]amino]sulfonyl]-carbamidsäure-isobutylester, ist in WO 01/96298 beschrieben.
  • Man hat sich bemüht hinsichtlich der verwendeten Zahlen (z. B. Mengen, Temperaturen usw.) genau zu arbeiten, kleine experimentelle Fehler und Abweichungen sollten selbstverständlich aber auch eingeräumt werden.
  • Beispiel 1
  • Fähigkeit von 15-Lipoxygenaseinhibitoren, die Knochenbildung zu erhöhen
  • Zur Bestimmung der Fähigkeit von Inhibitoren von 15-Lipoxygenase, die Knochenbildung und das Knochenzusammenwachsen zu erhöhen, wurde die Fähigkeit der 15-LO-Inhibitoren, Maßnahmen zur Differenzierung von Stammzellen zu knochenbildenden Zellen (Osteoblasten) zu fördern, in vitro getestet. Genauer gesagt, wurde die Fähigkeit dreier Inhibitoren, der Verbindung 1 (3-(2-Non-1-inylphenyl)-propionsäure), der Verbindung 2 (6,11-Dihydro-5-thia-11-aza-benzo[a]fluoren) und der Verbindung 3 (3-Amino-N-(3,4-dichlorphenyl)-4-methoxybenzamid), hergestellt unter Verwendung von Verfahren aus der Literatur, die Differenzierung menschlicher Mesenchymstammzellen zu Osteoblasten zu fördern, durch das Messen zweier Marker der Osteoblasten-Differenzierung, der zellulären alkalische Phosphataseaktivität und des Kulturcalciumgehaltes bestimmt.
  • Im allgemeinen wurden menschliche Mesenchymstammzellen (hMSC, Poietics#PT-2501, BioWhittaker) in Kollagen-beschichteten 12-Loch-Kulturplatten bei 3100 Zellen pro Qua dratzentimeter in 1 ml Kulturmedium (Clonetics cat#PT-4105 plus Osteoblasteninducer) (100 nM Dex, 0,05 mM L-Ascorbinsäure-2-phosphat, 10 mM beta-Glycerolphosphat) kultiviert. Die drei 15-LO-Inhibitoren wurden einzeln in jede Kultur gegeben, außer in Kontrollöcher, in die 0,1% DMSO (Negativkontrolle) oder 1 nM 1,25-Vitamin D3 (Positivkontrolle) gegeben wurde. Die Konzentrationen der Inhibitoren waren wie folgt: Verbindung 1 bei 3 und 30 µM; Verbindung 2 bei 0,1, 0,2, 0,3 oder 1,0 µM und Verbindung 3 bei 3, 10 oder 30 µM. Für jede Dosiskonzentration wurden vier bis acht unabhängige Replikatkulturen angefertigt. Am Ende der Experimente wurden die kultivierten Zellen durch Ausschaben der Löcher in das entsprechende Medium zur weiteren Analyse auf entweder alkalische Phosphatase (Sigma Kit#104-LL) oder zelluläres Calcium (Sigma Kit#587-M) geerntet. Die für die Bewertung der alkalischen Phosphatase geernteten Kulturen wurden durch Ausschaben der Zellen und erneutes Suspendieren in 250 µl Tris-gepuffertem 0,1% Triton X-100 geerntet und dann frisch oder nach Gefrieren/Auftauen analysiert. Separate Kulturen zur Analyse in bezug auf den Gesamtcalciumgehalt wurden ausgeschabt und in 250 µl 0,5 M HCl erneut suspendiert. Die Ergebnisse dieser Assays wurden hinsichtlich der gesamten zellulären DNA und dadurch in bezug auf Differenzen bei der Zellproliferation normalisiert. Gleichzeitig mit dem Ernten der Kulturen für alkalische Phosphatase und Calcium wurden separate Replikatkulturen durch Ausschaben der Zellen und erneutes Suspendieren in 250 µl Hanks Mineralsalzmedium geerntet, und die Zellanzahl durch DNA (DNeasy Tissue Kit, Qiagen cat#69506) bestimmt.
  • Quantifizierung der Osteoblastendifferenzierung in vitro
  • Zur Quantifizierung der alkalische Phosphatase-Aktivität wurden die Inhibitoren in 0,1% DMSO hergestellt und den Kulturen an Tag 1 und alle 2–3 Tage danach für 14–16 Tage zugegeben. Es wurden unterschiedliche Experimentreihen durchgeführt.
  • In der ersten Experimentreihe wurden Verbindung 1 oder Verbindung 2 (0,2 µM oder 1 µM) als Inhibitoren mit dem Lösungsmittel (DMSO) als Negativkontrolle verwendet und vier unabhängige Replikatkulturen für jede Dosiskonzentration hergestellt. Die Platten wurden für 14 Tage kultiviert. Die DNA-normalisierte Aktivität der alkalischen Phosphatase ist in 5 eingezeichnet.
  • Die zweite Experimentreihe bestand aus acht Replikatkulturen mit Verbindung 3 (3, 10 und 30 µM) oder Verbindung 2 (0,1, 0,3, 1,0 µM) als 15-LO-Inhibitoren. Die Inhibitoren wurden entweder an Tag 1 oder Tag 11 zugegeben. DMSO wurde als Negativkontrolle und 1,25-Vitamin D3 als Positivkontrolle für die Osteoblastendifferenzierungsinduktion verwendet. Die normalisierte Aktivität der alkalischen Phosphatase und der Calciumgehalt sind in den 6 bzw. 7 eingezeichnet. Verbindung 2 war am effektivsten, wenn sie an Tag 1 zugegeben wurde, und Verbindung 3 war am effektivsten, wenn sie an Tag 11 zugegeben wurde.
  • Als eine Kontrolle der Spezifität der 15-LO-Inhibierung für die Induktion der Osteoblastendifferenzierung von Stammzellen in vitro untersuchte die dritte Experimentreihe acht Replikate von Standard-Lipoxygenaseinhibitoren, die als spezifischer für das 5-LO-Enzym als für das 15-LO-Enzym ausgewiesen wurden. Zileuton (1,10, 50 µM, hergestellt bei Roche as), Verbindung 5, AA-861 (1, 10, 50 µM, Sigma#A3711) und Rev-5901 (15 µM, Sigma#R5523) wurden alle 2–3 Tage frisch hergestellt und in den menschlichen Osteoblasten-Präkursorzellen getestet. Es wurde herausgefunden, daß die 5-LO-Inhibitoren die Fähigkeit zur Induktion alkalischer Phosphataseaktivität an Tag 9 oder Kultivierung der Calciumabscheidung nach 16 Tagen Kultur nicht besaßen, wie in den 8 bzw. 9 gezeigt.
  • Die Ergebnisse der Quantifizierung von Markern für die Osteoblastendifferenzierung, sowohl der alkalischen Phosphataseaktivität als auch des Kulturcalciumgehalts, in hMSC-Kulturen, die hinsichtlich der Differenzierung zu Osteoblasten stimuliert wurden, demonstrierten, daß die Zugabe der spezifischen 15-Lioxygenaseinhibitoren die Differenzierung der menschlichen knochenbildenden Zellen in vitro förderte.
  • Des weiteren wurde die Fähigkeit von 15-Lipoxygenaseinhibitoren zur Stimulierung der Knochenbildung und des Knochenwachstums durch die Verwendung von Klonbildungsassays, in denen das Klonbildungspotential der Knochenmarkpräkursorzellen gemessen wird, gemessen. Die Osteoblasten- und Osteoklastenzellen wurden mit 15-Lipoxygenaseinhibitoren behandelt. In einem Verfahren wurden die Zellen und die Inhibitoren in vitro inkubiert. In einem anderen Verfahren wurde einem Säuger der Inhibitor verabreicht, die Knochenmarkpräkursoren isoliert und dann eine Plattenkultur angelegt. Für beide Verfahren wurden die koloniebildenden Einheiten, die aus diesen Knochenmarkzellen abgeleitet sind, gemessen. Man kann nach Verbindungen mit Potential zur Erhöhung der Knochenmineraldichte scree nen, wenn sie eine Erhöhung des Osteoblasten-Klonbildungspotentials des Knochenmarks oder eine Verringerung des Osteoklasten-Klonbildungspotentials des Knochenmarks zeigen.
  • Beispiel 2
  • 15-Lipoxygenaseinhibitoren, die die Knochenbildung in vivo fördern Die Fähigkeit von 15-Lipoxygenaseinhibitoren, die Knochenbildung in vivo zu fördern, wurde durch das Messen der Fähigkeit der Inhibitoren, die Knochenparameter in einem Mausmodell von Osteoporose zu verbessern, gemessen. Die konstitutive Expression eines Interleukin-4-Transgens aus dem Lck-Genpromotor (Lck-IL4) in C57BL/6-Mäusen führte zu einer schweren Knochen-Phänotyp-nachahmenden Osteoporose. (Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 11618–22, (1993)) und diese Mäuse wurden dazu verwendet, die Wirkung der Behandlung mit 15-LO-Inhibitoren auf die Knochenmasse zu demonstrieren.
  • Die vier verwendeten experimentellen Gruppen sind in Tabelle 2 gezeigt. Während der Entwöhnung erhielten Wildtyp-C57BL/6- oder transgene Lck-IL4-Mäuse 150 mg/kg zweimal täglich von Verbindung 2 PD146176 in ihr Futter für 84 Tage (Diet 5001: 23% Protein, 10% Fett, 0,95% Calcium und 0,67% Phosphor; PMI Feeds, Inc., St. Louis, MO). Die Mäuse hatten zweimal täglich in ungefähr 12-Stunden-Intervallen Zugang zur Hälfte der täglichen Futteraufnahme, und die Nahrungsaufnahme wurde täglich aufgezeichnet. Wasser war nach Belieben verfügbar. Die Kontrollgruppen erhielten dieselbe Nahrung ohne Verbindung 2. Alle Gruppen zeigten einen gleich guten Futterverbrauch im Verlauf des Experiments. Tabelle 2
    C57BL/6 Lck-IL4 transgen
    Kontrolle Verbindung 2 Kontrolle Verbindung 2
    n = 17 (8F/9M) n = 18 (9F/9M) n = 20 (11F/9M) n = 22 (11F/11M)
    • Tabelle 2. Experimentelle Gruppen, die für In-vivo-Inhibitorstudien verwendet wurden. Nach dem Entwöhnen (ungefähr 28 Tage) wurde den Mäusen für 84 Tage Futter mit oder ohne 15-LO-Inhibitor (Verbindung 2) gefüttert. F, weibliche und M, männliche Tiere waren in den Gruppen gleich vertreten.
  • Die Wirkungen der IL4-Überexpression und 15-LO-Inhibierung auf alle Körperparameter, die Femoral-BMD und die Geometrie und die Femoralbiomechanik sind in Tabelle 3 gezeigt.
  • Die Überexpression von IL4 führt zu einer signifikanten Verringerung der Gesamtkörper- BMD, des Körpergewichtes und des Hämatokrit und einer Erhöhung des prozentualen Körperfettes. Die Überexpression von IL4 reduziert auch die Femoral-BMD, die Kortikalfläche, den Trägheitsmoment und die Kortikaldicke im Vergleich zu Wildtyp-C57BL/6-Mäusen. Die Erhöhung der Knochenmarkfläche bei Lck-IL4-Mäusen korreliert mit dem verringerten Hämatokrit und der damit verbundenen Anämie, von der berichtet worden ist. Des weiteren hatte die IL4-Überexpression eine signifikante Wirkung auf die Femoralbiomechanik, einschließlich verringerter Ausfallbelastung, Knochensteifheit und Knochenfestigkeit (Tabelle 3). Die Mäuse, denen der 15-LO-Inhibitor (Verbindung 2) gefüttert wurde, zeigten eine teilweise Umkehrung der gesundheitsschädlichen Wirkungen auf den Ganzkörper- und Femoralknochen (Tabelle 3). Die Arzneimittel-behandelten Mäuse zeigten eine signifikante Erhöhung der Ganzkörper-BMD, von Hämatokrit, der Femoral-BMD und der Kortikaldicke bezogen auf Kontrollmäuse, die das Lck-IL4-Transgen tragen. Wichtig ist, daß die mit 15-LO-Inhibitor behandelten Mäuse eine signifikante Erhöhung der Femoralbiomechanik, einschließlich Ausfallbelastung, Steifheit und Festigkeit zeigten. Dies ist besonderes bei Osteoporose wichtig, bei der der Grad der Knochenfestigkeit und die Ausfallbelastung signifikante Determinanten bei Patienten sind, die weitere Frakturen erleiden. Zusammengefaßt zeigen die Ergebnisse, daß die Inhibierung von 15-LO in vivo zu einer höheren BMD und höherer Knochenfestigkeit in einem Tiermodell von Osteoporose führt. Tabelle 3
    Ganzer Körper
    Phänotyp Wirkung der IL-4-Überexpression p-Wert Wirkung der IL-4-Überexpression + Verbindung 2 p-Wert
    Körpergewicht –7% 0,042 NC ns
    % Körperfett +19% 0,007 NC ns
    Hämatokrit –25% 2 × 10–9 +20% 2 × 10–5
    Ganzkörper-BMD –11% 2 × 10–9 +5% 7 × 10–5
    Femoral-BMD & Geometrie
    Phänotyp Wirkung der IL-4-Überexpression p-Wert Wirkung der IL-4-Überexpression + Verbindung 2 p-Wert
    BMD –17% 4 × 10–12 +9% 3 × 10–6
    Länge NC ns NC ns
    Gesamtfläche NC ns –4% 0,035
    Kortikalfläche –25% 6 × 10–12 NC ns
    Knochmarkfläche +16% 4 × 10–7 –7% 7 × 10–5
    Trägheitsmoment –17% 7 × 10–5 NC ns
    Kortikaldicke –27% 9 × 10–10 +6% 0,037
    Femoralbiomechanik
    Phänotyp Wirkung der IL-4-Überexpression p-Wert Wirkung der IL-4-Überexpression + Verbindung 2 p-Wert
    Ausfallbelastung –45% 6 × 10–13 +18% 0,003
    Steifheit –48% 3 × 10–11 +11% 0,09
    Festigkeit –34% 2 × 10–12 +22% 2 × 10–4
  • Tabelle 3. Wirkungen der IL4-Überexpression und der 15-LO-Inhibierung auf die Ganzkörper- und Femoralknochenparameter. Die Ganzkörper- und Femoralknochenparameter wurden bei Mäusen, die das Lck-IL4-Transgen tragen, das zur Überexpression von IL4 führte, im Vergleich zu C57BL/6-Kontrollen gemessen. Diese Parameter wurden auch bei Lck-IL4-Mäusen, denen der 15-LO-Inhibitor Verbindung 2 gefüttert wurde, im Vergleich zu unbehandelten Lck-IL4-Kontrollen gemessen. NC, nicht verändert zwischen den Gruppen. ns, p-Wert war nicht signifikant.
  • Tiere
  • Alle Mäuse, die in den In-vivo-Experimenten verwendet wurden, wurden unter identischen Bedingungen in der Portland VA Veterinary Medical Unit aus einem Stamm, der ursprünglich von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten wurde, gezüchtet. Die Mäuse wurden über nicht mehr als drei Generationen aus einem Stamm, erhalten von The Jackson Laboratory, gezüchtet. Während der Entwöhnung waren die Mäuse in Gruppen (9–10 Tiere pro Käfig) unter einem 12stündigen Hell/Dunkel-Zyklus (6:00 Uhr morgens bis 6:00 Uhr abends) bei 21 ± 2°C untergebracht. Alle Verfahren waren vom VA Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und wurden gemäß der Richtlinien zur Behandlung und Verwendung von Tieren in der Forschung des National Institutes of Health durchgeführt.
  • Knochendensitometrie
  • Knochenmineralmessungen wurden durch Dual-Spektren-Röntgen-Absorptiometrie (DEXA) bestimmt. Alle Studien wurden mit einem Lunar PIXImus-Densitometer (Lunar Corp., Madison, WI) durchgeführt. Die densitometrischen Ganzkörperanalysen wurden an 4 Monate alten anästhesierten Mäusen durchgeführt, wenn die Akquisition reifer Knochenmasse beendet war. Das Gesamtfenster wurde als das Ganzkörperbild minus Kalvarie, Mandibula und Zähne definiert. Nach der Tötung wurden die rechten Femora vorsichtig entfernt und vor dem DEXA-Scannen von anhängendem Gewebe gesäubert.
  • Probenverarbeitung
  • Erwachsene Mäuse (16 Wochen alt) wurden durch CO2-Inhalation getötet und auf 0,1 g genau abgewogen. Unmittelbar nach der Tötung wurden Herzblutabzüge erhalten, und ein kleines Aliquot Vollblut wurde für die Hämatokritbestimmung konserviert. Lumbalwirbel und beide Femora wurden unmittelbar geerntet, in sterile Gaze, getränkt mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, eingewickelt und bei weniger als etwa –20°C für anschließende Analysen eingefroren.
  • Femurschaftgeometrie
  • Die geometrischen Querschnittsparameter der Mitteldiaphyse der Femora wurden unter Verwendung eines tragbaren Röntgenstrahlenmikrotomographen (Model 1074, Skyscan, Antwerpen, Belgien) bestimmt. Es wurde in 40-mm-Intervallen abgetastet und eine Scheibe, die sich in der Mitte des Femurs befand, wurde hinsichtlich der Gesamtfläche (FCSA), der Kortikalfläche (Ct Ar) und der Markkanalfläche (Ma Ar) analysiert. Des weiteren wurden unter Verwendung der Pixel, erhalten in der Kortikalregion des Digitalbildes, der Radius aus dem Schwerpunkt des Querschnitts zur äußeren Faser in der Anterior-posterior-Ebene, der flächenmäßige Trägheitsmoment (Ixx) in der Biegebene und die durchschnittliche Kortikaldicke (Ct Th) berechnet.
  • Biomechanik-Studien
  • Das Femur wurde in bezug auf den Ausfall beim Dreipunktbiegen auf einem hochauflösenden Material-Testapparat (Instron Model 4442, Canton, MA) getestet. Die Ausfallbelastung und die Steifheit wurden unter Verwendung von Systemsoftware bestimmt. Die Biegefestigkeit wurde dann unter Verwendung der zuvor bestimmten Querschnittsflächenmessungen berechnet.
  • Datenanalyse
  • Alle Daten wurden durch eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung des JMP-Software-Packets (SAS Institute) analysiert.
  • Beispiel 3
  • Fähigkeit eines 15-Lipoxygenaseinhibitors zur Erhöhung der Knochenbildung in vivo
  • Zur Bestimmung der Fähigkeit von Inhibitoren von 15-Lipoxygenase zur Stimulierung der Knochenbildung und des Knochenzusammenwachsen wurde [[[5-(5,6-Difluor-1H-indol-2-yl)-2-methoxyphenyl]amino]sulfonyl]-carbamidsäure-isobutylester, Verbindung 6, wie in WO 0196298 beschrieben, hergestellt und in dem Östrogenmangel-Ratten-OVX-Osteopenie-Standardassay getestet.
  • Drei Monate alten Ratten wurden die Eierstöcke entfernt (Ovx) und 1 mg/kg/Tag der Verbindung 6 oder 0,1 g/kg/Tag von 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 (Positivkontrolle, abgekürzt Vit. D in der Tabelle) durch orale Sondenfütterung einmal am Tag, beginnend 2 Wochen nach der Eierstockentfernung und fortlaufend für 7 Wochen verabreicht. Die Dosis wurde auf 2 mg/kg/Tag erhöht und bis 11 Wochen fortgeführt. Kontrollgruppen, sowohl Schein (Ratten, bei denen die Eierstöcke nicht entfernt wurden) als auch Ovx, erhielten nur ein Vehikel. Die Knochenmineraldichte der Spina und der rechten Hüfte wurden unter Verwendung des High Resolution Software-Pakets auf einem QDR-4500-Knochendensitometer (Hologic, Walthan, MA) bestimmt. Die Tiere wurden abgetastet, indem sie in Rücklage so plaziert wurden, daß das rechte Femur senkrecht zum Rest des Körpers und das Schienbein senkrecht zum Femur lagen. Die Knochenmineraldichte (g Mineral/cm2) für die Verbindungen in Hüfte und Spina sind in Tabelle 4 unten angegeben. Tiere, die mit dem 15-LO-Inhibitor behandelt waren, zeigten eine erhöhte BMD in der Spina nach > 3 Wochen und im proximalen Femur nach > 7 Wochen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
    Behandlungsdauer Chirurgie Behandlung Dosis mg/kg/Tag BMD
    Lumbalspina proximales Femur
    L2–L4 L5
    3 Wochen Schein Vehikel nd nd nd
    Ovx Vehikel 0,2224 0,2343 0,2737
    Ovx Vit D 0,1 nd nd nd
    Ovx Verb. 6 1000 0,2347 0,2480 0,2838
    (0,055) (0,041) (0,103)
    7 Wochen Schein Vehikel 0,2664 0,2841 0,3068
    Ovx Vehikel 0,2303 0,2387 0,2829
    Ovx Vit D 0,1 0,2628 0,2742 nd
    (0,023) (0,015)
    Ovx Verb. 6 1000 0,2474 0,2549 0,2932
    (0,019) (0,120) (0,033)
    11 Wochen Schein Vehikel 0,2740 0,2895 0,3177
    Ovx Vehikel 0,2353 0,2525 0,2842
    Ovx Verb. 6 2000 0,2507 0,2626 0,2986
    (0,009) (0,059) (0,039)
    • Werte in Parenthese sind p-Werte gegenüber OVX-Kontrolle zum selben Zeitpunkt. nd = keine Daten

Claims (7)

  1. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Knochenmineraldichte erhöhen, wobei das Verfahren das Kontaktieren einer Verbindung mit 15-Lipoxygenase und das Bestimmen, ob die Verbindung die 15-Lipoxygenaseaktivität inhibiert, umfaßt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner das Testen der Verbindung in einem funktionellen Assay, der die Wirkung der Verbindung auf die Knochenbildung zeigt, umfaßt.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der funktionelle Assay das Kontaktieren der Verbindung mit menschlichen Mesenchymstammzellen, die nicht menschlichen embryonalen Ursprungs sind, und das Bestimmen der Zelldifferenzierung zu knochenbildenden Zellen umfaßt.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der funktionelle Assay das Verabreichen der Verbindung an ein nicht menschliches Lebewesen und das Messen eines Anzeichens für Knochenbildung umfaßt.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das gemessene Anzeichen die Knochenmineraldichte ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Anzeichen ein biomechanischer Parameter des Knochens ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Bestimmung der Zelldifferenzierung die Durchführung eines alkalische Phosphatase-Assays, eines Calcium-Assays, eines Gesamt-DNA-Präparations-Assays oder Kombinationen davon umfaßt.
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Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8639009B2 (en) 2000-10-11 2014-01-28 Imatx, Inc. Methods and devices for evaluating and treating a bone condition based on x-ray image analysis
US7660453B2 (en) 2000-10-11 2010-02-09 Imaging Therapeutics, Inc. Methods and devices for analysis of x-ray images
EP1389947B1 (de) 2001-05-25 2009-08-26 Imaging Therapeutics, Inc. Verfahren zur diagnose, behandlung und prävention von knochenverlust
US7840247B2 (en) 2002-09-16 2010-11-23 Imatx, Inc. Methods of predicting musculoskeletal disease
US8965075B2 (en) 2002-09-16 2015-02-24 Imatx, Inc. System and method for predicting future fractures
US8600124B2 (en) 2004-09-16 2013-12-03 Imatx, Inc. System and method of predicting future fractures
EP1605824A2 (de) 2003-03-25 2005-12-21 Imaging Therapeutics, Inc. Verfahren zur kompensation der bildgebenden technik bei der bearbeitung von röntgenaufnahmen
US20080058613A1 (en) * 2003-09-19 2008-03-06 Imaging Therapeutics, Inc. Method and System for Providing Fracture/No Fracture Classification
GB0410103D0 (en) * 2004-05-06 2004-06-09 Biolipox Ab New method
WO2005123130A2 (en) * 2004-06-17 2005-12-29 Osteologix A/S Improved treatments of rheumatic and arthritic diseases comprising combinations of a 5-lipoxygenase inhibitor
US20070036770A1 (en) * 2005-08-12 2007-02-15 Wagner Darrell O Biologic device for regulation of gene expression and method therefor
EP1947942B1 (de) * 2005-08-18 2015-07-29 Accelalox, Inc. Verfahren zur behandlung von knochen durch modulation eines arachidonsäure-stoffwechsel- oder -signalleitungswegs
DE602007008565D1 (de) * 2006-06-27 2010-09-30 Biolipox Ab Verfahren zur identifizierung von modulatoren der eoxin-bildung
US20080076836A1 (en) * 2006-09-01 2008-03-27 Cardiac Pacemakers, Inc Method and apparatus for using light to enhance cell growth and survival
US20080200425A1 (en) * 2007-02-16 2008-08-21 Kurtz Seymour J Methods and compositions for regulating bone mineral density
EP2142924A2 (de) * 2007-04-26 2010-01-13 President And Fellows Of Harvard College Tests zur identifizierung von knochenbildung und knochenmineralisierung modulierenden verbindungen
WO2009105723A2 (en) * 2008-02-22 2009-08-27 Accelalox, Inc. Novel methods for bone treatment by modulating an arachidonic acid metabolic or signaling pathway
US8939917B2 (en) 2009-02-13 2015-01-27 Imatx, Inc. Methods and devices for quantitative analysis of bone and cartilage
US20110136728A1 (en) * 2009-12-09 2011-06-09 Patricia Grasso Methods of increasing bone formation using leptin-related peptides
US9745589B2 (en) 2010-01-14 2017-08-29 Cornell University Methods for modulating skeletal remodeling and patterning by modulating SHN2 activity, SHN3 activity, or SHN2 and SHN3 activity in combination
CN102138961A (zh) * 2010-02-02 2011-08-03 北京绿色金可生物技术股份有限公司 黑豆皮提取物在预防和治疗骨关节炎的产品中的应用
KR101474053B1 (ko) 2011-04-08 2014-12-19 울산대학교 산학협력단 골다공증 또는 골다공성 골절 발생 위험도 예측용 다형성 마커
RU2517037C1 (ru) * 2013-02-08 2014-05-27 Евгений Викторович Ларионов Способ получения костного минерального компонента и костный минеральный компонент для замещения и восстановления дефектов костной ткани
WO2015027146A1 (en) 2013-08-22 2015-02-26 The General Hospital Corporation Inhibitors of human 12/15-lipoxygenase
EP3159003A3 (de) * 2015-10-23 2017-07-19 Universiti Putra Malaysia Zusammensetzung zur förderung des knochenwachstums, zur verhinderung von knochenresorptionsstörungen und zur gelenkgesundheit
CN106405064B (zh) * 2016-08-30 2018-10-26 嘉兴行健生物科技有限公司 一种40岁以上女性骨转换率的评估方法
CN108251454A (zh) * 2017-12-26 2018-07-06 温州医科大学附属第医院 一种脂氧合酶基因修饰间充质干细胞的获取方法及其应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0109225B1 (de) 1982-11-11 1985-08-28 Beecham Group Plc Arachidonsäureanaloga, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre therapeutische Verwendung
ZA838339B (en) * 1982-11-11 1985-06-26 Beecham Group Plc Novel arachidonic acid analogues and pharmaceutical compositions containing them
US4605669A (en) 1985-04-26 1986-08-12 Abbott Laboratories Lipoxygenase inhibiting naphthohydroxamic acids
US4623661A (en) * 1985-04-26 1986-11-18 Abbott Laboratories Lipoxygenase inhibiting compounds
US4761403A (en) * 1986-04-09 1988-08-02 Abbott Laboratories Lipoxygenase inhibiting compounds
US4873259A (en) 1987-06-10 1989-10-10 Abbott Laboratories Indole, benzofuran, benzothiophene containing lipoxygenase inhibiting compounds
DE69122759T2 (de) * 1990-07-25 1997-05-15 Abbott Lab Acetylenderivate mit lipoxygenase inhibitorischer wirkung
US5478579A (en) * 1991-02-06 1995-12-26 Biodyn Medical Research, Inc. Method for treatment of osteoporosis
US5977070A (en) 1992-07-14 1999-11-02 Piazza; Christin Teresa Pharmaceutical compositions for the nasal delivery of compounds useful for the treatment of osteoporosis
US5641747A (en) * 1994-07-25 1997-06-24 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Treatment of osteopetrotic diseases
US5620997A (en) * 1995-05-31 1997-04-15 Warner-Lambert Company Isothiazolones
US5717062A (en) 1995-06-07 1998-02-10 Beth Israel Hospital Association Cyclic analogs of PTH and PTHrP
AU6966696A (en) * 1995-10-05 1997-04-28 Warner-Lambert Company Method for treating and preventing inflammation and atherosclerosis
US5972980A (en) 1995-10-05 1999-10-26 Warner-Lambert Company Method for treating and preventing inflammation and atherosclerosis
ATE282591T1 (de) * 1997-12-23 2004-12-15 Warner Lambert Co Thioharnstoffverbindungen, zusammensetzungen sowie verfahren zur behandlung oder verhütung von entzündlichen erkrankungen und atherosklerose
WO2001096298A2 (en) * 2000-06-14 2001-12-20 Warner-Lambert Company 1,2,4-trisubstituted benzenes as inhibitors of 15-lipoxygenase

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003066048A3 (en) 2003-12-24
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Murray et al. Effect of low dietary calcium on bone metabolism in the SENCAR mouse
Lightfoot The musculoskeletal system
Green Type 1 diabetes and bone mass, interrelationships with nutrient intake and physical activity in children and with dietary fish oil in weanling rats

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