CN101327208B - 红花黄色素在制备治疗和/或预防肺损伤药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从中药红花中提取制备的红花黄色素在制备治疗和/或预防肺损伤药物的新用途，特别是在制备治疗和/或预防肺缺血再灌注、肺部栓塞或致炎因子作用于肺引发炎症反应造成的急性肺损伤药物的新用途，上述红花黄色素制成的药物及其制剂。

Description

红花黄色素在制备治疗和/或预防肺损伤药物的应用

技术领域：

本发明涉及从中药红花中提取制备的红花黄色素的新用途，即在制备治疗和/或预防肺损伤特别是急性肺损伤药物的新用途，上述红花黄色素组成的药物组合物。

技术背景：

肺损伤为常见的疾患，急性肺损伤严重影响着人类的健康。体内过度的炎性反应常引发急性肺损伤，其症状可见呼吸功能不全、肺毛细血管通透性增高、肺间质水肿、肺顺应性下降、肺组织充血、肺血管周围出血及肺泡萎陷、肺泡上皮坏死、白细胞浸润等现象[龙村主编，体外循环学，北京，人民军医出版社，2004年2月第1版，140-148。]。在感染性疾病中，大量释放的细菌毒素脂多糖这一致炎因子可引发炎症反应，造成急性肺损伤[郭振辉，洪新，毛宝龄，钱桂生，陈正堂，山莨菪碱对脂多糖诱导的急性肺损伤大鼠肺组织TNFα、IL-8表达的影响，第三军医大学学报，2000，22(5)：410-412]。多种炎症介质及脂多糖等可激活白细胞释放趋化因子和炎症介质如TNFα、IL-1β、IL-6等，还可释放髓过氧化物酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶、明胶酶等，可引起内皮细胞与肺泡上皮细胞的损伤。在急性肺损伤的炎症反应中，内皮细胞表达的ICAM-1、ICAM-2、E-选择素、VCAM-1和白细胞合成的L-选择素、CD11b/CD18等黏附分子对介导白细胞的聚集、黏附起了重要作用。激活的内皮细胞还可释放IL-1β、IL-6、TNFα等炎症因子，激活并吸引更多的白细胞游出到炎症灶，进一步加剧了肺部的炎症损伤[金咸瑢，急性呼吸衰竭的病理生理进展，内科急危重症杂志，2004，10(4)：214-218；金慧铭，卢建，殷莲华，细胞分子病理生理学，郑州，郑州大学出版社2002年5月第一版485-505。]。抑制炎症反应、缓解炎症反应导致的相关损伤对于治疗及预防急性肺损伤具重要意义。

中药红花为菊科植物Carthamus tinctorius L.的干燥花，为一活血化瘀代表性药物。红花活血通经，散瘀止痛，主要用治冠心病，脑血栓等多种血液循环障碍性疾病。临床上红花多以水煎液入药，红花黄色素为红花的主要水溶性组分，为多种查耳酮苷的混合物，研究结果表明，红花黄色素为红花活血化瘀的有效部位，具扩张血管、降血压、抗凝等作用[王会玲，红花黄色素的现代研究概述。中国中医药科技，1998，5(5)：333-334]。羟基红花黄色素A(Hydroxysafflor yellow A，HSYA，分子结构见附图)为红花黄色素中的主要有效成分[金鸣，高子淳，李金荣，臧宝霞，吴伟，大孔树脂色谱法制备羟基红花黄色素A及红花黄色素，中草药，2004，35(1)：25-28]，该成分可抑制血小板激活[臧宝霞，金鸣，司南，张彦，吴伟，朴永哲，HSYA对血小板活化因子的拮抗作用。药学学报，2002，37(9)：696-699]，具多方面的药理作用。近年来虽然关于红花黄色素药理作用的研究报道逐渐增多，但红花黄色素缓解肺损伤特别是急性肺损伤的研究尚未见报道。

发明内容：

本发明的目的是提供红花黄色素的一种新用途。

本发明所述的红花黄色素所含红花主要有效成分羟基红花黄色素A的含量按重量计为50-100％。

本发明发明人的研究表明，红花黄色素具有治疗和/或预防肺损伤作用。

本发明发明人的研究表明，红花黄色素具有治疗和/或预防急性肺损伤作用。

急性肺损伤的重要损伤作用为肺部的炎症损伤，本发明发明人的研究表明，红花黄色素具有治疗和/或预防急性肺损伤的作用，这种损伤的主要起因是由肺部缺血再灌注损伤、肺部栓塞、致炎因子作用于肺这三种因素中的一种或两种或三种因素的作用所引起的急性肺损伤所致。

本发明提供一种治疗和/或预防肺损伤特别是急性肺损伤的药物组合物，其特征在于含有治疗和/或预防肺损伤特别是急性肺损伤有效量的红花黄色素和可药用的载体，它可以制成胶囊、注射剂、片剂、栓剂或口服液等可使用的制剂，上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

以下三个实验说明了红花黄色素的新药效。

实验一、红花黄色素对油酸-脂多糖所致大鼠急性肺损伤的缓解作用

1.实验步骤

本实验所用红花黄色素采用本发明实施例3中的大孔树脂-凝胶柱层析法制备，HPLC面积归一化法测定其HSYA含量为95％。以山莨菪碱(RA)为阳性对照药[林建东，刘宁，山莨菪碱防治急性肺损伤及其机理探讨，中国医师杂志2000，2(11)：653-655]。Wistar大鼠，♂，230±20g，北京维通利华公司清洁级动物，大鼠随机分为6组，即正常组、肺损伤组(ALI)、肺损伤+山莨菪碱组(ALI+RA)、肺损伤+红花黄色素高剂量组(ALI+SYH)、肺损伤+红花黄色素中剂量组(ALI+SYM)、肺损伤+红花黄色素低剂量组(ALI+SYL)。肺损伤+红花黄色组实验方法：20％乌拉坦/NS腹腔注射麻醉大鼠，腹腔注射相应剂量的红花黄色素/NS后半小时，油酸/0.4％牛血清白蛋白/NS混悬液按油酸0.2g·kg^-1尾静脉注射，4h后尾静脉注射2mg·kg^-1脂多糖/706代血浆，此模型中进入肺微血管中的油酸可造成栓塞，致炎因子脂多糖可加剧炎症反应造成急性肺损伤，注射脂多糖/706代血浆后2h腹主动脉取血1mL，以1％肝素/NS 0.1mL抗凝，立即测动脉血氧分压及动脉血pH值并计算本组动物的酸中毒(血pH＜7.35)发生率；同时取另一份腹主动脉血2mL，以1％肝素/NS 0.1mL抗凝，1000g离心10min，制备血浆，-20℃保存以备ELISA法测定血浆IL-1β和IL-6；取右肺下叶肺瘀血最严重处肺组织加入Trizol Regent匀浆，-20℃保存，一周内提取RNA。肺损伤组于尾静脉注射油酸混悬液前半个小时腹腔注射NS，其余操作同肺损伤+红花黄色素组。正常组分别以相同体积0.4％牛血清白蛋白/NS替代油酸/0.4％牛血清白蛋白/NS混悬液尾静脉注射、以相同体积706代血浆替代脂多糖/706代血浆尾静脉注射、以相同体积NS替代红花黄色素/NS腹腔注射，其它处理均同肺损伤+红花黄色素组。山莨菪碱组以山莨菪碱/NS代替红花黄色素/NS，其余处理同肺损伤+红花黄色素组。

2.肺湿重/干重比(W/D)、肺干重/体重比(D/B)及肺系数(LI)的测定

打开胸腔取出整个肺脏，小心剔除肺外组织，称全肺重，计算肺系数(LI＝100×肺湿重/体重×100％)。取左肺，用滤纸吸干表面血水称重，然后将左肺标本置80℃烘烤24h至恒重后精密称定干重，计算肺湿重/干重比(W/D)、肺干重/体重比(D/B)和100×左肺干重/体重×100％。

3.Trizol试剂一步法提取大鼠肺组织的RNA

肺组织每5-10mg加入1mLTrizol试剂，制得匀浆置于1.5mL离心管内，加入200μl氯仿振荡，4℃12000g离心15min，取上清液加入0.5mL异丙醇沉淀RNA，4℃12000g离心10min，75％乙醇洗一次沉淀，所得沉淀即为RNA，0.1％DEPC-H₂O溶解后测RNA样品OD260/OD280值计算浓度；甲醛变性电泳观察RNA片段的完整性。

4.RT-PCR法检测大鼠肺组织TNFa、ICAM-1，VCAM-1mRNA的表达量

反转录反应：10μLRNA，70℃5min，冰浴加入Oligo dT 1μl，dNTP10mM1μl，5×反转录缓冲液4μl，M-MLV 25U，加H₂O至20μl，39℃60min即得反转录产物。

PCR反应：分别选取TNFα或ICAM-1的特异引物，以18srRNA为内对照进行半定量PCR反应。反应体系：反转录产物1μl，10×PCR buffer 2.5μl，dNTP10mM2μl，primer 25pmol，rTaq1U，加H₂O至25μl。首次循环先在95℃变性5min，经95℃变性45sec，退火45sec，退火温度分别为TNFα59℃、ICAM-155℃、18srRNA 55℃，72℃延伸45sec，延伸加时72℃5min，共28个循环。聚合酶链反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并以18srRNA为内对照，用Scionimage成像系统对电泳条带进行灰度扫描，用Total lab v1.11软件分析TNFα及ICAM-1与18srRNA条带的灰度比，并比较各组表达量的变化。

Name of primer    Primer sequence                    Pruduct size(bp)

18srRNA           5’-GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT-3’ 160

                  5’-CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG-3’

TNFα             5’-GCC AAT GGC ATG GAT CTC AA-3’ 307

                  5’-ACT TGG GCA GGT TGA CCT CA-3’

ICAM-1            5’-TCC GGT AGA CAC AAG CAA GAG-3’239

                  5’-AGA AGC CCA AAC CCG TAT GA-3’

5.ELISA法检测大鼠血浆IL-1β，IL-6的水平

参照R&D公司ELISA试剂盒说明书操作，将标准品及以试剂盒稀释液制备的1/50000血浆稀释样本各100μl加入包被板孔中，24℃反应20min后弃反应液，洗涤液洗板三次，每孔加入100μl Biotin anti rat IL-6工作液，混匀30sec，24℃温育20min后洗涤液洗板三次，每孔加入100ul 1×HRP工作液，混匀30sec，24℃温育10min，洗涤液洗板三次，每孔加入100μl TMB显色液，轻轻混匀10sec，24℃温育20min，每孔加入100μl TMB终止液，混匀30sec，15min内在450nm处读O.D.值。用CurveExpert1.3软件绘制标准曲线，根据样本的O.D.值在标准曲线上查出对应浓度。

IL-1β检测所用抗体为Biotin anti rat IL-1β，其余操作同上。

6.统计学方法

以SPSS12.0进行统计，数据以均数±标准差表示，多组样本量的比较采用单因素方差分析和两两比较q检验，计数资料用卡方检验，P＜0.05表示差异的显著性具有统计学意义。。

实验一结果

1.红花黄色素对急性肺损伤大鼠动脉血氧分压影响

表1.红花黄色素缓解大鼠急性肺损伤血PaO₂饱和度下降的作用

与正常组比较△△P＜0.01；与ALI组比较*P＜0.05，**P＜0.01

表1结果可见，ALI组动脉血氧分压较空白组明显降低(P＜0.01)，而红花黄色素处理组和RA处理组则较ALI组动脉血氧分压明显升高，其中红花黄色素750mg·kg^-1组(P＜0.01)、红花黄色素500mg·kg^-1处理组(P＜0.01)和RA处理组(P＜0.05)与ALI组比较均有统计学意义。

2.红花黄色素对急性肺损伤大鼠酸中毒发生率的影响

表2.红花黄色素抑制急性肺损伤所致的酸中毒的作用

与正常组比较△△P＜0.01；与ALI组比较*P＜0.05，**P＜0.01。n’为该组中发生酸中毒大鼠的例数。

表2结果表明，损伤组大鼠酸中毒比率较正常组明显增加(P＜0.01)，红花黄色素330mg·kg^-1组酸中毒比率较损伤组明显下降(P＜0.05)，红花黄色素750mg·kg^-1组、红花黄色素500mg·kg^-1组和山莨菪碱组酸中毒发生率较损伤组有下降趋势。

3.红花黄色素对急性肺损伤大鼠肺系数、肺湿/干重比、100×左肺干重/体重的影响

表3.红花黄色素缓解ALI大鼠肺系数(LI)、肺湿/干重比(W/D)、100×左肺干重/体重变化的作用

与正常组比较△△P＜0.01；与ALI组比较*P＜0.05

由表3.结果可见，ALI组肺系数较空白组明显升高(P＜0.01)，而红花黄色素处理组和RA处理组与ALI组相比均可有效降低肺系数，且其差异的显著性均具有统计学意义。表3结果表明ALI组、红花黄色素500mg·kg^-1处理组、红花黄色素330mg·kg^-1处理组和山莨菪碱处理组的肺湿/干重比均较空白组明显增加(P＜0.05)，红花黄色素处理组和山莨菪碱处理组肺湿/干重比均较ALI组明显降低，均有统计学意义，且红花黄色素组的药效随剂量增加呈增强趋势。表3结果表明，ALI组和给药组的100×左肺干重/体重均较空白组明显增加(P＜0.01)。红花黄色素处理组和山莨菪碱处理组的LI和W/D均较ALI组明显降低；红花黄色素330mg·kg^-1组(P＜0.05)、红花黄色素500mg·kg^-1处理组(P＜0.05)和山莨菪碱处理组(P＜0.01)的100×左肺干重/体重与ALI组的差异均有统计学意义。

4.红花黄色素对急性肺损伤大鼠肺组织TNFαmRNA及ICAM-1mRNA表达量的影响

表4红花黄色素对急性肺损伤大鼠肺组织TNFα和ICAM-1mRNA表达升高的抑制作用

与正常组比较△△P＜0.01；与ALI组比较*P＜0.05，**P＜0.01

由表4结果可见，肺损伤组TNF α和ICAM-1mRNA表达量均较正常组明显增加(P＜0.01)，山莨菪碱组、红花黄色素750mg·kg^-1处理组、红花黄色素500mg·kg^-1处理组和红花黄色素330mg·kg^-1处理组TNFα和ICAM-1mRNA表达量均较肺损伤组明显下降(P均＜0.01)。

5.红花黄色素对急性肺损伤大鼠血浆IL-1β、IL-6表达水平的影响

表5.红花黄色素抑制急性肺损伤大鼠血浆IL-1β水平升高的作用

与正常组比较△△P＜0.01；与ALI组比较*P＜0.05

由表5结果可见，ALI组血浆IL-1β蛋白浓度较正常组明显升高(P＜0.01)，给药组血浆IL-1β蛋白浓度介于ALI组和正常组之间，与ALI组相比有降低的趋势，但统计学上无显著性差异。ALI组血浆IL-6蛋白浓度较正常组明显升高(P＜0.01)，给药组血浆IL-6蛋白浓度介于ALI组和正常组之间，与ALI组相比均有降低的趋势，其中红花黄色素750mg·kg^-1组可显著降低血浆IL-6蛋白浓度(P＜0.05)。

实验二.红花黄色素对油酸致大鼠急性肺损伤的保护作用

1.实验步骤

本实验所用红花黄色素采用本发明实施例2中的大孔树脂-凝胶柱层析法制备，HPLC面积归一化法测定其羟基红花黄色素A(Hydroxysafflor yellow A，HSYA)含量为76％。清洁级Wistar雄性大鼠，体重210～270g，购自维通利华实验动物公司，适应性喂养3d后，按体重分层随机分为6组，即正常对照组，急性肺损伤(ALI)组及四个给药组：红花黄色素治疗组(290mg·kg^-1、170mg·kg^-1、100mg·kg^-1)和阳性药物对照组：山莨菪碱30mg·kg^-1组。

急性肺损伤模型制备与给药油酸-0.4％牛血清白蛋白混悬液的配制：油酸精密称重后按密度计算得体积，加入五倍体积的用生理盐水配制的0.4％牛血清白蛋白，振荡器剧烈振荡混匀后立刻尾静脉注射。急性肺损伤模型制作：腹腔注射1.2g·kg^-1氨基甲酸乙酯麻醉大鼠，ALI组和四个给药组分别按油酸0.13g·kg^-1尾静脉注射油酸-0.4％牛血清白蛋白混悬液，油酸栓塞于肺部微血管可造成损伤。正常对照组以0.4％牛血清白蛋白代替油酸-0.4％牛血清白蛋白混悬液。给药：注射油酸前30min，四个给药组腹腔注射各组药物，ALI组和正常对照组腹腔注射生理盐水。

观测指标：(1)肺系数(LI)及A指数、B指数的测定：油酸尾静脉注射5h后处死动物，取全肺称重，计算肺系数(LI＝100×肺湿重/体重×100％)。取右肺大叶称量湿重(W)，置80℃烤箱24h至恒重，称量干重(D)。A指数及B指数计算方法：A指数＝100×W/体重×100％，B指数＝100×D/体重×100％。(2)血浆IL-1β及IL-6含量测定注射油酸5h后腹主动脉取血，1％肝素抗凝，950g离心10min取上清，分装后-20℃冻存。样品解冻后按Bio-lab公司ELISA试剂盒说明进行操作，用CurveExpert1.3软件绘制标准曲线，根据样本的OD450值在标准曲线上查出对应浓度。每批检测时各组取相同样品数。

2.统计学处理实验数据以均数±标准差表示。采用SPSS 10.0软件对数据进行单因素方差分析及两两比较的q检验。P＜0.05表示差异的显著性具有统计学意义。。

实验二结果

1.红花黄色素对肺系数(LI)、A指数、B指数的影响

与正常对照组相比，ALI组LI、A指数、B指数均显著升高(P＜0.01)。与ALI组相比，四个给药组均能明显降低油酸引起的LI、A指数、B指数增加(P＜0.01，P＜0.05)，其中红花黄色素290mg·kg^-1组与ALI组相比，三个指数差异均非常显著(P＜0.01)，红花黄色素170mg·kg^-1组、红花黄色素100mg·kg^-1组和山莨菪碱组与ALI组相比均有显著性差异(P＜0.01，P＜0.05)，见表6。

表6各组动物LI、A指数、B指数的比较

注：与正常组比较，△△P＜0.01；与ALI组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

2.红花黄色素对血浆IL-1β、IL-6的影响

与正常对照组相比，油酸组血浆IL-1β、IL-6蛋白水平显著升高(P＜0.05)。红花黄色素三个剂量组和山莨菪碱组均能明显降低油酸引起的血浆IL-1β蛋白水平的升高(P＜0.01)，红花黄色素三个剂量组和山莨菪碱组均能明显降低油酸引起的血浆IL-6蛋白水平的升高，其中红花黄色素290mg·kg^-1组、红花黄色素100mg·kg^-1组与ALI组差异非常显著(P＜0.01)；红花黄色素170mg·kg^-1组、山莨菪碱组与ALI组相比有显著性差异(P＜0.05)，见表7。

表7各组动物血浆IL-1β、IL-6含量的比较

注：与正常组比较，△P＜0.05；与ALI组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

实验三、红花黄色素缓解猪体外循环肺缺血再灌注损伤的作用

1.实验步骤

本实验所用的红花黄色素采用本发明实施例1中的大孔树脂柱层析法制备，HPLC面积归一化法测定其羟基红花黄色素A(Hydroxysafflor yellow A，HSYA)含量为68％。实验动物为中国农业大学产实验用小型猪，雌雄不限，体重19-28公斤。本实验体外循环过程中由于肺脏停止供血，体外循环结束恢复肺部灌流后可造成缺血再灌注损伤。以如下步骤进行红花黄色素缓解体外循环肺损伤实验即红花黄色素+体外循环组实验。取小型猪，腹腔注射戊巴比妥钠使麻醉，称体重后，建立外周静脉输液通路，股动静脉置管，气管插管连接呼吸机辅助呼吸，股动脉置管，建立外周动脉血压监测装置。静脉注射1.5mL/kg红花黄色素/NS。胸部正中切口，静脉注射3mg/kg肝素全身抗凝，建立体外循环，上下腔静脉分别插管，套阻断带，体外循环开始后阻断上下腔静脉，从右心房注入2mL/kg红花黄色素/NS。给药后10min阻断升主动脉，灌注15-20mL/kg停跳液，心脏停跳40min后开放上下腔静脉，做呼吸后2分钟，抽取左、右心房血液，10min后开放升主动脉，20min后注入右心房1.5mL/kg红花黄色素/NS，10分钟后停止体外循环，体外循环结束后静脉注射1∶1鱼精蛋白中和肝素，关胸，继续辅助呼吸、观察4h。术中观察气道压、潮气量、血压及心率；鱼精蛋白中和1小时后，再经外周静脉给予红花黄色素/NS 1.5mL/kg，于鱼精蛋白中和后4小时处死动物，取左上叶肺组织称量湿重(W)，置80℃烤箱24h至恒重，称量干重(D)计算湿/干重比(W/D)。另外沿左肺下叶最长横轴做水平切面，从该切面中瘀血最重处取组织置4％中性福尔马林固定常规切片、HE染色后光镜观察，各动物的光镜切片随机选取5个视野照相，参照雷文章[雷文章，韦靖江，沈文律，金立人，实验性胰腺炎多器官损害与内毒素血症的关系，中华实验外科杂志，1995，12(3)：131。]肺损伤评分方法以盲法对各照片进行评分，以每张切片五个视野评分的平均值作为该动物的得分。体外循环损伤组动物以NS代替红花黄色素/NS溶液注射，其它操作均同体外循环+红花黄色素组。阳性对照药选用目前临床常用的体外循环肺保护药物乌司它丁(ULI)，体外循环+ULI组动物以ULI/NS溶液代替红花黄色素/NS注射，其它操作均同体外循环+红花黄色素组。假手术组动物同法麻醉，建立外周静脉输液通路，股动静脉置管，气管插管连接呼吸机辅助呼吸，建立外周动脉血压监测装置，术中不阻断升主动脉及上下腔静脉，不进行体外循环，以NS代替红花黄色素/NS溶液在与红花黄色素组相同的给药途径分别在相应的时间点注射。

2.统计学处理  实验数据以均数±标准差表示。计量资料采用SPSS 10.0软件对数据进行单因素方差分析及两两比较的q检验。等级资料以秩和检验法进行分析。P＜0.05表示差异的显著性具有统计学意义。

实验三结果

1.红花黄色素缓解猪体外循环肺缺血再灌注损伤的作用

表8.红花黄色素缓解猪体外循环肺缺血再灌注损伤的作用

与假手术组比较，△P＜0.05；与体外循环组比较，*P＜0.05

表8结果表明，注射红花黄色素的猪肺湿/干重比较体外循环损伤者有下降趋势，肺组织光镜切片HE染色后分析结果表明，红花黄色素高剂量组病理变化评分明显低于体外循环损伤组，低剂量组则与体外循环损伤组相当，乌司它丁保护组的肺湿/干重比和光镜病理评分均较体外循环组有改善的趋势。从图6可见，370mg·kg^-1红花黄色素可缓解猪肺部损伤所见的充血、水肿、炎症细胞浸润等损伤。

实验一至实验三的结果均表明红花黄色素可抑制肺部炎症因子的表达，缓解实验动物的急性肺损伤。这种损伤中，肺部炎症反应为其重要损伤机制，肺缺血再灌注、局部栓塞及致炎因子刺激为这些急性肺损伤的重要起因。

附图说明：

附图：HSYA的分子结构

具体实施方式：

以下实施例是为了更详细地说明本发明的实施方法，而不是为了限制本发明。

实施例1

大孔树脂柱层析法制备粗品红花黄色素

实验材料

红花生药购自新疆维吾尔族自治区乌鲁木齐药材公司，产地为新疆维吾尔族自治区吉木萨尔县。鉴定人北京中医药大学中药学院生药系李家实教授，为菊科植物红花Carthamustinctorius L的干燥花。95％卫生酒精北京市远弘药用酒精有限责任公司生产；D-4020型非极性大孔树脂为天津南开大学化工厂产品；本发明的大孔树脂柱层析实验还可用其它型号的大孔树脂如D-3520，X-5，NKA-9等。新购大孔树脂用5％NaOH液浸泡2hr后，用水洗至中性，再用5％HCl浸泡2hr，水洗至中性，湿法装柱，95％乙醇洗至流出液中加水无白色混浊，水冲洗至无醇味备用。HSYA对照品为发明人自制[臧宝霞，金鸣，司南，张彦，吴伟，朴永哲，HSYA对血小板活化因子的拮抗作用。药学学报，2002，37(9)：696-699]。乙腈为Fisher公司HPLC级产品，甲醇为国产优级纯，其它试剂均为国产分析纯。

设备

岛津LC-6A型高效液相色谱仪，色谱软件为泰立化公司TL9000液相色谱工作站；XZR-A型20升旋转蒸发器，中科院生物物理所科龙仪器厂产品。

红花水提取液的制备

红花生药20kg，加400L水，室温浸泡并不时搅动，24hr后放出提取液，再加400L水同法冷浸24hr，弃药渣，合并两次水提液，离心过滤除去药渣，80℃减压浓缩至1g生药/mL，过滤即得红花水提取液。

大孔树脂柱层析法制备粗品红花黄色素

取1g生药/mL红花水提液4000mL上直径40厘米×高120厘米的D-4020型非极性大孔树脂层析柱，蒸馏水洗至Molish反应阴性后用20％乙醇洗脱，收集后续黄色流出液，此洗脱液60℃减压浓缩即得红花黄色素粗品浓缩液。

HPLC法分析红花黄色素方法

色谱柱为Inertsil ODS-3 5μm 4.6I.D×250mm分析柱，日本Glscience公司产品，检测波长403nm，流动相为甲醇-乙腈-水(20∶10∶70)含0.02％磷酸，pH2.6，流速1mL/min。

HPLC法分析粗品红花黄色素的结果

大孔树脂柱层析法制备所得的红花黄色素粗品溶液稀释后HPLC分析结果表明其HSYA纯度为68％。

实施例2

大孔树脂-凝胶柱层析法制备精品红花黄色素

本实验所用的凝胶为Sephadex LH-20，为Pharamacia公司产品；本发明的凝胶柱层析实验除可用Sephadex LH-20外，还可用Sephadex G-25或Sephadex G-50凝胶。取前述大孔树脂层析法制得的红花黄色素粗品浓缩液上直径10厘米×高70厘米的凝胶层析柱，蒸馏水洗脱除去先流出的棕色杂质，收集黄色洗脱液，60℃减压浓缩即得红花黄色素精品。

HPLC法分析精品红花黄色素的结果

大孔树脂柱层析收集全部黄色流份后再经凝胶柱层析法纯化，所得的红花黄色素精品溶液稀释后HPLC分析结果表明其HSYA纯度为76％。

实施例3

大孔树脂-凝胶柱层析法制备高纯度精品红花黄色素

取1g生药/mL红花水提液4000mL上直径40厘米×高120厘米的D-4020型非极性大孔树脂层析柱，蒸馏水洗至Molish反应阴性后用20％乙醇洗脱，为了得到纯度较高的红花黄色素，可在红花水提液进行大孔树脂柱层析时，以HPLC法分析每份流出液，将HSYA色谱峰面积80％以上的流出液合并后浓缩即得HSYA含量较高的红花黄色素粗品浓缩液。此HSYA含量较高的红花黄色素粗品浓缩液再上直径10厘米×高70厘米的凝胶层析柱，蒸馏水洗脱除去先流出的棕色杂质，以HPLC技术检测黄色洗脱液，收集HSYA色谱峰面积不低于95％的流出液合并即得高纯度红花黄色素洗脱液，60℃减压浓缩即得高纯度精品红花黄色素。此高纯度红花黄色素精品溶液稀释后HPLC分析结果表明其HSYA纯度为95％。

以本发明实施例1-3制备的红花黄色素按以下实施例方法可制得可使用的红花黄色素药物制剂。

实施例4

红花黄色素口服硬胶囊剂

红花黄色素                        100克

干淀粉                            100克

上述组分混合后装入1000个硬胶囊，即得红花黄色素口服硬胶囊剂

实施例5

红花黄色素注射剂

红花黄色素                        50克

注射用水                        适量

全量                            1000毫升

取50克红花黄色素以适量注射用水溶解后加至1000毫升按常规方法经灌装，封口等步骤制得红花黄色素注射剂.

实施例6

红花黄色素栓剂

红花黄色素                      500克

半合成脂肪酸甘油脂              适量

制成                            1000粒

取半合成脂肪酸甘油脂加热使融，适当降温后加入500克红花黄色素混匀，制栓，冷却即得红花黄色素栓剂.

实施例7

红花黄色素口服液

红花黄色素                      0.5克

蒸馏水                          10毫升

红花黄色素溶解后按常规方法经灌装，封口等步骤生产即得红花黄色素口服液.

实施例8

红花黄色素片剂

红花总黄色素                    500克

硬脂酸镁                        5克

淀粉                            20克

制成                            1000片

红花黄色素，硬脂酸镁与淀粉混匀后按常规方法经压片，包衣，装瓶等工艺即得红花黄色素片剂.

此外，在未违背本发明精神内，可以对给定的实施例进行各种变化和改进。由本技术领域中熟练的技术人员认识到的可选择的实施例，它们也被包括在权利要求的范围内。

Claims (2)

1.红花黄色素在制备治疗和/或预防急性肺损伤药物的应用。

2.权利要求1所述的应用，其特征在于红花黄色素所含的红花主要有效成分羟基红花黄色素A的含量按重量计为50-100％。

Images