CN115554306B - 哈巴俄苷在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本申请提供了哈巴俄苷在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途和非治疗方法。实验结果表明，哈巴俄苷能显著缓解神经病理性疼痛小鼠的机械痛觉超敏、热痛觉过敏、冷痛觉超敏现象，激活脊髓内部的GLP‑1R/IL‑10/β‑Endorphin通路中使IL‑10、β‑Endorphin蛋白的表达增加，对神经病理性疼痛小鼠具有保护作用。

Description

哈巴俄苷在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途

技术领域

本申请属于神经疾病治疗领域，具体地，本申请提供了哈巴俄苷在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途和非治疗方法。

背景技术

疼痛作为第5生命体征，与血压、体温、呼吸、脉搏一起，是生命体征的重要指标。慢性疼痛是一种疾病不仅仅在于疼痛本身，更重要的是在慢性疼痛中，长期的疼痛刺激可以促使中枢神经系统发生病理性重构，使疼痛疾病的进展愈加难以控制。对于患者而言，慢性疼痛也不仅仅是一种痛苦的感觉体验，调查研究显示，慢性疼痛可以严重影响躯体和社会功能，使患者无法参与正常的生活和社交活动。在发展中国家约有18％的人患有慢性疼痛，除了成年人外，慢性疼痛还影响了约11-38％的青少年。近期，一项研究表明神经病理性疼痛在普通人中的发生率约为6.9-10％，神经病理性疼痛的诱发因素很多，除创伤、代谢紊乱、感染、血管性疾病等病理性因素外，性别、年龄、教育背景、生存环境、经济水平也与神经病理性疼痛的发生密切相关。现今，随着全球人口老龄化趋势增加，与糖尿病和癌症生存率相关的神经性疼痛的发病率将不可避免地呈升高趋势。目前对神经病理性疼痛的治疗方式以药物治疗为主，如普瑞巴林、加巴喷丁、阿米替林等，这些药物对患者的治疗作用有限，且存在不同程度的副作用，因此研发更安全、更有效治疗神经病理性疼痛的药物具有重大的社会价值和研究意义。

玄参始载于《神农本草经》，列为中品。为玄参科植物玄参Scrophularianingpoensis Hemsl.的干燥根，具有清热凉血、滋阴降火、解毒散结的功效，用于热入营血、温毒发斑、热病伤阴、舌绛烦渴、津伤便秘、骨蒸劳嗽、目赤、咽痛、白喉、瘰疬和痈肿疮毒。主产地为浙江、湖南、湖北、陕西、四川等省，浙江磐安为其道地产区。文献报道，玄参总色素提取物对热板和冰醋酸引起的小鼠痛阈降低有显著改善作用，表明玄参总色素提取物具有抗炎镇痛活性。玄参口服液对蛋清致炎引起的大鼠足趾肿胀、对小鼠肉芽肿的形成、巴豆油引起的耳壳肿胀、醋酸引起的扭体反应有显著抑制作用，表明玄参口服液具有显著抗炎、镇痛和抑菌作用。而哈巴俄苷是玄参中的主要活性成分之一，研究表明哈巴俄苷具有神经保护、抗炎和镇痛的药理作用。因此将其发展为治疗神经病理性疼痛药物具有极高的潜在价值与社会意义。

发明内容

一方面，本发明提供了哈巴俄苷在制备治疗神经病理性疼痛药物中的用途。

另一方面，本发明提供了哈巴俄苷在制备增加脊髓中IL-10、β-Endorphin蛋白的表达的药物中的用途。

另一方面，本发明提供了哈巴俄苷在制备治疗坐骨神经病理损伤和保护坐骨神经髓鞘的药物中的应用。

进一步地，所述药物中哈巴俄苷为唯一活性成分。

进一步地，所述神经病理性疼痛为机械痛觉超敏、热痛觉过敏或者冷痛觉超敏。

进一步地，所述神经病理性疼痛为机械缩足反射阈值降低、热缩组潜伏期缩短、冷抬足次数升高。

另一方面，本发明提供了改善神经病理性疼痛的非治疗方法，包括向患有神经病理性疼痛的对象施用哈巴俄苷。

进一步地，哈巴俄苷单次应用剂量为60-120mg/kg。

进一步地，哈巴俄苷单次应用剂量为120-180mg/kg。

进一步地，哈巴俄苷单次应用剂量为180mg/kg。

进一步地，所述药物为注射或者口服剂型，优选口服剂型。

本申请中哈巴俄苷的结构式如式(I)所示，其CAS号为19210-12-9：

本申请中的非治疗方法包括但不限于保健方法以及科学研究方法，实施对象可以为人或其他哺乳动物如鼠、兔、犬等。

本申请中神经病理性疼痛的症状或指症包括但不限于机械痛觉超敏、热痛觉过敏、冷痛觉超敏，脊髓组织中的GLP-1R/IL-10/β-Endorphin通路。

本申请的可用的药物剂型包括各种注射和口服剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、口服液、针剂、粉针剂、透皮给药制剂，特别优选口服剂型。

除哈巴俄苷外，本申请中所述的药物还可以包括药学上可接受的各种辅料/赋形剂，包括但不限于包衣材料、溶剂、增溶剂、粘合剂、稳定剂、抗氧化剂、pH调节剂、矫味剂等，特别优选可用于口服剂型的各种辅料/赋形剂。

本发明的药物中可以包含其他治疗神经病理性疼痛的中西药药物或保健品，或者本发明的药物可以与这些中西药药物或保健品或手术等治疗手段联合使用。所述中西药药物或保健品包括但不限于抗感染药物、促性腺激素类药物、抗氧化剂类药物、能量代谢和血液循环改善剂。

本发明首次证实，哈巴俄苷具有治疗神经病理性疼痛小鼠的作用，可用于制备神经病理性疼痛的治疗药物，为此类药物提供了一种新的选择。本申请的实施例中哈巴俄苷能显著改善机械痛觉超敏、热痛觉过敏、冷痛觉超敏症状；激活脊髓内部的GLP-1R/IL-10/β-Endorphin通路中使IL-10、β-Endorphin蛋白的表达增加，改善神经病理性疼痛。进而可以将其用于与脊髓内部IL-10、β-Endorphin降低密切关联的脊髓损伤等疾病。

附图说明

图1为哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠机械缩足反射阈值的影响图；结果以Mean±SEM(n＝6)表示，^##p<0.01与Shan+NS组比较,^*p<0.05,^**p<0.01与CCI+NS组比较。

图2为哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠热缩足潜伏期的影响图。结果以Mean±SEM(n＝6)表示，^##p<0.01与Shan+NS组比较，^*p<0.05,^**p<0.01与CCI+NS组比较。

图3为哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠冷抬足次数的影响图。结果以Mean±SEM(n＝6)表示，^#p<0.05,^##p<0.01与Shan+NS组比较，^*p<0.05,^**p<0.01与CCI+NS组比较。

图4为哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠自主活动次数的影响图。结果以Mean±SEM(n＝6)表示，^*p<0.05表示与CCI+NS组比较。

图5为哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠神经肌肉电生理的影响图。A-G：哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠坐骨-感觉神经动作电位的影响图(A：Sham+NS组，B:Sham+HAR180mg/kg,C:CCI+NS组，D：CCI+PRE 20mg/kg组，E:CCI+HAR 60mg/kg组，F:CCI+HAR 120mg/kg组，G:CCI+HAR 180mg/kg组)；H：哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠复合肌肉动作电位振幅影响的统计图；I：哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠坐骨-感觉神经传导速度影响的统计图。结果以Mean±SEM(n＝6)表示，^###p<0.001与Shan+NS组比较,^*p<0.05,^**p<0.01与CCI+NS组比较。

图6为哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠坐骨神经神经纤维排列及脱髓鞘情况(A：Sham+NS组，B:Sham+HAR180 mg/kg,C:CCI+NS组，D：CCI+PRE 20mg/kg组，E:CCI+HAR 60mg/kg组，F:CCI+HAR 120mg/kg组，G:CCI+HAR 180mg/kg组)。

图7为哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠坐骨神经有髓神经纤维髓鞘的影响(A：Sham+NS组，B:Sham+HAR180 mg/kg,C:CCI+NS组，D：CCI+PRE 20mg/kg组，E:CCI+HAR 60mg/kg组，F:CCI+HAR 120mg/kg组，G:CCI+HAR 180mg/kg组)。

图8为哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠坐骨神经超微结构的影响(A：Sham+NS组，B:Sham+HAR180 mg/kg,C:CCI+NS组，D：CCI+PRE 20mg/kg组，E:CCI+HAR 60mg/kg组，F:CCI+HAR 120mg/kg组，G:CCI+HAR 180mg/kg组)。

图9为哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠脊髓组织中IL-10表达水平的影响图。结果以Mean±SEM(n＝6)表示，^#p<0.05与Shan+NS组比较,^*p<0.05与CCI+NS组比较。

图10为哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠脊髓组织中β-Endorphin表达水平的影响图。结果以Mean±SEM(n＝6)表示，^#p<0.05与Shan+NS组比较,^**p<0.01与CCI+NS组比较。

图11为胰高血糖素样肽-1拮抗剂Exendin(9-39)对哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠镇痛作用的阻断效应图。结果以Mean±SEM(n＝6)表示，^*p<0.05，^**p<0.01与CCI+HAR180mg/kg组比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，以下实施例中使用的哈巴俄苷均为前述式(1)所示的化合物，可通过商购获得。

实施例1哈巴俄苷的剂型和剂量

哈巴俄苷在制备治疗神经病理性疼痛药物中单次应用剂量为小鼠60mg/kg、120mg/kg、180mg/kg，药物的剂型为腹腔注射剂型。

实施例2实验材料

动物处理

体重18-22g之间的SPF级C57BL/6J雄性成年小鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司繁殖(动物孵育合格批号：SCXK(京)2020-004)。动物饲养参照实验动物饲养标准，饲养房12h人工控制昼夜交替，小鼠自由饮水。

实验药品及仪器

本实验中会涉及到的主要药品和试剂包括：哈巴俄苷(购自上海源叶生物公司，纯度≥98％，缩写为HAR)；普瑞巴林(购自辉瑞制药有限公司，缩写为PRE)；戊巴比妥钠(购自德国默克)；生理盐水(购自天津大茂化学试剂厂)；多聚甲醛固定液(购自Servicebio)；二甲苯(购自国药集团化学试剂有限公司)；HE染液(购自Servicebio)；全蛋白提取试剂盒(购自南京凯基生物公司)；IL-10ELISA试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)；β-Endorphin ELISA试剂盒(购自美国Sabbiotech)

本实验中会涉及到的主要仪器包括：Von Frey纤维丝(购自美国North CoastMedical)；热刺痛仪(购自成都泰盟科技有限公司)；冷热痛觉测定仪(购自法国Bioseb)；多功能小鼠自主活动记录仪(购自山东医学科学院设备厂)；生物机能实验系统(购自成都泰盟科技有限公司)；全自动样品冷冻研磨仪(购自上海净信科技有限公司)；高速低温离心机(德国Eppendorf)；电热恒温鼓风干燥箱(购自上海琅玕实验设备有限公司)；荧光显微镜(购自OLYMPUS)；光学显微镜(购自OLYMPUS)；

实施例3实验动物分组及给药

体重18-22g之间的雄性成年C57BL/6J小鼠清洁级饲养间适应性喂养3天后，按体重梯度抽样法将其平均分至对照组、模型组、普瑞巴林组和哈巴俄苷60mg/kg、120mg/kg、180mg/kg组。各组动物除正常饲养外，模型组使用羊肠线结扎坐骨神经3次完成慢性压迫性损伤模型(CCI)的手术过程，即构建雄性小鼠神经病理性疼痛模型。普瑞巴林组给予普瑞巴林(20mg/kg)腹腔注射，哈巴俄苷60mg/kg、120mg/kg、180mg/kg组给予哈巴俄苷(60mg/kg、120mg/kg、180mg/kg)腹腔注射，每组6只。普瑞巴林组和哈巴俄苷各给药剂量组于每天上午固定时间点连续给药8天，对照组和模型组小鼠均给予相同容量的0.9％生理盐水溶液；以每0.1mL/10g的给药容积腹腔注射给药；其余实验条件相同。

实施例4机械缩足反射阈值测定

在造模前、造模后第7、8、10、12、14天采用Von Frey纤维丝检测各组小鼠手术侧足底的机械缩足反射阈值。小鼠被置于一个透明的有机玻璃罩内，适应15min，待其安静后用不同的Von Frey纤维丝刺激小鼠手术侧足底的3、4趾之间，观察小鼠是否发生抬足、缩足或舔足现象，当使用某一个Von Frey纤维丝刺激10次，有6次及以上上述行为发生时，停止试验，并记录此Von Frey纤维丝的值(g)，即为该小鼠的机械缩足反射阈值。

结果如表1、图1所示，造模前1天，各组小鼠的PWT均无显著性差异(p＞0.05)；造模第7天，CCI+NS组与Sham+NS组小鼠相比，PWT显著降低(p＜0.01)，下降超过60％，证明造模成功；与CCI+NS组相比，CCI+PRE组小鼠PWT显著升高(p＜0.01)，CCI+HAR(60，120mg/kg)组小鼠PWT无显著性差异(p＞0.05)，CCI+HAR 180mg/kg组小鼠PWT显著升高(p＜0.05，p＜0.01)。与Sham+NS组小鼠相比，Sham+HAR组小鼠PWT无显著差异(p＞0.05)；提示哈巴俄苷可以升高神经病理性疼痛小鼠机械缩足反射阈值，从而缓解其机械痛觉超敏现象。

表1哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠机械缩足反射阈值的影响(n＝6)

^##p<0.01与Sham+NS组比较；^*p<0.05,^**p<0.01与CCI+NS组比较

实施例5热缩足潜伏期的测定

在造模前、造模后第7、8、10、12、14天采用PL-200辐射热刺痛仪测定各组小鼠患侧的PWL值。小鼠被置于一个透明的有机玻璃罩内，待小鼠安静后启动仪器，该仪器发射红外光照射小鼠右后肢足底，待小鼠因热痛而出现缩足、抬足时，仪器便自动切断热源并记录从开始照射至小鼠出现缩足的时间(s)，重复测量3次，每次间隔10min，取平均值，即为热缩足反射潜伏期。为了防止小鼠被热辐射烫伤，将测量时间的上限设置为20s。

结果如表2、图2所示，造模前1天，各组小鼠的PWL均无显著性差异(p＞0.05)；造模第7天，CCI+NS组与Sham+NS组小鼠相比，PWL显著降低(p＜0.01)，下降超过50％，证明造模成功；与CCI+NS组相比，CCI+PRE组小鼠PWL显著升高(p＜0.01)，CCI+HAR(60mg/kg)组小鼠PWL无显著性差异(p＞0.05)，CCI+HAR(120，180mg/kg)组小鼠PWL显著升高(p＜0.05，p＜0.01)。与Sham+NS组小鼠相比，Sham+HAR组小鼠PWL无显著差异(p＞0.05)；提示哈巴俄苷可以升高神经病理性疼痛小鼠热缩足潜伏期，从而缓解其热痛觉过敏现象。

表2哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠热缩足潜伏期的影响(n＝6)

^##p<0.01与Sham+NS组比较；^*p<0.05,^**p<0.01与CCI+NS组比较

实施例6冷抬足次数的测定

在造模前、造模后第7、8、10、12、14天采用冷热板痛觉测定仪测定各组小鼠手术侧的冷抬足次数。冷热板痛觉测定仪温度设置为4.0±0.5℃，小鼠被置于一个透明的有机玻璃罩内，使其适应5min后，记录5min内小鼠的抬足次数。

结果如表3、图3所示，造模前1天，各组小鼠的PWL均无显著性差异(p＞0.05)；造模第7天，CCI+NS组与Sham+NS组小鼠相比，冷抬足次数显著升高(p＜0.05)，下降超过100％，证明造模成功；与CCI+NS组相比，CCI+PRE组小鼠冷抬足次数显著降低(p＜0.01)，CCI+HAR(60mg/kg)组小鼠冷抬足次数无显著性差异(p＞0.05)，CCI+HAR(120，180mg/kg)组小鼠冷抬足次数显著降低(p＜0.05，p＜0.01)。与Sham+NS组小鼠相比，Sham+HAR组小鼠冷抬足次数无显著差异(p＞0.05)；提示哈巴俄苷通过降低神经病理性疼痛小鼠冷抬足次数，来缓解其冷痛觉超敏现象。

表3哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠冷抬足次数的影响(n＝6)

^#p<0.05,^##p<0.01与Sham+NS组比较；^*p<0.05,^**p<0.01与CCI+NS组比较

实施例7自主活动次数的变化

在造模后第14天采用自主活动测定仪检测各组小鼠的自主活动次数。将小鼠置于自主活动测定仪中，适应5min后，计时5min并记录该时间段内小鼠的自主活动次数。

结果如表4、图4所示，造模后第14天，与CCI+NS组相比，CCI+PRE组小鼠的自主活动次数显著下降(p＜0.05)。其余各组小鼠的自主活动次数之间无显著性差异(p＞0.05)。

表4哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠自主活动次数的影响(n＝6)

^*p<0.05，与CCI+NS组比较

实施例8电生理实验测定各组小鼠的复合肌肉动作电位振幅

设定好BL-420F电生理检测参数，随后用戊巴比妥钠(65mg/kg，i.p.)将小鼠麻醉，剪毛、备皮并消毒后剪开右后肢皮肤，用玻璃分离器分离出坐骨神经，剔除结扎线，刺激电极钩住坐骨神经主干、参比电极插入腓肠肌、记录电极分别插入小鼠脚踝及2、3趾间，实验过程中，用温液体石蜡保护小鼠坐骨神经，用生理盐水导电，实验时间应尽量保证在30min内，结束后保存数据(CMAP：动作电位波峰与波谷之间的距离)。

结果如表5、图5所示，与Sham+NS组相比，CCI+NS组小鼠CMAP显著降低(p＜0.001)；与CCI+NS组相比，CCI+PRE组小鼠CMAP显著升高(p＜0.001)，CCI+HAR(60、120、180mg/kg)组CMAP显著升高(p＜0.05，p＜0.001)；与Sham+NS组相比，Sham+HAR组无显著差异(p＞0.05)。

表5哈巴俄苷对神经病理性疼痛小鼠SNCV和CMAP的影响(n＝6)

^###p<0.001与Sham+NS组比较；^*p<0.05,^***p<0.001与CCI+NS组比较

实施例9HE染色观察哈巴俄苷对CCI小鼠坐骨神经病理损伤的影响

制备石蜡切片：

①取材：各组小鼠在第14天行为学实验结束后分别进行心脏灌注，取小鼠脊髓L3-L5节段及右侧坐骨神经主干部分。

②固定：4％多聚甲醛浸泡过夜，原则上不超过24h。

③脱水及透明：将组织放到包埋盒内，用流水冲洗10min后进行梯度稀释，流程如下：70％乙醇1h—80％乙醇45min—90％乙醇30min—95％乙醇30min—无水乙醇Ⅰ20min—无水乙醇Ⅱ20min—二甲苯Ⅰ1h—二甲苯Ⅱ45min。

④浸蜡：浸入60℃的石蜡Ⅰ、Ⅱ各1.5h。

⑤包埋：使用自动包埋机包埋，随后室温下冷凝，备用。

⑥切片：从矢状面(厚度为4μm)切下，随后将切片置于温水中展片，用载玻片中段部分捞片并标记。

HE染色：

①脱蜡：切片浸于二甲苯Ⅰ20min—二甲苯Ⅱ20min—无水乙醇Ⅰ5min—无水乙醇Ⅱ5min—75％酒精5min，流水冲洗。

②苏木素染色：切片浸入苏木素染液中4min，分化液分化5s，水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。

③伊红染色：切片浸于85％酒精5min—95％酒精5min—伊红染色液5min。

④脱水封片：染色完成后，将切片放入无水乙醇中进行脱水，再用二甲苯进行透明处理，中性树胶封片。

⑤显微镜下观察，采集图像并分析。

对坐骨神经进行HE染色可以看出，Sham+NS组小鼠坐骨神经神经纤维排列致密、整齐、染色均匀，轴突呈红色线状结构，髓鞘呈半月形对称分布于轴突两侧(见图6-a)。与Sham+NS组相比，CCI+NS组小鼠髓鞘退化，施万细胞核固缩，细胞间有裂隙并伴随大量空泡(见图6-b)。与CCI+NS组相比，给予HAR(60、120、180mg/kg)和PRE(20mg/kg)治疗后，在镜下观察到神经纤维及髓鞘损伤得到缓解，细胞间裂隙减少，空泡减少(见图6-d、e、f)。

实施例10甲苯胺蓝染色观察哈巴俄苷对CCI小鼠坐骨神经髓鞘的影响

实验过程：

①取材：各组小鼠在第14天行为学实验结束后颈椎脱臼法处死小鼠，取右侧坐骨神经主干部分，并修至1cm左右，斜切标记方向。

②前固定：将坐骨神经置于戊二醛固定液中(4℃)固定后放入二甲砷酸钠缓冲液中，2h更换一次缓冲液，重复3次。

③后固定：将坐骨神经置于1％锇酸中2h，随后用二甲砷酸钠缓冲液冲洗。

④脱水：在梯度酒精中各浸10min，无水乙醇15min。

⑤包埋：环氧丙烷渗透30min，用树脂包埋，随后35℃下烘干约36h。

⑥切片：将组织包埋块切为1μm的切片，用甲苯胺蓝染色液染色，封片，阴干后在光学显微镜下观察，采集图像并保存。

对坐骨神经进行甲苯胺蓝染色可以看出，Sham+NS组小鼠坐骨神经髓鞘完整，形态规则多为圆形或卵圆形(见图7-a)。与Sham+NS组相比，CCI+NS组小鼠髓鞘水肿，形态不规则多为卷发样(见图7-b)。与CCI+NS组相比，给予HAR(60、120、180mg/kg)和PRE(20mg/kg)治疗后，在镜下观察到小鼠髓鞘水肿状况得到缓解，且形态逐渐规则(见图7-d、e、f)。

实施例11透射电镜观察哈巴俄苷对CCI小鼠坐骨神经髓鞘的影响

组织切片准备工作同7.1。①超薄切片：定位后将组织包埋块切位75nm。②用枸橼酸铅和乙酸双氧铀染色液进行复染。③随后用透射电镜扫描成像，观察坐骨神经超微结构的变化。随后在40000倍下拍照，并保存图片。

经透射电镜观察后可以看出，Sham+NS组小鼠坐骨神经髓鞘板层致密，明暗相间，呈圆形(见图8-a)。与Sham+NS组相比，CCI+NS组小鼠髓鞘板层严重松解且增厚，呈卷发样，板层明暗相间的结构消失(见图8-b)。与CCI+NS组相比，给予HAR(60、120、180mg/kg)和PRE(20mg/kg)治疗后，观察到小鼠髓鞘板层松解状况得到改善，板层趋于清晰(见图8-d、e、f)。

实施例12ELISA法检测小鼠脊髓组织IL-10蛋白的表达

实验过程：

①提取脊髓蛋白：于超低温冰箱中取出小鼠的脊髓组织，称重，按质量体积比1:7(100mg：0.7mL)加入细胞裂解液，在冷冻研磨机中研磨(60HZ，45s，2次)，将研磨好的匀浆液转移到预冷的1.5mL离心管中，离心(4℃，12000r/min，10min)，吸取上清液到新的预冷的1.5mL离心管中，分装保存于超低温冰箱中，避免反复冻融。

②实验前准备：将试剂盒从-20℃冰箱中取出，室温下溶解，按说明书配制工作液。

③梯度稀释标准品：于IL-10标准品中加入1mL样品稀释液，混匀，此时浓度为1000pg/mL；取离心管加入300μL样品稀释液，再加入300μL的1000pg/ml的标准品，混匀，此时得到浓度为500pg/mL的标准品，余以此类推，分别得到250、125、62.5、31.3、15.6pg/mL的标准品溶液。

④加样：向酶标板中分别加入标准品和样品各100μL，加封板膜，37℃反应90min。弃去酶标板中液体，用洗液洗3次，每次2min，每孔325μL。

⑤加IL-10抗体：将准备好的IL-10抗体工作液按每孔100μL依次加入，盖封板膜，37℃反应30min，弃去酶标板中液体，用洗液洗3次，每次2min，每孔325μL。

⑥加入亲和素-过氧化物酶复合物工作液：将准备好的亲和素-过氧化物酶复合物工作液按每孔100μL依次加入，盖封板膜，37℃反应30min，弃去酶标板中液体，用洗液洗5次，每次2min，每孔325μL。

⑦加入TMB显色液：每孔加入90μLTMB显色液，避光37℃反应30min。

⑧加入终止液并测定O.D.值：每孔加入100μL终止液，用酶标仪在450nm测定O.D.值。

⑨结果计算：校正O.D.值＝样品O.D.值-空白孔O.D.值。以1000、250、125、62.5、31.3、15.6pg/mL绘制X轴，各标准品O.D.值为Y轴，绘制标准曲线，将各待测样品的O.D.值代入上述曲线方程中，得到各待测样品的浓度。

结果如图9所示，与Sham+NS组相比，CCI+NS组小鼠脊髓组织中IL-10蛋白含量显著升高(p＜0.05)；与CCI+NS组相比，CCI+HAR组小鼠脊髓组织中IL-10蛋白含量显著升高(p＜0.05)。

实施例13ELISA法检测小鼠脊髓组织β-Endorphin蛋白的表达

实验过程：

①提取脊髓蛋白：于超低温冰箱中取出小鼠的脊髓组织，称重，按质量体积比1:5(100mg：0.5mL)加入细胞裂解液，在冷冻研磨机中研磨(60HZ，45s，2次)，将研磨好的匀浆液转移到预冷的1.5mL离心管中，离心(4℃，12000r/min，10min)，吸取上清液到新的预冷的1.5mL离心管中，保存于超低温冰箱中，避免反复冻融。

②实验前准备：将试剂盒从-20℃冰箱中取出，室温下溶解，按说明书配制工作液。

③梯度稀释标准品：于β-Endorphin标准品中加入2mL样品稀释液，静置15min，轻柔震动，混匀，此时浓度为1000pg/mL；取离心管加入300μL样品稀释液，再加入300μL的10000pg/ml的标准品，混匀，此时得到浓度为500pg/mL的标准品，余以此类推，分别得到250、125、62.5、31.2、15.6pg/mL的标准品溶液。

④加样：向酶标板中分别加入标准品和样品各50μL，随后快速加入50μL检测试剂A，轻轻混匀，加封板膜，37℃反应1h。

⑤弃去酶标板中液体，用洗液洗3次，每次2min，每孔325μL。

⑥加检测试剂B：将准备好的检测试剂B工作液按每孔100μL依次加入，盖封板膜，37℃反应45min，弃去酶标板中液体，用洗液洗5次，每次2min，每孔325μL。

⑥加入底物工作液：将准备好的底物工作液按每孔90μL依次加入，盖封板膜，37℃反应20min，避光。

⑦加入终止液并测定O.D.值：每孔加入50μL终止液，用酶标仪在450nm测定O.D.值。

⑧结果计算：校正O.D.值＝样品O.D.值-空白孔O.D.值。以1000、250、125、62.5、31.2、15.6pg/mL绘制X轴，各标准品O.D.值为Y轴，绘制标准曲线，将各待测样品的O.D.值代入上述曲线方程中，得到各待测样品的浓度。

结果如图10所示，与Sham+NS组相比，CCI+NS组小鼠脊髓组织中β-Endorphin蛋白含量显著降低(p＜0.05)；与CCI+NS组相比，CCI+HAR组小鼠脊髓组织中β-Endorphin蛋白含量显著升高(p＜0.001)。提示哈巴俄苷的保护作用可能通过增加β-Endorphin蛋白的表达，对神经病理性疼痛小鼠产生保护作用。

实施例14Exendin(9-39)对哈巴俄苷抗神经病理性疼痛小鼠痛觉超敏效应的阻断作用

将体重为18-22g的C57BL/6J雄性小鼠用随机数字表法分为CCI+HAR180mg/kg组和CCI+Exendin(9-39)0.1mg/kg+HAR 180mg/kg组，每组6只。造模及给药方法方法同1.3。

结果如表6、图11所示，与CCI+HAR 180mg/kg组相比，CCI+Exendin(9-39)0.1mg/kg+HAR 180mg/kg组小鼠的机械缩足反射阈值显著降低(p＜0.05，p＜0.01)。提示哈巴俄苷的保护作用可能作用于胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)对神经病理性疼痛小鼠产生保护作用。

表6 Exendin(9-39)对哈巴俄苷抗神经病理性疼痛小鼠痛觉超敏效应的阻断作用(n＝6)

^*p<0.05，^**p<0.01与CCI+HAR 180mg/kg组比较。

Claims (6)

1.哈巴俄苷在制备治疗坐骨神经病理损伤和保护坐骨神经髓鞘的药物中的用途，所述药物中哈巴俄苷为唯一活性成分。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物为注射或者口服剂型。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述药物为口服剂型。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述口服剂型为片剂、胶囊剂或口服液。

5.根据权利要求2-4任一项所述的用途，其中所述药物包含药学上可接受的辅料。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述药学上可接受的辅料选自包衣材料、溶剂、增溶剂、粘合剂、稳定剂、抗氧化剂、pH调节剂、矫味剂中的一种或多种。