CN103316024B - 掌叶覆盆子中半日花烷型二萜苷类化合物作为药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域。本发明提供了掌叶覆盆子中半日花烷型二萜苷类化合物在制备预防或治疗慢性肾炎、肾阳虚、骨质疏松、前列腺炎药物中的应用，所述的掌叶覆盆子中半日花烷型二萜苷类化合物的化学结构通式如式（Ⅰ）所示：

Description

掌叶覆盆子中半日花烷型二萜苷类化合物作为药物的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体是指掌叶覆盆子（Rubus chingii Hu）中所含的半日花烷型二萜苷类化合物在制备预防和治疗慢性肾炎、肾阳虚、骨质疏松和前列腺炎药物中的应用。

背景技术

掌叶覆盆子（Rubus chingii Hu），又名华东覆盆子，为蔷薇科悬钩子属植物，其干燥的未成熟果实入药称为覆盆子，传统功效为益肾固精缩尿、养肝明目。

为开发利用该植物，本发明人对该植物进行了较系统的化学成分研究，并从中分离得到一系列半日花烷型二萜苷，参见文献：Nan Sun,Yan Wang,Yun Liu,Mei-Li Guo,and Jun Yin，A NEW ent-LABDANE DITERPENE SAPONIN FROMTHE FRUITS OF Rubus chingii，Chemistry of Natural Compounds,Vol.49,No.1,March,2013，49-53。

但到目前为止，尚未见有关掌叶覆盆子中半日花烷型二萜苷类化合物具有预防和治疗慢性肾炎、肾阳虚、骨质疏松和前列腺炎活性的相关报道。

发明内容

本发明的目的是为覆盆子中所含的活性物质半日花烷型二萜苷类化合物作为药物的新用途，尤其是掌叶覆盆子（Rubus chingii Hu）中所含的半日花烷型二萜苷类化合物在制备预防和/或治疗慢性肾炎、肾阳虚、骨质疏松、前列腺炎药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明的主要技术方案如下：

首先从覆盆子中提取半日花烷型二萜苷类化合物，具体方法如下：

（1）提取

掌叶覆盆子未成熟果实粉碎后，用20-95%含水乙醇渗漉提取，得提取液，提取液减压浓缩，浓缩后离心或过滤，取上清液或过滤液；

（2）纯化

将上述上清液或过滤液通过聚苯乙烯型多孔性吸附树脂吸附，用水-40%的含水低级醇淋洗除去杂质，再用上样生药质量的4-12倍量体积的60-95%的含水低级醇洗脱，收集含半日花烷型二萜苷的60%部位洗脱液，所说的低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇；

（3）浓缩、干燥

按常规将洗脱液减压浓缩、干燥，即得覆盆子提取物；

（4）覆盆子提取物中所含半日花烷型二萜苷类化合物的分离纯化：

将上述制得的覆盆子提取物溶于水制成混悬液，进行反复硅胶柱层析和反相硅胶柱层析，最终获得了8个半日花烷型二萜苷类化合物。

本发明覆盆子提取物所含半日花烷型二萜苷类化合物均含有半日花烷型二萜母核，它们的化学结构通式如式（Ⅰ）所示：

其中R₁、R₂和R₃分别代表：

R₁：-H，-OH，-O-glc；

R₂：-H，-OH，-Glc；

R₃:-CH₃，-CH₂OH，-CH₂O-glc，-COO-glc，-CH₂O-glc-(6←1)-araf；

注glc:β-D-glucopyranosyl    araf:α-L-arabinofuranosyl。

本发明涉及的半日花烷型二萜苷类化合物的名称及其化学结构见表1。

表1半日花烷型二萜苷类化合物母环上各R基团

进一步地，本发明对覆盆子提取物中所含的半日花烷型二萜苷类化合物进行了药理试验、生物活性实验等。

本发明提供了上述的掌叶覆盆子中的半日花烷型二萜苷类化合物在制备预防和/或治疗慢性肾炎、肾阳虚、骨质疏松、前列腺炎药物中的应用。

上述的半日花烷型二萜苷类化合物，经体内动物实验，均具有预防、治疗慢性肾炎、肾阳虚、骨质疏松和前列腺炎的活性，覆盆子苷-F1-7疗效更佳。因此，本发明所述的掌叶覆盆子中的半日花烷型二萜苷类化合物可以用于制备防治包括慢性肾炎、肾阳虚、骨质疏松和前列腺炎等疾病的药物。

具体实施方式

现结合实施例，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

实施例中所用掌叶覆盆子（Rubus chingii Hu）的未成熟果实采集于浙江省金华市郊区。

实施例1、制备覆盆子提取物

（1）提取

掌叶覆盆子未成熟果实50kg，用70%的含水乙醇250L按常规方法渗漉得提取液，提取液减压浓缩后离心，取上清液备用；

（2）纯化

将上述上清液进行聚苯乙烯型多孔性吸附树脂吸附，用水洗脱除去杂质后，用80L60%的含水醇洗脱，收集含半日花烷型二萜苷类化合物的洗脱液。

（3）浓缩、干燥

将洗脱液按常规减压浓缩，干燥，即得覆盆子提取物6.5kg。

实施例2、制备覆盆子提取物

（1）提取

掌叶覆盆子未成熟果实50kg，用50%的含水乙醇250L按常规方法渗漉得提取液，提取液减压浓缩后离心，取上清液备用；

（2）纯化

将上述上清液进行聚苯乙烯型多孔性吸附树脂吸附，用水洗脱除去杂质后，用100L50%的含水醇洗脱，收集含半日花烷型二萜苷类化合物的洗脱液。

（3）浓缩、干燥

将洗脱液按常规减压浓缩，干燥，即得覆盆子提取物7.3kg。

实施例3、制备覆盆子提取物所含的半日花烷型二萜苷类化合物

取实施例1制备的覆盆子提取物6.5kg，用水混悬后进行聚苯乙烯型多孔性吸附树脂（D101，天津南开大学化工厂）吸附，然后分别用水、60%乙醇、95乙醇洗脱，收集并浓缩60%的洗脱液，得60%乙醇部位。将60%乙醇部位按常规进行硅胶（颗粒度200-300目，山东烟台芝罘黄务硅胶开发试验厂）柱层析，依次以乙酸乙酯-乙醇（16：2：1，8：2：1和5：2：1）梯度洗脱，并用薄层层析监测（硅胶板为HSGF₂₅₄，颗粒度8±2μm，山东烟台芝罘黄务硅胶开发试验厂)，展开剂为乙酸乙酯：乙醇：水10：1：0.5-4：2：1。具体如下：

用乙酸乙酯-乙醇-水16：2：1洗脱，用薄层层析（展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水10：1：05）检测，根据检测结果，合并并回收相同斑点的洗脱液，得有相同斑点的浓缩液2份（Fr.1，2）；再用乙酸乙酯-乙醇-水8：2：1洗脱，用薄层层析（展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水6：1：1）检测，根据检测结果，合并并回收相同斑点的洗脱液，得有相同斑点的浓缩液2份（Fr.3，4）；再用乙酸乙酯-乙醇-水5：2：1洗脱，用薄层层析（展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水4：2：1）检测，根据检测结果，合并并回收相同斑点的洗脱液，得有相同斑点的浓缩液2份（Fr.5，6，7）；Fr.2用ODS（50μm，YMC）反相柱层析分离，以甲醇-水（3：1）洗脱，并用薄层层析（展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水10：1：0.5-8：1：0.5）检测，合并相同斑点，浓缩，获得化合物覆盆子苷-G（0.64g），覆盆子苷-F1(1.20g)和覆盆子苷-F2(2.38g)。Fr.3同样用ODS反相柱层析分离，以甲醇-水（2:1）洗脱，并用薄层层析（展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水6：1：1-4：1：0.5）检测，合并相同斑点，浓缩，获得化合物覆盆子苷-F6（1.16g），覆盆子苷-F3（1.63g），覆盆子苷-F7（1.08）和覆盆子苷-F4（2.56g）。Fr.5用ODS反相柱层析分离，以甲醇-水（3：2）洗脱，并用薄层层析（展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水4：1：2）检测，合并相同斑点，浓缩，获得化合物覆盆子苷-F5（19.8g）。

实施例4、制备覆盆子提取物所含的半日花烷型二萜苷类化合物

取实施例2制备的覆盆子提取物7.3kg，用水混悬后进行聚苯乙烯型多孔性吸附树脂（D101，天津南开大学化工厂）吸附，然后分别用水、60%乙醇、95乙醇洗脱，收集并浓缩60%的洗脱液，得60%乙醇部位。将60%乙醇部位按常规进行硅胶（颗粒度200-300目，山东烟台芝罘黄务硅胶开发试验厂）柱层析，依次以乙酸乙酯-乙醇（16：2：1，8：2：1和5：2：1）梯度洗脱，并用薄层层析监测（硅胶板为HSGF₂₅₄，颗粒度8±2μm，山东烟台芝罘黄务硅胶开发试验厂)，展开剂为乙酸乙酯：乙醇：水10：1：0.5-4：2：1。具体如下：

用乙酸乙酯-乙醇-水16：2：1洗脱，用薄层层析（展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水10：1：05）检测，根据检测结果，合并并回收相同斑点的洗脱液，得有相同斑点的浓缩液2份（Fr.1，2）；再用乙酸乙酯-乙醇-水8：2：1洗脱，用薄层层析（展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水6：1：1）检测，根据检测结果，合并并回收相同斑点的洗脱液，得有相同斑点的浓缩液2份（Fr.3，4）；再用乙酸乙酯-乙醇-水5：2：1洗脱，用薄层层析（展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水4：2：1）检测，根据检测结果，合并并回收相同斑点的洗脱液，得有相同斑点的浓缩液2份（Fr.5，6，7）；Fr.1用ODS（50μm，YMC）反相柱层析分离，以甲醇-水（3：1）洗脱，并用薄层层析（展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水10：1：0.5-8：1：0.5）检测，合并相同斑点，浓缩，获得化合物覆盆子苷-G（0.72g），覆盆子苷-F1(1.38g)和覆盆子苷-F2(2.54g)。Fr.3同样用ODS反相柱层析分离，以甲醇-水（2:1）洗脱，并用薄层层析（展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水6：1：1-4：1：0.5）检测，合并相同斑点，浓缩，获得化合物覆盆子苷-F6（1.08g），覆盆子苷-F3（1.47g），覆盆子苷-F7（0.92）和覆盆子苷-F4（2.39g）。Fr.5用ODS反相柱层析分离，以甲醇-水（3：2）洗脱，并用薄层层析（展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水4：1：2）检测，合并相同斑点，浓缩，获得化合物覆盆子苷-F5（18.1g）。

用实施例3或4得到的半日花烷型二萜苷类化合物进行实施例5-8的生物活性试验。

实施例5、掌叶覆盆子中所含半日花型二萜苷类化合物对大鼠被动型Heymann肾炎的防治作用

被动型Heymarm肾炎是研究人类膜性肾病的经典模型（参见文献：庄凌，刑昌赢，郑东辉，赵秀芬，钱军，来氟米特对大鼠被动型Heymann肾炎的治疗作用，南京医科大学学报（自然科学版），2006，26（8），667-670），以大量蛋白尿为显著特征。因此，本发明用Heymann肾炎模型研究覆盆子苷类化合物对肾炎的防治作用。

1、试验材料

1.1、实验仪器

BCA蛋白检测试剂盒(Pierce公司，美国)，ReverTra DashTM试剂盒(Toyobo公司，日本)。

1.2、供试样品:

按实施例3或4制备的覆盆子苷类化合物：覆盆子苷-F1-7、覆盆子苷-G地塞米松（河北冀衡药业有限公司）

配制溶液：临用时将覆盆子苷-F1-7、覆盆子苷-G和地塞米松分别用0.5%的羧甲基纤维素钠(CMCNa)混配制成相应浓度。

2、试验动物

品系：Wistar大鼠

性别：雄性

体重：175～200克

来源：上海斯莱克实验动物责任有限公司

饲养：恒温净化通风动物房，自由进食与饮水，25±2℃。

3、试验方法

3.1制备抗FXlA血清

（1）制备FXlA抗原

正常雄性Wistar大鼠，乙醚麻醉后消毒皮肤，剪开胸腹腔，以无菌的冷生理盐水灌洗肾脏，然后分离肾皮质称重，将皮质充分研磨成匀浆后加适量生理盐水，依次用80目、100目和220目筛网过滤，收集最后的滤液，将滤液以1600r/min20min离心,取上清，重复离心一次，取上清，再以10000r/min30min离心后弃上清，将沉淀物用双蒸水洗涤3次，所得沉淀物为FXA1A抗原。

（2）制备抗FXlA血清

将上述制备的FXA1A抗原和等体积弗氏完全佐剂充分乳化后，间隔2周经皮下免疫大耳白兔，共免疫6次后取血清。用免疫双向扩散和间接免疫荧光法测定效价，分别达到1：32和1：2000为合格。颈动脉取血，分离血清，其为抗FX1A血清，-20℃备用，使用前灭活。

3.2、被动型Heymann肾炎模型的建立和动物分组

取雄性Wistar大鼠110只，它们的24h尿蛋白均小于10mg。随机平均分为以下组：阳性对照组、覆盆子苷(覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G)治疗组、模型对照组（简称模型组，下同）和空白对照组（简称空白组，下同）。空白组一次性尾静脉注射生理盐水5ml/kg；其余各组大鼠一次性尾静脉注射抗FX1A血清5ml/kg进行造模，在造模当天起每天经口灌胃给药（给药剂量分别以每公斤体重计算），共4周，给药剂量分别为阳性对照组（地塞米松，0.1mg/kg/d）；覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G（20mg/kg/d）；模型组和空白组每天每只大鼠经口灌注0.5%的羧甲基纤维素钠(CMCNa)混悬液5mg/kg/d。

3.3、观察指标

尿蛋白定量采用BCA(bicinchoninincacid)法，11个组均在造模开始第2和第4周周末分别放入代谢笼中，收集24h尿液。计量资料以均数±标准差（）表示，各组分别与模型组比较，采用双侧两样本t检验进行统计分析。结果见表2。

表2大鼠尿蛋白量统计表

*p<0.05，**p<0.01,与模型对照组比较；与空白组比较：#P<0.05，##P<0.01

由表2可见，模型组尿蛋白量明显高于空白组（P<0.01），覆盆子苷-F1-F7和覆盆子苷-G组尿蛋白量均低于模型组(P<0.05)，具有显著性差异。其中覆盆子苷-F1-7实验组的尿蛋白量均低于覆盆子苷-G组。

上述结果表明，本发明的半日花烷型二萜苷（覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G）对被动型Heymann肾炎具有防治作用，且覆盆子苷-F1-7的疗效均优于覆盆子苷-G，覆盆子苷-F1、覆盆子苷-F5、覆盆子苷-F7疗效更佳，本发明的化合物均可以用于制备防治肾炎的药物。

实施例6、掌叶覆盆子中所含半日花型二萜苷类化合物对氢化可的松诱导的小鼠肾阳虚的防治作用

本发明选用了氢化可的松诱导的小鼠肾阳虚模型（参见文献：黄厚才,彭蕴茹,沈明勤，金匮肾气丸对大鼠肾阳虚模型的影响，中国比较医学杂志，2004，14（3），155-157），此模型是经典的、常用的肾阳虚模型。

1、试验材料

1.1、造模药品

名称：氢化可的松

来源：天津市生物化学制药厂

性状：注射用粉针

配制：用生理盐水配成3.57mg/ml。

1.2、供试样品:

覆盆子苷类化合物同实施例5；甲睾酮片（上海信谊康捷药业有限公司）；金匮肾气丸（北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂）。

配制溶液：临用时将覆盆子苷F1-7和覆盆子苷-G溶于0.5%的羧甲基纤维素钠(CMCNa)制成相应浓度的混悬液；

甲睾酮：用0.5%的羧甲基纤维素钠(CMCNa)制成30mg/ml的混悬液；

金匮肾气丸：用0.5%的羧甲基纤维素钠(CMCNa)制成150mg/kg的混悬液。

2、试验动物

品系：ICR小鼠

年龄：6周龄

级别：清洁级

性别：雄性

体重：25g±2g

来源：上海斯莱克实验动物责任有限公司

饲养：清洁级动物房，自由进食与进水，温度：25±2℃，湿度：40-60%，人工照明模拟昼夜变化。

3、试验方法

雄性ICR小鼠96只，在实验条件下适应3天。随机分组，每组8只。除空白组每天每只小鼠腹腔注射0.2ml生理盐水连续注射10天外，其余各组每天每只小鼠腹腔注射0.2ml氢化可的松溶液造模，同时分别灌胃上述配制的药液，给药剂量为：覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G组30mg/kg/d；甲睾酮组0.65g/kg/d；金匮肾气丸组6g/kg/d；模型组和空白组分别灌胃0.5ml0.5%的羧甲基纤维素钠，并连续注射氢化可的松溶液10天。给药第13天，各组小鼠称重，眼眶取血，然后处死小鼠。摘取小鼠的睾丸、肾脏，称重。小鼠血液放置2小时后，离心，取上层血清，放置在-20℃冰箱中，待测。

各组小鼠肾脏和睾丸重量无差异，血清样品使用睾酮化学发光试剂盒，按照使用说明操作，测定血清睾酮浓度。计算每组小鼠体重和睾酮浓度的平均值和标准差（n=8），实验数据用表示，各组分别与模型组比较，采用双侧两样本t检验进行统计分析，结果见表3。

表3小鼠的体重及睾酮浓度水平统计表

与模型组比较：*P<0.05,**P<0.01；与空白组比较：#P<0.05，##P<0.01

由表3可见，模型组小鼠体重和血清睾酮水平显著低于空白组（P<0.05），血液睾酮水平较空白组有显著的降低（P<0.01）；覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G组，小鼠体重较模型组均有显著增加（P<0.05），血清睾酮水平较模型组有显著提高(P<0.05)。覆盆子苷-F1-7组小鼠体重和血清睾酮浓度均高于覆盆子苷-G组。

结果表明，本发明半日花烷型二萜苷类化合物（覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G）对小鼠肾阳虚具有明显的防治作用，且覆盆子苷-F1-7疗效优于覆盆子苷-G，覆盆子苷-F2、覆盆子苷-F3、覆盆子苷-F5、覆盆子苷-F6、覆盆子苷-F7疗效更佳，本发明所述的化合物均可以用于制备防治肾阳虚的药物。

实施例7、掌叶覆盆子所含的半日花烷型二萜苷类化合物对维甲酸致小鼠骨质疏松的治疗作用

为了研究覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G的抗骨质疏松的作用，本实验采用维甲酸致骨质疏松的动物模型（参见文献：陈方,吴铁，崔燎，维甲酸致小鼠骨质疏松模型的量效关系及骨药理作用探讨，中国药理学通报，2002,18（6），681-684），因为全反式维甲酸是一种免疫抑制剂，其具有抑制骨合成等作用，所以常用来建立动物骨质疏松模型。

1、试验材料

1.1、实验仪器

AE240电子天平（梅特勒-托利多仪器公司）。

1.2、供试样品:

覆盆子苷类化合物同实施例5；全反式维甲酸（河南中天实业有限公司）；阿仑膦酸钠（华北制药公司）。

配制：临用时将覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G、全反式维甲酸和阿仑膦酸钠分别溶于0.5%的羧甲基纤维素钠(CMCNa)混悬液中待用。

羟脯氨酸（HOP）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

2、试验动物

品系：昆明种小鼠

性别：雄性

体重：33±4克

来源：中科院上海动物中心

饲养：恒温净化通风动物房，自由进食与饮水，25±2℃。

3、试验方法

昆明种小鼠100只，随机分成10组，每组10只：分别为空白组，模型组，覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G组（60mg/kg/d）。除空白组外，其余各组均用全反式维甲酸（105mg/kg/d）造模，每天上午灌胃给药维甲酸，下午灌胃给予小鼠相应剂量的药物，模型组和空白组分别灌胃0.5%的羧甲基纤维素钠(CMCNa)混悬液，共14天。实验过程中每周末称体重一次，第15天处死动物，并取右股骨供测定用。

小鼠股骨剖取后，除净附着的软组织，经80℃烘干至恒重，并进行如下测定：

（1）骨干重测量：用电子天平称量，得骨干重；

（2）骨长度基骨横径测量：用游标卡尺对股骨长度及横径进行测量；

实验结果以均数±标准差（）表示，计量资料用t检验进行组间比较。结果见表4。

表4小鼠的体重及骨指数统计表

与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01；与空白组比较：#P<0.05，##P<0.01

由表4可见，模型组小鼠右股骨干重及右股骨横短径均较空白组显著减少（P<0.05），而覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G组均显著高于模型组（P<0.05），覆盆子苷-F1-7组右股骨干重及右股骨横短径均高于覆盆子苷-G组。说明覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G可减少维甲酸引起的小鼠股骨干重的减少和股骨横短径的缩短，且覆盆子苷-F1-7的治疗效果优于覆盆子苷-G。

上述结果表明，本发明半日花烷型二萜苷类化合物（覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G）均对骨质疏松症具有防治作用，且覆盆子苷-F1-7疗效优于覆盆子苷，覆盆子苷-F3、覆盆子苷-F4、覆盆子苷-F5、覆盆子苷-F7疗效更佳，本发明所述的化合物均可以用于制备防治骨质疏松的药物。

实施例8、掌叶覆盆子所含的半日花烷型二萜苷类化合物对大鼠慢性前列腺炎的治疗作用

本实验采用前列腺内注射消痔灵致慢性前列腺炎模型（参见文献：黄鸿源，前列舒通胶囊对慢性前列腺炎大鼠前列腺组织中IL-10及TNF-α表达的影响，期刊名，2012，8（9），55-56），研究覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G对大鼠慢性前列腺炎的治疗作用。

1、试验材料

1.1、实验仪器

AE240电子天平（梅特勒-托利多仪器公司）。

1.2、造模药品

名称：消痔灵注射液

来源：吉林集安益盛药业股份有限公司提供

1.3、供试样品:

覆盆子苷类化合物同实施例5；TNF-αELISA试剂盒（欣博盛生物科技有限公司）。

配制：临用时将覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G分别溶于0.5%的羧甲基纤维素钠(CMCNa)混悬液中待用。

2、试验动物

品系：SD大鼠

性别：雄性

体重：200-250克

来源：上海斯莱克实验动物责任有限公司

饲养：恒温净化通风动物房，自由进食与饮水，25±2℃。

3、试验方法

取大鼠110只，随机分为假手术组、模型组、覆盆子苷（覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G）组和阳性药组，10只/组。每只大鼠经1％戊巴比妥钠30mg·kg腹腔注射麻醉后，无菌条件下打开腹腔，于前列腺叶内注入25％消痣灵生理盐水0.2mL，其中假手术组注入等量生理盐水，依次缝合肌层、皮肤。术后恢复1周后，分别灌胃给药给药体积为0.002mL/g/d，或等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液，1次/d，共30d。假手术组：0.5%羧甲基纤维素钠溶液；模型组：0.5%羧甲基纤维素钠溶液；覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G治疗组：20mg/kg/d；阳性药组：前列回春胶囊0.18g/kg/d。28天后放血处死大鼠，剥离前列腺周围组织，取出前列腺检测。前列腺组织冰浴条件下匀浆，离心后取上清液，严格按照TNF-αELISA试剂盒说明测定TNF-α浓度。

计量资料以均数±标准差（）表示，各组分别与模型组比较，采用双侧两样本t检验进行统计分析。

表5前列腺组织中TNF-a浓度(pg/mL)

与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01；与空白组比较：#P<0.05，##P<0.01

由表5可以看出，覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G能够抑制前列腺组织中促炎因子TNF-α的生成（P<0.05），具有具有显著性差异。覆盆子苷-F1-7组的TNF-a浓度均低于覆盆子苷-G组，说明覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G均能够起到抑制前列腺炎症的作用，且覆盆子苷-F1-7抑制活性优于覆盆子苷-G；

上述结果表明，本发明半日花烷型二萜苷类化合物（覆盆子苷-F1-7和覆盆子苷-G）对慢性前列腺炎具有防治作用，且覆盆子苷-F1-7治疗效果优于覆盆子苷-G，覆盆子苷-F4、覆盆子苷-F5、覆盆子苷-F7的疗效更佳，本发明所述的化合物均可以用于制备防治前列腺炎的药物。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (1)

1.掌叶覆盆子中半日花烷型二萜苷类化合物在制备预防或治疗肾阳虚、骨质疏松药物中的应用，所述的掌叶覆盆子中半日花烷型二萜苷类化合物的化学结构通式如式(Ⅰ)所示：

其中各化合物的R₁、R₂和R₃基团组合如下：

其中Glc为β-D-glucopyranosyl；araf为α-L-arabinofuranosyl。