CN116059199B

CN116059199B - 灯盏乙素化合物作为野生型idh1激动剂的应用

Info

Publication number: CN116059199B
Application number: CN202310193304.3A
Authority: CN
Inventors: 杨洪军; 陈鹏; 崔钊; 黎彩凤; 刘为; 邓世文
Original assignee: EXPERIMENTAL RESEARCH CENTER CHINA ACADEMY OF CHINESE MEDICAL SCIENCES
Current assignee: EXPERIMENTAL RESEARCH CENTER CHINA ACADEMY OF CHINESE MEDICAL SCIENCES
Priority date: 2023-03-03
Filing date: 2023-03-03
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2043-03-03
Also published as: CN116059199A

Abstract

本发明涉及灯盏乙素化合物作为野生型IDH1激动剂的应用。本发明首次发现灯盏乙素及其衍生物能作为野生型IDH1的激动剂，在IDH1激动剂类药物中具有重要的应用潜力。成药性研究表明本发明的灯盏乙素能够显著提高IDH1的酶活，提高细胞和小鼠动物体内IDH1产物a‑KG的含量，体外细胞实验表明具有显著的抑制肿瘤细胞生长的效果，小鼠载瘤实验证明能够显著抑制小鼠体内瘤的体积，进一步表明，灯盏乙素与IDH1结合的位点和结合动力学参数被测定，灯盏乙素通过增加a‑KG促进HIF‑1降解发挥抑制下游效应分子VEGF、GLUT1等的作用，进而抑制肿瘤细胞生长、延缓衰老和改善神经退行性疾病，为药物的研发拓宽了思路。

Description

灯盏乙素化合物作为野生型IDH1激动剂的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种灯盏乙素化合物作为野生型IDH1激动剂的应用。

背景技术

Isocitrate dehydrogenase soluble 1（IDH1）异柠檬酸脱氢酶1，蛋白分子量约46 kDa，是人体内重要的脱羧氧化还原酶，它主要分布于肝脏、心肌、骨骼肌和肾脏等器官组织。异柠檬酸脱氢酶IDH在细胞能量代谢、氨基酸和维生素合成中起着关键作用，是三羧酸循环中的关键限速酶。人的IDH有三种，即IDH1、IDH2和IDH3，IDH1位于细胞质和过氧化物酶体中，IDH2和IDH3位于线粒体中。IDH1催化异柠檬酸盐的氧化和脱羧，产生a-酮戊二酸（a-KG）和CO₂，为细胞代谢和物质合成提供能量。IDH1的辅酶是NADP，它作为电子受体，将氧化的NADP+还原为NADPH。

IDH1的产物a-KG和NADPH在体内具有重要的生物学功能。a-KG是三羧酸循环中的关键代谢产物，是连接细胞碳氮代谢的节点。a-KG不仅是三羧酸循环中重要的代谢中间体，也是体内各种氨基酸、维生素和有机酸（如L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸）生物合成的前体。有机物进入细胞后，通过糖酵解形成丙酮酸，丙酮酸进入三羧酸循环后形成a-KG，a-KG可在α-酮戊二酸脱氢酶系的作用下进一步代谢成琥珀酰-CoA，进入碳代谢节点，这一过程伴随着电子转移和能量产生，为生物体的生长提供物质和能量。

a-KG在抗肿瘤、抗炎、抗衰老等领域具有重要作用。a-KG是p53通路的抑制肿瘤生长的关键效应因子，在小鼠癌细胞中过表达p53会导致a-KG积累，进一步导致5-羟甲基胞嘧啶积累，进而诱导肿瘤细胞分化和对环境的适应度降低。在结直肠癌类器官及对应小鼠模型中，使用a-KG实验组的小鼠的Wnt信号通路被抑制，起到了抗肿瘤作用。a-KG可以提高脯氨酰羟化酶和泛素连接酶的酶活，促进缺氧诱导因子HIF的降解，进而影响HIF下游通路发挥抗肿瘤的作用。在动物饮食中a-KG作为添加剂，能够延长中年小鼠的寿命，并且小鼠的各项衰老相关的生理指标如听力、皮毛状态等都有所改善。此外，a-KG还能降低中老年小鼠的全身慢性炎症水平，减少衰老细胞的衰老分泌表型；在该小鼠的脾脏内，研究人员发现T细胞大量分泌了抑制炎症的细胞因子IL-10，抑制了小鼠的慢性炎症。a-KG还在维持干细胞活性、肠道等代谢中发挥作用，a-KG还可促进皮肤胶原蛋白的生成，从而降低皮肤纤维化，维持皮肤健康。

需要与野生IDH1区分的是IDH1突变型基因，IDH1基因发生R132位点的突变，IDH1突变后酶功能会发生变异，把α-酮戊二酸转化成2-羟戊二酸（2-HG），2-HG积累会诱导细胞组蛋白和DNA发生超甲基化，阻断细胞的分化，从而有助于肿瘤细胞的生长和增殖。IDH1的突变与脑胶质瘤、前列腺瘤、副神经节瘤以及急性髓细胞白血病等相关。针对IDH1靶点的药物开发，目前主要是IDH1突变型的抑制剂的开发，还没有针对野生型IDH1开发的激动剂类药物。例如：Agios公司开发的针对IDH1 R132H突变的抑制剂AGI-5198，该化合物能够降低脑胶质瘤细胞内2-HG的水平，促进组蛋白H3K9me3去甲基化，诱导肿瘤细胞分化，抑制IDH1突变的脑胶质瘤进展。Agios的另一IDH1突变体抑制剂药物ivosidenib（艾伏尼布，AG-120）已于2018年7月被FDA批准上市。除了Agios公司产品之外，诺华的IDH305，拜尔的BAY1436032、Forma Therapeutics的FT-2002等药物也已经处于临床研究的不同阶段。国内厂家方面，圣和药业的突变型IDH2抑制剂SH1573、和记黄埔的突变型IDH1/2抑制剂HMPL-30等也已经进入临床试验阶段。但是，目前还没有一种药物通过激动野生型IDH1实现a-KG的含量提高发挥药效作用。

由此不难看出，目前针对IDH1的药物研究和开发集中于对IDH1突变型的抑制，忽略了激动野生型IDH1蛋白所带来的直接作用，且IDH1突变型的抑制和野生型IDH1的激动剂是不同的作用机理，两者之间亦没有互相启示的作用。

故基于此，提出本发明技术方案。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明经探究得出IDH1是灯盏乙素化合物的作用直接靶点，提供了一种灯盏乙素化合物作为野生型IDH1激动剂的应用。

本发明的方案是提供一种灯盏乙素化合物作为野生型IDH1激动剂的应用。

优选地，灯盏乙素化合物作为野生型IDH1激动剂在制备治疗肿瘤、衰老、神经退行性疾病药物中的应用。其中，根据应用场景的不同，还能拓展至化妆品、保健品和食品添加剂等。

更具体的，本发明发现野生型IDH1是灯盏乙素的直接作用靶点，灯盏乙素直接结合IDH1，可以激增加IDH1酶活，并促进IDH1产生a-KG，而a-KG通过诱导HIF-la降解，改变HIF-la下游通路发挥抗肿瘤作用；另外，本发明还发现，灯盏乙素通过IDH1靶点还具有促进干细胞增殖，保护神经、心肌细胞的作用，作为野生型IDH1激动剂在抗衰老、治疗神经退行性疾病方面具有潜在应用。

优选地，所述的药物为口服制剂。

优选地，所述药物为注射制剂。

优选地，所述药物为吸入制剂。

优选地，所述灯盏乙素化合物为灯盏乙素或灯盏乙素苷元衍生物。

其中，灯盏乙素苷元衍生物为式（I）所示的通式，

式（I），

其中，R为Me或H；X为S、Se或O，部分化合物如表1所示。

表1 灯盏乙素苷元衍生物结构式特征

灯盏乙素的结构式为式（II）所示：

式（II）

另外，需要强调的是，灯盏乙素化合物还可以是以灯盏乙素活性基团为核心的其他制剂，如能增加灯盏乙素可溶性、缓释、定向释放等的各种药用盐、改良型制剂。

本发明的有益效果为：

本发明首次发现灯盏乙素及其衍生物能作为野生型IDH1的激动剂，在IDH1激动剂类药物中具有重要的应用潜力。成药性研究表明本发明的灯盏乙素能够显著提高IDH1的酶活，提高细胞和小鼠动物体内IDH1产物a-KG的含量，体外细胞实验表明具有显著的抑制肿瘤细胞生长的效果，小鼠载瘤实验证明能够显著抑制小鼠体内瘤的体积，进一步分子生物学实验表明，灯盏乙素与IDH1结合的位点和结合动力学参数被测定，灯盏乙素通增加a-KG促进HIF-1降解发挥抑制下游效应分子VEGF、GLUT1等的作用，进而抑制肿瘤细胞生长、延缓衰老和改善神经退行性疾病，为药物的研发拓宽了思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是灯盏乙素的体外抗肿瘤细胞毒性检测结果图。

图2是灯盏乙素的体外抗肿瘤细胞周期、克隆斑形成、迁移能力检测图（注：PE-A为PI信号通道）；其中：

图2中A是灯盏乙素的抗HepG2肿瘤细胞克隆斑生成实验图；

图2中B是灯盏乙素的抗Huh7肿瘤细胞克隆斑生成实验图；

图2中C是灯盏乙素的抗HepG2肿瘤细胞的周期的实验图；

图2中D是灯盏乙素的抗Huh7肿瘤细胞的周期的实验图；

图2中E是灯盏乙素的抗HepG2肿瘤细胞迁移实验图；

图2中F是灯盏乙素的抗Huh7肿瘤细胞迁移实验图。

图3是灯盏乙素的降低肿瘤细胞糖摄取和糖酵解结果图（注：2-NBDG是一种结合葡萄糖的探针）；其中：

图3中A是利用荧光探针，检测灯盏乙素对HepG2肿瘤细胞葡萄糖降低作用的结果图；

图3中B是利用荧光探针，检测灯盏乙素对Huh7肿瘤细胞葡萄糖降低作用的结果图；

图3中C是利用能量检测仪，检测灯盏乙素对HepG2肿瘤细胞的糖酵解作用减弱图（胞外酸化率）；

图3中D是利用能量检测仪，检测灯盏乙素对HepG2肿瘤细胞的糖酵解作用减弱图（基础糖酵解）；

图3中E是利用能量检测仪，检测灯盏乙素对HepG2肿瘤细胞的糖酵解作用减弱图（补偿糖酵解）；

图3中F是利用能量检测仪，检测灯盏乙素对Huh7肿瘤细胞的糖酵解作用减弱图（胞外酸化率）；

图3中G是利用能量检测仪，检测灯盏乙素对Huh7肿瘤细胞的糖酵解作用减弱图（基础糖酵解）；

图3中H是利用能量检测仪，检测灯盏乙素对Huh7肿瘤细胞的糖酵解作用减弱图（补偿糖酵解）。

图4是灯盏乙素生物素探针的分子结构示意图。

图5是利用生物芯片和灯盏乙素探针进行作用靶点筛选图（注：Scu-biotin为生物素标记的灯盏乙素探针）。

图6是灯盏乙素探针筛选到全部靶点的生物功能的生物信息学分析图（注：GO-BP是生物学功能聚类分析，GO-CC是细胞内分布位置聚类分析，GO-MF是分子学功能分析）。

图7是灯盏乙素探针的靶点蛋白IDH1定性结合实验验证图。

图8是灯盏乙素增加IDH1蛋白的热稳定性结果图。

图9是生物膜干涉（BLI）技术测定灯盏乙素与IDH1之间的结合亲和力结果图。

图10是灯盏乙素与IDH1结合位点的确定图；其中：

图10中A是灯盏乙素与GSH的竞争结合结果图；

图10中B是灯盏乙素与碘乙酰胺IAA的竞争结合结果图；

图10中C是质谱法检测灯盏乙素结合的位点结果图；

图10中D是定点突变C297位半胱氨酸后，生物芯片法检测IDH1与Scu结合减弱结果图；

图10中E是定点突变C297位半胱氨酸后，ELISA法检测IDH1与Scu结合减弱结果图；

图10中F是定点突变C297位半胱氨酸后，Scu对IDH1的酶活没有增强作用的结果图；

图10中G是定点突变C297位半胱氨酸后，BLI检测Scu与IDH1结合力减弱结果图。

图10中H是灯盏乙素与C297位半胱氨酸结合示意图；

图10中I是对结合位点进行可视化的示意图。

图11是灯盏乙素促进IDH1酶活结果图；其中：

图11中A是灯盏乙素未增加HepG2细胞IDH1的mRNA转录结果图；

图11中B是灯盏乙素未增加Huh7细胞IDH1的mRNA转录结果图；

图11中C是灯盏乙素未增加HepG2细胞中IDH1蛋白的表达结果图；

图11中D是灯盏乙素未增加Huh7细胞中IDH1蛋白的表达结果图；

图11中E是差示荧光法检测Scu对IDH1的稳定性影响结果图；

图11中F是灯盏乙素促进IDH1酶活结果图；

图12是灯盏乙素促进细胞a-KG的产生结果图；其中：

图12中A是灯盏乙素促进IDH1产物的示意图；

图12中B是灯盏乙素增加天然蛋白IDH1酶活结果图；

图12中C是灯盏乙素增加HepG2细胞产生a-KG的含量结果图；

图12中D是灯盏乙素促进酶活的EC50值的测定结果图。

图13是灯盏乙素通过增加细胞中a-KG的产生促进HIF-1 a蛋白的羟基化和降解结果图；其中：

图13中A是免疫印迹检测HepG2和Huh7细胞中HIF1a的降解和羟基化情况图；

图13中B是免疫荧光检测HepG2细胞中HIF1a的降解和羟基化情况图；

图13中C是免疫印迹检测HepG2和Huh7细胞中HIF1a互作蛋白的情况图；

图13中D是免疫荧光检测Huh7细胞中HIF1a的降解和羟基化情况图。

图14是灯盏乙素影响HIF-1a下游通路图；其中：

图14中A是灯盏乙素下调HepG2细胞HIF相关通路的表达结果图；

图14中B是灯盏乙素下调Huh7细胞HIF相关通路的表达结果图。

图15是过表达IDH1抑制肿瘤细胞a-KG生成及细胞增殖克隆形成结果图；其中：

图15中A是IDH1过表达HepG2细胞株的免疫印迹验证结果图；

图15中B是过表达后细胞的a-KG表达量上升结果图；

图15中C是过表达IDH1抑制HepG2肿瘤细胞增殖克隆结果图。

图16是过表达IDH1抑制HepG2肿瘤细胞的糖摄取和糖酵解结果图；其中：

图16中A是过表达IDH1抑制HepG2肿瘤细胞的糖酵解图（胞外酸化率）；

图16中B是过表达IDH1抑制HepG2肿瘤细胞的糖酵解图（基础糖酵解）；

图16中C是过表达IDH1抑制HepG2肿瘤细胞的糖酵解图（补偿糖酵解）；

图16中D是采用2-NBDG探针检测过表达后HepG2细胞的糖摄取结果图。

图17是过表达IDH1抑制HepG2肿瘤细胞HIF-1a与下游通路结果图；其中：

图17中A是过表达IDH1抑制肿瘤细胞HIF-1a与下游通路mRNA表达结果图；

图17中B是过表达IDH1抑制肿瘤细胞HIF-1a与下游通路蛋白表达结果图。

图18是过表达IDH1提高HepG2细胞HIF-1a的羟基化结果图。

图19是敲低IDH1的表达降低灯盏乙素对于HepG2细胞毒性图。

图20是敲低IDH1的表达降低灯盏乙素对于HepG2细胞增殖克隆斑的影响图。

图21是降低IDH1后Scu对HepG2细胞的周期影响结果图（注：S期为DNA复制期；G0/G1为DNA合成前期；G2为有丝分裂准备期）。

图22是降低IDH1后HepG2细胞中Scu对HIF-1 α和下游效应蛋白的mRNA转录影响结果图。

图23是降低IDH1减少Scu对HepG2细胞中HIF-1 α和下游效应蛋白的影响图。

图24是降低IDH1对HepG2细胞中HIF-1 α的羟基化的影响结果图。

图25是灯盏乙素抑制HepG2小鼠移植瘤的生长图；其中：

图25中A是小鼠实验流程图；

图25中B是小鼠移植瘤实拍对比图；

图25中C是灯盏乙素降低裸鼠成瘤的重量图；

图25中D是灯盏乙素降低裸鼠成瘤的体积图。

图26是灯盏乙素降低小鼠肿瘤组织Ki-67的表达结果图（免疫组化法）。

图27是灯盏乙素增加小鼠血清a-KG含量结果图。

图28是灯盏乙素增加HepG2小鼠肿瘤组织IDH1酶活结果图。

图29是灯盏乙素影响HepG2小鼠血清炎症因子水平结果图。

图30是灯盏乙素抑制HepG2小鼠肿瘤组织HIF-1 α，VEGF,LDHA等的mRNA转录表达结果图。

图31是灯盏乙素抑制HepG2小鼠肿瘤组织HIF-1 α，VEGF，LDHA等的蛋白表达结果图（免疫印迹法）。

图32是灯盏乙素抑制HepG2小鼠肿瘤组织HIF-1 α，VEGF，LDHA等的蛋白表达结果图（免疫组化法）。

图33是灯盏乙素提高脐带间充质干细胞的增殖能力结果图。

图34是灯盏乙素对间充质干细胞的干性增强作用结果图。

图35是灯盏乙素对神经退行性细胞SH-SY5Y细胞模型增殖损伤（膜电位、ROS积累）的保护作用图。

图36是灯盏乙素增强神经退行性细胞SH-SY5Y细胞模型受损后的膜电位结果图。

图37是灯盏乙素降低神经退行性细胞SH-SY5Y细胞模型受损后的ROS水平结果图。

图38是灯盏乙素对H9C2细胞的H₂O₂心肌损伤保护作用结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1：灯盏乙素的体外抗肿瘤细胞实验

本实施例主要检测灯盏乙素等体外肿瘤细胞的毒性。

HepG2、Huh7和LO2细胞从北京协和医学院细胞资源中心获得，在含有10%胎牛血清（FBS）、链霉素（100 g/mL）和青霉素（100U/mL）的DMEM培养基中培养。细胞在含5%CO2培养箱中37℃培养。

将HepG2、Huh7和LO2细胞置于96孔板中并用灯盏乙素（Scu）化合物处理。孵育48小时后，将细胞与CCK-8（MedChemExpress）再孵育2小时。然后在酶标仪（Bio-Tek）采取分光光度法测定450nm处的吸光度。每种药物的50%抑制浓度（IC50）由代表x轴上的所用药物浓度（对数尺度）和y轴上的生存能力（线性尺度）的剂量-生存曲线确定。细胞毒性的测试结果如图1所示，灯盏乙素对肿瘤代表细胞株HepG2、Huh7细胞具有细胞毒性，但是对LO2正常对照细胞毒性低，说明其体外抗肿瘤效果好且具有安全性。

采用细胞流式术对细胞周期进行测定，同时进行细胞集落生长形成测定，将HepG2和Huh7细胞接种在6孔板中，用Scu处理10天，并用结晶紫溶液染色。计数超过50个细胞的细胞集落。对于细胞迁移测定，在Scu存在状态将细胞接种到transwell上室（BDBiosciences）中24小时，去除上表面上的细胞，用结晶紫溶液对粘附在下膜上的细胞进行染色，并在显微镜（奥林巴斯CKX53）下进行分析。对于细胞周期分布测定，细胞用Scu等不同浓度药物处理24小时，然后根据细胞周期和凋亡分析试剂盒（Beyotime）的方案用PI染色。最后，通过使用Beckman Coulter Cyto FLEX（BeckmanCourter）测定细胞周期分布。使用trans-well小室检测Scu对肿瘤细胞的迁移能力的作用。结果如图2所示，结果表明Scu对肿瘤细胞HepG2和Huh7的周期阻滞，阻滞细胞周期在G2期、克隆斑形成随着药量的增加逐渐减少呈现显著性差异（P<0.05）量效关系明确，对HepG2和Huh7细胞的迁移具有抑制作用，用药组和对照组之间呈现显著性差异（P<0.05）。

细胞能量分析仪（Agilent）用于实时测量反映细胞糖酵解活性的细胞外酸化（ECAR）值。在测定之前，将细胞以30000细胞/孔的密度附着在补充有2 mM丙酮酸钠、10 mM葡萄糖和2 mM L-谷氨酰胺的海马XFRPIM培养基中的96孔XF-PS板上。根据仪器操作说明，使用糖酵解速率测定试剂盒（安捷伦）评估细胞糖酵解率。

使用葡萄糖含量检测试剂盒（Solarbio公司购买）评估细胞的葡萄糖消耗。将细胞在添加有5%FBS和5.5mM葡萄糖的无葡萄糖DMEM培养基（Solarbio公司购买）中培养。用Scu等不同浓度药物处理24小时后，根据试剂盒操作说明收获培养基以测量葡萄糖含量。

使用2-NBDG（AbMol）探针测量细胞的葡萄糖摄取能力。简而言之，将接种在24孔板中的细胞在无葡萄糖DMEM培养基中培养，并使其粘附在板上过夜。用Scu等不同浓度药物处理后，将细胞与100μM2-NBDG在37℃下孵育30分钟。通过荧光显微镜（Olympus）检测荧光强度。灯盏乙素对肿瘤细胞的糖酵解和葡萄糖摄取的影响结果如图3所示，结果显示灯盏乙素显著抑制HepG2和Huh7细胞的糖酵解和葡萄糖摄取（P<0.05）。

实施例2：灯盏乙素生物素探针的合成和靶点筛选

将灯盏乙素（纯度>98 %；购买自上海诗丹德生物技术有限公司）溶于二甲基亚砜（DMSO）中，作为储备溶液，浓度为10 mM，储存于-20℃。在每次体外实验之前，用培养基将灯盏乙素和灯盏乙素生物素探针储备溶液稀释至最终浓度，且最终DMSO浓度不超过0.1 %。灯盏乙素生物素探针标记如图4所示，展示了灯盏乙素被标记后的分子结构。

在室温下用人蛋白质组芯片鉴定Scu的靶蛋白。在室温下用封闭缓冲液（5 % BSA/1×PBST）封闭人蛋白质组芯片（购买自CDI LABS）1.5小时。使用灯盏乙素生物素探针（10 μM）与蛋白质组芯片在室温下在反应缓冲液（1×PBST）中孵育1小时。将芯片用PBST洗涤三次，然后用0.1 % Cy3-Streptavidn溶液孵育20分钟。然后将芯片离心干燥，用GenePix4000B微阵列扫描仪（Axon Instruments）在635 nm处检测蛋白质与灯盏乙素的相互作用，并进行数据分析。蛋白质芯片靶点的筛选结果如图5所示。

经过生物信息学分析（如图6所示），本发明根据靶点的功能分类，相关通路分析，糖酵解代谢通路被显著富集出来，根据这一通路中靶点的功能，初步将IDH1确定为Scu的作用候选靶点。

本发明进一步进行IDH1、Scu结合的初步定性分析。首先纯化的IDH1纯蛋白进行了生物芯片和免疫印迹实验，判断Scu与IDH1是否存在结合，实验结果表明Scu与IDH1杂交后会出现信号，如图7所示（左图是生物芯片方法的验证，右图免疫印迹方法都表明IDH1能够结合灯盏乙素），IHD1蛋白处呈现明显的亮点，IDH1作为阳性靶点的代表展示出来。

本发明进行细胞热位移测定实验，将HepG2细胞用Scu（200 μM）或DMSO处理2小时，然后等分，并在不同温度（37 ℃和77 ℃）下加热4分钟。冷却至室温后，在4℃下以20000 g离心5分钟收集可溶性蛋白，然后通过Western blotting检测IDH1蛋白含量。

这个实验测定，如图8所示，Scu增加靶点蛋白的热稳定性具备量效关系，说明Scu增加IDH1的热稳定性，这一现象为证明Scu作用于IDH1提供了间接证据。

实施例3：灯盏乙素与IDH1蛋白之间直接结合的亲和力测定

生物膜干涉技术可以定量的分析小分子药物和靶点结合力，采用生物膜干涉的BLI方法进行Scu与IDH1的结合力测定，具体地，用2倍摩尔量的生物素试剂标记重组IDH1蛋白，通过超滤去除未偶联的生物素。通过使用Gator plus（Gator Bio）SMAP生物传感器（Gator Bio）在缓冲液（PBS，0.05 % BSA，0.01 % 吐温20）预润湿后固定生物素标记的蛋白质，用重组蛋白平衡SMAP生物传感器。背景结合对照使用了一组重复的传感器，这些传感器在没有蛋白质的缓冲液中孵育。所有测定均按照标准方案在96孔板中进行，总体积为250 μL/孔。所有数据均通过Gator Bio数据分析软件进行分析，根据解离常数（Koff）与结合力常数（Kon）的比值计算平衡解离常数（Kd）值，结果如图9所示，结果表明Scu与IDH1的平衡解离常数（Kd）为11.5 μM，属于中等结合强度，Koff的值表明药物与蛋白结合以后的解离比较难。

实施例4：灯盏乙素与IDH1结合的位点的测定

首先使用谷胱甘肽与IDH1竞争结合Scu，如图10中A所示，表明IDH1与Scu可能存在半胱氨酸的结位点，进一步的半胱氨酸结合试剂IAA可以与IDH1竞争结合Scu，更加指向IDH1可能通过Cys与Scu结合，如图10中B所示，Scu随着浓度增加能够限制IAA荧光探针与IDH1的结合。

使用Orbitrap Fusion Lumos质谱仪（Thermo Fisher Scientific）通过LC-MS/MS鉴定Scu结合修饰位点。首先，将50 μg IDH1与1 mM Scu混合，并在200 μL PBS系统中孵育2小时。然后，加入5 mM DTT 60分钟，继续向混合溶液中加入20 mM IAA用于烷基化。为了去除过量的药物和试剂，选择甲醇/氯仿系统沉淀蛋白质。使用胰蛋白酶（酶/蛋白质比例为1:100）在37℃下将蛋白酶切割成肽过夜。C18柱脱盐后，使用0.1 % FA溶解肽并制备用于MS检测。实验结果表明IDH1，在IDH1 C297S处检测到Scu的修饰，二级肽段图同样显示了与一级肽段类似的实验结果，结果表述在图10 中C所示，IDH1 C297S所在的肽段能够清晰的被发现，表明这一个肽段被Scu修饰，有可能是Scu的结合肽段。

使用重组IDH1、IDH1 C269S、IDH1 C297S和IDH1 C379S蛋白（1 μg/mL）在4℃下涂覆96孔板（Corning）过夜或者点制芯片进行测试，然后在37℃下使用2 % BSA封闭1小时。用PBST洗涤三次后，在37℃将100 μM Scu生物素加入孔中2小时，将辣根过氧化物酶（HRP，1:5000）（Bios）标记的链霉亲和素添加到孔中，并在室温下孵育1小时。用PBST洗涤三次后，添加3，3′，5，5′-四甲基苯齐丁（TMB）试剂，并使用Synergy 2多模微板读取器（Biotek）捕获数据。同时采用BLI方法测试定点突变后的Scu与IDH1的结合力变化。

实验结果表明IDH1 C297是Scu与IDH1的关键结合位点，如图10中D、图10中E所示，突变为C297为C297S显著影响了IDH1与Scu的结合，同时其他位点的突变作为对照并没有显著的影响他俩的结合，进一步表明灯盏乙素结合IDH1 C297位点的特异性，在芯片和ELISA平台检测结果抑制。同时如图10 中F所示，Scu对突变IDH1 C297S后的酶活没有了促进作用，进一步证明了这一结合位点的活性，同时如图10中G所示，BLI检测IDH1突变后与Scu的结合力情况，实验表明IDH1 C297S突变对结合力的降低作用十分明显，由于结合量少，检测不到解离的常数。图10中H，展示了IDH1 C297与灯盏乙素的结合结构图，图10 中I对结合位点进行了可视化的表现。

实施例5：灯盏乙素是野生IDH1的激动剂，提高IDH1的酶活

本专利细胞内和体外通过酶活检测方法对灯盏乙素对IDH1的酶活进行测定，HepG2细胞种植在6孔细胞培养板内，待细胞长满80 %，向孔板内添加。该方法的原理是通过IDH1催化NADP+还原为NADPH，并在340 nm处测量NADPH浓度的增加。为了检测细胞或肿瘤组织中的酶活性，在用Scu等处理一定时间后，收集细胞或组织并加入提取液，然后超声粉碎并在冰上提取，在4℃下以8000 g离心10分钟，并收集上清液。最后，使用细胞质异柠檬酸脱氢酶（ICDHc）活性检测试剂盒（Solarbio）评估相对IDH1活性。

为了在体外检测Scu对IDH1蛋白的直接影响，通过在4 ℃下将IDH1多克隆抗体（Proteintech）涂覆在96孔板（100 ng/孔）上过夜，获得抗体板。然后将HepG2细胞裂解物添加到抗体板中并在室温下孵育2小时，然后用PBS洗涤以去除未结合的蛋白，以获得IDH1蛋白包被板。在IDH1蛋白包被板中用不同浓度的Scu孵育1 h后，用PBS进行三次洗涤，并检测相对IDH1活性。如上所述，通过在4℃下将纯化的IDH1蛋白（50 μg/孔）涂覆在96孔板中过夜，获得重组IDH1蛋白包被板。在重组IDH1蛋白板中用不同浓度的Scu等孵育1 h后，用PBS进行三次洗涤，并检测相对IDH1活性。体外和细胞酶活测试如图11所示，图11中A、图11中B表明灯盏乙素没有增加HepG2和Huh7 细胞IDH1的mRNA转录；图11中C、图11中D表明灯盏乙素没有增加HepG2和Huh7细胞中 IDH1蛋白的表达；图11中E、图11中F表明Scu刺激细胞后，显著增加了HepG2细胞中NADPH的含量，同时体外给予体外表达纯蛋白IDH1的底物后，其产生的产物NADPH的含量也进一步提高，EC50值大约为173.8 μM，这些证据都是一致的，表明了Scu对IDH1酶活的促进作用。

实施例6：灯盏乙素促进HepG2细胞内a-KG的积累

使用人ELISA试剂盒（上海博湖）评估细胞中a-KG浓度。对于细胞样品，将细胞重新悬浮在PBS中并在冰上超声破碎，然后在4℃下以8000 g离心10分钟，最后取上清液并置于冰上进行测试。对于组织样品，将新鲜组织在冰上的PBS中匀浆，然后在4℃下以8000 g离心10分钟，最后取上清液并置于冰上进行测试，血清样本可直接用于检测。图12中A为 Scu促进IDH1产生a-KG示意图，图12中B表明Scu对天然蛋白的酶活同样具有促进作用，a-KG检测数据如图12中C所示，显著提高了肿瘤细胞内的a-KG水平，用药组相对于不给药组具有显著的统计学差异（P<0.05），a-KG的增加是IDH1发挥一系列生物作用的关键因子，如图12中D所示，以NADPH含量计算Scu对天然纯蛋白IDH1酶活促进的EC50为31.23 μM。a-KG的增加，会影响HIF-1a的羟基化，增加HIF-1a羟基化，增加招募HIF-1a的互作分子VHL，进而引发HIF-1a的泛素化降解。本发明采用免疫方法对Scu和a-KG对HepG2、Huh7细胞中HIF-1a羟基化、HIF-1a含量（图13中A所示），免疫荧光也进一步获得了一致的结果（图13中B所示），同时免疫印迹也检测泛素化关键蛋白VHL含量升高（图13中C所示），免疫荧光也进一步获得了一致的结果（图13中D所示）。

实施例7：灯盏乙素减少HepG2细胞中HIF-1 α，VEGF，LDHA等蛋白的表达

灯盏乙素增加HepG2细胞中HIF-1 α的羟基化和降解，采用HIF-1 a羟基化抗体进行免疫印迹好细胞免疫荧光的检测，结果如图13所示。

灯盏乙素刺激肿瘤细胞后，提取细胞蛋白进行western blotting免疫印迹检测，针对特定蛋白HIF-1 α，VEGF,LDHA购买对应的抗体，按照抗体说明书进行稀释，然后进行基于ECL发光仪器进行成像，获得的条带进行蛋白定量分析。灯盏乙素减少HepG2、Hun7细胞中HIF-1 α，VEGF，LDHA等基因转录、蛋白的表达如图14所示，PFKL、GLUT1、PGK1、LDHA、VEGFA均与Scu药效浓度呈现相关性降低。

实施例8：过表达、敲低IDH1对HepG2细胞的功能影响

使用pLV-U6-shRNA-CMV-EGFP（2A）-PURO载体设计并合成了针对人IDH1的三个最高评分shRNA序列。人IDH1基因表达慢病毒载体使用pLV-mCherry:T2A:Bsd-EF1A>FLAG/hIDH1载体设计和合成。空载体用作阴性对照。使用慢病毒包装试剂盒（Bioorigin）进行慢病毒包装。然后，用慢病毒浓缩物感染HepG2细胞24小时。感染HepG2细胞72小时后，在Olympus荧光显微镜下观察荧光蛋白表达，以检测病毒感染效率。最后分别用嘌呤霉素和芽孢霉素筛选IDH1敲低和过表达细胞系。过表达、敲低IDH1后的细胞株采用以上实施例子的方法进行抗肿瘤细胞增殖、IDH1酶活、a-KG含量、细胞增殖斑、HIF-1a下游通路的检测，其中mRNA的检测表述为：

提取细胞RNA进行荧光定量PCR检测，RNA的提取采用trizol试剂方法，进行总RNA的提取，定量，逆转录，逆转录后的CDNA，针对特定基因HIF-1 α，VEGF，LDHA等设计引物进行检测，采用常规荧光定量方法，荧光定量缓冲液购买自Abclonal公司，荧光定量PCR仪器为ABI stepone plus。这些结果在图15~图23中展示。

针对过表达IDH1的HpG2细胞，图15 中A、图15中B 为过表达IDH1细胞的免疫印迹验证，过表达HepG2细胞株IDH1表达量增加具有显著差异；图15中C显示IDH1抑制HepG2肿瘤细胞增殖克隆斑的生成。图16中A、图16中B和图16中C为过表达IDH1抑制HepG2肿瘤细胞的糖酵解图，均呈现显著差异；如图16中D所示，采用2-NBDG探针检测过表达后HepG2细胞的糖摄取，Scu刺激后也呈现显著降低。图17为过表达IDH1抑制HepG2肿瘤细胞HIF-1a与下游通路相关蛋白mRNA转录和表达；图18显示过表达IDH1提高HIF-1a的羟基化，降低了HepG2肿瘤细胞的HIF-1a的含量。提高IDH1含量与增加IDH1的酶活生物学效应是一致的，这既表明了IDH1激活具生物学活性，也进一步表明了Scu通过提高IDH1酶活，增加a-KG含量，发挥生物学功能。

进一步的，采用ShRNA质粒敲低IDH1的HepG2细胞的测试结果与过表达IDH1的结果相反，提供了进一步的佐证。降低IDH1的表达降低灯盏乙素对于HepG2毒性（如图19所示），IC50值升高了约一倍左右，降低IDH1的表达降低灯盏乙素对于HepG2增殖克隆斑的促进作用十分显著（P<0.05，如图20所示），降低IDH1后Scu对HepG2细胞的周期的影响消失(P>0.05，如图21所示)，降低IDH1后HepG2细胞中Scu对HIF-1 α和下游效应蛋白的mRNA转录影响消失(P>0.05，如图22所示)，降低IDH1后会减少Scu对HepG2细胞中HIF-1 α和下游效应蛋白的影响(P>0.05，如图23所示)；降低IDH1会减少HepG2细胞中HIF-1 α的羟基化(如图24所示)，与Scu刺激和过表达的结果一致。通过降低IDH1细胞的活性测试，进一步表明了Scu通过激活IDH1发挥生物学效应。

实施例9：灯盏乙素对HepG2小鼠移植瘤生长的影响

将IDH1野生型或过度表达的HepG2细胞（3×7天后，当肿瘤大小达到约100 mm³时，小鼠每天腹腔注射Scu或0.9 %生理盐水，持续28天。每周通过测量肿瘤的两个垂直直径并使用公式V=长度（mm）×宽度（mm）²/2来确定肿瘤体积V，每周记录体重。在治疗结束时，处死小鼠，切除其肿瘤和主要器官以进行后续实验。

将HCC组织切片和切片在二甲苯中脱蜡，并通过降阶醇方法脱水。每个区块都有一个苏木精和伊红（H&E）染色切片。通过在90℃的0.01M柠檬酸盐缓冲液中孵育20分钟实现抗原修复。通过在3 %过氧化氢中孵育实现内源性过氧化物酶的清除。将切片在含有10 %正常山羊血清和0.3%Triton X-100的PBS中封闭60分钟，用Ki-67（1:200）、IDH1（1:500）、HIF1a（1:500）、GLUT1（1:5000）和VEGF（1:400）抗体（购买自Abclonal公司）标记，在4℃下过夜，并在室温下与相应的山羊二级抗体孵育1小时。使用3,3′-二氨基联苯胺（DAB）底物试剂盒（Solarbio）完成检测。然后切片用苏木精染色，并使用显微镜观察并拍照。

灯盏乙素对HepG2小鼠移植瘤生长的影响如图25所示，Scu显著降低了HepG2移植瘤的体积、重量，呈现剂量依赖的关系，具有显著的统计学差异，进一步使用免疫组化的方法检测Ki67增殖蛋白组化结果如图26所示，使用Scu后肿瘤组织细胞的Ki67增殖蛋白显著降低且呈现剂量依赖的关系。

实施例10：灯盏乙素增加移植瘤小鼠的a-KG含量、降低验证因子的水平

按照实施例8进行小鼠体内载瘤实验后，收集小鼠血清，采用液相芯片方法测定其中的炎症因子和采用ELISA方法测定a-KG的含量，Scu组的小鼠血清中的a-KG的含量明显升高，表明Scu在体内也可以能加a-KG的水平（如图27所示），同时测定了增小鼠肿瘤组织IDH1酶活，Scu组的小鼠肿瘤组织的a-KG的酶活明显升高，具有统计学差异（P<0.05）（如图28所示）。

进一步测定小鼠血清中炎症因子的含量，首先将伯乐生物科技有限公司的小鼠炎症因子试剂盒恢复室温，按照说明书要求制备稀释标准曲线，稀释样本，取100 μL Bio-Plex assay buffer于孔板底部湿润；将10x beads混匀后，用assay buffer稀释到1x，混匀，A1-H1每孔加入50 μL；100 μL Bio-Plex wash buffer (1x) /每孔，清洗2次；按照S1、S4、S7、Blank、样1、样2、样1稀释4倍、样2稀释4倍的顺序加入到A1-H1孔，50 μL/孔，加样后铝箔纸密封置于摇床上，850 ± 50 rpm，室温1h；孵育剩余10 min时，提前震荡detectionantibodies 15s，稀释至1x；洗板3次，每次100 μL wash buffer; 混匀1x detectionantibodies，每孔加入25 μL，铝箔纸密封置于摇床上，850±50 rpm，室温30 min；孵育剩余10 min时，将100 x streptavidin-phycoerythrin(SA-PE) 斡旋5 s，取assay buffer稀释成1 x; 洗板3次，每次100 μL wash buffer; 震荡1x SA-PE，每孔加入50 μL，铝箔纸密封置于摇床上，850±50 rpm，室温10 min；洗板3次，每次100 μL wash buffer；每孔加入125μL assay buffer，铝箔纸密封置于摇床上，850 ± 50 rpm，30 s；仪器校正后，上机检测。结果表明，Scu对肿瘤小鼠的炎症具有抑制作用，抗炎因子提高，促炎症因子降低，具有明显的差异P＜0.05（如图29所示）。

实施例11：灯盏乙素降低HepG2小鼠移植瘤中HIF-1α，VEGF，LDHA等蛋白的mRNA转录和表达

小鼠组织中RNA提取方法与HepG2细胞类似，使用总RNA提取试剂（ABclone）分离总RNA。用ABScript III逆转录酶（ABclone）将RNA逆转录为互补DNA（cDNA）。使用Genious 2 XSYBR Green Fast qPCR Mix（ABclone）进行定量实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。20 μL反应混合物包含400 nM引物、10 μL SYBR Green Fast qPCR Mix、2 μL模板cDNA和无RNA酶水。按照仪器说明在Archimed X6定量实时PCR（RocGene）上进行cDNA扩增。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）用作内参对照。

使用含有完整蛋白酶抑制剂混合液的（Beyotime）的RIPA裂解缓冲液（Epizyme）制备全细胞裂解物，并在4 ℃、通过BCA蛋白质测定试剂（Solarbio）测定细胞裂解物的蛋白质浓度。细胞裂解物在上样缓冲液中以10 %的SDS-PAGE分离10分钟，转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore）上，在25℃用5 % 脱脂牛奶封闭膜30分钟，然后在4℃与对应蛋白抗体孵育过夜。随后，将膜与辣根过氧化物酶（HRP）缀合的二抗抗体或抗小鼠IgG二级抗体在室温下孵育1小时。化学发光试剂盒（Epizyme）用于检测感兴趣的蛋白质。膜通过SH-520凝胶成像分析系统（Shenhua Bio）进行分析，并通过ImageJ软件（1.8.0版）进行定量。

结果表明，灯盏乙素抑制HepG2小鼠肿瘤组织HIF-1α，VEGF,LDHA等的mRNA转录表达，具有明显的差异P<0.05（如图30所示）；

免疫印迹法检测结果如图31所示，免疫组化法如图32所示，各种方法之间的检测结果一致，且具有明显的剂量依赖关系。以上结果均验证出Scu在体内具有良好的抗肿瘤药效，且作用机制与细胞实验结果一致，Scu在体内是良好的IDH1激活剂，基于此机理，具有良好的开发价值。

实施例12：灯盏乙素增加间充质干细胞的活力和干性

干细胞增殖和干性增加对抗衰老、抗炎等具有已知的作用，本专利同样测试了Scu在干细胞活性和干性保持机制方面的作用，来揭示Scu作为IDH1激动剂的潜在基于干细胞的抗衰老、抗炎等的应用价值，同时一并检测了Scu作为IDH1激动剂对干细胞、神经细胞SH-SY5Y、大鼠心肌细胞H9C2细胞的a-KG增加情况（如表2所示）。

表2 灯盏乙素对脐带间充质干细胞、H-SY5Y、H9C2细胞的IDH1激活情况对比

首先培养人脐带间充质干细胞，人脐带间充质干细胞购买自广州赛莱拉干细胞有限公司，细胞冻存管37 °C解冻后，500 rpm, 3 min离心，弃上清，加入培养基，吹匀，放入培养皿中；细胞传代消化时加入2 mL PBS清洗，用胰酶消化1 min，用手轻拍，加入培养基，轻吹；离心，500 rpm, 3min，弃上清；加入培养基后放入培养箱。采用P7代以前的干细胞，培养于六孔板中，加入不同浓度Scu药物，药物刺激后，采用上述实施例中CCK-8方法检测细胞活性，Scu对干细胞的增殖能力具有显著的增强作用，最优浓度在20 μM左右，测试浓度没有表现出细胞毒性（如图33所示），采用成骨、成脂肪诱导试剂盒（购买自广东赛业生物科技有限公司）观察细胞的诱导分化能力结果表明Scu对干细胞的分化能力具有显著的增强作用（如图34所示）。干细胞在人体内具有非常重要的作用，干细胞的活性增强能够显著降低人体炎症，同时干细胞是细胞更新的源泉，干细胞增殖和分化能力的提高暗示Scu具有通过提高抗炎、抗衰老的作用。

实施例13：灯盏乙素增加神经退行性疾病细胞的保护作用

本实施例通过检测Scu对神经退行性细胞模型的保护作用，来揭示Scu作为IDH1激动剂的潜在的神经细胞保护或恢复应用价值，Scu在SH-SY5Y细胞对IDH1的激活作用如表1所示。

细胞活力检测，使用96孔板作为细胞活力测试的载体，接种约1×10⁴个SH-SY5Y细胞。培养12小时后，将SH-SY5Y细胞与6-OHDA孵育24小时，另外设置灯盏乙素药物干预组。使用MTT法检测细胞活力。噻唑蓝（MTT，Macklin，中国）能够与活细胞的酶结合，并形成可被二甲基亚砜（DMSO，Tgreag，中国）溶解的蓝紫色结晶甲瓒沉淀。在490 nm处通过酶标仪测定活细胞的数量。独立实验重复三次(如图35所示)，实验结果表明灯盏乙素增加了细胞的SH-SY5Y细胞受损后的活性。

细胞线粒体荧光检测，设置正常细胞对照组、药物损伤组和灯盏移乙素药物干预组，制备200 μM Mito Tracker Red CMXRos（Beyotime Biotechnology，中国）储液，将其稀释按照1:1000比例稀释使最终浓度为2 0 nM~200 nM的工作液。工作液在使用前需在37 ℃预孵育。随后，当SH-SY5Y细胞在细胞培养板或培养皿中培养至一定密度时，去除细胞培养液，将2 μL Mito Tracker Red CMXRos染色溶液和5 μL Hoechst 33342染色溶液（Beyotime Biotechnology，中国）依次添加到培养基中。37℃孵育15-30分钟。去除Mito-Tracker Red CMXRos工作液，加入37℃预温育的新鲜细胞培养液，并转移至荧光显微镜下观察荧光。实验结果表明灯盏乙素增加了线粒体荧光，起到了保护作用，结果如图36所示。

细胞ROS检测，置正常细胞对照组、药物损伤组和灯盏移乙素药物干预组，制备DCFH-DA（Beyotame Biotechnology，中国）储液，将其用无血清培养液按照1:1000进行稀释，使其终浓度为10 μM，并加入SH-SY5Y细胞中，在37 ℃预孵育。随后，将2 μL MitoTracker Red CMXRos染色溶液或DCFH-DA染色溶液和5 μL Hoechst 33342染色溶液依次添加到培养基中。在37 ℃孵育20分钟并用无血清细胞培养液反复洗涤细胞3次，在荧光显微镜下观察。实验结果表明灯盏乙素降低了细胞ROS水平，起到了保护作用，结果如图37所示。

实施例14：灯盏乙素对大鼠心肌细胞H9C2抗氧化损伤的保护作用

本实施例通过检测Scu对大鼠心肌细胞H9C2细胞模型的保护作用，来揭示Scu作为IDH1激动剂的潜在心肌保护应用价值。Scu在H9C2细胞对IDH1的激活作用如表2所示。

大鼠心肌细胞H9C2、人血管内皮细胞购买自北京协和医学院基础所细胞保存中心，细胞培养方法按照不同的细胞要求进行，将复苏后的H9c2细胞，接种于培养皿中，加入10 mL含10 % FBS的DMEM培养基，置于5 % CO₂、37 ℃培养箱中培养，24 h后换液并观察细胞状态。待细胞生长面积在80 % 以上时，吸出培养液，加入PBS 2ml轻轻荡洗细胞数次，然后加入1mL 0.25 %的胰蛋白酶，加胰酶后轻轻摇荡，使胰酶流过所有细胞，将细胞在倒置显微镜下随时观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，待细胞形态趋于圆形时，加入含10 %FBS DMEM培养基终止消化，用吸管轻轻吹打几次，收集消化后的细胞至15 mL离心管，1000r/min离心5 min，弃去培养液；加入含10 % FBS DMEM培养基重悬H9C2细胞，使细胞完全分散，分别接种于培养皿中，并补足培养基至10 mL，置于5% CO₂、37 ℃培养箱中培养，隔日观察细胞生长状态，H9C2心肌细胞约每3天进行一次传代。

细胞在孔板中培养汇合达到70 %后，采用H₂O₂诱导细胞氧化损伤模型，200 μMH₂O₂或者 4 mM Na₂S₂O₄处理细胞大于 6小时；检测培养基中的心肌损伤指标CK-MB，CCK-8检测细胞存活率，将细胞按照1×10⁴/100μL/孔的密度接种于96 孔板，边缘孔加100 μL PBS防止蒸发，置于37 ℃、5 % CO₂培养箱中培养24 h；细胞铺板24 h后换液（无血清培养基），平衡4~6 h，加药液（24h）后加入10微升CCK8，孵育(1-2h，根据时间确定)，酶标仪测定450nm 处的OD 值，细胞活力（%）=（A实验-A空白）÷（A对照-A空白）× 100%。实验组和对照组存在差异为造模成功。采用不同的Scu药物干预，采用DMSO溶解药物单体，稀释至DMSO含量不超过千分之一，用于细胞实验。药物单体作用不同浓度梯度测定药物干预和对照组的细胞活力、线粒体膜电位和ROS水平，检测方法同实施例12，检测结果如图38所示。

实施例15：不同灯盏乙素化合物的横向药效比较

本发明所述的灯盏乙素化合物为灯盏乙素、灯盏乙素苷元衍生物及其药学上可接受的盐。且针对不同化合物进行横向对比：对HepG2细胞的毒性以及对IDH1酶活增加的影响，对a-KG含量升高的能力，以及对干细胞、神经推行性细胞模型的作用。表明以灯盏乙素苷元为骨架不同的化合物都具有类似的功能，灯盏乙素苷元类化合物都在本专利设定的权限以内，各化合物的结果如表3所示。

表3 不同灯盏乙素化合物的横向药效比较

总结论：

1、基于酶活性评价体系和结合力测定试验发现灯盏乙素化合物与野生型的IDH1蛋白具有较强的结合亲和力并且直接激活的IDH1的酶活性。

2、灯盏乙素化合物作用于IDH1抑制HepG2等细胞的增殖及克隆的形成；抑制HepG2、Huh7等细胞的糖酵解速率；促进HepG2等细胞中IDH1生成物a-KG的产生，抑制HepG2细胞的细胞增殖；诱导HepG2细胞的周期阻滞；抑制裸鼠HepG2瘤的生长。

3、灯盏乙素作用于IDH1提高HIF1a的羟基化，导致HIF-1a的降解，引起HIF1a下游通路VEGF，LDHA等蛋白的转录和表达的变化，发挥抗肿瘤等作用。

4、过表达IDH1抑制HepG2的增殖及克隆形成；抑制HepG2的糖酵解速率；促进HepG2细胞中IDH1生成物a-KG的产生，抑制HepG2细胞的细胞增殖；诱导HepG2细胞的周期阻滞；抑制HepG2小鼠移植HepG2瘤的生长。

5、利用干扰质粒ShRNA降低IDH1的表达降低灯盏乙素对于HepG2细胞活力的敏感性；降低IDH1提高HepG2细胞的糖酵解速率；降低IDH1提高HepG2细胞中HIF-1α，影响VEGF，LDHA等蛋白的表达。

6、灯盏乙素化合物促进脐带间充质干细胞增殖和干性，对神经退行性损伤细胞模型起到保护作用，对心肌细胞损伤起到保护作用，灯盏乙素对这些细胞中的a-KG含量均有促进作用。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.灯盏乙素化合物作为野生型IDH1激动剂在制备增强干细胞增殖和分化能力药物中的应用，其特征在于，所述干细胞为脐带间充质干细胞；所述灯盏乙素能够提高IDH1的酶活，提高细胞和小鼠动物体内IDH1产物a-KG的含量，灯盏乙素增加a-KG促进HIF-1降解发挥抑制下游效应分子PFKL、PGK1、LDHA、GLUT1、VEGFA的作用。

2.根据权利要求1所述灯盏乙素化合物作为野生型IDH1激动剂在制备增强干细胞增殖和分化能力药物中的应用，其特征在于，所述的药物为口服制剂。

3.根据权利要求1所述灯盏乙素化合物作为野生型IDH1激动剂在制备增强干细胞增殖和分化能力药物中的应用，其特征在于，所述药物为注射制剂。

4.根据权利要求1所述灯盏乙素化合物作为野生型IDH1激动剂在制备增强干细胞增殖和分化能力药物中的应用，其特征在于，所述药物为吸入制剂。