KR20170106913A - 포도나무 조직의 세포배양으로부터 스테비오사이드를 이용한 비니페린을 대량생산하는 방법 - Google Patents

포도나무 조직의 세포배양으로부터 스테비오사이드를 이용한 비니페린을 대량생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포도나무 조직의 세포배양으로부터 스테비오사이드를 이용한 비니페린을 대량생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 비니페린의 경우 간보호, 항암, 항산화 및 피부의 화이트닝에 효과적이고, 저밀도 리포프로테인과 고밀도 리포프로테인의 산화저해와 혈관평활근세포의 증식과 이동을 저해시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명은 포도 식물체 꽃밥 조직 유래의 캘러스로부터 유용물질(스틸벤 화합물) 중에서도 특히 비니페린을 대량생산하는데 매우 유용한 방법으로, 관련 산업에 매우 중요하다.

Description

포도나무 조직의 세포배양으로부터 스테비오사이드를 이용한 비니페린을 대량생산하는 방법{Method for mass production of viniferin through tissue culture from grape tree using stevioside}
본 발명은 포도나무 조직의 세포배양으로부터 스테비오사이드를 이용한 비니페린을 대량생산하는 방법에 관한 것이다.
주로 레스베라트롤 화합물로 표현되는 스틸벤은 페닐알라닌으로 시작하는 일반적인 페닐프로파노이드 경로로부터 유래된 식물 2차 대사산물의 작은 클래스이다. 레스베라트롤(resveratrol; 3,4',5-transtrihydroxystilbene)은 UV 조사나 곰팡이 감염과 같은 환경 스트레스에 대한 반응으로 포도, 땅콩 및 베리류 등의 일부 식물에서 생산되는 자연적으로 발생하는 피토알렉신 (phytoalexin)이다. 레스베라트롤 및 이의 유도체는 식물 방어 반응에서 피토알렉신 및 항산화 물질로서 중요한 역할뿐만 아니라, 항암효과, 항염증 효과, 항종양 활성 및 항노화 효과를 포함하는 다양한 유익한 특성을 나타낸다.
그러나 이와 같이 항암, 항산화 활성 등이 밝혀지고 있는 레스베라트롤은 그 가능성이 확인된 유망 천연 기능성 자원으로서 앞으로 다양한 연구를 통해 기능성 식품 소재 및 신약 소재로 활용될 수 있음에도 불구하고, 아직 국내산 포도 품종을 대상으로 이 물질의 함량을 증가시키기 위한 재배 생리 및 생명공학 측면에서의 연구는 거의 이루어지지 않았다. 이와 관련하여 최근 레스베라트롤의 함량을 증폭시키기 위한 방법으로 수확된 포도에 플라스모파라 비티콜라(Plasmopara viticola) 균주를 인위적으로 접종하는 방법(한국공개특허 제2003-21976호), 수확 후 포도에 UV-C 광선을 처리하는 방법(J. Argic Food Chem. 2002 Oct 23;50(22):6322-9; W00200192) 또는 알루미늄을 포도에 처리하는 방법(US6834398) 등이 개시된 바 있으나, 이는 모두 포도 수확 후 처리 방법이거나 포도재배시 단처리 방법일 뿐이다.
한국공개특허 제2005-0089492호에서는 '환경인자를 이용한 레스베라트롤 고함유 포도의 생산방법'에 대해 기재되어 있고, 한국공개특허 제2003-0021976호에서는 '포도 유래의 천연 항암물질인 레스베라트롤의 함량을 증폭시킨 레스베라트롤 강화 포도 및 그 생산방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, '포도나무 조직의 세포배양으로부터 스테비오사이드를 이용한 비니페린을 대량생산하는 방법'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 포도 식물체 꽃밥 조직 유래의 캘러스로부터 유용물질(스틸벤 화합물)을 대량으로 생산하는 방법을 구축하고자, 포도나무 꽃밥 조직 절편체를 식물생장조절 물질이 첨가된 MS 고체배지에 치상하고 배양하여 캘러스를 유도시키고, 상기 유도된 캘러스를 증식 배지에서 배양하여 증식시킨 후, 상기 증식된 캘러스를 활성유도제로 메틸 자스몬산을, 가용화제로 스테비오사이드를 포함하는 액체배지에서 진탕배양한 결과, 플라스크 수준에서는 레스베라트롤의 생산은 없었고, 델타-비니페린(δ-viniferin)만이 생산되는 것을 확인하였으며(도 3), 스케일 업(scale-up) 조건인 바이오리액터 수준에서는 델타(δ)-비니페린뿐만 아니라 고가의 입실론(ε)-비니페린의 생산에도 매우 효과적임을 확인하였다(도 7).
또한, 상기 증식된 캘러스 배양 배지에 활성유도제 및 가용화제(스테비오사이드)를 처리한 후 플라스크 수준에서 정치배양을 수행한 결과, 비니페린의 생산은 전혀 없이 레스베라트롤만을 생산하는 점(도 10A)을 확인하였고, 진탕배양을 수행한 결과, 레스베라트롤의 생산은 전혀 없이 비니페린만을 생산하는 점(도 10B)을 확인하였다.
본 발명을 통해, 스틸벤의 대량생산이 가능하며, 특히, 본 발명의 스테비오사이드를 가용화제로 이용한 포도나무 조직 유래 캘러스의 배양 방법을 통해, 델타(δ)-비니페린뿐만 아니라 고가의 입실론(ε)-비니페린의 생산에 매우 효과적인 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은
(a) 포도나무 조직 절편체를 캘러스 유도 배지에 치상하여 포도나무 캘러스를 유도하는 단계; (b) 상기 유도된 포도나무 캘러스를 증식 배지에서 배양하여 증식시키는 단계; 및 (c) 상기 증식된 캘러스에 활성유도제 및 가용화제를 첨가하여 진탕배양하는 단계를 포함하는 포도나무 유래의 비니페린(viniferin)을 대량생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 메틸 자스몬산(MeJA) 및 스테비오사이드(stevioside)를 유효성분으로 함유하는, 포도나무 캘러스로부터 비니페린을 대량생산하기 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 포도나무 조직 절편체를 캘러스 유도 배지에 치상하여 포도나무 캘러스를 유도하는 단계; (b) 상기 유도된 포도나무 캘러스를 증식 배지에서 배양하여 증식시키는 단계; 및 (c) 상기 증식된 캘러스에 메틸 자스몬산(MeJA) 및 스테비오사이드(stevioside)를 첨가하여 정치배양하는 단계를 포함하는 포도나무 유래의 레스베라트롤(resveratrol)을 대량생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 스틸벤은 항암, 항바이러스, 항염증, 항노화, 항산화 등의 여러 생리활성으로 인하여 건강 기능성 식품, 화장품, 의약품, 염료 및 기능성 가축 사료 등에 활용되고 있으며, 특히 비니페린의 경우 간보호, 항암, 항산화 및 피부의 화이트닝에 효과적이고, 저밀도 리포프로테인과 고밀도 리포프로테인의 산화저해와 혈관평활근세포의 증식과 이동을 저해시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명은 포도 식물체 꽃밥 조직 유래의 캘러스로부터 유용물질(스틸벤 화합물) 중에서도 특히 비니페린을 대량생산하는데 매우 유용한 방법으로, 관련 산업에 매우 중요하다.
도 1은 본 발명의 스틸벤류 화합물 생성과정을 나타내는 것이다. 타이로신, 페닐알라닌과 같은 아미노산으로부터 p-쿠마르산(p-coumaric acid)이 생성되고 4CL(4-coumarate:CoA ligase)에 의해 p-쿠마로일-CoA가 생성된다. 이를 다시 STS 효소가 레스베라트롤로 변환시키고 산화효소에 의해 산화가 일어나면서 두 개의 레스베라트롤은 하나의 이합체 비니페린이 된다.
도 2는 포도 캘러스의 세포배양 및 활성유도제 처리를 통한 레스베라트롤 생합성 유전자(STS, ROMT)의 전사 발현을 분석한 결과이다. 이때 사용한 활성유도제는 MeJA(methyl jasmonate), ABA(abscisic acid), SA(salicylic acid), 에테폰, 플라젤린 22(Flg22), MV(methyl viologen) 및 키토산이다.
도 3은 식물 액체배양을 통하여 유용 대사체를 대량생산할 때 가용화제로 알려져있던 CD-M(Methyl-beta-cyclodextrin)과 스테비오사이드의 가용화 및 물질생산 효율을 비교하기 위하여 포도 캘러스 배양액에 100μM MeJA 와 50mM CD-M(MJ+CD) 또는 100μM MeJA와 50mM 스테비오사이드(MJ+Stevioside)를 처리하여 배양한 후 레스베라트롤 및 델타-비니페린을 추출하여 HPLC 분석을 수행한 결과이다. 또한, 가용화제를 처리하지 않고 100μM MeJA(MJ)만을 처리하여 대조구로 사용하였다.
도 4는 포도 캘러스 배양액에 100μM MeJA와 50mM CD-M 또는 100μM MeJA와 50mM 스테비오사이드(E95)를 처리하고 파라쿠마르산(p-cou) 및 레스베라트롤(res)을 전구체로 이용하여 가용화제 처리에 따른 생물전환 차이를 확인한 결과이다.
도 5는 포도 캘러스 조직 배양으로부터 생산된 델타-비니페린을 분리하고 분리된 델타-비니페린의 1H-NMR 스펙트럼 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 포도 캘러스 조직 배양으로부터 생산된 델타-비니페린을 분리하고 분리된 델타-비니페린의 1C-NMR 스펙트럼 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 대량배양(바이오리액터 수준)을 진행하고 그 배양액에 100μM MeJA 및 50mM 스테비오사이드를 처리하여 배양한 후 배양액을 추출하여 델타-비니페린 및 입실론-비니페린의 생성을 HPLC 분석으로 확인한 결과이다.
도 8은 대량배양으로부터 생산된 입실론-비니페린을 분리하고 분리된 입실론-비니페린의 1H-NMR 스펙트럼 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 대량배양으로부터 생산된 입실론-비니페린을 분리하고 분리된 입실론-비니페린의 1C-NMR 스펙트럼 분석 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명에서 개발한 레스베라트롤 및 델타-비니페린의 선택적 생산 방법을 통해 생산된 레스베라트롤(A) 및 델타-비니페린(B)의 생산결과를 HPLC로 확인한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 포도나무 조직 절편체를 캘러스 유도 배지에 치상하여 포도나무 캘러스를 유도하는 단계;
(b) 상기 유도된 포도나무 캘러스를 증식 배지에서 배양하여 증식시키는 단계; 및
(c) 상기 증식된 캘러스에 활성유도제 및 가용화제를 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는 포도나무 유래의 비니페린(viniferin)을 대량생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (c) 단계의 활성유도제는 메틸 자스몬산(methyl jasmonate), SA(salicylic acid) 또는 플라젤린 22(Flg22)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메틸 자스몬산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 가용화제는 스테비오사이드(stevioside)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 메틸 자스몬산 및 스테비오사이드는 바람직하게는 각각 50~350 μM 및 40~60 mM의 농도로 첨가할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 각각 100 μM 및 50 mM의 농도로 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 비니페린은 델타(δ)-비니페린 또는 입실론(ε)-비니페린일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (a) 단계의 캘러스 유도 배지는 생장조절제로 0.05~0.2 mg/L IAA(indole-3-acetic acid), 0.05~0.2 mg/L NAA(1-naphthaleneacetic acid), 1~2 mg/L 2,4-D 및 0.2~0.3 mg/L 키네틴이 첨가된 배지일 수 있고, 바람직하게는 0.1 mg/L IAA(indole-3-acetic acid), 0.1 mg/L NAA(1-naphthaleneacetic acid), 1.5 mg/L 2,4-D 및 0.25 mg/L 키네틴이 첨가된 배지(표 1)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (b) 단계의 증식배지는 0.5~2.0mg/L 2,4-D가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지일 수 있고, 바람직하게는 1mg/L 2,4-D가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 바람직하게는
(a) 멸균한 포도나무 조직 절편체를 생장조절제로 0.05~0.2 mg/L IAA(indole-3-acetic acid), 0.05~0.2 mg/L NAA(1-naphthaleneacetic acid), 1~2 mg/L 2,4-D 및 0.2~0.3 mg/L 키네틴이 첨가된 캘러스 유도 배지에 치상하여 포도나무 캘러스를 유도하는 단계;
(b) 상기 유도된 포도나무 캘러스를 0.5~2.0mg/L 2,4-D가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지에서 배양하여 증식시키는 단계; 및
(c) 상기 증식된 캘러스에 50~350 μM 메틸 자스몬산(MeJA) 및 40~60 mM 스테비오사이드(stevioside)를 첨가하여 진탕배양하여 델타(δ)-비니페린 또는 입실론(ε)-비니페린을 대량생산하는 단계를 포함할 수 있으며,
더욱 바람직하게는
(a) 멸균한 포도나무 조직 절편체를 생장조절제로 0.05~0.2 mg/L IAA(indole-3-acetic acid), 0.05~0.2 mg/L NAA(1-naphthaleneacetic acid), 1~2 mg/L 2,4-D 및 0.2~0.3 mg/L 키네틴이 첨가된 캘러스 유도 배지에 치상하여 23~27℃에서 25~30일 동안 계대배양하여 포도나무 캘러스를 유도하는 단계;
(b) 상기 유도된 포도나무 캘러스를 0.5~2.0mg/L 2,4-D가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지에서 23~27℃에서 5~10일 배양하여 증식시키는 단계; 및
(c) 상기 증식된 캘러스에 100 μM 메틸 자스몬산(MeJA) 및 50 mM 스테비오사이드(stevioside)를 첨가하여 진탕배양하여 델타(δ)-비니페린 또는 입실론(ε)-비니페린을 대량생산하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 메틸 자스몬산(MeJA) 및 스테비오사이드(stevioside)를 유효성분으로 함유하는, 포도나무 캘러스로부터 비니페린을 대량생산하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 메틸 자스몬산(methyl jasmonate) 및 스테비오사이드(stevioside)는 바람직하게는 각각 50~350 μM 및 40~60 mM의 농도로 첨가할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 각각 100 μM 및 50 mM의 농도로 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 비니페린은 델타(δ)-비니페린 또는 입실론(ε)-비니페린일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은,
(a) 포도나무 조직 절편체를 캘러스 유도 배지에 치상하여 포도나무 캘러스를 유도하는 단계; (b) 상기 유도된 포도나무 캘러스를 증식 배지에서 배양하여 증식시키는 단계; 및 (c) 상기 증식된 캘러스에 메틸 자스몬산(MeJA) 및 스테비오사이드(stevioside)를 첨가하여 정치배양하는 단계를 포함하는 포도나무 유래의 레스베라트롤(resveratrol)을 대량생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법은
(a) 멸균한 포도나무 조직 절편체를 생장조절제로 0.05~0.2 mg/L IAA(indole-3-acetic acid), 0.05~0.2 mg/L NAA(1-naphthaleneacetic acid), 1~2 mg/L 2,4-D 및 0.2~0.3 mg/L 키네틴이 첨가된 캘러스 유도 배지에 치상하여 포도나무 캘러스를 유도하는 단계;
(b) 상기 유도된 포도나무 캘러스를 0.5~2.0mg/L 2,4-D가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지에서 배양하여 증식시키는 단계; 및
(c) 상기 증식된 캘러스에 50~350 μM 메틸 자스몬산(MeJA) 및 40~60 mM 스테비오사이드(stevioside)를 첨가하여 정치배양하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 정치배양은 24~26℃에서 4~7일 동안 정치배양하는 것일 수 있고, 바람직하게는 25℃에서 5일 동안 정치배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 포도 캘러스 유도 및 증식
본 발명에서는 대표적인 상업용 포도 품종인 켐벨(Vitis vinifera L. cv Campbell Early)로부터 캘러스를 유도하였다. 켐벨의 꽃을 절취하여 흐르는 물로 세척한 다음 70% 에탄올 용액에 1분간 침지하여 표면살균을 실시하였다. 표면살균은 무균작업대 내에서 포도 꽃 조직을 유리병에 담고 상업용 락스(약 1% sodium hypochlorite) 용액으로 15분간 실시하였으며 멸균 증류수로 3회 세척하였다. 표면살균이 완료된 조직은 멸균 여과지를 이용하여 남은 습기를 제거하고 배양에 사용하였다. 표면살균이 완료된 포도 조직을 메스를 이용하여 절취한 다음 각각의 조직(꽃잎, 꽃밥, 수술대)을 배양배지에 치상하였다. 포도 캘러스 유도에 사용된 배지는 표 1에 나타내었으며, 생장조절제로 0.1 mg/L IAA, 0.1 mg/L NAA, 1.5 mg/L 2,4-D 그리고 0.25 mg/L 키네틴이 첨가된 배지를 사용하였다. 배양조건은 25℃ 항온기에서 암배양을 실시하였다. 배양 후 형성된 백색의 캘러스는 동일조성의 고체배지에 약 4주 간격으로 계대배양을 실시하였다.
(mg/L)
KNO3 2,500
(NH4)2SO4 134
MgSO4·7H2O 250
MnSO4·1H2O 10
ZnSO4·7H2O 2
CuSO4·5H2O 0.025
NH4H2PO4 150
NaH2PO4 150
KCl 300
KI 0.75
CoCl2·6H2O 0.025
CaCl2·2H2O 150
H3BO3 3
Na2MoO4·2H2O 0.25
FeSO4·7H2O 27.85
Na2-EDTA 37.25
Thiamine HCl 10
Nicotinic acid 1
Pyridoxine HCl 1
myo-inositol 100
IAA 0.1
NAA 0.1
2,4-D 1.5
Kinetin 0.25
Sucrose 20,000
Gelrite 4,000
pH = 5.8.
sterilized at 121˚C for 15 minutes
실시예 2. 포도 캘러스의 세포배양 및 활성유도제 처리를 통한 레스베라트롤 생합성 유전자 ( STS , ROMT ) 전사 발현 분석
포도 캘러스로부터 레스베라트롤 생산 시스템을 확립하기 위해 상기 실시예 1에서 유도되어 안정화된 포도 캘러스의 액체배양을 통하여 전사발현 분석을 수행하였다. 1mg/L 2,4-D가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지를 칭하는 MS1D(MS 4.4g, 수크로스 30g, MES 0.5g, 미오-이노시톨 0.1g, 티아민 HCl 0.4mg, 2,4-D 1mg/L) 액체배지에 25℃, 90rpm 7일 배양 후 활성유도제를 처리하고 24h이 지난 포도 캘러스로부터 총 RNA를 분리하였다(Kim CY et al. 2010, Physiologia Plantarum 139: 259-261). 분리된 총 RNA (5μg)는 First-Strand cDNA Synthesis Kit(Fermantas, Canada)를 이용하여 설명서대로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA(20μl)를 2.5배 희석한 후 2μl를 주형으로 하여 포도 캘러스에서 레스베라트롤 및 테로스틸벤 생합성 관련 유전자를 대상으로 RT-PCR를 수행하였다. PCR 증폭은 94℃에서 2분간 변성, 95℃에서 30초, 50℃에서 40초, 72℃에서 1분을 1 사이클로 하여 25 사이클 및 72℃에서 10분간 최종 연장반응에 의해 수행되었다. 본 실험을 위해 사용한 포도 레스베라트롤, 테로스틸벤 생합성 유전자 및 포도액틴 RT-PCR용 프라이머는 다음과 같다 : STS-F: 5'-ATGGCTTCAGTTGAGGAAATCAGA-3' (서열번호 1), STS-R: 5'-TTAATTTGTCACCATAGGAATGCTA-3' (서열번호 2), ROMT-F: 5'-ATGGATTTGGCAAACGGTGTGA-3' (서열번호 3), ROMT-R: 5'-TCAAGGATAAACCTCAATGAGGGA-3' (서열번호 4), ACTIN-F: 5'-TGCTGACAGAATGAGCAAGG-3' (서열번호 5), ACTIN-R: 5'-TACTAAGAAGCTTTCAACCCAGTATA-3' (서열번호 6). 다양한 활성유도제를 처리하여 스틸벤 화합물의 생산 증진을 도모하였으며, 이때 사용한 활성유도제는 MeJA(methyl jasmonate), ABA(abscisic acid), SA(salicylic acid), 에테폰, 플라젤린 22(Flg22), MV(methyl viologen), 키토산이다. 그 결과 MeJA, SA, Flg22를 처리했을 때 두 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, 그 중에서도 MeJA를 처리했을 때 유전자의 발현이 가장 높은 것을 확인하였다(도 2).
실시예 3. 포도 캘러스 에서의 활성유도제 및 가용화제 처리
상기 실시예 2에서 선발한 활성유도제(100μM MeJA)를 이용하여 스틸벤 화합물 생산을 유도하였다. 20ml의 MS에 2g의 포도 캘러스를 접종한 후 125ml 플라스크에서 7일간 배양 후 100μM MeJA를 처리하여 5일 후 포도캘러스를 확보하였다. 추출하여 HPLC 분석을 진행한 결과, 포도 캘러스 내에서 미량의 피시드(piceid)가 확인되었으며(데이터 미제시), 스테비오사이드 처리를 통하여 생산된 스틸벤 화합물을 가용화 함으로써 생산율을 높이는 실험을 수행하였다. 앞서 기술한 바와 같이 포도 캘러스 7일 배양액에 5mM, 10mM, 25mM, 50mM 스테비오사이드를 농도별로 처리하거나 100μM MeJA와 함께 농도별로 처리하였으며 이후 배양 5일째 시료를 거름망에 걸러 캘러스와 캘러스 배양액으로 분리하였다. 분리한 캘러스는 거름망에 걸러 탈수작업을 진행하였으며, 액체질소를 이용하여 얼린 후 -80℃에 추출 전까지 보관하여 사용하였다. 캘러스 배양액 시료는 보관기간 없이 바로 추출하여 사용하였다.
그 결과 스테비오사이드 50mM 농도에서 가장 안정적으로 스틸벤 화합물을 생산하는 것을 확인하였다. 또한 식물조직 혹은 세포 배양시 가용화제로 알려져 있던 CD-M(Methyl-beta-cyclodextrin) 및 스테비오사이드의 가용화 및 스틸벤 화합물의 생산 효율을 분석하기 위해 100μM MeJA와 함께 각각의 가용화제를 50mM씩 처리한 후 배양액을 추출하여 스틸벤 화합물의 생산 경향성을 확인해 보았다. 그 결과 100μM MeJA와 50mM CD-M을 처리한 경우에는 트랜스-레스베라트롤이 가장 많이 생산되었고, 100μM MeJA와 50mM 스테비오사이드를 처리한 경우 델타-비니페린이 생산된 스틸벤 화합물의 대부분을 차지하였다. 100μM MeJA와 50mM CD-M 처리구에서는 최대 40mg/L의 레스베라트롤이 생산되었으며, 100μM MeJA와 50mM 스테비오사이드를 처리구에서는 최대 700mg/L의 델타-비니페린이 생산되었다(도 3).
실시예 4. 포도 캘러스에서의 생물전환
상기 실시예 3에서 실시한 결과를 토대로 포도 캘러스 현탁배양시 파라쿠마르산 및 레스베라트롤을 기질로 사용하여 생물전환을 시도해 보았다. 먼저 100μM MeJA와 50mM CD-M에 기질을 넣지 않은 것을 대조구로 하고, 2mM의 파라쿠마르산 및 레스베라트롤을 기질로 처리한 것을 실험구로 하여 그 패턴을 확인하였다(도 4A). 그 결과 기질을 넣어 준 경우 레스베라트롤 이외에 팔리돌(Pallidol), Parthenocissin A, Quadrangularin A 및 델타-비니페린이 생산되었다(도 4A). 그러나 100μM MeJA와 50mM 스테비오사이드(E95)에 기질을 넣지 않은 것을 대조구로 하고, 2mM의 파라쿠마르산 및 레스베라트롤을 기질로 처리한 것을 실험구로 하여 그 패턴을 확인하였다(도 4B). 그 결과, 기질을 처리하지 않은 대조구와 같이 기질을 처리한 실험구에서 델타-비니페린이 많이 생산되는 것을 확인하였다. 이 결과를 토대로 스테비오사이드를 포도 캘러스 현탁배양시 가용화제로 사용하면 델타-비니페린을 생산하는데 아주 효과적인 것을 확인하였다(도 4).
실시예 5. 바이오리액터를 활용한 포도 캘러스의 대량배양에서의 활성유도제 및 가용화제 처리
상기 실시예 1에서 안정화시킨 포도캘러스를 100ml MS1D 액체배지에 10g 씩 3개 플라스크에 각각 접종한 후 25℃, 90rpm으로 14일간 배양하였다. 14일간 배양하여 증식한 캘러스를 미리 멸균하여 건조한 3L 바이오리액터에 모두 계대한 후 1.2L의 MS1D 액체배지를 추가하였다. 상기 실시예 3에서와 마찬가지로 50mM 스테비오사이드를 100μM MeJA와 함께 처리하였으며 이후 배양 5일째 시료를 거름망에 걸러 캘러스와 캘러스 배양액으로 분리하였다. 분리한 캘러스는 거름망에 걸러 탈수작업을 진행하였으며, 액체질소를 이용하여 얼린 후 -80℃에 추출 전까지 보관하여 사용하였다. 캘러스 배양액 시료는 보관기간 없이 바로 추출하여 사용하였다. 캘러스 배양액 추출물을 HPLC 분석한 결과, 입실론-비니페린 및 델타-비니페린이 생산되는 것을 확인하였다(도 7).
실시예 6. 포도 캘러스 배양액 추출 및 HPLC 분석
상기 실시예 3, 4 및 5에서 분리된 포도 캘러스는 액체질소를 이용하여 분말화하였다. 상기 캘러스 분말 1g 을 3ml의 80% 메탄올로 추출한 다음 원심분리 함으로써 상층부의 캘러스 추출물을 얻었다. 추출한 여액은 공기(air)를 주입하여 건조시키고 건조물을 600㎕ 80% 메탄올에 녹이고 0.2㎛ PTFE 필터(hydrophilic, ADVANTEC, 일본)하여 HPLC 분석에 이용하였다. 10ml의 캘러스 배양액은 동량의 에틸아세테이트로 물과 에틸아세테이트 분배 추출하여 얻어진 에틸아세테이트 층을 공기를 주입하여 건조시켰다. 건조물을 1ml의 80% 메탄올에 녹이고 0.2㎛ PTFE 필터하여 HPLC 분석에 이용하였다. HPLC는 Agilent Technology 1200 series를 사용하여 분석하였다. 펌프 시스템은 4개 용매펌프(quaternary pump)를 사용하였으며 컬럼은 agilent사의 ZORBAX SB-18 (5mm, 4.6 X 150mm)을 사용하였으며 이동상은 물 (A, 0.05% 트리플루오로아세트산)과 아세토니트릴(B 0.05% 트리플루오로아세트산)을 이용하여 기울기 용리를 이용하여 분석하였다. 상기 포도 캘러스의 7일 배양액에서 100μM MeJA와 5mM, 10mM, 25mM, 50mM 스테비오사이드를 농도별로 처리한 결과, 낮은 농도에서 높은 농도로 스테비오사이드를 처리했을 때 농도가 높아질수록 점차적으로 스틸벤 함량이 증가되는 양상을 보이며, 50mM에서 가장 높은 스틸벤 화합물 함유를 확인하였고(데이터 미제시) 스테비오사이드를 처리하지 않은 처리구에 비해 월등히 스틸벤 화합물 함량이 증가하는 것을 관찰하였다(도 3). 스테비오사이드를 처리하지 않은 처리구 및 캘러스 추출물에서는 스틸벤 화합물을 확인할 수 없었다.
실시예 7. 포도 캘러스 생산 비니페린 분리 및 NMR 분석
상기 실시예 3에서 준비된 가용화제 처리 포도 꽃밥 유래 캘러스 배양액을 물과 에틸아세테이트로 분배 추출하여 얻어진 에틸아세테이트 층을 감압 농축하였다. 얻어진 농축물(15 g)을 MPLC 기기를 이용하여 역상 칼럼(10 × 30 cm)을 1단계 분리를 실시하였다. 이때 용리용매는 물-아세토나이트릴을 이용하였으며 물-아세토나이트릴 혼합용액을 100:1에서 100% 아세토나이트릴까지 극성을 낮추며 용리시켜 7개의 분획물(A-G)을 얻었다. 목표 화합물인 델타-비니페린(trans-δ-viniferin, 하기 화학식 1)이 다량 함유된 분획 C를 농축하여 농축물 1.3g을 얻었다. 얻어진 농축물 1.3g을 Recylcing LC 기기를 이용하여 역상 칼럼 크로마토그래피를 물-아세토나이트릴(2:2) 혼합용매 조건에서 실시하여 80% 이상 순도의 델타-비니페린 160mg을 얻었다. 얻어진 분획물을 95% 메탄올로 용리시키는 겔크로마토그래피(Sephadex LH-20)를 실시하여 98% 순도의 델타-비니페린 12mg을 얻었다. 얻어진 화합물의 구조는 1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR, DEPT 및 질량분석기를 이용하여 규명하였다(도 5 및 도 6).
trans-δ-Viniferin: 1HNMR(500MHz,Acetone-d 6)d 7.45 (dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6), 7.27 (s, H-4), 7.25 (d, J = 8.5 Hz, H-2,6A), 7.07 (d, J = 16.5 Hz, H-2'), 6.92 (d, J = 16.5 Hz, H-1'), 6.88 (d, J = 8.1 Hz, H-7), 6.86 (d, J = 8.5 Hz, H-3,5A), 6.55 (d, J = 2.0 Hz, H-2,6C), 6.29 (t, J = 2.0 Hz, H-2B), 6.27 (t, J = 2.0 Hz, H-4C), 6.21 (d, J = 2.0, H-4,6B), 5.47 (d, J = 8.0 Hz, H-2), 4.48 (d, J = 8.0 Hz, H-3); 13CNMR(125MHz,Acetone-d 6)d 159.7 (C-7a), 158.8 (C-1,3B), 158.6 (C-3,5C), 157.5 (C-4A), 144.3 (C-5B), 139.8 (C-1C), 131.6 (C-3a), 131.2 (C-1A), 130.8 (C-5), 128.2 (C-2'), 127.7 (C-6), 127.6 (C-2,6A), 126.3 (C-1'), 123.0 (C-4), 115.2 (C-3,5A), 109.2 (C-7), 106.4 (C-4,6B), 104.7 (C-2,6C), 101.8 (C-4C), 101.4 (C-2B), 93.1 (C-2), 56.9 (C-3).
Figure pat00001
실시예 8. 포도 캘러스 생산 입실론 - 비니페린 분리 및 NMR 분석
상기 실시예 5에서 준비된 가용화제 처리 포도 꽃밥 유래 캘러스 배양액을 물과 에틸아세테이트로 분배 추출하여 얻어진 에틸아세테이트 층을 감압 농축하였다. 얻어진 농축물(10 g)을 MPLC 기기를 이용하여 역상 칼럼(10 × 30 cm)을 1단계 분리를 실시하였다. 이때 용리용매는 물-아세토나이트릴을 이용하였으며 물-아세토나이트릴 혼합용액을 70:1에서 100% 아세토나이트릴까지 극성을 낮추며 용리시켜 5개의 분획물(A-E)을 얻었다. 목표 화합물인 입실론-비니페린(trans-ε-viniferin, 하기 화학식 2)이 다량 함유된 분획 B를 농축하여 농축물 1.5g을 얻었다. 얻어진 농축물 1.5g을 Recylcing LC 기기를 이용하여 역상 칼럼 크로마토그래피를 물-아세토나이트릴(2:1) 혼합용매 조건에서 실시하여 85% 이상 순도의 입실론-비니페린 100mg을 얻었다. 얻어진 분획물을 95% 메탄올로 용리시키는 겔 크로마토그래피(Sephadex LH-20)를 실시하여 98% 순도의 입실론-비니페린 30mg을 얻었다. 얻어진 화합물의 구조는 1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR, DEPT 및 질량분석기를 이용하여 규명하였다(도 8 및 도 9).
trans-ε-viniferin 1H-NMR (400 MHz, MeOD) d 7.14 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2(6)a), 7.03 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2(6)b), 6.80 (1H, d, J = 13.6 Hz, H-7b), 6.78 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3(5)a), 6.65 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3(5)b), 6.56 (1H, d, J = 13.6 Hz), 6.28 (1H, brs, H-12b), 6.21 (1H, brs, H-12a), 6.18 (2H, brs, H-10a,14a), 5.37 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-7a), 4.35 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-8a); 13C-NMR (100 MHz, MeOD) d 161.3 (C-11b), 158.6 (C-11a, 13a), 158.3 (C-13b), 157.1 (C-4a), 156.9 (C-4b), 146.0 (C-9a), 135.6 (C-9b), 132.5 (C-1a), 129.1 (C-1b, 7b), 127.5 (C-2(6)b), 127.0 (C-2(6)a), 122.4 (C-8b), 118.8 (C-10b), 115.1 (C-3(5)b), 115.1 (C-3(5)a), 106.3 (C-14a, 10a), 103.1 (C-14b), 101.0 (C-12a), 95.6 (C-12b), 93.5 (C-7a), 56.9 (C-8a).
Figure pat00002
실시예 9. 레스베라트롤 및 델타- 비니페린(δ-viniferin)의 선택적 생산 기술 개발
상기 실시예 1에서 유도된 포도 캘러스에서 레스베라트롤 및 델타-비니페린을 각각 주로 생산하기 위해 서로 다른 조건으로 물질 생산을 유도하였다. 1mg/L 2,4-D가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지 100ml에 10g의 포도 캘러스를 접종 후 6일간 25℃에서 90rpm으로 배양하였다. 이를 25ml씩 분주하여 24시간 같은 조건으로 배양 후 100μM MeJA 및 50mM 스테비오사이드를 각각 처리하여 25℃에서 정치배양 혹은 90rpm 두 그룹으로 나누어 5일간 배양하였다. 그 후 상기 실시예 6에서 실시한 방법으로 물질 추출 후 HPLC 분석에 이용하였다. 배양 속도 조건을 다르게 한 결과 정치배양한 시료에서는 레스베라트롤이 델타-비니페린에 비해 월등히 많이 생성되는 것을 확인하였고, 진탕배양을 한 시료에서는 델타-비니페린이 레스베라트롤에 비해 월등히 많이 생성되는 것을 확인하였다(도 10).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for mass production of viniferin through tissue culture from grape tree using stevioside <130> PN16456 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 atggcttcag ttgaggaaat caga 24 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ttaatttgtc accataggaa tgcta 25 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atggatttgg caaacggtgt ga 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcaaggataa acctcaatga ggga 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgctgacaga atgagcaagg 20 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tactaagaag ctttcaaccc agtata 26

Claims (8)

  1. (a) 포도나무 조직 절편체를 캘러스 유도 배지에 치상하여 포도나무 캘러스를 유도하는 단계;
    (b) 상기 유도된 포도나무 캘러스를 증식 배지에서 배양하여 증식시키는 단계; 및
    (c) 상기 증식된 캘러스에 활성유도제 및 가용화제를 첨가하여 진탕배양하는 단계를 포함하는 포도나무 유래의 비니페린(viniferin)을 대량생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 활성유도제 및 가용화제는 각각 메틸 자스몬산(methyl jasmonate) 및 스테비오사이드(stevioside)인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 메틸 자스몬산 및 스테비오사이드는 각각 50~350 μM 및 40~60 mM의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 비니페린은 델타(δ)-비니페린 또는 입실론(ε)-비니페린인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 메틸 자스몬산(MeJA) 및 스테비오사이드(stevioside)를 유효성분으로 함유하는, 포도나무 캘러스로부터 비니페린을 대량생산하기 위한 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 50~350 μM 메틸 자스몬산 및 40~60 mM 스테비오사이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. (a) 포도나무 조직 절편체를 캘러스 유도 배지에 치상하여 포도나무 캘러스를 유도하는 단계;
    (b) 상기 유도된 포도나무 캘러스를 증식 배지에서 배양하여 증식시키는 단계; 및
    (c) 상기 증식된 캘러스에 메틸 자스몬산(MeJA) 및 스테비오사이드(stevioside)를 첨가하여 정치배양하는 단계를 포함하는 포도나무 유래의 레스베라트롤(resveratrol)을 대량생산하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 정치배양은 24~26℃에서 4~7일 동안 정치배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
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