KR20230110056A

KR20230110056A - 콩과 식물 재배를 통한 쿠메스트린 말로네이트 및 그 구조이성질체의 생산 방법

Info

Publication number: KR20230110056A
Application number: KR1020220006092A
Authority: KR
Inventors: 라찬수; 이은정; 김형민; 홍용덕; 박원석
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2023-07-21

Abstract

본 발명은 쿠메스트린 말로네이트(coumestrin malonate))이 다량 생성되는 식물 재배 및 기내 배양 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인공토양, 기내배양, 발아양액등의 재배법을 이용하여 식물체에 적절한 스트레스 조건으로 쿠메스트린 말로네이트의 생성을 증대하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법으로 제조된 쿠메스트린 말로네이트는 모유두 세포의 증식 효과가 있어, 화장품, 식품, 의약품 등의 다양한 분야에 활용될 수 있다.

Description

콩과 식물 재배를 통한 쿠메스트린 말로네이트 및 그 구조이성질체의 생산 방법{A method for producing coumestrin malonate and structural isomers thereof through Leguminosae cultivation}

본 명세서는 식물 배양의 조건과 방법을 조절하여 쿠메스트린 말로네이트 생성을 증대하는 방법에 관한 것이다.

쿠메스트롤(coumestrol)은 콩과식물에서 얻을 수 있는 대표적인 파이토알렉신(phytoalexin)으로 식물 뿌리의 공생관계를 형성하는 미생물이 식물의 뿌리에 정착하는데 도움이 되고 유해 미생물의 증식을 억제하는 기능을 한다. 쿠메스트롤의 생성과 축적은 콩과 식물에서 생합성 된 이소플라본 중에 다이드진 (daidzin; 다이드제인 모도글루코시드(daidzein monoglucoside))이 식물세포내의 생합성 효소에 의해 생성되며 쿠메스트린(coumestrin; 쿠메스트롤 모노글루코시드(coumestrol monoglucoside))이 생성된다(도 1). 다수의 발명과 연구결과에서 배당체인 쿠메스트린에서 비당체인 쿠메스트롤로 전환하는 연구가 있으나 물질의 안정성과 수용성측면에서는 불리한 기술로 여겨진다. 따라서 본 발명에서는 식물의 생전환 기술을 활용하여 기존에 얻을 수 없었던 프레닐화된 쿠메스트린 (prenyl coumestin; 쿠메스트린 말로네이트(coumestrin malonate))이 다량 생성되는 식물 재배 및 기내 배양 방법 방법을 개시하고 이 물질이 함유된 추출물의 식품, 화장품, 또는 약품으로 활용하고자 한다.

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10-2014-0107779

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Mass production of coumestrol from soybean (Glycine max) adventitious roots through bioreactor: effect on collagen production, Plant Biotechnology Reports 제14권 제1호 Metabolomics study for exploring metabolic perturbations in soybean adventitious roots by fluorescent light irradiation, Applied Biological Chemistry volume 64, Article number: 26 (2021)

본 명세서는 콩과 식물의 재배를 통하여 쿠메스트린 말로네이트 및 이의 이성질체를 다량 생산하는 방법을 개시한다.

일 측면에서, 콩과 식물을 기내 배양하여 쿠메스트린 말로네이트(coumestrin malonate)를 생산하는 방법에 있어서, 상기 기내 배양은 (a) 상기 콩과 식물의 콩배양근을 유도하는 단계; (b) 상기 유도된 콩배양근을 증식시키는 단계; 및 (c) C₁-C₆저급 알킬 자스모네이트를 처리하는 단계를 포함하는, 쿠메스트린 말로네이트 생산 방법을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 쿠메스트린 말로네이트 화합물, 그 염, 그 입체이성질체, 그 수화물, 또는 그 용매화물을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 상기 쿠메스트린 말로네이트 화합물, 그 염, 그 입체이성질체, 그 수화물, 또는 그 용매화물을 포함하는 수용액 조성물을 제공한다.

콩과 식물 및 콩과 식물 세포 재배 방법을 통해, 식물의 생전환 기술을 활용하여 기존에 얻을 수 없었던 프레닐화된 쿠메스트린 (prenyl coumestin; 쿠메스트린 말로네이트(coumestrin malonate))을 다량 생산할 수 있고, 모유두 세포의 증식 효과가 있는 쿠메스트린 말로네이트가 포함된 조성물은 식품, 화장품, 또는 약품으로 활용할 수 있다.

도 1은 쿠메스트롤 화합물의 생합성 경로를 나타낸 개요도이다.
도 2는 인공토양에서 5주 재배 한 콩 식물체의 비교 사진이다 (Control: 메틸자스모네이트 무처리; Elicitor: 메틸자스모네이트 처리)
도 3은 기내 배양으로 생장한 콩 뿌리 배양근의 사진이다.
도 4는 양액 재배로 7일간 생장한 발아된 콩의 비교 사진이다. (A) 암조건의 증류수 처리, (B) 암조건의 메틸자스모네이트 처리, (C) 명조건의 증류수 처리, 그리고 (D) 명조건의 메틸자스모네이트 처리
도 5는 쿠메스트린 배당체 2종을 분취 크로마토그래피 시스템으로 수득한 크로마토그램이다. (F1,쿠메스트린; F2, 쿠메스트린 말로네이트)
도 6는 쿠메스트린 배당체 2종의 UV 흡광 스펙트럼이다. (F1,쿠메스트린; F2, 쿠메스트린 말로네이트)
도 7는 쿠메스트린이 생성된 기내배양 암 조건으로 재배된 콩 뿌리 추출물의 크로마토그램이다. (CMS-G1: 쿠메스트린)
도 8은 쿠메스트린 말로네이트가 생성된 기내 배양 명 조건으로 재배된 콩 뿌리 추출물의 크로마토그램이다. (CMS-G1: 쿠메스트린, M-CMS-G1: 쿠메스트린 말로네이트)
도 9은 쿠메스트린 (F1) 물질의 핵자기 공명 분석 데이터(1H) 이다.
도 10은 쿠메스트린 (F1) 물질의 핵자기 공명 분석 데이터(13C) 이다.
도 11은 쿠메스트린 (F1) 물질의 핵자기 공명 분석 데이터(2D COSY) 이다.
도 12은 쿠메스트린 (F1) 물질의 핵자기 공명 분석 데이터(2D HSQC) 이다.
도 13은 쿠메스트린 (F1) 물질의 핵자기 공명 분석 데이터(2D HMBC) 이다.
도 14은 쿠메스트린 말로네이트 (F2) 물질의 핵자기 공명 분석 데이터(1H) 이다.
도 15은 쿠메스트린 말로네이트 (F2) 물질의 핵자기 공명 분석 데이터(13C) 이다.
도 16은 쿠메스트린 말로네이트 (F2) 물질의 핵자기 공명 분석 데이터(2D COSY) 이다.
도 17은 쿠메스트린 말로네이트 (F2) 물질의 핵자기 공명 분석 데이터(2D HSQC) 이다.
도 18은 쿠메스트린 말로네이트 (F2) 물질의 핵자기 공명 분석 데이터(2D HMBC) 이다.
도 19은 쿠메스트린(F1: A1, A2)과 쿠메스트린 말로네이트 (F2: B1, B2) 물질의 구조 분석 모형도 이다. A1:A2 및 B1:B2 의 함량비율은 80:20 이다.
도 20은 콩 뿌리 추출물, 정제된 쿠메스트린, 및 쿠메스트린 말로네이트의 모유두세포 증식효과를 비교한 그래프이다. C는 대조군, P는 양성대조군, extract는 콩 뿌리 추출물, F1은 정제된 쿠메스트린, 및 F2는 정제된 쿠메스트린 말로네이트의 데이터를 나타낸다. 바그래프의 영문 소문자는 통계적인 차이를 나타낸다. (모든 측정치에 대해 Tukey-Kramer의 Honestly Significant Different test 수행(p-value < 0.05))

용어의 정의

본 명세서에서 "명조건"이란, 24시간을 주기로 식물에 일정량의 광원을 일정 시간 동안 조사하다가 광원을 차단하는 것을 번갈아 실시하는 것을 의미하며, 예시적으로 14시간 동안 광원을 조사하고 10시간 동안 광원을 차단하는 것을 반복하는 것일 수 있다. "암조건"은 24시간 내내 광원이 100% 차단된 조건을 의미한다.

본 명세서에서 "콩과 식물"은 쿠메스트린 말로네이트를 생산할 수 있는 콩과 식물이며, "콩과 식물의 종자"는 콩과 식물에서 유래되는 씨(씨앗)이다. 구체적으로 콩과 식물의 종자는 "콩"일 수 있다.

본 명세서에서 "두상관수"란, 토양 위에 물을 주어 물이 위에서 아래로 빠져나가며 흙 속에 있던 공기를 내려주고 동시에 뿌리가 호흡하는 데 필요한 산소를 공급하는 물주기 방식을 가리킨다.

본 명세서에서 "저면관수"란, 화분보다 큰 용기에 화분을 담고, 화분 바깥의 용기에 물을 부어 뿌리부터 물을 흡수하도록 하는 방식을 일컫는다.

본 명세서에서 "입체 이성질체"는 특히 광학 이성질체(optical isomers)(예를 들면, 본래 순수한 거울상 이성질체(essentially pure enantiomers), 본래 순수한 부분 입체 이성질체(essentially pure diastereomers) 또는 이들의 혼합물)뿐만 아니라, 형태 이성질체(conformation isomers)(즉, 하나 이상의 화학 결합의 그 각도만 다른 이성질체), 위치 이성질체(position isomers)(특히, 호변이성체(tautomers)) 또는 기하 이성질체(geometric isomers)(예컨대, 시스-트랜스 이성질체)를 포함한다.

본 명세서에서 "본래 순수(essentially pure)"란, 예컨대 거울상 이성질체 또는 부분 이성질체와 관련하여 사용한 경우, 거울상 이성질체 또는 부분 이성질체를 예로 들 수 있는 구체적인 화합물이 약 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 97% 이상 또는 약 98% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 99% 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 약 99.5% 이상(w/w) 존재하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 그 염은 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다. 본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능"이란 통상의 의약적 복용량(medicinal dosage)으로 이용할 때 상당한 독성 효과를 피함으로써, 동물, 더 구체적으로는 인간에게 사용할 수 있다는 정부 또는 이에 준하는 규제 기구의 승인을 받을 수 있거나 승인 받거나, 또는 약전에 열거되거나 기타 일반적인 약전으로 인지되는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능한 염"은 약학적으로 허용 가능하고 모 화합물(parent compound)의 바람직한 약리 활성을 갖는 본 발명의 일측면에 따른 염을 의미한다.

본 명세서에서 "그의 염"또는 "약학적으로 허용 가능한 염"은 (1) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 형성되거나; 또는 아세트산, 프로파이온산, 헥사노산, 시클로펜테인프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 1,2-에테인-디설폰산, 2-히드록시에테인설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산, 4-메틸바이시클로 [2,2,2]-oct-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로파이온산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염(acid addition salt); 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 치환될 때 형성되는 염을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 "수화물(hydrate)"은 물이 결합되어 있는 화합물을 의미하며, 물과 화합물 사이에 화학적인 결합력이 없는 내포 화합물을 포함하는 광범위한 개념이다.

본 명세서에서 "용매화물"은 용질의 분자나 이온과 용매의 분자나 이온 사이에 생긴 고차의 화합물을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 (a) 단계는 광원이 100% 차단된 암조건에서 수행하고, 상기 (b) 및 (c) 단계는 명조건에서 수행하는 것일 수 있다.

구체적으로, 콩과 식물에 화학적 스트레스인 C₁-C₆저급 알킬 자스모네이트를 처리하고, 자연 상태에서는 광원이 없는 땅 속에서 생장하는 뿌리에 인공적으로 광원을 조사하는 조건에서 배양하여 물리적인 스트레스를 부여하면 스트레스로 인해 쿠메스트린 말로네이트가 다량 생산된다.

예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 쿠메스트린 말로네이트는 화학식 1 또는 화학식 2의 구조 중 선택된 하나일 수 있다.

화학식 1

화학식 2

상기 화학식 1은 쿠메스트린 말로네이트의 지배적인 구조일 수 있고, 4'-OH 구조이고, 상기 화학식 2는 상기 화학식 1의 구조 이성질체로서, 5'-OH 구조를 가지는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 명조건은 24시간을 주기로 14시간 내지 18시간 동안 40 내지 80 PPFD(Photosynthesis Photon Flux Density)의 광원을 조사하는 단계; 및 6시간 내지 10시간 동안 광원을 차단하는 단계를 번갈아 실시하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 명조건은 14시간 이상, 15시간 이상, 16시간 이상, 17시간 이하, 또는 18시간 이하의 시간 동안 광을 조사하고, 10시간 이상, 9시간 이상, 8시간 이상, 7시간 이하, 또는 6시간 이하의 시간 동안 광을 100% 차단하는 것일 수 있으며, 상기 광 조사 및 광 차단을 24시간 주기로 번갈아 실시하는 것일 수 있다. 또한 구체적으로, 상기 광은 40 PPFD 이상, 42 PPFD 이상, 44 PPFD 이상, 46 PPFD 이상, 48 PPFD 이상, 50 PPFD 이상, 52 PPFD 이상, 54 PPFD 이상, 56 PPFD 이상, 58 PPFD 이상, 60 PPFD 이상, 62 PPFD 이하, 64 PPFD 이하, 66 PPFD 이하, 68 PPFD 이하, 70 PPFD 이하, 72 PPFD 이하, 74 PPFD 이하, 76 PPFD 이하, 78 PPFD 이하, 또는 80 PPFD 이하의 광량으로 조사되는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 C₁-C₆저급 알킬 자스모네이트는 40 μmol 내지 60 μmol의 농도일 수 있다. 구체적으로, 상기 C₁-C₆저급 알킬 자스모네이트는 40 μmol 이상, 41 μmol 이상, 42 μmol 이상, 43 μmol 이상, 44 μmol 이상, 45 μmol 이상, 46 μmol 이상, 47 μmol 이상, 48 μmol 이상, 49 μmol 이상 또는 50 μmol 이상이면서, 51 μmol 이하, 52 μmol 이하, 53 μmol 이하, 54 μmol 이하, 55 μmol 이하, 56 μmol 이하, 57 μmol 이하, 58 μmol 이하, 59 μmol 이하 또는 60 μmol 이하일 수 있다.

예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 C₁-C₆저급 알킬 자스모네이트는 메틸자스모네이트(methyl jasmonate)일 수 있다.

예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 C₁-C₆저급 알킬 자스모네이트는 상기 배양 용액에 첨가하여 처리하는 방식일 수 있다.

예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 메틸자스모네이트는 콩과 식물체 수확일을 기준으로 수확 전 1일 내지 10일 사이에 처리하는 것일 수 있다. 이때, 구체적으로, 상기 메틸자스모네이트는 수확일을 기준으로 수확 전 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일에 처리할 수 있으며, 예를 들어, 수확일을 기준으로 수확 전 3일 내지 8일 사이에 처리할 수 있다.

예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 배양는 4주 내지 6주 간 실시하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 배양 기간은 4주 이상, 4.5 주 이상, 또는 5 주 이상일 수 있고, 6주 이하, 또는 5.5주 이하일 수 있다.

예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 콩과 식물은 콩과 속(Glycine max)일 수 있다.

예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 기내 배양에 사용하는 배지는 질산암모늄(NH₄NO₃), 염화칼슘(CaCl₂·2H₂O), 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O), 제일인산칼륨(KH₂PO₄) 및 질산칼륨(KNO₃)을 포함하며, 상기 질산암모늄(NH₄NO₃)의 농도는 650 내지 1500 mg/L이고, 상기 염화칼슘(CaCl₂·2H₂O)의 농도는 175 내지 400 mg/L이며, 상기 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O)의 농도는 145 내지 320 mg/L이고, 상기 제일인산칼륨(KH₂PO₄)의 농도는 65 내지 150 mg/L이며, 상기 질산칼륨(KNO₃)의 농도는 750 내지 1500 mg/L일 수 있다.

더 구체적으로, 상기 배양 배지 내 질산암모늄(NH₄NO₃)의 농도는 650 mg/L 이상, 660 mg/L 이상, 700 mg/L 이상, 740 mg/L 이상, 760 mg/L 이상, 800 mg/L 이상, 825 mg/L 이상, 850 mg/L 이상, 900 mg/L 이상, 1000 mg/L 이상, 1200 mg/L 이상 또는 1400 mg/L 이상일 수 있고, 1500 mg/L 이하, 1400 mg/L 이하, 1200 mg/L 이하, 1000 mg/L 이하, 990 mg/L 이하, 900 mg/L 이하, 850 mg/L 이하, 825 mg/L 이하, 800 mg/L 이하, 760 mg/L 이하, 740m g/L 이하, 700 mg/L 이하 또는 660 mg/L 이하일 수 있다.

더 구체적으로, 상기 배양 배지 내 염화칼슘(CaCl₂·2H₂O)의 농도는 175mg/L 이상, 176 mg/L 이상, 190 mg/L 이상, 200 mg/L 이상, 220 mg/L 이상, 240 mg/L 이상, 260 mg/L 이상, 264 mg/L 이상, 270 mg/L 이상, 280 mg/L 이상, 300 mg/L 이상, 350 mg/L 이상 또는 380 mg/L 이상일 수 있고, 400 mg/L 이하, 380 mg/L 이하, 350 mg/L 이하, 300 mg/L 이하, 280 mg/L 이하, 270 mg/L 이하, 264 mg/L 이하, 260 mg/L 이하, 240 mg/L 이하, 220 mg/L 이하, 200 mg/L 이하, 190 mg/L 이하 또는 176 mg/L 이하일 수 있다.

더 구체적으로, 상기 배양 배지 내 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O)의 농도는 145 mg/L 이상, 148 mg/L 이상, 150 mg/L 이상, 160 mg/L 이상, 180 mg/L 이상, 185 mg/L 이상, 190 mg/L 이상, 200 mg/L 이상, 215 mg/L 이상, 222 mg/L 이상, 24 0mg/L 이상, 280 mg/L 이상 또는 300 mg/L 이상일 수 있고, 32 0mg/L 이하, 300 mg/L 이하, 280 mg/L 이하, 240 mg/L 이하, 222 mg/L 이하, 215 mg/L 이하, 200 mg/L 이하, 190 mg/L 이하, 185 mg/L 이하, 180 mg/L 이하, 160 mg/L 이하, 150 mg/L 이하 또는 148 mg/L 이하일 수 있다.

더 구체적으로, 상기 배양 배지 내 제일인산칼륨(KH₂PO₄)의 농도는 65 mg/L 이상, 68 mg/L 이상, 70 mg/L 이상, 75 mg/L 이상, 80 mg/L 이상, 85 mg/L 이상, 90 mg/L 이상, 95 mg/L 이상, 100 mg/L 이상, 102 mg/L 이상, 120 mg/L 이상 또는 140 mg/L 이상일 수 있고, 150　mg/L 이하, 140 mg/L 이하, 120 mg/L 이하, 110 mg/L 이하, 102 mg/L 이하, 100 mg/L 이하, 95 mg/L 이하, 90 mg/L 이하, 85 mg/L 이하, 80 mg/L 이하, 75 mg/L 이하, 70 mg/L 이하 또는 68 mg/L 이하일 수 있다.

더 구체적으로, 상기 배양 배지 내 질산칼륨(KNO₃)의 농도는 750 mg/L 이상, 760 mg/L 이상, 800 mg/L 이상, 850 mg/L 이상, 900 mg/L 이상, 950 mg/L 이상, 1000 mg/L 이상, 1140 mg/L 이상, 120 mg/L 이상 또는 1400 mg/L 이상일 수 있고, 1500 mg/L 이하, 1400 mg/L 이하, 1300 mg/L 이하, 1140 mg/L 이하, 1000 mg/L 이하, 980 mg/L 이하, 950 mg/L 이하, 900 mg/L 이하, 850 mg/L 이하, 800 mg/L 이하 또는 760 mg/L 이하일 수 있다.

또한 구체적으로, 상기 배양 배지는 MS 배지(Murashige and Skoog medium)일 수 있다. 구체적으로, 배지 내 무기물의 농도에 따라, 0.25 MS 배지, 0.5 MS 배지, 0.75 MS 배지, 1.0 MS 배지, 1.5 MS 배지 또는 2.0 MS 배지를 사용할 수 있다.

구체적으로, 상기 배양근 유도 배지는 IBA(Indole-3-Butyric Acid) 및 NAA(Naphthalene Acetic Acid) 중 어느 하나 이상을 배양 배지 전체 부피를 기준으로 0.1 내지 10 mg/L 포함하며, 수크로오스를 배양 배지 전체 부피를 기준으로 10 내지 100 g/L 포함할 수 있다. 더 구체적으로, 구체적으로, 상기 IBA 또는 NAA의 농도는 배양 배지 전체 부피를 기준으로 0.1 mg/L 이상, 0.5 mg/L 이상, 1 mg/L 이상, 2 mg/L 이상, 3 mg/L 이상, 3.5 mg/L 이상, 3.6 mg/L 이상, 3.7 mg/L 이상, 3.8 mg/L 이상, 3.9 mg/L 이상, 4 mg/L 이상 또는 5 mg/L 이상일 수 있다. 또한, 상기 IBA 또는 NAA의 농도는 배양 배지 전체 부피를 기준으로 10 mg/L 이하, 9 mg/L 이하, 8 mg/L 이하, 7 mg/L 이하, 6 mg/L 이하, 5 mg/L 이하, 4.5 mg/L 이하, 4.3 mg/L 이하, 4.1 mg/L 이하, 3.5 mg/L 이하 또는 3 mg/L 이하일 수 있다.

구체적으로, 상기 배양근 증식을 위한 배양 배지는 IBA(Indole-3-Butyric Acid)를 배양 배지 전체 부피를 기준으로 3 내지 5 m/L 포함하며, 수크로오스를 배양 배지 전체 부피를 기준으로 10 내지 100 g/L 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 IBA를 배양 배지 전체 부피를 기준으로 3 mg/L 이상, 3.6 mg/L 이상, 3.7 mg/L 이상, 3.8 mg/L 이상, 3.9 mg/L 이상, 4 mg/L 이상 또는 4.5 mg/L 이상 포함할 수 있으며, 또한, 5 mg/L 이하, 4.5 mg/L 이하, 이하, 4 mg/L 이하, 3.9 mg/L 이하, 3.8 mg/L 이하, 3.7 mg/L 이하, 3.6 mg/L 이하 또는 3.5 mg/L 이하 포함할 수 있다. 또한 상기 수크로오스의 농도는 상기 단계 (1)의 종자 배양 배지에서의 농도와 동일하게 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 배양근 증식의 배양 배지는 0.5 내지 1.5 MS 배지일 수 있다. 구체적으로, 상기 배양근 증식 단계에서의 배양 배지는 무기물 농도에 따라 0.5 MS 배지, 0.6 MS 배지, 0.7 MS 배지, 0.75 MS 배지, 0.8 MS 배지, 0.9 MS 배지, 1.0 MS 배지 또는 1.5 MS 배지일 수 있다.

상기 배양근 증식 단계에서, 상기 유도된 배양근을 배양 배지에 위치시킬 때의 배지의 pH는 4.8 내지 6.8일 수 있다. 구체적으로, 상기 pH는 4.8이상, 5이상, 5.2이상, 5.4이상, 5.6이상, 5.8이상, 6.0이상, 6.2이상, 6.4이상, 또는 6.6이상일 수 있다. 또한, 상기 pH는 6.8이하, 6.6이하, 6.4이하, 6.2이하, 6.0이하, 5.8이하, 5.6이하, 5.4이하, 5.2이하, 5.0이하일 수 있다.

상기 배양근 증식 단계에서 상기 유도된 배양근을 배양 배지에 위치시킬 때의 접종 밀도는 2 내지 6 g/L일 수 있다. 구체적으로, 상기 밀도는 2 g/L이상, 3 g/L이상, 4 g/L이상, 또는 5 g/L이상일 수 있다. 또한, 상기 밀도는 6 g/L이하, 5 g/L이하, 4 g/L이하, 또는 3 g/L이하일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 상기 쿠메스트린 말로네이트 화합물, 그 염, 그 입체이성질체, 그 수화물, 또는 그 용매화물을 포함하는 수용액 조성물일 수 있다.

예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 쿠메스트린 말로네이트 화합물, 그 염, 그 입체이성질체, 그 수화물, 또는 그 용매화물을 5 내지 20 ppm의 양으로 포함할 수 있다. 구체적으로, 쿠메스트린 말로네이트 화합물, 그 염, 그 입체이성질체, 그 수화물, 또는 그 용매화물이 5 내지 20 ppm의 양으로 포함되는 경우, 세포단위에서 모유두 세포의 증식에 효과가 있다. 상기 쿠메스트린 말로네이트 화합물 등은 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 용해시킬 수 있으며, FBS 세럼을 함유하는 DMEM 배지로 희석할 수 있다.

예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 식품, 화장품, 또는 약학 조성물인, 수용액 조성물일 수 있다.

이하, 실시예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

실시예

(1) 인공 토양 재배

2019년도 10월에 생산된 국내산 신화콩 (백태)을 사용하였다. 5주간 식물생장기 (growth chamber, GC-1000, (주)제이오텍, 대한민국)에서 재배하였다.

신화콩 종자를 2% 치아염소산 나트륨 용액으로 20분간 표면 살균 후, 원예용 상토(한아름 상토, (주)신성미네랄)가 담긴 플라스틱 화분에 각각100 - 120립씩 파종하였다. 상토의 조성은 다음과 같다. EC ≤ 1.2 ds/m, pH 5 ~ 7, 밀도 < 0.3 Mg/m2, 구성비 (%; 코코피트 51.5, 펄라이트 15, 피트모스 10, 질석 13, 제오라이트 10, 부식산 0.1, 비료 0.4). 관수(수돗물) 는 3~4일 간격으로 3L/vessel 두상 관수(작물의 위쪽에서 물을 뿌려 주는 방법) 하였다. 메틸자스모네이트 처리는 수확 5일전 저면 관수방법으로 2리터를 다음과 같이 처리하였다. 비교예 1: 메틸자스모네이트 무처리, 비교예 2: 메틸자스모네이트 50 μmol (참고: 특허 10-2019-0117597, 메틸자스모네이트 처리를 통한 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 생산 방법) 재배 5주 경과 후, 식물체를 수확하여 액체 질소로 냉동하고 동결건조 후 IKA Tubemill^TM 으로 25000rpm, 1분간 분쇄한다 (도 2).

(2) 양액 배양

증류수 400 g에 신화콩 종자 100 g을 담가 15~24시간 침지한다. 침지에 사용한 물을 버리고 물을 흡수한 종자 중 배아가 갈라지거나 색이 변하는 등 발아가 불가능 한 것을 제거하고 2% 치아염소산 나트륨 용액으로 20분간 표면 살균 한다. 샬균액을 버리고 샤알레에 살균된 거즈를 깔고 증류수(비교예 3 및 5) 또는 메틸자스모네이트가 함유된 증류수(비교예 4 및 비교예 6) 10 mL을 넣어 거즈에 흡수 시킨다.

거즈 위에 살균된 종자 20 개를 균일하게 배치하고 명조건의 경우(비교예 3 및 비교예 4) 배양기에서 명/암을 달리하여 9일간 23도씨 40% 상대습도 조건에서 배양한다. 배양 종료 후 발아된 콩 종자를 액체질소에 담가 냉동하고 이를 동결건조한다 (도 4). 건조된 발아종자를 IKA Tubemill^TM 으로 25000 rpm, 1 min 분쇄한다.

(3) 기내 배양

콩배양근 유도 및 배양 조건은 선행 특허(10-2019-0117597, 메틸자스모네이트 처리를 통한 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과식물 배양근의 생산 방법) 에 준하여 시행하였다.

1) 콩 종자 발아 및 기내 식물체 유도

신화콩 종자(Glycine max)를 2중량% 치아염소산나트륨(Sodium Hypochlorite) 수용액으로 20분간 표면을 살균한 뒤 멸균수로 3회 세척하였다. 그 후 수크로오스 30 g/L가 첨가된 0.5 MS 배지(Murashige and Skoog Medium, Haarlem, 네덜란드)를 이용하여 기내에서 25±1℃가 유지되는 명조건으로 2주간 식물체를 유도하였다.

2) 콩 배양근 유도

기내에서 발아된 식물체의 유근으로부터 IBA(indole-3-butyric acid, Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt,독일) 4 mg/L, 수크로오스 30 g/L가 첨가된 1.0 MS 배지(Murashige and Skoog medium, Duchefa, 네덜란드)에서 배양근을 유도하였으며, 기타 배양조건은 22±1℃가 유지되는 암조건으로 2주간 유지하였다.

3) 증식 및 메틸자스모네이트 처리

공기 용적이 3L인 벌브형(Bulb Type) 생물반응기(시중에서 일반적으로 입수 가능, 도 1 참조) 내에서 IBA(indole-3-butyricacid, Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, 독일) 4 mg/L, 수크로스 30 g/L가 첨가된 2L의 0.5 MS 배지(Murashige and Skoog medium, Duchefa, 네덜란드)를 이용하여 배양근을 4주간 증식시켰다. 이때 배지는 1N NaoH를 이용하여 pH 5.8로 조정 후 121℃, 1.2 기압에서 35분 간 멸균한 것을 사용하였으며, 상기 배양근을 1-1.5 cm로 절단하여 생체중을 기준으로 4 g/L 접종밀도로 배양근을 접종한 후 22±1℃가 유지되는 명조건에서 실시하였다. 공기공급량은 배양 전 기간 동안 에어플로우 미터(air flow meters, RMA series; Dwyer Instruments,Inc., 미국)를 이용하여 0.1vvm(air volume/culture volume per min)으로 일정하게 조절하였으며, 생물반응기 내부로 공급하는 공기는 일정한 온도 유지를 위하여 압축공기를 응축시킬 수 있는 공기응축기와 불순물을 제거할 수 있는 필터 및 공기 건조기 등을 순차적으로 통과시킨 후 기름을 사용하지 않는 공기 압축기를 이용하여 생물반응기 내부로 공급하였다.

암조건 배양(실시예 1)의 경우 전 배양 기간 동안 광이 없는 조건에서 재배하고 수확 5일 전 50 μmol 메틸자스모네이트를 처리하였다.

명조건 배양(실시예 2)의 경우 광 환경은 형광등(모델명: OSRAM FHF32W/865, 제조사: OSRAM GmbH 社, 중국)을 이용하여 60PPFD (Photosynthesis Photon Flux Density)의 광량으로 처리하였고, 24시간 주기로 16시간의 광 조사 단계와 8시간의 광 차단 단계를 번갈아 가면서 실시하고 수확 5일 전 50 μmol 메틸자스모네이트를 처리하였다.

배양종료 후 배양액을 제거하고 증류수로 수세하였다 (도 3). 배양근을 액체 질소로 냉동하고 동결건조 후 IKA Tubemill?? 으로 25000 rpm, 1 min 분쇄하였다. 분쇄한 배양근을 50%(v/v) 에틸알코올 수용액으로 60도씨 조건에서 3시간 추출하였다. 추출액을 잔사와 분리 및 농축하고 동결건조방법등을 사용하여 분말화하였다. 본 발명에서는 콩배양근 추출물에 효소 처리를 하지 않았다.

각 비교예 및 실시예의 재배 조건을 하기 표 3에 정리하였다.

(4) 물질의 분취, 질량분석, 및 정량분석

분쇄된 시료를 60%(v/v) 메탄올 수용액에 용해한 후 0.45 ㎛ PVDF 필터로 여과 후 기기를 이용하여 분취 및 분석 하였다.

가.분취 방법

- 기기: Gilson Preparative HPLC (321-binary pump, 172-diode array detector, 그리고 GX-271 liquid handler)

- 컬럼: Phenomenex Luna C18(2), 5 ㎛, 21.2 * 250 ㎜, 30℃

- 이동상 A: 0.1% formic acid (FA) in water, 이동상 B: 0.1% FA in acetonitrile

- 유속: 21.2 ㎖/min, 주입량: 1000 ㎕

- UV 검출: 254 nm, 365 nm

콩 배양근에서 추출한 물질중 쿠메스트린 (F1) 과 쿠메스트린 말로네이트 (F2)를 분취하고 수차례 반복하여 수득한 같은 분취물의 용매를 제거하고 동결건조하여 검량 표준품으로 사용하였다. (도 5) 각 분획은 고유 흡광도를 나타냈으며 UV 흡광 피크 면적으로 환산하여 모두 95% 순도로 적용하였다. (도 6)

나.고속액체크로마토그래피를 이용한 질량 및 정량 분석

12종의 이소플라본 표준품과 상기 일 구현에서 분취한 쿠메스트린과 쿠메스트린 말로네이트를 검량 표준물로 삼아 Stock solution 으로서 각각의 물질마다 2000 mg/L 의 농도로 준비하고 14종의 물질을 혼합하여 0.2 - 20 mg/L의 농도 구간으로 검량선을 구하여 각 시료내의 물질 함량을 정량하였다.

- 기기: Waters ACQUITY UPLC, 2998 PDA 검출기, 그리고 QDa^TM Mass detector

- 컬럼: Waters Cortecs C18 1.6 ㎛, 2.1 * 100 ㎜, 30℃

- 이동상 A: 0.1% FA in water, 이동상 B: 0.1% FA in acetonitrile

- 유속: 0.5 ㎖/min, 주입량: 1㎕

- UV 검출: 254 nm, 365 nm

질량 검출기: 검출 방법, single ion recoding (positive 5 V, negative 15V); probe 온도, 600℃; capillary voltage, 0.5 kV

인공 토양 재배 결과

인공 토양 재배시 메틸자스모네이트 비처리군(비교예 1) 대비 메틸자스모네이트 처리군(비교예 2)에서 쿠메스트린류와 이소플라본류의 생합성량이 약 2배 감소하였다(표 4). 이는 발아 후 생장 초기에 스트레스를 부여할 때 물질의 생합성이 원활하지 못하므로 충분한 생장 이후 스트레스를 부여해야됨을 시사한다. 인공토양에서 재배할 경우에 적절한 재배 방법으로 쿠메트스린과 쿠메스트린 말로네이트를 수득할 수 있다.

양액 배양 결과

화학적 스트레스(메틸자스모네이트 처리)가 없는 조건의 양액 재배 시 일반 조건 (비교예 3, 암조건) 대비 스트레스 조건(비교예 5, 명조건) 및 화학적 스트레스가 있는 조건의 일반 조건 (비교예 6, 암조건) 대비 스트레스 조건(비교예 4, 명조건)에서 쿠메스트린 말로네이트의 생합성량은 다소 감소하였고, 화학적 스트레스의 효과를 비교할 때 (비교예 3 및 비교예 5, 비교예 4과 비교예 6) 더욱 두드러지게 스트레스 조건에서의 쿠메스트롤류 및 이소플라본류의 생합성이 감소했다 (표 5). 이는 씨앗의 발아 초기부터 스트레스가 부여될 경우 생장이 지연되어 생합성량이 동일 기간내에서 감소된 것으로 나타났다. 콩을 발아시켜 물을 포함한 양액으로 단기간에 재배 할 경우에는 물리적 화학적 스트레스를 초기에 부여하는 것은 바람직하지 않은 것으로 나타났다. 콩의 발아 자체가 식물에게 스트레스로서 이를 적절히 활용할 때 쿠메스트린류의 물질을 획득 할 수 있다.

기내 배양 결과

기내 배양 시, 암조건 배양근(실시예 1)과 명조건 배양근(실시예 2)에는 수종의 이소플라본과 더불어 쿠메스트린과 쿠메스트린 말로네이트 (CMS-G1, M-CMS-G1)가 존재하였다 (도 7, 도 8) 기내 배양시 일반 조건 대비 스트레스 조건인 명조건에서 쿠메스트린 및 쿠메스트린 말로네이트의 생합성량이 약 2배 증가하였다 (표 6). 총 이소플라본의 생합성량은 일반 조건 대비 스트레스조건에서 약 3배 증가하였다. 특히 다이드진 말로네이트는 약 5배 증가하였다. 식물세포내의 생합성 과정에서 쿠메스트린과 쿠메스트린 말로네이트는 다이드진과 다이드진 말로네이트로부터 전환되는 것으로 문헌에서 보고하고 있다. 기내배양시 명조건으로 스트레스를 부여할 경우 이소플라본류의 생합성이 증가되고 이를 바탕으로 쿠메스트롤 류로 전환이 발생하는 것으로 추정한다. 인공 토양 및 양액 재배 방법과 비교하여 기내배양으로 수득할 수 있는 쿠메스트롤류의 화합물의 양은 약 20-50배로서, 기내배양과 더불어 적절한 스트레스부여는 쿠메스트롤류의 화합물을 효과적으로 생합성하는 방법이다.

(5) 배양근 유래 물질의 분자 구조 동정

고분해 핵자기공명 분광기(High Resolution Nuclear Magnetic Resonace Spectrometer; Bruker AVANCE 600MHz, Germany) 를 이용하여 proton 1D (¹H), carbon 1D (¹³C), 그리고 2D (COSY, HMQC, HMBC, HSQC) 분석을 시행하였다. 분취 및 정제된 분획물 F1과 F2 각각 5 mg을 DMSO-d ₂ 용매에 녹여 핵자기공명용 시험관에 넣어 분석했다. 분취물 F1은 coumestrin 으로 판명되었고 F2는 Coumestrin malonate 로 판명되었다 (도 9 내지 18). 각각의 분취물에는 5´-OH 구조를 지닌 이성질체가 약 20% 존재하였다 (도 19).

(6) 모유두 세포 증식 효과

상기 실시예에서 제조한 본 발명의 콩뿌리 배양근 및 쿠메스트린(F1), 쿠메스트린 말로네이트(F2) 화합물이 세포 단위에서 모유두 세포 증식 효능을 확인하였다. Dermal papilla cell을 96-웰 플레이트에 한 웰 당 약 2000개의 농도가 되도록 준비하였다. 콩뿌리 배양근 및 쿠메스트린(F1), 쿠메스트린 말로네이트(F2) 화합물을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 각각 용해시킨 후, 5% 농도의 FBS 세럼을 함유하는 DMEM 배지로 순차적 희석(serial dilution)하여 최종 농도가 40, 20, 10 또는 20, 10, 5 ppm이 되도록 하였다. 콩뿌리 배양근 및 쿠메스트린(F1), 쿠메스트린 말로네이트(F2) 화합물이 첨가된 배지와 대조군 배지는 각각 100 ㎕씩 웰 당 첨가한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 약 3일간 배양하였다. CCK8 solution을 10% 농도로 제조하여 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가한 후, 동일한 배양기에서 2시간 동안 반응시켰다. 이 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도(O.D.)를 측정하여 모유두 세포 증식(%)을 계산하였다. 콩 배양근 추출물은 10~20 ppm 의 농도일 때 대조군 대비 모유두 세포 증식 효과가 있었다. 쿠메스트린과 쿠메스트린 말로네이트 물질도 5~20 ppm 농도에서 대조군대비 모유두 세포 증식 효과가 있었다 (도 20).

Claims

콩과 식물을 기내 배양하여 쿠메스트린 말로네이트(coumestrin malonate)를 생산하는 방법에 있어서,
상기 기내 배양은
(a) 상기 콩과 식물의 콩배양근을 유도하는 단계;
(b) 상기 유도된 콩배양근을 증식시키는 단계; 및
(c) C₁-C₆저급 알킬 자스모네이트를 처리하는 단계를 포함하는,
쿠메스트린 말로네이트 생산 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계는 광원이 100% 차단된 암조건에서 수행하고,
상기 (b) 및 (c) 단계는 명조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는,
쿠메스트린 말로네이트 생산 방법.
제1항에 있어서,
상기 쿠메스트린 말로네이트는 화학식 1 또는 화학식 2 구조 중 선택된 하나인, 쿠메스트린 말로네이트 생산 방법.

화학식 1

화학식 2
제2항에 있어서,
상기 명조건은 24시간을 주기로
14시간 내지 18시간 동안 40 내지 80 PPFD(Photosynthesis Photon Flux Density)의 광원을 조사하는 단계; 및
6시간 내지 10시간 동안 광원을 차단하는 단계를 번갈아 실시하는 것을 특징으로 하는,
쿠메스트린 말로네이트 생산 방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은 상기 C₁-C₆저급 알킬 자스모네이트를 40 μmol 내지 60 μmol의 농도로 처리하는 것인,
쿠메스트린 말로네이트 생산 방법.
제1항에 있어서,
상기 C₁-C₆저급 알킬 자스모네이트는 메틸자스모네이트(methyl jasmonate)인,
쿠메스트린 말로네이트 생산 방법.
제1항에 있어서,
상기 C₁-C₆저급 알킬 자스모네이트는 콩과 식물체 수확일을 기준으로 수확 전 1일 내지 10일 사이에 처리하는 것인,
쿠메스트린 말로네이트 생산 방법.
제1항에 있어서,
상기 배양은 4주 내지 6주 간 실시하는 것인,
쿠메스트린 말로네이트 생산 방법.
제1항에 있어서,
상기 콩과 식물은 콩 속(Glycine max)인,
쿠메스트린 말로네이트 생산 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 생산된 쿠메스트린 말로네이트 화합물, 그 염, 그 입체이성질체, 그 수화물, 또는 그 용매화물.
제10항에 따른 쿠메스트린 말로네이트 화합물, 그 염, 그 입체이성질체, 그 수화물, 또는 그 용매화물을 포함하는 수용액 조성물.
제11항에 있어서,
상기 조성물의 총 중량을 기준으로 쿠메스트린 말로네이트 화합물, 그 염, 그 입체이성질체, 그 수화물, 또는 그 용매화물을 5 내지 20 ppm의 양으로 포함하는, 수용액 조성물.
제11항에 있어서,
상기 조성물은 식품, 화장품, 또는 약학 조성물인, 수용액 조성물.