KR100905772B1 - 일리시터를 이용한 발아 현미의 제조 방법 및 상기 방법에의해 제조된 발아 현미 - Google Patents
일리시터를 이용한 발아 현미의 제조 방법 및 상기 방법에의해 제조된 발아 현미 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 특정 일리시터(elicitor)를 포함하는 발아 배지에서 현미를 발아시키는 단계를 포함하는 발아 현미의 제조 방법, GABA (감마-아미노부티르산) 및 페놀 화합물 함량이 증가된 발아 현미, 특정 일리시터를 포함하는 현미 발아용 배지, 상기 발아 현미를 유효 성분으로 함유하는, 포유동물의 고혈압을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물 및 상기 발아 현미를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 고혈압을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, GABA (감마-아미노부티르산) 및 페놀 화합물 함량이 증가된 발아 현미를 수득할 수 있으며, 상기 발아 현미는 포유동물의 고혈압을 예방 또는 치료하는데 유용하다.
일리시터, 현미, 발아, 고혈압, 페놀 화합물
Description
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도 2는 배양 동안 키토산 (500ppm)으로 처리된 발아 현미의 ACE 저해 활성을 나타낸 결과이다.
도 3은 키토산의 분자량에 따른 발아 현미의 ACE 저해 활성을 나타낸 결과이다.
도 4는 키토산(10cps)의 농도에 따른 발아 현미의 ACE 저해 활성을 나타낸 결과이다.
도 5는 다양한 일리시터에 따른 발아 현미의 ACE 저해 활성을 나타낸 결과이다.
도 6은 발아된 현미의 GABA 함량에 대한 일리시터 처리 효과를 나타낸 것이다.
삭제
도 8은 발아된 현미의 총 페놀 화합물 함량에 대한 일리시터 처리 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 발아된 현미의 ACE 저해 활성에 대한 일리시터 처리 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 상이한 쌀의 식이에 따른 자발성 고혈압 랫트의 혈압을 비교한 것으로서, 고혈압 쥐를 대상으로 4주 동안 섭취하도록 하여 2주, 3주와 4주 경과시에 혈압을 측정한 결과이다.
본 발명은 특정 일리시터(elicitor)를 포함하는 발아 배지에서 현미를 발아시키는 단계를 포함하는 발아 현미의 제조 방법, GABA (감마-아미노부티르산) 및 페놀 화합물 함량이 증가된 발아 현미, 특정 일리시터를 포함하는 현미 발아용 배지, 상기 발아 현미를 유효 성분으로 함유하는, 포유동물의 고혈압을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물 및 상기 발아 현미를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 고혈압을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
식량에너지 섭취를 쌀에 크게 의존하고 있는 국가의 인구는 32억 명이 넘는다. 이러한 실태를 반영하면 쌀은 전세계 식량에너지의 20%를 차지하며, 개도국의 경우 식량에너지의 27%, 아시아의 경우는 31%를 점유하고 있어, 밀과 옥수수를 크게 웃돌고 있는 것으로 나타나고 있다.
그러므로 생리적 기능성이 강화된 쌀의 유통은 WTO 개방 체체 하에서 우리 농업의 발전에도 크게 기여할 수 있을 것으로 기대되므로 이에 대한 연구가 시급히 이루어질 필요가 있다. 즉, 우리의 농업은 농지가격이 비싸고 농촌의 모임이 높으며 경작지가 협소하여 고소득 작물만이 재배에 적합한 구조를 가지고 있다. 따라서 그 동안의 일반 영양소 소재를 생산하는 농업으로는 수지를 맞출 수 없으므로 사회적으로 수요가 높은 생리적 기능성을 함유한 기능성 소재의 생산은 고소득 농업에 아주 적합한 분야이다. 특히 인간의 건강을 증진시키는 기능성 성분이 밝혀지면서 다량 함유하도록 소위 "고기능성 쌀" 등을 개발할 수도 있을 것이다.
고등식물은 척추동물과 같은 면역계는 갖고 있지 않지만 어떠한 신호체계에 의해서 병원균의 감염을 확인하고 생체 방어기구를 활성화하는 시스템을 갖고 있다. 이러한 생체 방어 기구의 활성화 작용을 갖는 물질을 일리시터(elicitor)라 부르며, 병원균의 세포 표층 다당이나 그 분해물은 가장 전형적인 일리시터로 알려져 있다. 일리시터가 감염의 신호로서 식물세포에 의해 인식되고 신호 전달을 통해 생체 방어 관련 유전자의 발현이나 항균성 물질의 생산을 유도하는 분자기구를 알아내는 일을 병해충에 강한 작물의 육종이나 새로운 병해충 방제 기술의 개발에 있어서 중요한 일일 뿐 아니라 동물과 비교해서 상황 인지가 늦은 식물에 있어서 신호 전달 기구 연구로 봐서도 매우 의의가 크다 할 수 있다. 또한 특정의 올리고당이 신호로서 유전자 발현의 제어를 수행한다는 점에서 생물적인 의의를 고려해서도 우수한 모델계라 생각된다.
벼 배양세포를 사용해서 파이토알렉신(phytoalexin) 합성 유도를 지표로써 일리시터 활성을 갖는 당질을 조사한 결과 6량체 이상 크기의 키틴올리고당이 매우 강한 일리시터 활성을 갖는 것을 알 수 있다. 이러한 올리고당은 나노몰 수준에서 활성을 나타내는 것에 대해 키토산 분해물은 전혀 활성을 나타내지 않았다. 또한 도열병균 세포벽 글루칸의 특정의 분해물도 역시 강한 일리시터 활성을 나타냈다. 이러한 벼 배양세포에 인식되는 일리시터는 콩의 어린 잎 세포에 대한 것과는 다른 것으로 생각된다.
키틴올리고당의 신호가 세포 표층의 수용체로써 인식된 직후의 응답으로써 막전위의 탈분극, 이온 후 락스와 세포질의 산성화, 활성화의 생성, 단백질인산화 등이 관찰되었다.
또한, 키틴올리고당 일리시터는 키틴분해효소나 글루칸분해효소, PAL과 같은 생체 방어관련 유전자의 발현을 유도한다. 특히 이것으로 인해 매우 빠른 단계에서 일과성의 mRNA 축적이 야기되는 유니크한 유전자가 존재한다는 것도 알게 되었고 그 기능의 해석을 진행하고 있다. 이러한 일리시터 응답성 유전자의 발현과 세포의 초기 응답의 관련을 조사한 결과 단백질 인산화나 칼슘, 양성자 등의 이온유입이 유전자 발현에 극히 중요한 역할을 갖는 것을 나타내었다. 한편 항균성에 중요한 파이토알렉신 합성은 일리시터 인식 후 비교적 늦게 일어나는 반응이지만 이 과정은 일리시터에 의해 유도되는 자스몬산에 의해서 제어된다는 것도 알게 되었다.
혈압이란 혈관 내에 작용하는 압력으로 혈액이 전신을 돌아다니는데 필요한 압력을 뜻한다. 심장이 수축시에 나타나는 혈압을 수축기혈압, 확장시에 나타나는 혈압을 확장기 혈압이라고 하는데, 혈압은 120/80mmHg와 같이 표시하며, 120은 수 축기 혈압, 80은 확장기 혈압을 나타냅니다. 여기에서 고혈압이란 혈압이 정상수치보다 높은 상태로 보통 수축기 혈압이 160mmHg이상, 확장기 혈압이 95mmHg이상인 경우를 말합니다.
고혈압은 주로 레닌 안지오텐신계에 의한 생리 생화학학적 기전으로 설명되고 있으며, 고혈압의 직접적인 억제를 위하여 안지오텐신 전환효소(ACE: angiotensin Ⅰconverting enzyme)의 활성을 억제할 수 있는 물질에 관심이 집중되고 있다.
ACE는 혈관 내측에 존재하는 내피세포에서 만들어지는 효소로 혈액 중에 분비되며 불활성인 안지오텐신 Ⅰ의 C말단 His-Leu을 절단하여 혈관수축 등의 강한 혈압상승작용을 갖는 안지오텐신 Ⅱ를 생성시키며 한편으로는 강한 혈관확장작용을 갖는 브래드키닌을 분해하는 작용을 갖는 승압계 효소이다.
ACE는 혈압을 저하시키는 키닌을 분해하고 반대로 혈압을 상승시키는 안지오텐신Ⅱ를 생성하는 방법으로 혈압을 올리는 것에 관여하고 있다. 따라서 ACE의 활성이 올라가면 혈압이 상승하게 되는 셈이다. 이 ACE의 작용을 저해함으로써 고혈압증의 치료가 가능하다.
고혈압은 심부전증, 신장기능저하, 뇌졸중 등 치명적인 심장순환기계통질환의 직접원인이 되는 것으로 알려지고 있다. 따라서 고혈압의 억제는 ACE 활성을 억제함으로서 가능하며 고혈압의 원인이 되고 있는 ACE 활성 저해제로는 화학합성 ACE 저해제로 캅토프릴(captoprill), 에날라프릴(enalapril) 등이 있으며, 이들은 고혈압 치료제로 이용되고 있으나, 마른기침, 두통, 식욕부진, 미각이상, 발진, 백 혈구 감소 등의 부작용이 많기 때문에 안전성이 확보된 식품 등 천연물의 혈압강하 작용에 관하여 많은 연구가 이루어지고 있다. ACE의 활성을 저해하는 식품관련 성분으로 우유, 대두, 옥수수, 정어리 등의 단백질 가수분해물, 감귤 및 과실류의 플라보노이드, 차 성분의 카테킨, 고도 불포화지방산 등이 보고되어 있다.
또한 쌀과 기타 곡류의 ACE 저해 활성도 많이 보고되어 있는 바와 같이 현미도 혈압상승을 억제하는데 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 현미는 식이섬유, GABA(감마-아미노부티르산), 이노시톨, 페룰산(ferulic acid) 등의 여러 가지 기능성 물질들을 함유하고 있으며, 이들 성분 중 Vit E, GABA, 페룰산 등이 혈압에 미치는 영향에 관해 연구된 바 있다.
따라서, 본 발명자는 발아 현미를 연구하는 중에, 특정 일리시터를 이용하여 현미를 발아함으로써 발아된 현미가 페놀 화합물과 같은 유용 성분이 증가되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 유용 화합물이 증가된 발아 현미의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유용 화합물이 증가된 발아 현미를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유용 화합물의 함량을 증가시키는 현미 발아용 배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발아 현미를 포함하는 포유동물의 고혈압을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발아 현미를 이용하여 포유동물의 고혈압을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 염화나트륨 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 일리시터(elicitor)를 포함하는 발아 배지에서 현미를 발아시키는 단계를 포함하는 발아 현미의 제조 방법을 제공한다.
일리시터(elicitor)는 일반적으로 생체 방어 기구의 활성화 작용을 갖는 물질을 말한다. 본 발명의 발아 현미의 제조 방법에 유용한 일리시터로는 염화나트륨 및 키토산 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
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키토산은 인체에 무해한 생분해성 천연고분자 물질로서 그 자체가 항균력을 갖고 있으며, 식물에 사용할 경우 키틴분해효소의 생성유도 작용 등 식물체의 자기보호 기능 향상 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일리시터는 현미뿐만 아니라, 보리, 밀, 옥수수, 수수, 콩 등에 대해 적용할 수도 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 일리시터는 0.01~0.25 중량% 염화나트륨 용액일 수 있다. 일리시터의 농도가 상기 범위를 벗어나면 원하는 유용 물질, 예를 들면, 페놀 화합물의 함량의 증가가 크지 않기 때문이다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 일리시터는 0.01~0.25 중량% 염화나트륨 및 0.01~0.25 중량% 키토산 용액의 혼합물일 수 있다. 일리시터의 농도가 상기 범위를 벗어나면 원하는 유용 물질, 예를 들면, 페놀 화합물의 함량의 증가가 크지 않기 때문이다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 발아 현미는 페놀 화합물의 함량이 증가된 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 페놀 화합물은 플라보노이드일 수 있다. 상기 발아 현미는 페놀 화합물의 증가 외에도 GABA의 함량이 증가될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GABA (감마-아미노부티르산) 및 페놀 화합물 함량이 증가된 발아 현미를 제공한다. 즉, GABA만이 증가된 발아 현미, 페놀 화합물만이 증가된 발아 현미, GABA 및 페놀 화합물이 증가된 발아 현미도 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 발아 현미에서, 상기 발아 현미는 본 발명의 발 아 현미의 제조 방법에 의해 제조된 발아 현미일 수 있다.
또한, 본 발명의 발아 현미는 상기 GABA (감마-아미노부티르산) 및 페놀 화합물 함량이 표준 발아 조건에 의해 제조된 발아 현미에 비하여 각각 30~80% 및 50~100% 증가된 발아 현미일 수 있다. 표준 발아 조건이란 물에서 현미를 발아시키는 것을 말한다. 또한, 상기 범위를 초과한 발아 현미도 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 염화나트륨 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 일리시터를 포함하는 현미 발아용 배지를 제공한다. 상기 배지 중의 일리시터는 바람직하게는 0.01~0.25 중량% 염화나트륨 용액일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 일리시터는 0.01~0.25 중량% 염화나트륨 및 0.01~0.25 중량% 키토산 용액의 혼합물일 수 있다. 상기 일리시터의 농도가 상기 범위를 벗어나면 원하는 유용 물질, 예를 들면, 페놀 화합물의 함량의 증가가 크지 않기 때문이다. 상기 현미 발아용 배지는 발아 현미의 페놀 화합물의 함량의 증가를 목적으로 할 수 있다. 바람직하게는 상기 페놀 화합물은 플라보노이드일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 발아 현미를 유효 성분으로 함유하는, 포유동물의 고혈압을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 발아 현미 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 비히클을 함유할 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는"이란 생리적으로 허용되며 사람에게 투여했을 때 구토, 현기증 등과 같은 알레르기 또는 유사한 바람직하지 않은 반응을 일반적으로 야기하지 않는 조성물 및 분자 실체를 의미한다. 용어 "담체"는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 비히클 또는 운반체를 의미한다. 이러한 약학적 담체는 멸균 액체, 예를 들면 물 및 오일, 예를 들면 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 그 예로는 낙화생유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함한다. 물 또는 수용액, 식염수 용액 및 수성 덱스트로스와 글리세롤 용액은 특히 주사용 용액의 담체로서 바람직하게 사용된다. 적합한 약학적 담체에 대해서는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 개시되어 있다.
본 발명의 약학 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 경피 등의 투여용으로 제조할 수 있다. 약학 조성물은 주사용 제제의 약학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 조성물은 특히 멸균된 등장성 식염수 용액(인산일나트륨, 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등이나 또는 이의 혼합물)이거나 또는 적당한 때 멸균수 또는 생리식염수를 첨가하면 주사용 용액이 만들어질 수 있는 무수, 특히 동결건조된 조성물일 수 있다. 바람직한 멸균 주사용 제제는 비독성의 비경구적으로 허용성인 용매 또는 희석제 중의 용액 또는 현탁액일 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체 또는 비히클의 예로는 식염수, 완충 식염수, 등장성 식염수(예, 인산일나트륨, 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등이나 또는 이의 혼합물), 링거액, 덱스트로스, 물, 멸균수, 글리세롤, 에탄올 및 이의 혼합물이 있다. 바람직하게는, 1,3-부탄디올 및 멸균 고정화 오일이 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드를 비롯하여 임의 상표의 고정화 오일이 사용될 수 있다. 올레산과 같은 지방산 역시 주사제의 제조에 사용될 수 있다.
투여시 사용되는 단독물 또는 벡터에 혼입된 상태의 본 발명에 개시된 핵산의 투여량은 여러 매개 변수, 특히 사용되는 투여 방식, 해당하는 병리상태, 발현시키고자 하는 유전자 또는 원하는 치료 기간에 따라 조정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 비경구 또는 경점막, 예를 들면 경구, 비측 또는 직장 또는 경피적으로 투여될 수 있다. 바람직한 투여는 비경구, 예를 들면 정맥내 주사이며, 예를 들면, 소동맥내, 근육내, 피내, 경피, 복강내, 심실내 및 두개내 투여를 포함하고, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내 또는 경피성 투여 경로로 전달할 수 있다. 또는, 적당하게 조제된 조성물은 비측 또는 경구 투여로 투여할 수 있다. 생물학적 물질의 일정 공급은 일정한 간격, 예를 들면 1일, 매 12시간 등으로 치료적 유효 투여량(즉, 피검체의 대사적 변화를 유도하기에 효과적인 투여량)을 제공함으로써 얻을 수 있다. 이 매개 변수는 치료받는 질병 상태의 정도, 실시되는 다른 작용, 예를 들면 식이 변화, 체중, 연령 및 피검체의 성별, 및 다른 기준에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 표준 우수 의약 처방에 따라 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 범위 내에서 생물학적 물질이 투여되는 유기체는, 사람인 것이 바 람직하나, 모든 동물일 수도 있다. 즉, 당업자라면 용이하게 인식할 수 있는 바와 같이 본 발명의 약학 조성물은 특히 포유동물, 비제한적으로 가축, 예를 들면 고양이과, 개과 피검체, 사육 동물, 예를 들면 비제한적으로 소, 말, 염소, 양 및 돼지 피검체, 야생 동물(야생 또는 동물원 동물에 관계없음), 연구용 동물, 예를 들면 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양, 돼지, 개, 고양이 등, 조류 종, 예를 들면 병아리, 칠면조, 명금류 등, 즉 수의용의 모든 동물에 투여하기에 특히 적합하다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 발아 현미를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 고혈압을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서, 투여 경로, 투여량 및 투여 스케줄 등에 관한 사항은 상기한 본 발명의 조성물에 대하여 설명한 바와 같다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
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2: 현미의 발아 조건의 최적화
가. 원료 및 발아
전라남도 농업기술원에서 얻은 2005년 동진벼를 시험품종으로 사용하였다. 정미기(농가용 미니 셋트 정미기,(주)성산기업)에서 현미를 생산하여 현미를 10℃에서 보관하면서 원료로 사용하였다. 세척한 현미를 일정한 플라스틱 재배통에 넣고 물 또는 기타 용수가 담긴 발아 장치 내에서 현미를 일정온도로 유지하면서 발아하였다. 발아에 사용한 각 용액들은 12시간마다 새로이 조제한 용액으로 교환하여 주었다.
나. 발아조건
현미의 기능성 영양성분을 증진시키기 위한 적정 발아 조건을 확립하기 위하여 발아시간과 발아온도를 달리하여 발아 후 즉시 건조하여 발아현미의 ACE 저해 활성을 측정하였다.
그리고 발아용액이 발아현미의 ACE 저해 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 500 ppm의 농도의 키틴올리고당, 키토산올리고당, 글루코사민, 베타키토산 등을 발아용액으로 이용하여 25℃, 72시간의 발아조건에서 발아현미를 제조한 후 ACE 저해활성을 측정하였다.
이 때 키토산의 경우 분자량 차이에 따른 ACE 저해 활성 정도의 차이를 조사하기 위해 5, 10, 30 cps의 키토산을 발아용액으로 하여 발아현미를 제조한 후 ACE 저해 활성을 측정하였다. 그리고 키토산의 농도에 따른 ACE 저해 활성 정도의 차이를 조사하였다.
다. 발아현미추출액 제조
발아 현미를 분쇄한 후 6배량의 80%(v/v) 에탄올 용액으로 20℃에서 24시간 진탕하여 추출하고 원심분리한 상등액을 추출 시료로 사용하였다.
라. 안지오텐신 Ⅰ전환효소 (ACE) 활성 측정 방법
ACE 저해 작용의 측정은 Cushman과 Cheung(1971)의 방법에 준하여 실시하였다. 증류수에 녹인 2% 120/80SYMBIOSAL 50㎕에 300mM NaCl을 함유한 100mM 소듐 보레이트 버퍼(pH 8.3) 100㎕를 넣은 반응액에 기질인 5mM Hippury-His-Leu 50㎕를 넣고 37℃에서 10분간 미리 인큐베이션시킨 후 ACE 조효소액 100㎕을 넣어 37℃에서 1시간 30분간 인큐베이션시킨 다음 1M HCl 200㎕를 넣어 반응을 정지시킨 후 에 틸 아세테이트 2㎖를 넣어 15초간 볼텍싱하였다. 볼텍싱한 액을 1000rpm에서 5분간 원심분리한 후 에틸 아세테이트 층을 1.5ml 취하여 끊는 물에 중탕으로 휘발시킨 후 완전히 건조시킨 후 1N NaCl 1㎖를 가하여 용해시키고 228 nm에서 흡광도를 측정하였다.
마. 발아기간에 따른 ACE 저해 활성 조사
발아현미의 ACE 저해활성을 증진시키기 위한 적정 발아조건을 확립하기 위하여 25℃로 조정된 발아조에서 72시간 동안 발아용액 내에서 발아시킨 후 곧바로 열풍건조하여 ACE 저해활성을 분석한 결과는 도 2와 같다. 도 2는 배양 동안 키토산 (500ppm)으로 처리된 발아 현미의 ACE 저해 활성을 나타낸 결과이다. 초기에 ACE 저해 활성이 70% 였던 현미는 발아시간이 증가함에 따라 발아 24시간의 75%에서 서서히 증가하여 발아 48시간 경과시 82%를 나타낸 이후부터 급격히 증가하기 시작하여 발아 72시간 경과시 86%의 ACE 저해 활성을 나타내었다.
바. 키토산의 분자량 변화에 따른 ACE 저해 활성 조사
일리시터로 이용되고 있는 키토산을 분자량별로 구분하여 용액 제조 후 발아현미를 제조하였을 때 분자량 분포에 상관없이 제조한 발아현미의 ACE 저해 활성은 83-86%의 분포를 나타내어 키토산이 발아현미의 ACE 저해 활성 증진에 효과가 있음을 알 수 있었다. 도 3은 키토산의 분자량에 따른 발아 현미의 ACE 저해 활성을 나타낸 결과이다. 도 3에서, "1"로 표시된 것은 0.05% (5cps) 키토산 처리된 발아 현미를 나타내며, "2"로 표시된 것은 0.05% (10cps) 키토산 처리된 발아 현미를 나타내며, "3"으로 표시된 것은 0.05% (30cps) 키토산 처리된 발아 현미를 나타내며, "4"로 표시된 것은 물로 처리된 발아 현미를 나타낸다.
키토산이 현미 발아시 활성화되는 프로테아제 등의 단백질 가수분해 효소를 더욱 활성화하여 유리 형태의 아미노산을 많이 생성시켜 영향을 미치는 것으로 판단된다. 고등식물은 키틴과 키토산을 함유하고 있지 않으나 키틴분해효소, 키토산분해효소와 같은 분해효소를 가지고 있으며, 키토산은 식물세포에서 키틴분해효소의 생성 유도작용, 파이토알렉신의 축적, 단백질분해효소 저해제의 합성 등과 같은 방어기작을 촉진시키는 것으로 알려져 있어 식물체의 자기보호기능 향상과 식물세포의 활성화를 통하여 생장을 촉진하는 효과가 크다고 할 수 있다.
사. 키토산 농도에 따른 ACE 저해 활성 조사
현미를 침지할 때 침지용액에 키토산을 0-500 ppm으로 첨가하였을 때의 ACE 저해 활성 정도의 차이를 조사한 결과는 도 4와 같다. 도 4는 키토산(10cps)의 농도에 따른 발아 현미의 ACE 저해 활성을 나타낸 결과이다. 키토산의 농도가 높을수록 ACE 저해 활성은 증가하며, 키토산을 500 ppm 첨가하였을 때 91%의 ACE 저해활성을 나타내어 무첨가구의 75%에 비해 유의적으로 증가하였다.
키토산의 농도가 높을수록 발아현미의 높은 ACE 저해 효과는 발아에 의해 고분자의 단백질이 가수분해되어 ACE 저해 효과를 나타낼 수 있는 저분자의 펩티드가 생성되었기 때문인 것으로 추정된다.
아. 일리시터 종류에 따른 ACE 저해 활성 조사
상이한 일리시터를 포함하는 발아 용액에서 발아 현미를 제조한 후 발아 용액이 발아 현미의 ACE 저해 활성에 미치는 영향을 조사한 결과는 도 5와 같다. 도 5는 다양한 일리시터에 따른 발아 현미의 ACE 저해 활성을 나타낸 결과이다. 도 5에서, "1"로 표시된 것은 0.05% 염화나트륨 처리된 발아 현미를 나타내며, "2"로 표시된 것은 0.03% 키토산 및 0.05% 염화나트륨 처리된 발아 현미를 나타내며, "3"으로 표시된 것은 0.03% 키토산 처리된 발아 현미를 나타내며, "4"로 표시된 것은 물로 처리된 발아 현미를 나타낸다.
ACE 저해 활성의 경우, 물로 제조하였을 때의 75%에 비해 0.05% 염화나트륨 및 0.03% 키토산 용액으로 제조하였을 때 95%의 저해율을 나타내어 물로 처리한 발아 현미에 비해서 ACE 저해 효과가 상당히 높은 것으로 나타났다.
실시예
3:
일리시터
처리에 따른 발아 현미의
GABA
함량 조사
가. GABA(감마-아미노부티르산) 분석 방법의 정립
일반적으로 GABA 분석시 형광물질을 붙여서 형광분석기로 많이 분석하나 본 발명에서는 효소를 이용한 분석 방법을 사용하였다.
1) 시료에서 GABA 추출
GABA 함량 분석은 Zhang과 Bown의 방법을 변형하여 실험하였다. 초저온 냉동고(deep freezer)에 보관되어 있는 시료를 꺼내 막자사발에서 갈아준 후, 시료 2g을 100% 메탄올 4 ml에 넣고 25℃ 수조에서 10분 동안 추출하였다. 추출 후 80℃ 수조에서 메탄올을 증발시킨 후 70mM 란타늄 클로라이드 10ml을 첨가하여 15분 동안 진탕하고 13,000g에서 15분 원심분리하였다. 상등액 8 ml을 취하여 여기에 1M KOH 1.6ml을 첨가하여 5분 동안 진탕하고 13,000g에서 15분 동안 원심분리하였다. 상등액을 취해 GABA 분석을 실시하였다.
2) GABA 추출액에서 GABA 함량 분석
GABA 추출액 550 ㎕에 4mM NADP+ 150 ㎕, 0.5M 포타슘 피로포스페이트 버퍼 (pH8.6) 200 ㎕와 GABASE (2 유닛/ml) 50 ㎕를 혼합하여 340nm에서 흡광도를 측정한 값을 초기 흡광도(Absorbance)로 하고 이 혼합 용액에 20mM α-케토글루타레이트 50 ㎕을 첨가하여 60분 후 340nm에서 측정한 흡광도 값을 최종 흡광도로 하여 최종 흡광도 값과 초기 흡광도 값의 차이를 계산하여 나타내었다.
3) 일리시터를 처리한 발아 현미에서 GABA 함량
일리시터를 식물에 처리하였을 경우 식물체 내에서 생체 방어 기작의 활성화와 유전자 발현 활성화로 인한 식물 내 GABA 함량과 기능성 성분들의 변화를 예상함에 따라, 현미를 0.03% 키토산 및 0.05% 염화나트륨 처리된 발아 현미에서 25℃에서 60시간 처리한 후 발아된 현미에서 성분 함량의 변화를 조사하여 대조구인 증류수에서 25℃에서 60시간 처리한 후 발아된 현미의 성분 함량과 비교하였으며 실험 결과는 도 6에 나타난 바와 같다. 도 6은 발아된 현미의 GABA 함량에 대한 일리시터 처리 효과를 나타낸 것이다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 증류수로 처리한 발아 현미에 비해 본 발명의 일리시터로 처리한 발아 현미의 GABA 함량은 약 56% 정도 증가하였다.
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실시예
5:
일리시터
처리에 따른 발아 현미의 페놀 화합물 함량 조사
Amerine과 ough의 Folin-ciocalteau의 방법을 변형하여 실험하였다. 제조된 쌀 추출액 100㎕에 증류수 900㎕을 2N Folin-ciocalteau 시약 500㎕, 20% Na2CO3 2.5 mL를 넣어 혼합한 후 원심분리하여 염을 제거하고 25℃에서 20분간 인큐베이션시킨후 735 nm에서 흡광도를 측정하였다.
일리시터를 식물에 처리하였을 경우 식물체 내에서 방어 시스템과 신호 전달 시스템의 변화로 인해 페놀 화합물 함량에 변화가 있을 것이라 예상하여 현미를 500 ppm 키토산에서 25℃에서 60시간 처리한 후 발아된 현미에서 총 페놀 화합물 함량을 조사하여 대조구인 증류수에서 25℃에서 60시간 처리하여 발아된 현미의 총 페놀 화합물 함량과 비교하였으며, 그 결과는 도 8에 나타난 바와 같다. 도 8은 발 아된 현미의 총 페놀 화합물 함량에 대한 일리시터 처리 효과를 나타낸 것이다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 일리시터를 처리하지 않은 대조구에 비해 일리시터를 처리한 본 발명의 경우에 페놀 화합물 농도가 약 80% 정도 증가했음을 알 수 있다.
실시예
6:
일리시터
처리에 따른 발아 현미의 ACE 저해 활성 조사
ACE 저해 작용의 측정은 Cushman과 Cheung(1971)의 방법에 준하여 실시하였다 (실시예 2 참고). 도 9는 발아된 현미의 ACE 저해 활성에 대한 일리시터 처리 효과를 나타낸 것이다. 일리시터 처리구 및 대조구는 상기 실시예 5에서 제조한 것과 동일하다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 일리시터를 처리하지 않은 대조구에 비해 일리시터를 처리한 본 발명의 경우에 ACE 저해 활성이 약 25% 정도 증가했음을 알 수 있다.
실시예
7:
일리시터
처리에 따른 발아 현미의 일반 성분 비교
상기 실시예 5와 같이 제조한 일리시터 처리구 및 대조구를 이용하여 발아 현미의 일반 성분을 비교한 결과는 하기 표 1과 같다.
표 1. 일리시터를 처리한 발아 현미에서의 일반 성분 비교
| 특성 | 대조구 | 일리시터 처리한 발아 현미 |
| 재(ash) (%) | 1.43 | 1.29 |
| 조 지방 (%) | 2.55 | 2.78 |
| 조단백 (%) | 8.57 | 8.82 |
| 탄수화물 (%) | 87.2 | 87.8 |
| P (mg/kg) | 331 | 337 |
| K (mg/kg) | 1332 | 1444 |
| Zn (mg/kg) | 24.9 | 25.6 |
| Fe (mg/kg) | 25.6 | 45.6 |
| Mg (mg/kg) | 1018.5 | 1077 |
| Ca (mg/kg) | 378 | 422 |
실시예
8: 자발성 고혈압
랫트의
혈압에 대한 본 발명의 발아 현미의 영향 조사
가. 시험계
1) 종 및 계통
자발성 고혈압(Spontaneous Hypertensive) 랫트
2) 성별 및 입수시 주령: 수컷 5주령
3) 선택사유
본 발명에 사용될 자발성 고혈압 랫트(SHR)는 고혈압 모델 동물로서 많이 사용되어 왔기 때문에 비교 가능한 방대한 생리, 해부 및 독성학적 기초자료가 있어서 이를 선택하였다. SHR 모델은 식이를 통하여 대략 10주 이후면 자연적으로 고혈압이 발생된다.
4) 입수시 동물수: 총 24마리
5) 실험개시 주령
모든 군들은 동일 사육 환경에서 동일한 식이로 일정한 혈압을 유발한 다음 각 군 (4 군당 6마리) 모두 매일 3회 경구 투여 후 5주간의 평균 혈압을 측정하여 수치를 통계화하였다.
6) 사용 동물수: 총 24마리
7) 군 분리법: 무작위법
8) 식별법: 개체 식별은 피모색소법을 이용하거나, 꼬리에 유성 매직으로 표시하며 사육 상자별로 태그 표시법을 이용하고, 사육 동물실의 입구에는 시험번호, 표제, 동물실, 시험기간, 시험책임자명을 기재한 라벨을 첨부하였다.
나. 동물실
1) 위치: 실험동물 사육실 85동 10층
2) 온도 및 습도 범위: 온도 22±3℃, 상대 습도55±10%
3) 환기 횟수: 10-12회/시간
4) 명암 주기: 형광등 조명(07:00 점등 - 19:00 소등)
5) 조도: 150-200 lux
6) 사육 상자의 종류(크기): 순화, 검역, 투여 및 관찰 기간 중 폴리카보네이트 케이지 (26×42×18cm, 명진기계제작)에 사육하였다.
7) 사육 상자당 동물수
순화, 검역기간 - 3마리씩
투여 기간 3 마리씩
다. 사료
1) 제조한 사료: 원료의 열량과 식이 섬유량을 고려하여 하기 표 2와 같이 식이 배합을 조정하였다.
표 2. 사료의 조성
| 조성 | 백미 50% | 현미 50% | 발아 현미 50% | 일리시터 발아 현미 50% |
| 카세인 | 149 | 149 | 149 | 149 |
| DL-메티오닌 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| 옥수수 전분 | 105 | 105 | 105 | 105 |
| 수크로오스 | 150 | 150 | 150 | 150 |
| 셀룰로오스 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 옥수수 오일 | 36 | 36 | 36 | 36 |
| 비타민 믹스 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 미네랄 믹스 | 35 | 35 | 35 | 35 |
| 콜린 비타르트레이트 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 백미 | 500 | |||
| 현미 | 500 | |||
| 발아 현미 | 500 | |||
| 일리시터 발아 현미 (12080 쌀) | 500 | |||
| 총량 | 1kg | 1kg | 1kg | 1kg |
라. 음수
1) 종류: 고압 멸균한 상수도수
2) 급수: 자유섭취
마. 시험물질
1) 명칭: 12080 쌀
2) 보관조건: 냉장 보관
3) 시험물질의 성상: 분말
4) 시험물질의 시험성적서: 농약 검출 확인
바. 실험물질의 투여방법
1) 투여경로: 경구 투여
2) 투여회수 및 투여기간: 5 주간/1일 2회 투여
식이로 혈압상승을 유도한 후 4주째(10주령 랫트)부터 각 물질을 멸균 증류수에 일정하게 섞어 경구로 0.5ml를 1일 2회 5주간 투여하였다. 단 5주 이전에 현 저한 혈압 개선효과가 인정되는 시기가 있다면 그 시점에서 시험을 종료하였다.
사. 시험군의 구성
1) 시험군의 구성
가) 백미를 50% 혼합한 식이를 공급한 현미군
나) 현미를 50% 혼합한 식이를 공급한 현미군
다) 발아 현미를 50% 혼합한 식이를 공급한 현미군
라) 일리시터 발아 현미를 50% 혼합한 식이를 공급한 12080 벼군
아. 시험방법 및 관찰 항목
1) 평균 혈압 모두 주중 1회 정해진 시간에 혈압을 측정
2) 호르몬 변화
레닌-안지오텐신-알도스테론
자. 자발성 고혈압 랫트 모델에서 발아 현미가 혈압에 미치는 영향 조사
도 10은 상이한 쌀의 식이에 따른 자발성 고혈압 랫트의 혈압을 비교한 것으로서, 고혈압 쥐를 대상으로 4주 동안 섭취하도록 하여 2주, 3주와 4주 경과시에 혈압을 측정한 결과이다. 백미를 50% 첨가한 사료를 먹인 실험군은 초기 195.98 mmHg에서 2주 후 219.56 mmHg, 3주 후 231.99mmHg, 4주 후 233mmHg로 유의적인 혈압 증가를 보였다. 현미를 50% 첨가한 사료를 먹인 실험군 역시 초기 195.97 mmHg에서 2주 후 215.05 mmHg, 3주 후 226.49 mmHg, 4주 후 230.71 mmHg로 유의적인 혈압증가를 보여 주었다. 또한, 발아현미를 50% 첨가한 사료를 먹인 실험군에서는 초기 195.96 mmHg에서 2주 후 216.64 mmHg, 3주 후 224.92 mmHg, 4주 후 227.15 mmHg 로 유의적인 증가를 보였으나, 백미 및 현미를 50% 첨가한 사료를 먹인 실험군보다 감소하는 경향을 보여주었다.
본 발명의 일리시터 발아 현미를 50% 첨가한 사료를 먹인 실험군은 초기 195.88 mmHg에서 2주 후 216.64 mmHg, 3주 후 224.92 mmHg, 4주 후 227.15 mmHg로 발아 현미를 50% 첨가한 사료를 먹인 실험군보다 다소 낮은 혈압증가를 보여주었다.
일리시터 발아 현미를 50% 첨가한 사료를 먹인 실험군에서 2주 경과시부터 유의적인 수준에서 다소 낮은 혈압증가를 하는 것으로 나타나, 본 발명의 일리시터 발아 현미 섭취가 고혈압 환자의 혈압 강하에 효과가 있음을 알 수 있었다.
초기와 4주 경과 후의 혈압을 비교하면, 일리시터 발아 현미가 백미보다 13 mmHg 하강의 감소, 현미보다 10 mmHg 하강의 감소, 발아 현미보다 7 mmHg 하강의 감소하는 것으로 나타나 일리시터 발아 현미를 일상적인 식사로서 섭취함으로써 혈압을 관리할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명에 따르면, GABA (감마-아미노부티르산) 및 페놀 화합물 함량이 증가된 발아 현미를 수득할 수 있으며, 상기 발아 현미는 포유동물의 고혈압을 예방 또는 치료하는데 유용하다.
Claims (15)
- 일리시터(elicitor)로서 발아 배지 중 0.01~0.25 중량% 염화나트륨 및 0.01~0.25 중량% 키토산 용액의 혼합물을 포함하는 발아 배지에서 현미를 발아시키는 단계를 포함하는 GABA 및 페놀 화합물의 함량이 증가된 발아 현미의 제조 방법.
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- 제1항에 있어서, 상기 페놀 화합물은 플라보노이드인 것을 특징으로 하는 방법.
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- 일리시터로서 발아 배지 중 0.01~0.25 중량% 염화나트륨 및 0.01~0.25 중량% 키토산 용액의 혼합물을 포함하는, 발아 현미의 GABA 및 페놀 화합물의 함량을 증가시키기 위한 현미 발아용 배지.
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- 제9항에 있어서, 상기 페놀 화합물은 플라보노이드인 것을 특징으로 하는 배지.
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