CN100574754C - 一种白花前胡总香豆素提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中药提取物、其制备方法及其应用，具体为一种白花前胡总香豆素提取物及其制备方法、以及其在制备治疗高血压药物中的应用。本发明经过长期摸索研究，确证白花前胡治疗高血压病的有效部位，并提取分离得到本发明的白花前胡总香豆素提取物，用以治疗高血压。本发明解决了长期以来存在的发挥作用较慢，质量较难控制等中药使用局限，本发明提取物的药效学和药理学深入系统研究表明，本发明提取物具有药效作用强，毒副作用小，安全范围大，以及产品纯度高，服用剂量较小，质量可控等优点。

Description

一种白花前胡总香豆素提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种中药提取物、其制备方法及其应用，具体为一种白花前胡总香豆素提取物及其制备方法、以及其在制备治疗高血压药物中的应用。

背景技术

高血压病是当今世界发病率最高的慢性病，也是死亡率和致残率最高的疾病之一。在中国，每一小时就有120人死于高血压引起的各种心脑血管疾病，每一小时就有600人因高血压而致残。它严重危害人体健康，影响生活质量，临床表现为头痛，头晕，头胀，颈部扳住感，耳鸣、眼花、健忘、失眠，烦闷，乏力，四肢麻木，心悸等。它也是造成肢体偏瘫、心力衰竭、脑梗塞、脑出血、肾衰竭的重要原因，临床上因高血压病发生致残致死的病例屡见不鲜，故学者称之谓“隐形杀手”，是全世界医学界一重大难题。各国都在参与高血压的研究与探索，也研制了不少治疗高血压的药品，它们都有较好的近期疗效，但治疗上有针对性、局限性、片面性、有时需要同时使用几种药品、也只能起到控制血压的作用，容易发生停药反弹，更为严重的是毒副作用大。目前临床上经常使用的西药长期服用毒副作用较大，疗效较差，且价格比较昂贵。例如利血平、降压灵可引起鼻塞、四肢无力、精神疲倦、嗤睡、阳痿、腹泻、大量长期服用会出现精神忧郁症、震颤麻痹，还可诱发胃及十二指肠溃疡出血；受体阻断剂，如心得安，可诱发和患支气管痉挛、降低肌肉收缩力和病人的运动耐力，同时增加血中的甘油三脂，加速动脉硬化；肾上腺受体阻滞剂如派唑嗪可使患者出现疲乏心悸和恶心等。而中药治疗高血压病，疗效巩固，长期服用毒副作用小，已为临床所重视。但目前存在的主要问题在于其发挥作用较慢，质量较难控制等，因此药物的使用也受到一定的局限。与西药相比，中医药治疗高血压疗效确切，副作用小，这是西药所不能比拟的优势。因此随着高血压患者的增多，寻找疗效确切，使用方便的治疗高血压中药新制剂是一项非常有意义的工作。

白花前胡(Peucedanum praeruptorum Dunn)，又名姨妈菜、罗鬼菜、水前胡、野芹菜等，为多年生草本植物，作为药用始于宋代，其味苦、辛，性凉。前胡在民间有较多的应用。我国古代医药学家对白花前胡的功用有详细的阐述。《别录》记载前胡“味苦，微寒，无毒，主疗痰满胸肋中痞，心腹结气，风头痛”。《本草纲目》：“清肺热，化痰热，散风邪”^[1]。我们经过对前胡提取分离工艺的深入研究，提取得到有效部位，经在临床上应用，取得较好效果。临床证明，本发明的提取物使用剂量小，疗效好，毒性低，质量可控，是一种比较理想的中药治疗高血压及左心室肥大的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种白花前胡总香豆素提取物，其药效作用强，毒副作用小，安全范围大，产品纯度高，服用剂量较小，使用携带方便，质量可控。

本发明另一个目的是提供该白花前胡总香豆素提取物的制备方法。

本发明还有一个目的是提供该白花前胡总香豆素提取物在制备治疗高血压药物中的应用。

本发明第四个目的在于提供该白花前胡总香豆素提取物的质量控制方法。

为解决上述技术问题，本发明提出如下技术方案。

一种白花前胡总香豆素提取物，按重量百分比计，含有白花前胡丙素50-95％；优选含白花前胡丙素65-90％；更优选白花前胡丙素70+85％。

前述白花前胡总香豆素提取物的制备方法，其步骤包括，将白花前胡根，粉碎成粗粉，乙醇加热回流提取，过滤，滤液浓缩回收乙醇至无醇味，得到的膏状物加入蒸馏水拌散，用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，浓缩成稠膏状，加入石油醚，超声20分钟后静置，析出沉淀，过滤，沉淀用石油醚洗涤至浅黄色，即得到所述的提取物；其中提取所用的乙醇的浓度优选60-95％，优选85％-95％，更优选乙醇的浓度为95％；乙醇的用量优选8-10倍量；更优选乙醇加热回流提取3次，每次0.5-2小时，第一次加10倍量的乙醇，第二、三次各加8倍量的乙醇；乙酸乙酯的用量优选为1-3倍量；乙酸乙酯萃取次数优选为3-5次；更优选使用1倍量的乙酸乙酯萃取3次。

本发明的提取物可制成片剂、胶囊、滴丸、注射剂等所有药学上可接受的剂型。

前述白花前胡总香豆素提取物在制备治疗高血压药物中的应用。

前述白花前胡总香豆素提取物的含量测定方法：

1.总香豆素的含量测定

对照品溶液的配制：取减压干燥至恒重的白花前胡丙素标准品10.0mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液的配制：取本发明的提取物约10mg，置10ml量瓶中，加入甲醇约8ml，超声处理30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密吸取续滤液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0ml至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。取处方量的空白辅料，按上述方法制备空白对照溶液。照分光光度法(附录V B)，在323nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

测定法：取供试品溶液在323nm处测定吸收度，按标准曲线计算样品中总香豆素含量，即得。

2.白花前胡丙素的含量测定

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水(25∶60∶15)为流动相；检测波长323nm；流速：1.0ml/min，柱温：35℃；理论塔板数按白花前胡丙素峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备取减压干燥至恒重的白花前胡丙素对照品10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀作为对照品溶液。

供试品溶液的制备取本品细粉10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入甲醇适量，超声处理30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1.0ml，置100ml量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，按外标法以峰面积计算，即得。

基于有关白花前胡的古代医家记述及现代药理和临床研究取得的试验结果，本发明经过长期摸索研究，确证白花前胡治疗高血压病的有效部位，并提取分离得到本发明的白花前胡总香豆素提取物，用以治疗高血压。本发明解决了长期以来存在的发挥作用较慢，质量较难控制等中药使用局限，本发明提取物的药效学和药理学深入系统研究表明，本发明提取物具有药效作用强，毒副作用小，安全范围大，以及产品纯度高，服用剂量较小，质量可控等优点。以下就通过几个方面的研究来说明本发明技术方案的有益效果。

一、药效学实验

本发明的提取物：性状：淡黄色粉末。山东大学药学院提供。使用时，根据大鼠剂量要求用0.5％羧甲基纤维素钠制成混悬液。根据犬剂量要求用3ml 0.5％羧甲基纤维素钠和生理盐水配制成所需浓度的混悬液。

硝苯地平：规格10mg/片。批号：020411。山东省德州制药厂。

马来酸依那普利片：10mg×16片。批号：04092203。由扬子江药业集团江苏制药股份有限公司提供。

氯化钠注射液：250ml/瓶，批号：04092203。山东临淄制药厂提供。

3.动物：雄性Wistar大鼠120只，180±10g，购自山东大学实验动物中心。合格证号：鲁动质字20001003。自发性高血压大鼠50只，雌雄各半，200±10g，购自中国医学科学院实验动物研究所繁育场，许可证编号：SOXK京2000-0006。适应性饲养1周后，测量各鼠血压。杂种犬20只，体重11.58±1.23kg，雌雄兼用，购自济南郊区。实验前驯养1周，择其正常、健康、雌性无孕者供试验用。

4.仪器：

大鼠尾套法血压计，型号GB4727-44。湖南医科大学心血管生理研究室提供。

BioPAC多导生理信号采集分析系统，美国BioPAC公司。

CBI激光多普勒血流计，美国CBI公司。

DGD-300C-2医用电脑高频电刀，北京贝林电子有限公司

5.动物实验室条件：湿度：40-70％，温度：20-24℃，合格证号：鲁动环字H2002120672。笼具：苏州新区枫桥净化设备厂，许可证号：SCXK(苏)2002-0034。块状鼠饲料：山东省实验动物中心提供。鲁动饲字200001001。

6.方法

6.1本发明提取物对自发性高血压大鼠血压的影响

将自发性高血压大鼠按血压、体重均衡的原则分为五组，即本发明提取物大剂量组50.0mg/kg、中剂量组25.0mg/kg、小剂量组12.5mg/kg、阳性药硝苯地平组20mg/kg、模型对照组。每组10只。灌胃给药。给药体积为1ml/200g。模型对照组给予等体积的0.5％羧甲基纤维素钠。动物在清醒非麻醉及保温状态下，用大鼠尾套法血压计测量血压，连续测量3～4次取平均值。每天灌胃一次，分别于给药第5、10、15、20、30天同法测量血压。

6.2本发明提取物对肾型高血压大鼠血压的影响

雄性Wistar大鼠，在1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下，右侧卧位，在肋缘下1cm处逐层打开腹壁，游离左肾动脉，将直径0.20mm的银夹夹住肾动脉，使其产生部分狭窄，右肾不作处理。假手术组的大鼠，除不钳夹左肾动脉外，手术步骤同上。术后大鼠均给予抗生素4天预防感染。术后4周血压趋于稳定，测定血压3～4次，取其平均值，选收缩压在150mmHg以上者进行实验。动物分组和给药剂量、方法及测量方法同6.1。

6.3本发明提取物逆转肾型高血压大鼠左心室肥厚试验

肾型高血压动物模型的建立同6.2。参照文献，肾型高血压大鼠术后8周可形成明显的左室肥厚，据此，我们拟定术后9周开始给药观察供试品的逆转左室肥厚作用。将已造模动物按血压、体重均衡的原则分为六组，本发明提取物大剂量组50.0mg/kg、中剂量组25.0mg/kg、小剂量组12.5.0mg/kg、阳性药依那普利片组10mg/kg、模型对照组、假手术组。灌胃给药。给药体积为1ml/200g。假手术组、模型对照组均给予等体积的0.5％羧甲基纤维素钠。连续给药9周，分别测量给药前和给药9周后血压。实验结束后，立即处死动物，开胸，迅速取出心脏，用4℃生理盐水冲洗，去掉心房、右心室及其他组织，称左心室重量，计算左室指数，同时进行心肌组织病理学检查。

6.4本发明提取物对麻醉犬血流动力学的影响

将正常健康犬20只随机分为4组，即本发明提取物大剂量组10.0mg/kg(1、2、4、5、7号犬)，本发明提取物小剂量组5.0mg/kg(8、10、13、15、16号犬)，阳性对照药依那普利片组2.5mg/kg(11、12、18、19、20号犬)及空白对照组(3、6、9、14、17号犬)。动物用2.5％戊巴比妥钠(25mg/kg)静脉麻醉，分离颈总动脉和气管，颈总动脉插管经压力换能器与BioPAC多导生理信号采集分析系统相连记录血压；气管插管备接电动呼吸器行人工呼吸。分离十二指肠并插管供给药用。犬右侧卧位，于左侧第四肋间隙开胸，做心包床，暴露心脏。左心室尖部插管连接Biopac通用放大器记录左心室内压(LVP)和左室内压最大变化速率(±dp/dt_max)。分离冠状动脉左旋支及主动脉根部，分别放置合适的血流计卡式探头与多普勒血流计相连，分别测量冠脉血流量(CBF)及心输出量(CO)。同时计算总外周阻力、冠脉阻力、每搏心排出量和左室作功。所有上述指标均同步记录于BioPAC多导生理信号采集分析系统。术后缓慢恒速静脉滴注生理盐水，以补充体液。

术后稳定30min，待观察指标稳定后，记录上述各指标作为药前值。然后经十二指肠插管给药。给药体积为2.0ml/kg。空白对照组给予等体积的0.5％羧甲基纤维素钠和生理盐水。分别于给药后30、60、90、120、180和240min记录各项指标。实验结果分别与空白对照组比较，进行统计学分析处理。

7.结果

7.1本发明提取物对自发性高血压大鼠血压的影响

结果表明，本发明提取物大剂量组灌胃给药10天开始明显降低血压，与药前相比差异显著(P＜0.05)，15天差异更显著(P＜0.01)，20、30天时差异最明显(p＜0.001)。本发明提取物中剂量组灌胃给药15天开始降低血压(P＜0.05)，20、30天时差异最明显(p＜0.001)。小剂量组与药前比较虽无显著性差异(P＞0.05)，但有降低趋势。结果详见表1。

表1本发明提取物对自发性高血压大鼠收缩期血压(mmHg)的影响(n＝10，X±s)

注：与药前相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001；与模型组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01，^###P＜0.001

7.2本发明提取物对自发性高血压大鼠血压的影响

结果表明，本发明提取物大剂量组灌胃给药5天起开始有效，降压作用显著(P＜0.05)，10天起差异更显著(P＜0.01)，20天时差异最明显(p＜0.001)。中剂量组灌胃给药10天起有差异(P＜0.05)，30天时差异最明显(p＜0.001)。小剂量组灌胃给药与药前比有降低趋势，但无显著性差异。结果详见表2。

7.3本发明提取物对肾型高血压大鼠左心室肥厚的影响

从表3中可以看出，大鼠肾动脉狭窄术后第9周，高血压形成已经恒定，此时左心室肥厚已经形成。连续给药9周后，本发明提取物大、中剂量组和依那普利片组能显著降低肾型高血压大鼠的血压，与模型组相比有显著差异(P＜0.001)，

表2本发明提取物对肾型高血压大鼠收缩期血压mmHg影响(n＝10，X±s)

注：药前相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001；与模型组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01，^###P＜0.001

表3本发明提取物逆转肾型高血压左心室肥厚的作用(X±s)

注：与模型对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001

小剂量组无显著性差异(P＞0.05)。本发明提取物大、中剂量组能够明显降低肾型高血压大鼠的左室系数(P＜0.05)。说明本发明提取物能够逆转肾型高血压大鼠的左心室肥厚。结果详见表3。

本发明提取物逆转肾型高血压大鼠左心室肥厚病理学检查结果：

假手术组：心内膜、外膜、心肌及心肌间质组织结构正常，心肌纤维未见变性、坏死等形态学改变。

模型组：心肌纤维束明显肿胀增大，心肌纤维明显浊肿、颗粒变性及水样变性，部分心肌纤维可见少数灶状坏死，心肌间质中可见炎细胞浸润。在部分区域心肌组织中可见心肌纤维中断现象。部分小血管壁明显增厚，管腔明显变小，管周纤维结缔组织增多。

大剂量组：多数动物心肌纤维束未见明显改变，仅个别动物心肌纤维束轻度肿胀增大。个别部位少数心肌纤维轻度浊肿、变性，小血管壁未见增厚，管周纤维结缔组织未见增多。

中剂量组：心肌纤维束肿胀增大，心肌纤维明显浊肿、颗粒变性，部分心肌纤维可见少数灶状坏死，心肌间质中可见炎细胞浸润。在部分区域心肌组织中偶见心肌纤维中断现象。部分小血管壁增厚，管腔未见明显变小，管周纤维结缔组织也未见增多。

小剂量组：心肌纤维束肿胀增大，心肌纤维明显浊肿、颗粒变性，部分心肌纤维可见少数灶状坏死，心肌间质中可见炎细胞浸润。在部分区域心肌组织中偶见心肌纤维中断现象。部分小血管壁增厚，管腔变小，管周纤维结缔组织轻度增多。

阳性对照组：多数动物心肌纤维束未见明显改变，仅个别动物心肌纤维束轻度肿胀增大。个别部位少数心肌纤维轻度浊肿、变性，小血管壁未见增厚，管周纤维结缔组织未见增多。

7.4本发明提取物对麻醉犬血流动力学的影响

7.4.1本发明提取物对心输出量及冠脉血流量的影响

本发明提取物大、小剂量组均对心输出量无明显影响。依那普利片组给药后60min使心输出量降低。

本发明提取物大剂量组于给药后180min使冠脉流量明显增加(P＜0.01)，小剂量组有增加趋势。依那普利片组给药后60min使冠脉流量明显增加(P＜0.05)。

7.4.2本发明提取物对左室内压、+dp/dtmax和-dp/dtmax的影响

本发明提取物大、小剂量组和依那普利片均对左室内压无明显影响。

本发明提取物大、小剂量组皆于给药后120min使+dp/dtmax明显降低。依那普利片于给药后30～120min使+dp/dtmax明显降低。

本发明提取物大、小剂量组和依那普利片均对-dp/dtmax无明显影响。

7.4.3本发明提取物对总外周阻力和冠脉阻力的影响

本发明提取物大、小剂量组和依那普利片对总外周阻力均无明显影响。

本发明提取物大剂量组别于给药180min明显降低冠脉阻力，小剂量组和依那普利片有降低趋势。

7.4.4本发明提取物对血压和心率的影响

与空白对照组比较，本发明提取物大、小剂量组和依那普利片组均对平均血压和心率无明显影响。与给药前比较，本发明提取物大剂量组于给药后180～240mi明显降低平均血压，小剂量组无明显影响，依那普利片240min有降低趋势。

7.4.5本发明提取物对每搏心排出量和左室作功的影响

本发明提取物大、小剂量组和依那普利片组均对每搏心排出量无明显影响。

本发明提取物大、小剂量组对左室作功无明显影响。依那普利片组于给药后60min明显降低左室作功。

8.小结

8.1本发明提取物50.0mg/kg、25.0mg/kg分别从灌胃给药10天、15天开始明显降低自发性高血压大鼠收缩压，小剂量组12.5mg/kg虽无显著性差异，但有降低趋势。

8.2本发明提取物50.0mg/kg、25.0mg/kg分别从灌胃给药5天、10天开始明显降低肾型高血压大鼠收缩压，12.5mg/kg虽无显著性差异，但有降低趋势。

8.3本发明提取物50.0mg/kg、25.0mg/kg能逆转肾型高血压大鼠的左心室肥厚，小剂量组12.5mg/kg虽无显著性差异，但有逆转趋势。

8.4本发明提取物10.0mg/kg给药后180～240min能明显降低麻醉犬平均血压。

8.5本发明提取物10.0mg/kg、5.0mg/kg均于给药后120min使麻醉犬+dp/dtmax明显降低。

8.6本发明提取物10.0mg/kg于给药180min明显降低麻醉犬冠脉阻力，并显著增加冠脉流量；5.0mg/kg有增加趋势。

8.7本发明提取物10.0mg/kg、5.0mg/kg均对麻醉犬左室内压、-dp/dtmax、心输出量无明显影响。

8.8本发明提取物10.0mg/kg、5.0mg/kg均对麻醉犬总外周阻力、每搏心排出量和左室作功无明显影响。

8.9本发明提取物在降低平均血压和改善冠脉流量等方面显示了一定的药效作用。

二、白花前胡提取工艺研究

根据白花前胡活性成分的化学性质及药理学研究，我们对本发明提取物的提取工艺、分离纯化工艺进行了系统的研究。

1.白花前胡醇提工艺研究：考察了不同醇提工艺对白花前胡丙素含量的影响，采用正交试验，筛选最佳醇提工艺条件。

2.白花前胡分离纯化工艺研究：

(1)比较了不同乙酸乙酯用量对总香豆素得率及含量得影响，确定采用乙酸乙酯萃取，优选采取等量的乙酸乙酯。

(2)比较了不同乙酸乙酯萃取次数对总香豆素得率及含量的影响，确定根据所用萃取溶剂的量，优选采用3次萃取。

(3)提取物内控质量标准的制定

通过以上工艺研究，制定了本品的制备工艺，并经中试放大，成品各项指标均符合规定要求，进一步确证了本工艺合理、科学并适应规模生产的需要，保证了制剂质量。

1.1仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪

所用试剂均为色谱纯

所用药材由山东大学药学院温学森教授鉴定

对照品：白花前胡丙素对照品由实验室制备

1.2试验方法

采用正交表L₉(3⁴)筛选了乙醇回流提取的最佳工艺条件

1.2.1制备工艺：取白花前胡100g，共称取9份，分别按不同的提取工艺提取，回收乙醇，并浓缩至每g相当于1.5g原药材的清膏。

1.2.2白花前胡丙素含量测定

色谱条件∶流动相∶甲醇-水-乙腈＝25∶15∶60，流速：1.0ml/min，柱温：25℃，检测波长323nm，进样量20μl。

对照品溶液的配制：精取干燥至恒重的白花前胡丙素标准品约10.0mg，精密称重，置10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(含白花前胡丙素10ug/ml)。

供试品溶液的配制：取相当于1.0g原药材的清膏，置10ml量瓶中，加入甲醇约8ml，超声处理30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，从中精密量取1ml，置100ml量瓶中加甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液。

精密量取对照品溶液与供试品溶液20μl，在上述色谱条件下进样，测定峰面积，计算不同工艺白花前胡丙素含量。

1.2.3方差分析

正交试验结果分析，A因素即醇浓度对白花前胡丙素含量有显著差异，选择乙醇的浓度在60％-95％，但95％醇提清膏中白花前胡丙素含量明显高于75％醇提工艺及85％醇提工艺，故优选85-95％醇提工艺，更优选95％的乙醇；B因素即加醇量对白花前胡丙素含量的影响较大，故优选加醇量为8-10倍量，更优选10倍量；C因素即提取时间对白花前胡丙素含量无显著影响，故选择提取时间为60-120分钟。

2.1不同萃取次数的考察

萃取一步是该生产工艺中的关键步骤，它直接影响到白花前胡香豆素的产率，乙酸乙酯的用量和生产能耗等。考察萃取次数与得率，得到最佳萃取次数。

2.1.1供试品的制备

取白花前胡药材5kg，按选定的提取工艺提取，回收乙醇至无醇味，至相对密度为1.20(60℃)稠膏，平均分成3份，加水适量，分散，加1倍量乙酸乙酯分别萃取2、3、5次，回收溶剂，加入适量的石油醚，结晶析出淡黄色固体，得到白花前胡总香豆素提取物。

2.1.2白花前胡丙素的含量测定

色谱条件∶流动相∶甲醇-水-乙腈＝25∶15∶60，流速：1.0ml/min，柱温：25℃，检测波长323nm，进样量20μl。

对照品溶液的配制：精取干燥至恒重的白花前胡丙素标准品约10.0mg，精密称重，置10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(含白花前胡丙素10ug/ml)。

供试品溶液的配制：取白花前胡总香豆素提取物15mg，置10ml量瓶中，加入甲醇约8ml，超声处理30分钟，放冷，补足溶剂至刻度，摇匀，精密量取1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

精密量取对照品溶液与供试品溶液20μl，在上述色谱条件下进样，测定峰面积，计算不同工艺白花前胡丙素含量。

2.1.3总香豆素的含量测定

对照品溶液的配制：精密称取干燥至恒重的白花前胡丙素标准品10.0mg，置10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取0.5、2.0ml分别置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制备得对照液。

供试品溶液的配制：取本发明的提取物15mg，置10ml量瓶中，加入甲醇约8ml，超声处理30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，从中精密量取1ml，置100ml量瓶中加甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液。

照紫外分光光度法(中国药典2005版一部附录28页VA)测定。分别取对照品溶液和供试品溶液在323nm处测定吸收度，计算总香豆素含量。

结果表明，萃取次数为3次和5次得到的提取物的得率及含量没有明显的差别，而萃取2次所得的的提取物的得率较低，因此确定萃取次数为3-5次，优选3次。

2.2不同萃取剂用量得考察

考察了不同乙酸乙酯用量对本发明提取物得率及含量的影响。

取白花前胡药材5kg，按选定的提取工艺提取，回收乙醇至无醇味，至相对密度为1.20(60℃)稠膏，平均分成3份，加水适量，分散，每份200ml，分别加0.5倍、1倍量2倍量(V/V)乙酸乙酯，分别萃取3次，回收溶剂，加入适量的石油醚，结晶析出淡黄色固体，得到白花前胡总香豆素提取物。

以上不同提取工艺提取得到的供试品分别按2.1.2项下方法测定白花前胡丙素含量，按2.1.3项下方法测定总香豆素的含量。

结果表明，萃取剂用量为1倍量和2倍量(V/V)所得提取物的得率及含量无明显差别，为0.5倍时，得率较低，因此确定优选的萃取剂用量为1-3倍量(V/V)，优选1倍量(V/V)。

在上述一系列工艺条件研究后，确定了从白花前胡药材中提取、分离、纯化有效部位白花前胡丙素的各步工艺的具体条件，将各部最佳的工艺条件组合在一起确定白花前胡总香豆素提取物的制备工艺，确定采用乙酸乙酯萃取后，回收溶剂，加入适量石油醚，重结晶，得到本发明提取物，并进一步制定了提取物的内控标准。

具体实施方式

实施例1

一种白花前胡总香豆素提取物，按重量百分比计，含有白花前胡丙素50％；

将白花前胡根，粉碎成粗粉，8倍量60％乙醇加热回流提取，过滤，滤液浓缩回收乙醇至无醇味，得到的膏状物加入蒸馏水拌散，用3倍量的乙酸乙酯萃取3次，回收乙酸乙酯，浓缩成稠膏状，加入石油醚，超声20分钟后静置，析出沉淀，过滤，沉淀用石油醚洗涤至浅黄色。

实施例2

一种白花前胡总香豆素提取物，按重量百分比计，含有白花前胡丙素60％；

将白花前胡根，粉碎成粗粉，8倍量75％乙醇加热回流提取，过滤，滤液浓缩回收乙醇至无醇味，得到的膏状物加入蒸馏水拌散，用1倍量的乙酸乙酯萃取5次，回收乙酸乙酯，浓缩成稠膏状，加入石油醚，超声20分钟后静置，析出沉淀，过滤，沉淀用石油醚洗涤至浅黄色。

实施例3

一种白花前胡总香豆素提取物，按重量百分比计，含有白花前胡丙素75％；

将白花前胡根，粉碎成粗粉，10倍量95％乙醇加热回流提取，过滤，滤液浓缩回收乙醇至无醇味，得到的膏状物加入蒸馏水拌散，用1倍量的乙酸乙酯萃取3次，回收乙酸乙酯，浓缩成稠膏状，加入石油醚，超声20分钟后静置，析出沉淀，过滤，沉淀用石油醚洗涤至浅黄色。

实施例4

一种白花前胡总香豆素提取物，按重量百分比计，含有白花前胡丙素80％；

将白花前胡根，粉碎成粗粉，10倍量95％乙醇加热回流提取，过滤，滤液浓缩回收乙醇至无醇味，得到的膏状物加入蒸馏水拌散，用1倍量的乙酸乙酯萃取3次，回收乙酸乙酯，浓缩成稠膏状，加入石油醚，超声20分钟后静置，析出沉淀，过滤，沉淀用石油醚洗涤至浅黄色。

实施例5

一种白花前胡总香豆素提取物，按重量百分比计，含有白花前胡丙90％；

将白花前胡根，粉碎成粗粉，10倍95％乙醇加热回流提取，过滤，滤液浓缩回收乙醇至无醇味，得到的膏状物加入蒸馏水拌散，用3倍量的乙酸乙酯萃取5次，回收乙酸乙酯，浓缩成稠膏状，加入石油醚，超声20分钟后静置，析出沉淀，过滤，沉淀用石油醚洗涤至浅黄色。

附图说明：

图1为白花前胡提取工艺流程图。

图2为对照品溶液、供试品溶液及阴性对照液的HPLC图谱。

Claims (8)

1.一种白花前胡总香豆素提取物的制备方法，其特征在于，其步骤包括，将白花前胡根粉碎成粗粉，乙醇加热回流提取，过滤，滤液浓缩回收乙醇至无醇味，得到的膏状物加入蒸馏水拌散，用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，浓缩成稠膏状，加入石油醚，超声20分钟后静置，析出沉淀，过滤，沉淀用石油醚洗涤至浅黄色，即得到所述的提取物。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中提取所用的乙醇的浓度为60-95％。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其中提取所用的乙醇的浓度为95％。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其中乙醇加热回流提取3次，每次0.5-2小时，第一次加10倍量的乙醇，第二、三次各加8倍量的乙醇。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中用1-3倍量的乙酸乙酯萃取3-5次。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，其中用1倍量的乙酸乙酯萃取3次。

7.如权利要求1所述的制备方法得到的提取物在制备降压药物中的应用。

8.如权利要求1所述的制备方法得到的提取物的含量测定方法：

1.)总香豆素的含量测定

对照品溶液的配制：取减压干燥至恒重的白花前胡丙素标准品10.0mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；

供试品溶液的配制：取前胡素约10mg，置10ml量瓶中，加入甲醇约8ml，超声处理30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密吸取续滤液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0ml至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。取处方量的空白辅料，按上述方法制备空白对照溶液，根据分光光度法，在323nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

测定法：取供试品溶液在323nm处测定吸收度，按标准曲线计算样品中总香豆素含量，即得；

2.)白花前胡丙素的含量测定

色谱条件与系统适应性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水(25∶60∶15)为流动相；检测波长323nm。理论塔板数按白花前胡丙素峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备  取减压干燥至恒重的白花前胡丙素对照品10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀作为对照品溶液；

供试品溶液的制备  取本品细粉10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入甲醇适量，超声处理30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1.0ml，置100ml量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

测定法  精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，按外标法以峰面积计算，即得；

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